Summary
Evnen til præcist at opdage neuromuskulære krydskomponenter er afgørende for at evaluere ændringer i sin arkitektur på grund af patologiske eller udviklingsmæssige processer. Her præsenterer vi en komplet beskrivelse af en enkel metode til at opnå billeder i høj kvalitet af hele monterede neuromuskulære kryds, der kan bruges til at udføre kvantitative målinger.
Abstract
Det neuromuskulære kryds (NMJ) er et specialiseret kontaktpunkt mellem motornerven og skeletmusklen. Denne perifere synapse udviser høj morfologisk og funktionel plasticitet. I mange nervesystem lidelser, NMJ er en tidlig patologisk mål resulterer i neurotransmission fiasko, svaghed, atrofi, og selv i muskelfibre død. På grund af dens relevans kan muligheden for kvantitativt at vurdere visse aspekter af forholdet mellem NMJ-komponenter hjælpe med at forstå de processer, der er forbundet med dens samling / demontering. Den første hindring, når du arbejder med muskler, er at få den tekniske ekspertise til hurtigt at identificere og dissekere uden at beskadige deres fibre. Den anden udfordring er at bruge højkvalitetsdetekteringsmetoder til at opnå NMJ-billeder, der kan bruges til at udføre kvantitativ analyse. Denne artikel præsenterer en trin-for-trin protokol til dissekering extensor digitorum longus og soleus muskler fra rotter. Det forklarer også brugen af immunfluorescens til at visualisere præ- og postsynaptiske elementer af hele mount NMJs. Opnåede resultater viser, at denne teknik kan bruges til at etablere synapsisens mikroskopiske anatomi og identificere subtile ændringer i status for nogle af dens komponenter under fysiologiske eller patologiske forhold.
Introduction
Pattedyret neuromuskulære krydset (NMJ) er en stor cholinrgic trepartssynapse består af den motoriske neuron nerve slutter, den postsynaptiske membran på skeletmuskel fiber, og terminalen Schwann celler1,2,3. Denne synapse udviser høj morfologisk og funktionel plasticitet4,5,6,7,8, selv i voksenalderen, når NMJs kan gennemgå dynamiske strukturelle ændringer. For eksempel har nogle forskere vist, at motornerveender løbende ændrer deres form ved mikrometerskalaen9. Det er også blevet rapporteret, at NMJ's morfologi reagerer på funktionelle krav, ændret brug, aldring, motion eller variationer i lokomotorisk aktivitet4,10,11,12,13,14,15. Således er træning og manglende brug vigtig stimulus til at ændre nogle egenskaber ved NMJ, såsom dens størrelse, længde, spredning af synaptiske vesikler og receptorer samt nerveterminalforgrening14,16,17,18,19,20.
Desuden har det vist sig, at enhver strukturel ændring eller degeneration af dette vitale kryds kan resultere i motor neuron celledød og muskelatrofi21. Det menes også, at ændret kommunikation mellem nerver og muskler kan være ansvarlig for de fysiologiske aldersrelaterede NMJ-ændringer og muligvis for dets ødelæggelse i patologiske tilstande. Neuromuskulære krydset demontering spiller en afgørende rolle i starten af Amyotrofisk Lateral Sklerose (ALS), en neurodegenerativ sygdom, der udgør et af de bedste eksempler på nedsat muskel-nerve samspil3. På trods af de mange undersøgelser udført på motor neuron dysfunktion, er det stadig diskuteres, om forringelsen observeret i ALS opstår på grund af den direkte skade i motor neuron og derefter strækker sig til cortico-spinal fremskrivninger22; eller hvis det bør betragtes som en distal axonopati, hvor degeneration begynder i nerveender og skrider frem mod motor neuron somas23,24. I betragtning af kompleksiteten af ALS-patologi er det logisk at overveje, at der opstår en blanding af uafhængige processer. Da NMJ er den centrale aktør i det fysiopatologiske samspil mellem muskler og nerve, repræsenterer dets destabilisering et omdrejningspunkt i sygdommens oprindelse, der er relevant at analysere.
