Summary
이 논문은 고정 밀도를 가진 포획 구슬의 부양 높이의 변화를 정량화하여 용해성 또는 멤브레인 바운드항원들의 존재를 구체적으로 검출할 수 있는 자기 부양 기반 방법을 설명합니다.
Abstract
설명된 방법은 자기 적 부상의 원리에 기초하여 개발되었으며, 이는 밀도와 자기 특성에 따라 세포와 입자를 분리합니다. 밀도는 그 대사 속도, 분화 및 활성화 상태와 직접적으로 관련된 특성을 식별하는 세포 유형입니다. 자기 부양은 순환 혈액 세포를 성공적으로 분리, 이미지 및 특성화하고 빈혈, 겸상적혈구 질환 및 밀도 및 자기 특성에 따라 순환 종양 세포를 검출하는 1 단계 접근법을 허용합니다. 이러한 접근법은 또한 각각 포획 및 검출 항체로 코팅된 저밀도 비드 세트를 사용하여 용액에 존재하는 수용성 항원들을 검출할 수 있다. 항원이 용액에 존재하는 경우, 두 세트의 구슬을 교개하여 항체 코팅 구슬의 행 사이에 부과되는 새로운 구슬 비드 복합체를 생성합니다. 용액에서 표적 항원의 농도가 증가하면 항원 농도가 낮아지면 더 많은 수의 비드 비드 복합체가 생성되어 표적 항원의 정량적 측정이 가능합니다. 자기 부상은 감소된 시료 준비 시간과 고전적인 판독 방법에 대한 의존도 부족으로 인해 다른 방법에 유리하다. 생성된 이미지는 스마트폰이나 태블릿과 같은 표준 현미경 또는 모바일 장치를 사용하여 쉽게 캡처및 분석할 수 있다.
Introduction
자기부상은 세포 유형1,2,3,단백질4,5 및 오피오이드6을 특정 밀도 및 파라자성 특성에 기초하여 분리, 분석 및 식별하도록 개발된 기술입니다. 세포 밀도는 대사율 및 분화상태7,8,9,10,11,12,13,14와직접 관련된 각 세포 유형의고유하고본질적인 특성이다. 꾸준한 상태 조건 동안 세포 밀도에 미묘 하 고 일시적인 변화를 정량화, 그리고 다양 한 세포 과정 동안, 세포 생리학 및 병리 생리학에 대 한 타의 추종을 불허 하는 통찰력을 감당할 수 있습니다. 세포 밀도의 변화는 세포분화(15,16,세포 주기 진행9,17,18,19,세포 세포세포20,21,22, 23및 악성 변환24,25,26)와 연관된다. . 따라서, 세포 밀도의 특정 변화의 정량화는, 다양한 활성화 과정을 겪고 있는 세포의 동일 모형 사이에서 차별할 뿐만 아니라, 다른 모형의 세포를 분화하기 위하여 이용될 수 있다. 이를 통해 특정 세포 하위 집단을 대상으로 하는 실험을 가능하게 하며, 밀도의 동적 변화는 변화된 세포대사(27)의지표역할을 한다. 변화하는 환경에 대응하여 세포가 밀도를 변경할 수 있다는 것이 확립된 바와 같이7,그 밀도와 관련하여 세포의 역학을 측정하여 이를 완전히 이해하는 것이 필수적이며, 현재 의 방법은12를제공하지 않을 수 있다. 반면에 자기 부상은 세포 및 그성질(28)의동적 평가를 허용한다.