Pattedyrets neuromuskulære system er funktionelt organiseret i diskrete motorenheder, der består af en motorisk neuron og muskelfibrene, der udelukkende er innerveret af nerveterminalen. Hver motorenhed har fibre med lignende eller identiske strukturelle og funktionelle egenskaber25. Motor neuron selektiv rekruttering gør det muligt at optimere muskelrespons på funktionelle krav. Nu er det klart, at pattedyr skeletmusklerne er sammensat af fire forskellige fibertyper. Nogle muskler er navngivet i henhold til egenskaberne ved deres mest rigelige fibertype. For eksempel bærer soleus (en bageste muskel i bagbenet, der er involveret i vedligeholdelsen af kropsholdningen) et flertal af langsomme trækenheder (type 1) og anerkendes som en langsom muskel. I stedet er extensor digitorum longus (EDL) hovedsageligt sammensat af enheder med lignende hurtige rykegenskaber (type 2 fibre) og er kendt som en hurtig muskel specialiseret til gradvise bevægelser, der er nødvendige for bevægelse. Med andre ord, selvom voksne muskler er plastiske på grund af de hormonelle og neurale påvirkninger, bestemmer dens fibersammensætning evnen til at udføre forskellige aktiviteter, som det ses i soleus, der oplever kontinuerlig lavintensitetsaktivitet og EDL, der udviser et hurtigere enkelt ryk. Andre funktioner, der er variable blandt forskellige typer muskelfibre, er relateret til deres struktur (mitokondrieindhold, udvidelse af sarcoplasmic reticulum, tykkelsen af Z-linjen), myosin ATPase-indhold og myosin tung kædesammensætning26,27,28,29.
For gnaver NMJs er der betydelige forskelle mellemmusklerne 28,29. Morfometriske analyser udført i soleus og EDL fra rotter afslørede en positiv sammenhæng mellem synaptisk område og fiberdiameter (dvs. synaptisk område i soleus langsomme fibre er større end i EDL hurtige fibre), men forholdet mellem NMJ-området og fiberstørrelse er ens i begge muskler30,31. Også i forhold til nerveterminalerne var endepladens absolutte områder i type 1-fibre lavere end i type 2-fibre, mens normaliseringen af fiberdiameteren gjorde områder af nerveterminaler i type 1 fibre de største32.
Meget få undersøgelser fokuserer dog på morfometrisk analyse for at vise tegn på ændringer i nogle af NMJ-komponenterne33,34. På grund af NMJ's relevans i organismens funktion, hvis morfologi og fysiologi ændres i forskellige patologier, er det vigtigt at optimere dissektionsprotokoller for forskellige typer muskler med kvalitet nok til at muliggøre visualisering af hele NMJ-strukturen. Det er også nødvendigt at evaluere forekomsten af præ- eller postsynaptiske ændringer i forskellige eksperimentelle situationer eller tilstande som aldring eller motion35,36,37,38. Derudover kan det være nyttigt at bevise mere subtile ændringer i NMJ-komponenter som ændret neurofilamentphoosphorylation i terminalnervenenderne som rapporteret i ALS39.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne i den nationale lov nr. Protokollen blev godkendt af Det Institutionelle Etiske Udvalg (CEUA IIBCE, protokol nr. 004/09/2015).
1. Muskeldissektion (dag 1)
BEMÆRK: Før du starter, skal du lave 40 mL 0,5% paraformaldehyd (PFA), pH 7,4 i Dulbeccos fosfatsaltlinje (DPBS). Du kan også lave 20 mL på 4% PFA. Der tilberedes 5 mL aliquots, og der fryses ved -20 °C. På dissektionsdagen afrim en 4% aliquot og tilsæt 35 mL DPBS for at opnå 40 mL på 0,5% PFA.
-
Isolering af EDL (hurtig-twitch muskel)
- Aflive en rotte. Placer dyret med maven opad. Lav et indledende snit ved hjælp af et kirurgisk blad mellem tæerne mod bagbenet.
BEMÆRK: I dette tilfælde blev der givet en intraperitoneal injektion på 90:10 mg/kg ketamin:xylazin for at aflive rotten, men andre muligheder for anæstesi er også tilladt. - Skræl huden af, træk den opad, indtil rotte knæet er udsat.
- For at finde EDL, følg foden sener op til ringformede ledbånd. Dette ledbånd kredser to sener. Skær ledbåndet mellem de to sener med uniband saks (eller lignende). Identificer EDL senen ved at løfte begge dele og vælg den, der får tæerne til at bevæge sig opad.
- Skær senen med uniband saks. Derefter, mens du holder senen med fine biologiske pincet, begynder at langsomt adskille EDL muskel fra tibialis forreste, peroneus brevis, og peroneus longus40 (se figur 1A).
BEMÆRK: Sørg for, at musklen er adskilt uden skader. Gør dette ved at skære resten af sidemusklerne for at åbne en sti mellem dem (EDL har ikke en overfladisk placering), mens du holder og løfter EDL-musklen. - For helt at isolere musklen skal du skære senen fastgjort til rotte knæet med uniband saks.
- Den dissekerede muskel nedsænkes i 5 mL på 0,5% PFA og efterlades i 24 timer ved 4 °C. Eventuelt hæfte musklen i et stykke pap og drej den med musklen nedad. Derefter nedsænkes det helt i 8 ml af den fiksative opløsning. Dette trin hjælper med at opretholde musklen langstrakt under fikseringsprocessen.
- Aflive en rotte. Placer dyret med maven opad. Lav et indledende snit ved hjælp af et kirurgisk blad mellem tæerne mod bagbenet.
-
Isolering af soleus (muskel med langsom ryk)
- Vend dyret (maven vender nu nedad). Gennem huden skæres calcaneal senen ved hjælp af et kirurgisk blad.
- Ved hjælp af den biologiske pincet og uniband saks adskilles gastrocnemiusmusklen fra knoglerne, hvilket skaber et "muskuløst låg". Soleus vil være på den indvendige side af muskellåget. Det kan identificeres, fordi det er rødt i farve og har en flad morfologi.
- Med et par biologiske pincet, nå og løfte soleus senen, der ligger over gastrocnemius (se figur 1B).
- Skær senen med uniband saks. Løft hele musklen, mens du skærer nogle af de svage fastgørelsespunkter (dvs. neurovaskulære elementer). Endelig, helt at frigøre soleus muskel, skære soleus fascicle, der danner calcaneal senen med uniband saks.
- Gentag trin 1.1.6 for at rette dissekeret sålmuskel.
2. Drillet fiber forberedelse (Dag 2)
- Efter 24 timers fiksering skylles musklerne med 6 ml DPBS-opløsning 3x i 10 minutter hver, før muskelfibrene isoleres.
- For at isolere fibrene skal du sætte en muskel på et mikroskop dias. Ved hjælp af et stereomikroskop skal du forsigtigt holde en af senerne med et par biologiske pincet. Derefter begynder du med de andre biologiske pincet at klemme senen langsomt for at adskille muskelfibrene. Derefter trækker langsomt det klemte væv opad mod den modsatte muskel senen. Det vil være nødvendigt at gentage denne handling flere gange, indtil du får flere små, isolerede bundter.
- Placer dem omhyggeligt på en forbehandlet slide (silaniseret). Det er nødvendigt at holde alle fibrene i orden, så de ikke overlapper hinanden. På dette tidspunkt lufttørres fibrene i 24 timer.
3. Immunfluorescens
-
Primær antistofinkubation (dag 3)
BEMÆRK: Alle trin blev udført ved stuetemperatur, undtagen hvis andet er angivet. Den mest effektive måde at fjerne de forskellige løsninger uden at løsne fibre fra diaset er at bruge en insulinsprøjte.- For at starte immunostainingprocessen omkranser de tørrede isolerede muskelfibre med en pappen for at skabe en vandtæt barriere.
- For at hydrere muskelfibrene tilsættes 200 μL destilleret vand i 5 min. og derefter ændres vandet til 200 μL DPBS til de næste 5 min inkubation. På dette tidspunkt skal du starte immunfluorescensmærkningen.
- Inkuber fibre med 300 μL af en blokeringsbuffer (BB), der indeholder 50 mM glycin, 1% BSA og 1% Triton X-100 i 30 min.
- Bb erstattes med det primære antistof i en koncentration, som producenterne foreslår. Brug BB'en til at fortynde antistoffet. Dette forsøg anvendte 400 μL SMI 32 eller SMI 31, som anerkendte ikke-fosforinerede (Nf) eller fosforsyrede (Phos-Nf) neurofilamenter H ved 1/800 fortynding til påvisning af NMJ-præsynaptisk komponent.
BEMÆRK: Når du beslutter at genkende hele det præsynaptiske element i stedet for at evaluere neurofilamentphorylation, skal du vælge antistoffer mod synapsin, synaptophysin eller SV2a, der tidligere var med succes ansat. - Fibrene inkuberes med den primære antistoffortynding ved 4 °C natten over (eventuelt kan inkubation udføres ved 37 °C i 1 time). I begge tilfælde vil det være vigtigt at udføre inkubationen ved hjælp af et fugtigt kammer.