세포는 영구적인 자기 이폴 순간이 없다는 것을 의미하는 다각성입니다. 그러나, 외부 자기장에 노출되면, 약한 자기 이폴 모멘트는 적용된 필드의 반대 방향으로, 세포에서 생성된다. 따라서, 세포가 파라마그네틱 용액에서 중단되고 강한 수직 자기장에 노출된 경우, 자기 원에서 벗어나 높이로 멈추게 되며, 이는 주로 개별 밀도에 따라 달라집니다. 두 가지 기준이 충족될 때 불균일 자기장의 최소에 국한된 물체의 다이내자기 부유가 가능합니다: 1) 입자의 자기 감수성은 주변 매체보다 작아야 하며, 2) 자기력은 입자의 부력력에 대항할 만큼 충분히 강해야 한다. 두 기준 모두 자기 완충에서 RBC를 일시 중단하고 작고 저렴하며 시판되는 영구 자석1을가진 강력한 자기장 그라데이션을 만들어 달성 할 수 있습니다. 중력방향을 따라 축상에 자기적으로 갇힌 입자의 평형 위치는 밀도(버퍼밀도에 비해), 자기 감수성(완충의 자기 감수성에 대한) 및 적용된 자기장의 시그니처에 의해 결정된다. 용액의 밀도와 자기 특성이 시스템 전반에 걸쳐 일정하기 때문에, 세포의 본질적인 밀도 특성은 덜 조밀한 세포에 비해 더 낮은 상승하는 조밀한 세포와 함께 세포의 부양 높이를 결정하는 주요 요인이 될 것이다. 이 방법은 밀도 측정을 위해 정밀하고 비율 측정 분석을 사용할 수 있는 두 개의 밀도 참조 구슬(1.05 및 1.2 g/mL) 집합을 사용합니다. 자기 용액의 농도를 변경하면 순환 세포의 밀도가 세포에 특정이므로 CBC에서 RBC와 같은 다른 세포 집단을 분리하여 격리 프로토콜 또는 기타 세포 조작의 필요성을 제거할 수 있습니다.
생물학 연구에 사용되는 검출 방법의 대부분은 선형 신호를 정량화하기 쉬운 특정 결합 이벤트의 추정에 의존한다. 이러한 판독 방법은 종종 복잡하고 특수 장비 및 전담 과학 인력이 포함됩니다. 세포의 혈장 막또는 세포외 소포의 혈장 막에서 발견되거나 플라즈마에서 용해되는 항원의 검출을 겨냥한 접근법은 하나 또는 두 개의 항체 코팅 구슬을 사용하여 본원에 설명되어 있습니다. 구슬은 서로, 심문대상의 밀도가 서로 달라야 한다. 임의의 주어진 생체 유체에서 표적 항원의 존재는 검출 비드에 바인딩되는 항원 양성 세포의 부양 높이에 있는 특정, 측정 가능한 변화로 변환됩니다. 용해성 항원 또는 세포 외 소포의 경우, 비드 세포 복합체가 아닌 비드 비드 복합체를 형성하여 포획 및 검출 비드 모두에 바인딩됩니다. 부양 높이의 변화는 비드 셀 또는 비드 비드 복합체의 새로운 밀도에 따라 달라집니다. 생물유체에서 항원의 존재를 나타내는 복합체의 부양 높이의 변화 외에도, 복합체의 수는 표적의 양에도 의존하여 자기 적 발화를 하는 것 또한 항원검출(24)에대한 정량적 접근법이다.
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Protocol
이 연구에서 사용된 실험 프로토콜은 베스 이스라엘 Deaconess 의료 센터 기관 검토 위원회 (IRB)에 의해 승인되었습니다.
1. 악기 설정
참고: 이미징 부양 세포는 자기장을 생성하기 위해 서로 마주보고 동일한 극으로 배치하기 위해 z 축에 자화 된 두 개의 희토류 네오디뮴 자석이 필요합니다. 자석 사이의 거리는 자기장의 강도와 대상의 밀도에 따라 사용자 정의 할 수 있습니다. 이 경우 자석은 50mm 길이의 1x1 mm 제곱 유리 모세관 튜브를 삽입하기에 충분한 1mm 공간으로 분리됩니다. 이 장치는 요청 시 사용할 수 있는 AutoCAD 설계를 사용하여 3D 인쇄되었습니다.
- 현미경을 측면에 완벽하게 수평으로 놓습니다.
참고: 표준 직립 위치에 배치된 현미경은 응축기 및 목표에 대하여 자석의 위치 때문에 응고물 객체를 화상 진찰에 직접 적당하지 않습니다. 이러한 제한은 현미경을 측면에 배치하여 우회할 수 있으며, 완벽하게 수평으로 응축기가 모세관에 빛을 집중할 수 있게 하고, 객관적인 렌즈는 Köhler 조명 요구 사항을 유지하면서 자석 사이에 부풀어 올리는 세포를 이미지화할 수 있습니다. - 2~3개의 랩 잭을 사용하여 브레드보드 테이블에서 스탠드를 지원하고 레벨.
- 진동을 제한하려면 고무 가미 된 발로 브레드 보드 테이블을 지원합니다.
- 스테이지를 제거하고 부양장치(y축)의높이를 조정하기 위한 컴팩트한 랩 잭과 2개의 단일 축 번역 단계로 교체한다. 초점(z축)을조정하기 위한 것, 그리고 두 번째는 모세관 튜브를 스캔한다.
- 두 개의 미니 시리즈 광학 포스트를 사용하여 자기 부상 장치를 실험실 잭에 부착합니다.
2. 카복시 미세 입자 / 구슬에 항체의 결합 (폴리안에 의해 프로토콜에서 수정)
참고: 저밀도 구슬(1.05g/mL)만 Rh(+) 검출을 위해 코팅해야 하지만, 세포외 소포를 검출하기 위해 고밀도 및 저밀도 구슬을 코팅합니다.
- 비드 서스펜션의 1 mg 상당을 꺼내 서 활성화 버퍼의 0.5 mL에 추가 (50 mM MES (MW195.2, 9.72 mg 에 1 mL)) pH 5.0 및 0.001% 폴리소르 바테-20).
- 갓 만든 1.5 M EDC (MW 191.7, 0.28755 g 1 mL)와 얼음 차가운 물에 0.3 M Sulfo-NHS (MW 217.14, 0.0651 g)의 12 μL을 추가하십시오.
- 궤도 셰이커에 튜브를 놓고 실온에서 1 시간 동안 격렬하게 흔들어 구슬에 카복실 그룹을 활성화하십시오.
- 결합 버퍼의 0.5 mL (10x PBS, 또는 0.1 M 인산염 pH 7-9)를 추가하여 1 시간 후에 활성화를 중지합니다.
- 10분 동안 20,000 x g에서 원심분리하여 구슬을 펠렛하거나, 구슬을 펠렛할 수 없는 경우 0.45 μm 원심분리기 튜브 필터를 사용합니다. 슈퍼나플로루를 흡인한다.
- 비드를 10x PBS 1mL로 3배, 2.5단계로 씻어낸다.
- mg 구슬 당 항체의 25 μg를 계산하고 10X PBS에서 0.7-1.0 mg/mL 최종 항체 농도로 활성화된 구슬과 원하는 항체를 혼합합니다.
- 튜브를 저속으로 설정된 튜브 로커에 놓습니다. 커플링을 위해 밤새 실온에서 튜브를 부드럽게 굴려보십시오.
- 2.5단계를 반복하고 10x PBS의 1mL로 구슬을 두 번 씻으세요.
- 완충 pH 8.0에서 0.5mL(98% 재고 = 16.2M)로 세척하여 실온에서 1시간 동안 1h로 부드럽게 흔들어 주세요.
- 2.5단계를 반복하고 DPBS 의 1mL에서 한 번 구슬을 씻으세요. 구슬은 필요할 때까지 4°C에서 DPBS의 200 μL에 보관할 수 있습니다.
참고: 프로토콜은 여기에서 일시 중지할 수 있습니다.
3. Rh (+) 검출을 위한 혈액 의 수집 및 준비
- 한 번의 클릭 으로 랜싱 장치를 사용하여 Rh (+) 기증자의 손가락을 찌르고 10 μL의 혈액을 DPBS 1 mL로 수집합니다.
- 형광 혈장 막 얼룩을 가진 Rh+ 세포를 얼룩. 선택적으로, Rh+ 세포의 1mL 현탁액에 형광 염료 1μL을 추가합니다(1:1000 희석).
- 15 분 동안 37 °C에서 형광 염료로 세포를 배양합니다.
- 15s용 5,600 x g에서 회전하여 세포를 펠렛하고 DPBS 1mL을 사용하여 3번 세척합니다. 칼슘과 마그네슘 (HBSS ++)과 HBSS의 1 mL에서 다시 중단.
- 원클릭 랜싱 장치를 사용하여 Rh(-) 기증자의 손가락을 찌르고 2 μL의 혈액을 수집합니다.
참고: 2개 이상의 조건을 준비하는 경우, 각 튜브에 1 μL의 혈액을 추가하기에 충분한 혈액을 모으십시오. - 필요한 실험 튜브를 준비하십시오 : 구슬 혼자, IgG 제어, 샘플.
- 비드만: HBSS++의 174 μL, IgG 제어 구슬 1μL, 고밀도 구슬 1μL(1.2g/mL), 500m MD 3+(60mMMM)의 24μL을 추가합니다.
- IgG 제어: HBSS++의 172 μL, IgG 대조구 1μL, 고밀도 구슬 1μL, Rh-혈액 1 μL, 스테인드 Rh+ 혈액 현탁액 1μL, 500mM Gd3+의24 μL을 추가합니다.