-
Immunfluorescens: Sekundær antistofinkubation (dag 4)
- Det primære antistof fjernes, og fibrene skylles 3x i 10 minutter hver med 500 μL DPBS og sidste gang med BB.
- Fjern denne sidste vask og tilsæt det fluorescerende mærkede sekundære antistof fortyndet i BB. Til dette forsøg blev der anvendt 500 μL gedantimus Alexa Fluor 488 ved 1/1000 fortynding i BB. For at se det postsynaptiske element i NMJs blev 1:300 α-Bungarotoxin (Btx) biotin-XX konjugat føjet til det sekundære antistoffortynding.
BEMÆRK: Tilføjelsen af Btx-biotin XX giver bedre signal-til-støj billeder, når opdaget med streptavidin, der forstærker signalet. Hertil kommer, streptavidin konjugation til forskellige fluorophores øget farvekombinationer i co-mærkning assays. Alternativt giver fluorescerende mærket Btx mulighed for at få billeder af lignende kvalitet. - Det sekundære antistof og Btx inkuberes i 2 timer ved stuetemperatur eller 1 time ved 37 °C, der er beskyttet mod lys.
- Det sekundære antistof og Btx. Vask 3x i 10 minutter hver med 500 μL DPBS og den sidste skylning med BB.
- Inkuber med 500 μL Streptavidin Alexa Fluor 555 ved 1/1000 fortynding med BB i 1 time ved stuetemperatur. På dette tidspunkt tilsættes om ønsket en sonde for at modvirke kernerne, såsom diaminophenylindole ved en endelig koncentration på 1 μg/mL.
- Inkubationsopløsningen fjernes, og fibrene vaskes 3x i 10 minutter hver med 500 μL DPBS. Derefter montere fibrene.
-
Montering
- Placer 4 prikker gennemsigtig neglelak på mikroskopet dias, som om de var knudepunkter i en firkant. Lad dem tørre 1-2 min. Disse vil være de punkter, hvor coverslips vil hvile, bidrage til at undgå væv knusning.
- Fjern den sidste DPBS vask og tilsæt nok monteringsmedier (~ 200 μL) til at dække fibrene; undgå tørring.
BEMÆRK: For at forberede 10 mL af monteringsmedieblandingen skal du bruge Tris-HCl 1,5 M pH 8,8: glycerol i en 4:1 (v:v). - Brug en 200 μL pipettespids til omhyggeligt at sprede monteringsmediet over fibrene for at sikre en fuldstændig nedsænkning af dem alle. Før du placerer dækglasset, skal du fjerne luftbobler.
- Placer coverlip på prøverne forsøger at forhindre generering af luftbobler. Denne bevægelse kan gøres ved hjælp af pincet.
4. Mikroskopi og morfometrisk analyse
- Billede de drillede fiber præparater ved hjælp af laser confocal mikroskopi.
- Tag en række optiske sektioner (30 μm Z-stakke) over hele synapsen med et interval på et mikrometer. Hvis du vil indstille stakken, skal du bruge Btx-signalet. Billede mindst 15-20 NMJs for hver muskel tilstand med en 2048 px x 2048 px opløsning. Denne metode blev valgt for at opnå billeder med tilstrækkelig optisk kvalitet og opløsning til morfometrisk analyse.
- Hvis du vil udføre målingerne, skal du bruge projektionsbillederne af stakke med enhver analysesoftware.
BEMÆRK: Selv om den forklarede morfometriske analyse blev udført manuelt, der er to nyligt udviklede Image J-baserede værktøjer til at studere mange forskellige aspekter af præ-og postsynaptiske NMJ morfologi33,34. - Hvis du vil hente værdierne i området Total NMJ, skal du markere den ydre kant (udvendig kontur af det farvede område, se Figur 2) af slutpladen ved hjælp af værktøjet Photoshop Magnetisk lasso og bestemme antallet af markerede pixel i histogrammets vindue. Derefter kan pixelområderne konverteres til firkantede mikrometer ved hjælp af den skala, der er angivet af confocal-softwaren.
- Med det samme lassoværktøj skal du markere den indre kant (konturer af det farvede område i endepladen, se figur 2) og bestemme det ikke-farvede område i hele strukturen (eller det tomme område) som beskrevet ovenfor (trin 4.4.). Værdierne for postsynaptisk område hentes, når det samlede areal trækkes fra det tomme område i hver NMJ.