- 샘플 튜브는 HBSS++의 172 μL, 항 RhD 코팅 구슬 1μL, 고밀도 구슬 1μL, Rh-혈액 1μL, 스테인드 Rh(+) 혈액 현탁액 1μL, 500m Gd3+의24 μL을 추가합니다.
참고: 고밀도 구슬을 참조하기 위해 Rh 샘플에 추가됩니다.
4. 세포 분리 데모를 위한 PMN 격리
- 호중구의 고립
- 40mL의 정맥혈액을 구연산 나트륨 6mL(0.15M, pH 5.5) 및 6%의 Dextran-70의 14mL을 포함하는 60mL 주사기에 그립니다.
- 퇴적물까지 50분 기다립니다.
- 피콜-파크 20mL 위에 버피 코트 세포를 천천히 겹쳐서 혈액 수집 튜브를 통해 50mL 튜브를 밀어 퇴적한 RPC로 오염을 피하십시오. 원래 혈액 수집 튜브에 남은 잔류 RBC로 오염을 최소화하기 위해 신선한 혈액 수집 세트를 사용하는 것이 좋습니다.
- 3,000 x g에서20 분 동안 원심 분리에 의해 버피 코트 세포를 펠렛. 호중구와 오염 RBC는 튜브의 바닥에 펠릿 것입니다. PBMC는 피콜-파크 위에 흰색 레이어를 형성합니다.
- 호중구를 새로운 50mL 튜브로 옮기십시오.
- 25초 동안 0.2% 콜드 NaCl 용액의 20mL로 호중구를 배양하고, 1.6%의 추가 20mL를 순으로 배양하여 잔류 RBC를 Lyse. NaCl의 최종 콘서트는 0.9 %(동위)여야 합니다.
- 3,000 x g에서10 분 동안 서스펜션원심분리.
- 상체를 제거하고 호중구를 원하는 농도로 되감습니다.
-
림프구의 격리
- 6웰 배양판에 5%의 열 비활성화 세럼으로 RPMI의 PBMC를 플레이트.
- 플레이트를 37°C에서 1시간 동안 배양합니다. 단핵구는 접시에 부착되며 림프구는 자유롭게 떠있을 것입니다.
- 림프구가 들어 있는 버퍼를 제거하고 RPMI로 두 번 세척합니다.
- 원하는 농도에서 림프구를 다시 중단합니다.
-
레이블 RPC, PMN, 림프구.
- 각 세포 유형에 다른 형광염으로 라벨을 부착하십시오. 각 염료형은 다른 채널에서 형광을 염색해야 합니다. 선택한 각 염료에 대한 제조업체의 지침을 따릅니다.
5. 보완 활성화를 통한 RBC 세포 외 소포 생성
- EDTA 튜브를 사용하여 정맥을 통해 전혈을 얻습니다.
- 백혈구 필터를 통해 혈액을 통과한 다음 원심분리기를 500 x g에서 3번 씩 10분 동안 적혈구를 분리합니다. HBSS++를 세척 버퍼로 사용합니다.
- 1.5mL 튜브에 100 μL 포장 된 RBC의 알리쿼트를 만들고 HBSS ++를 추가하여 1 mL로 볼륨을 구성합니다.
- HbSS++에서 0.18 μg/mL 최종 농도에 C5b,6을 추가한 다음 소용돌이를 넣습니다.
- 실온에서 15분 동안 슬로우 셰이커를 착용하십시오.
- 0.2 μg/mL의 최종 농도에 C7 단백질을 추가합니다. 튜브를 몇 번 부드럽게 반전시켜 섞는다. 이 시점에서 앞으로 소용돌이하지 마십시오.
- 튜브를 실온에서 5분 동안 저속으로 설정된 튜브 셰이커에 놓습니다.
- C8 단백질을 0.2 μg/mL, C9 단백질을 0.45 μg/mL에 추가합니다. 튜브를 몇 번 부드럽게 반전시켜 섞는다.
- 37 °C에서 30 분 동안 배양하십시오.
- 10 분 동안 10,000 x g에서 튜브를 원심 분리합니다.
- 새로운 튜브에서 EV 함유 상체를 수집합니다. 셀 펠릿에 너무 가까이 있는 상체를 제거하지 마십시오.
6. 자기 부상 장치의 세포 분석
- 제조업체 지침에 따라 계측기 시동을 수행합니다.
- 튜브가 채워질 때까지 50 μL의 샘플을 모세관 튜브에 적재합니다. 모세관 실란트로 모세관 관의 끝을 밀봉하여 기포가 없는지 확인하십시오.
- 모세관 튜브를 상단과 하단 자석 사이의 홀더에 적재합니다. 스테이지와 포커스를 조정하여 최적의 시청을 할 수 있습니다.
참고: 세포/구슬은 밀도와 GD3+의농도에 따라 자기 평형 위치에 도달하기 위해 5-20 분에서 어디서나 걸릴 수 있습니다. Gd3+의농도가 높을수록 시간이 짧아지수 있습니다.
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Representative Results
자기 부상은 물체의 밀도, 자기 서명, 파라마그네틱 용액의 농도 및 두 개의 강한 희토류 자석에 의해 생성된 자기장의 강도에 따라 서로 다른 굴밀도의 물체를 집중시킵니다. 두 자석이 서로 위에 놓이기 때문에, 시료를 부유시키는 것은 Köhler 조명을 유지하면서, 그 측에 켜진 현미경을 사용하여 볼 수 있습니다(도 1). 각 세포 유형에 의해 도달된 최종 부양 높이는 파라마그네틱 용액의 농도를 변경하여 쉽게 변형될 수 있다. 도 2는 가돌리늄의 다양한 농도를 이용하여 상이한 순환 혈액세포의 분리를 도시한다. 밀도가 다른 두 비드 유형(1.05 및 1.2 g/mL)은 밀도 부양 높이 및 크기 참조를 제공하는 데 사용되었습니다. 주어진 세포 유형의 부양 높이는 본질적인 밀도에 따라 달라지므로 자기 부상은 중요한조작(24)없이관심 있는 세포를 격리하는 직접적인 수단을 제공한다. 이 프로토콜의 주요 목적은 자기 부상의 능력을 입증하여 막 바운드 항원, 이 경우 Rh 인자, 순환적 혈구에 대한 존재를 검출하는 것이었습니다. 이 실험을 위해, 저밀도 구슬은 IgG 대조군 항체 또는 반대로 코팅되었다. 견본은 그 때 1:1000의 비율로 Rh (+)에서 혈액을 가진 Rh (-) 기증자에게서 혈액을 스파이크하여 준비되었습니다. 안티-RhD(+) 코팅된 구슬 또는 제어IgG 코팅 구슬은 혈액 샘플에 첨가되어 10분 동안 배양하였다. 도 3A는 어떤 비드 적혈구 복합체를 생성하지 않은 IgG 대조군 샘플을 나타낸다. 다음으로, Rh(+)-양성 구슬에 의해 포획된 적혈구의 정체는 형광 혈장 막 얼룩으로 Rh(+) 세포를 전염색한 다음 형광 현미경 검사법(도3B)을사용하여 이미지화함으로써 검증되었다. 양수 검출 이벤트는 도 3C에표시됩니다. Rh(+) 세포에 대한 항-Rh-bead의 결합은 구슬과 셀 사이의 밀도를 가진 구슬 세포 복합체를 생성하므로 언바운드 캡처 구슬과 음의 RbC 사이에 위치한 높이로 부풀어 오르게 됩니다. 비드 세포 복합체의 클로즈업은 형광광으로 심화되어 형광 혈장 막 얼룩으로 표지된 Rh(+) 세포의 존재를 확인하였다. (그림3D). 도 3E는 CR1 및 CD47용 항체로 코팅된 고밀도 구슬과 저밀도 구슬 사이에 형성되는 구슬 복합체를 보여 주며, 이는 세포외 소포의 존재를 나타낸다. 비드 셀 복합체의 회로도는 도 3F에도시된다.