- Opnå det præsynaptiske område, der er defineret som området med anti-neurofilament immunofluorescens, på samme måde som total NMJ-området.
BEMÆRK: Alle disse parametre blev brugt til at bestemme indekset for postsynaptisk tæthed (postsynaptisk areal/samlet areal) og NMJ-dækningen (forsynaptisk område/postsynaptisk område). Et højere postsynaptisk tæthedsindeks indebærer en tættere - eller mere kompakt - endplate, mens en mindre NMJ-dækning afspejler en meget dårligere interaktion mellem nerveterminal og endeplade (begge kompatible med en denervationsproces). Da fosforrylerede og ikke-fosforrelaterede former for neurofilamenter blev påvist på nerveterminalniveau, blev det fosfor-/ikke-fosforerede præsynaptiske signalforhold og fosfor-/ikke-fosforalte dækningsforhold beregnet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Denne protokol tilbyder en enkel metode til at isolere og immunostain muskelfibre fra to forskellige typer af muskler (hurtig-og langsom-ryk muskler, se figur 1). Ved hjælp af de korrekte markører og / eller sonder kan NMJ-komponenter påvises og evalueres siden et kvantitativt synspunkt for at vurdere nogle af de morfologiske ændringer, der kan opstå som følge af sygdomsprogression eller en bestemt lægemiddelbehandling. I denne undersøgelse blev præsynaptiske og postsynaptiske komponenter i NMJ fluorescerende mærket ved hjælp af henholdsvis anti-Nf- eller anti-Phos-Nf-antistoffer og Btx (figur 2, øverste paneler). Hvert konfokal billede i høj opløsning af en NMJ, der er opnået efter immunostainingen, blev anvendt til at bestemme de morfometriske målinger og indekser, der er specificeret i protokolafsnittet (tabel 1), under anvendelse af de parametre, der er beskrevet i de nederste paneler i figur 2.
For at demonstrere, at dette hele mount NMJ-præparat perfekt bevarede synapsearkitekturen, hvilket gjorde det muligt at visualisere den virkning, der har en progressiv nervesystemsygdom på det, blev drillede fibre af transgene rotter, der udtrykker det menneskelige gen SOD1G93A (en ALS-model), immunostained ved hjælp af protokollen (Figur 3). De sammenflettede billeder af præ- og postsynaptiske signaler med kernerne farvet med DAPI viste, at forskelle mellem NMJs mellem transgene og ikke-transgene aldersmatchede dyr er tydeligt synlige og forenelige med de resultater, der forventes af litteraturen.
Desuden gjorde billedernes kvalitet det muligt at kvantificere de ændringer, der blev observeret ved at udføre den morfometriske analyse. Figur 4 viser f.eks., at det postsynaptiske signal hos transgene dyr synes at være mere kompakt (ca. 20%), hovedsagelig på grund af reduktionen af NMJ's samlede areal.
På den anden side viser figur 5, at NMJs' præsynaptiske område hos transgene dyr også reduceres. Kvaliteten af dette hele NMJ-præparat blev dokumenteret ved at analysere omfanget af nerveterminalens tilbagetrækning og ved at opdage ændringer vedrørende neurofilamentphoosphorylationstilstande. Dette faktum vil være vigtigt at få en dyb indsigt i NMJ demontering proces i forbindelse med ALS sygdom i den anvendte model. Det mindste præsynaptiske område, der blev påvist, var det, der var mærket med antifosforileret neurofilamenter(figur 5B, E, C, F).
Anvendelsen af dækningsindekset (figur 6) gjorde det muligt at fastslå, at de transgene NMJs var delvist denervated. Det kunne også bestemme, at dækningsindekserne for fosforlateret neurofilament er lavere end det, der opnås med ikke-fosforlateret neurofilamenter. Disse resultater viser vedrørende status for hele mount NMJ, og at det kunne være nyttigt at indføre studiet af neurofilament phosphorylation tilstand (en vigtig determinant for glødetråd plasticitet og stabilitet) ved hjælp af denne hele mount NMJ præparat.
Endelig tilbyder metoder præsenteret i dette arbejde den største NMJ-kvalitet til at identificere, vurdere og evaluere selv subtile ændringer i NMJ som helhed eller i en af dens komponenter.