그림 1. 자기 의 성력의 원리 : (A)자기장의 회로도. (B)모세관관에서 표적을 측면 이미징할 수 있도록 연구 학년 현미경이 측면에 기울어져 있다. (C)현미경 목표 하에서 자기 부상 장치의 각진 보기. (D)자기 부상 장치 정면 보기. (E)두 자석, 전면 및 측면 보기 사이에 장착 된 모세관 튜브가있는 자기 부상 장치의 회로도. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2. 세포별 밀도 평형의 데모: (A)저밀도 구슬(1.05 및 1.2 g/mL)에서 단독으로 60mM Gd3+(10배 목표에서 조회). (B)PMN은 21 mM Gd3+에서적혈구 위에 부풀어 오며, 초점 혈소판순환(10배 목표에서 본). (C)전혈은 60mM Gd3+에서부유하며, 이는 RBC에 초점을 맞춘 농도(10배 목표에서 볼 수 있음). (D)이 수치는 [타소글루, S. 외)에서 수정되었습니다. 측두 해상도의 부양 이미지 세포측정. 고급 재료. 27 (26), 3901-3908, doi:10.1002/adma.201405660 (2015)] 40mM Gd3+에서RBC(빨간색), PMN(녹색) 및 림프구(파란색)의 밀도 분리. 각 세포 인구는 본질적인 밀도(10배 목표에서 볼 수 있음)에 기초하여 높이로 부풀어 올랐다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3. 혈액 샘플에서 Rh 인자의 검출: (A)Rh (-) 혈액은 Rh (+) 혈액및 IgG 대조구로 스파이크. 비드 셀 복합체가 형성되지 않습니다(10배 목표에서 볼 수 있음). (B)광등 하에서 IgG 제어 샘플이 Rh(+) 세포를 강조한다(10배 목표에서 본). (C)Rh(-) 혈액은 Rh(+) 혈액과 항 RhD 코팅 구슬로 스파이크되어 비드 세포 복합체의 형성을 보여준다(10배 목표). (D)형광등 하에서 비드 셀 복합체의 클로즈업 뷰(10배 목표에서 본). (E)항-CR1 및 안티 CD47 코팅 구슬 형성 복합체, RBC 파생 세포 외 소포의 존재를 나타내는 (10 배 목표에 볼). (F)비드 셀 복합체를 묘사한 다이어그램. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
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Discussion
그라데이션 원심분리는 현재 고유한 밀도를 기반으로 하위 셀룰러 구성 요소를 격리하는 표준 기술입니다. 그러나 이러한 접근 방식은 전문 그라데이션 미디어와 원심분리기 장비를 사용해야 합니다. 여기에 제시된 자기 부양 접근법은 순환 세포의 형태학적 및 기능적 특성에 대한 상세한 조사를 최소한으로 허용하며, 세포의 조작이 있는 경우 순환 세포에 대한 생체 내 접근을 제공한다.
그러나 자기 부상을 사용할 때 몇 가지 점을 언급 할 가치가 있습니다. 첫째, 이미징에 사용되는 현미경은 설정이 시간이 많이 걸리기 때문에 이 방법에 전념해야 하며, 현미경이 부분적으로 분해되고 자석과 모세관 튜브와 정확하게 정렬된 광학과 수평으로 완벽하게 배치되어야 합니다. 둘째, 실험실 잭과 모세관 유리의 움직임을 조정하는 데 사용되는 번역 단계와 초점은 세 축 각각에 정확한 위치와 자유로운 움직임이 필요합니다. 아마도 전체 설정의 가장 중요한 정렬은, 상단 및 하단 자석이 완벽하게 수평뿐만 아니라 중력 벡터와 완벽하게 정렬되는 것을 번역 단계에서 자기 부양 장치를 장착한다. 이러한 요구 사항에서 임의의 편차는 모세관관의 양쪽으로 세포를 밀어 내고, 부양 과정을 방해하고, 결과를 신뢰할 수 없게 만드는 자기력과 중력 사이의 각도를 만들 것입니다.
세포를 부양하는 데 사용되는 가돌리늄 용액의 최적의 농도는 세포 유형 및 실험 목표에 맞게 조정되어야 합니다. 가돌리늄 용액의 농도의 변화는 분석되는 세포의 부양 높이를 크게 변화시킬 것이고, 따라서 한 실험 세트에서 다른 실험으로 일정하게 유지되어야 한다. 농도가 너무 낮으면 표적 세포의 밀도에 따라 전혀 부양되지 않을 수 있으며, 너무 높으면 정확하게 정량화될 수 있는 검출 가능한 변화의 범위를 제한할 수 있다.
그(것)들에 작용하는 유일한 힘이 중력과 자기 반발인 경우에 구조물을 부양하는 것은 안정한 밴드를 만듭니다. 모세관 관에 밀리미터 크기의 거품이 있으면 공기 액체 인터페이스에서 작은 원형 전류가 생성되어 부유 세포를 방해하여 분석이 사실상 불가능합니다. 샘플을 모세관 튜브에 적재한 다음 밀봉 한 후에 는 스테레오 현미경 또는 저전력 (4x) 목표하에서 모세관을 검사하여 공기가 존재하지 않도록해야합니다.
설정된 높이에서 세포의 부양은 시간이 지남에 따라 동일하게 유지되는 자기 시그니처에 따라 달라집니다. 부양 매체로부터의 파라마그네틱 가돌리늄 이온이 세포에 유입되면, 세포 세포에 피노세포증 또는 증막 투과성을 통해, 멸토증 시와 같은 증가된 막 투과성을 통해, 밀도 기준 비드에 기초하여 측정된 증가된 세포 밀도는 잘못될 것이다. 다행히도, 순환 세포의 대부분은 가난한 피노사이클 능력(26)을가지고, 이 방법은 오랜 기간 동안 세포를 공부하기위한 적절한 접근 방식을 만들기.
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Disclosures
저자는 공개 할 충돌이 없습니다.
Acknowledgments
저자는 세포 외 소포 작업에 대한 그의 도움에 대한 박사 Getulio 페레이라에게 감사드립니다.
이 작품은 ICG에 다음과 같은 국립 보건 원에 의해 지원되었다: RO1CA218500, UG3HL147353, UG3TR002881.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 2-(N-Morpholino)ethanesulfonic acid hydrate | Sigma Aldrich | M-2933 | (MES); component of activation buffer |
| 50x2.5x1 mm magnets, Nickel (Ni-Cu-Ni) plated, grade N52, magnetized through 5mm (0.197") thickness | K&J Magnetics | Custom | Magnets used for the magnetic levitation device |
| Capillary Tube Sealant (Critoseal) | Leica Microsystems | 267620 | Used to cap the ends of the capillary tubes |
| Centrifuge tube filters (Corning Costar Spin-X) | Sigma Aldrich | CLS8163 | Used to wash beads |
| Compact Lab Jack | Thorlabs | LJ750 | Used for adjusting the magnetic levitation device |
| DPBS, no calcium, no magnesium | Gibco | 14190-144 | Solution for bead suspensions |
| Ethanolamine | Sigma Aldrich | E9508-100ML | Used during a wash step for beads |
| Fluorescent Plasma Membrane Stain (CellMask Green) | Invitrogen | C37608 | Used to stain Rh+ cells |
| Gadoteridol Injection | ProHance | NDC 0270-1111-03 | Gadolinium (Gd3+); magnetic solution used to suspend cells |
| HBSS++ | Gibco | 14025-092 | Solution for sample preparation |
| Human C5b,6 complex | Complement Technology, Inc | A122 | Used to generate RBC Evs |
| Human C7 protein | Complement Technology, Inc | A124 | Used to generate RBC Evs |
| Human C8 protein | Complement Technology, Inc | A125 | Used to generate RBC Evs |
| Human C9 protein | Complement Technology, Inc | A126 | Used to generate RBC Evs |
| Mini Series Post Collar | Thorlabs | MSR2 | Used to secure magnetic levitation device to lab jacks |
| N-(3-Dimethylaminopropyl)-N′-ethylcarbodiimide hydrochloride | Sigma Aldrich | E1769-10G | (EDC); used in antibody coupling reaction |
| Normal Rabbit IgG Control | R&D Systems | AB-105-C | Used to coat beads as a control condition |
| Phosphate Buffered Saline (10X Solution, pH 7.4) | Boston Bioproducts | BM-220 | Component of coupling buffer, used for washing steps |
| Polysorbate 20 (Tween 20) | Sigma Aldrich | P7949-500ML | Component of activation buffer |
| Polystyrene Carboxyl Polymer | Bangs Laboratories | PC06004 | Top density beads (1.05 g/mL), used for antibody coupling |
| Rabbit RhD Polyclonal Antibody | Invitrogen | PA5-112694 | Used to coat beads for the dectection of Rh factor in red blood cells |
| Research Grade Microscope | Olympus | Provis AX-70 | Microscoped used to mount magnetic levitation device and view levitating cells |
| Rubber Dampening Feet | Thorlabs | RDF1 | Used to support the breadboard table |
| Square Boro Tubing | VitroTubes | 8100-050 | Capillary tube used for loading sample into Maglev |
| Sulfo-NHS | Thermoscientific | 24510 | Used in antibody coupling reaction |
| Translational Stage | Thorlabs | PT1 | Used for focusing and for scanning capillary tube |
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