Figur 1: Anatomiske vartegn for EDL og soleus. Billedfremhævning (A) EDL og (B) soleus placering blandt de andre muskler i rottens nedre bagben. Insets viser ordninger af bagbenene muskler tæt på EDL (rød) og soleus (grøn) muskler. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Hele monterede neuromuskulære kryds af EDL-muskelfibre. (A) Postsynaptisk komponent af NMJ opdaget ved hjælp af alfa-bungarotoxin (Btx, magenta), en sonde, der binder specifikt til acetylkolinreceptorerne (AChR). (B) Motorterminal opdaget ved hjælp af anti-neurofilamenter (anti-Nf, grøn). (C,D) Synaptiske komponenter er skematiseret for at illustrere de parametre (ydre og indre kanter), der definerede de målinger (Total Area, Presynaptic og Postsynaptic Area), der bruges til den morfometriske analyse, der er beskrevet i protokollen. Skalalinje = 50 μm. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Før og eftersynaptiske ændringer observeret i NMJs af en ALS-model. Repræsentative konfokale billeder fra hele monterede NMJs opnået i præparater fra EDL muskelfibre farves til at opdage neurofilamenter (grøn), AChR (magenta) og kerne (blå) fra enten ikke-transgene (-/-) eller transgene (hSOD1G93A/-) rotter. (A,C) Ikke-transgene rotter har normal NMJ morfologi (kringleform), både når motorenden visualiseres ved hjælp af anti-Phos-Nf (A) eller anti-Nf (C). (B,D) Transgene rotter præsenterer mere kompakt postsynaptisk område og mindre præsynaptiske terminaler med en reduktion i neurofilamentphorylationssignalet. Skalastang = 50 μm.
Figur 4: Morfometrisk vurdering af NMJ-postsynaptisk element i EDL-muskler fra 180 dage gamle hanrotter hSOD1G93A rotter. Repræsentative konfokale billeder af postsynaptiske komponenter i (A,D) ikke-transgene og (B,E) transgene dyr. Evaluering af (C) postsynaptisk areal og (F) postsynaptisk tæthedsindeks i NMJs af ikke-transgene (faste kolonner) og transgene (stribede kolonner) dyr. Mens det postsynaptiske område blev reduceret en smule hos transgene dyr, steg det postsynaptiske indeks i større omfang og fremhævede graden af NMJ-komprimering som angivet ved reduceret samlet areal hos transgene dyr som vist i tabel 1. Skalastang = 50 μm. De repræsenterede data er gennemsnitlige ± SEM. (*) og (***) angivet p<0,05 og p<0,001. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Morfometrisk vurdering af NMJ-præsynaptisk element i EDL-muskler fra 180 dage gamle hanrotter hSOD1G93A rotter. I betragtning af betydningen af NMJ demontering i ALS sygdom blev kvaliteten af præparatet evalueret ved at analysere ikke kun omfanget af nerveterminalens tilbagetrækning, men også muligheden for at opdage ændringer i fosforyleringen af NMJ-præsynaptisk element. Repræsentative konfokale billeder af den præsynaptiske komponent i (A,D) ikke-transgene og (B,E) transgene dyr, der påvises ved hjælp af (A,B) anti-Phos-Nf- eller (D,E) anti-Nf-antistoffer. Vurdering af præsynaptiske områder afgrænset af (C) fosforinerede og (F) ikke-fosforerede neurofilamenter i NMJs af ikke-transgene (faste kolonner) og overførige (stribede kolonner) dyr. Bemærk, at disse områder er meget ens i ikke-transgene dyr, mens de udgør en betydelig reduktion i NMJs af transgene dyr. Skalastang = 50 μm. Repræsenterede data er gennemsnitlige ± SEM. (****) angivet p<0.0001. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Evaluering af innervation status på hele mount NMJs af EDL hSOD1G93A fibre. Dækningsindekset bruges i vid udstrækning til at evaluere innervationens tilstand. Det vurderes, at NMJs med "fuldt innerveret" udgør et 
dækningsindeks på 50%, mens de "delvist innerverede" har dækninger mellem ≥20% og ≤50%, og de ledige betragtes som "denervated". Repræsentative konfokale billeder af (A,D) ikke-transgene og (B,E) transgene NMJs, der viser præsynaptiske og postsynaptiske elementer, der påvises ved hjælp af (A,B) anti-Phos-Nf eller (D,E) anti-Nf antistoffer til at observere motorterminalen. Vurdering af dækningen ved hjælp af (C) fosforinerede og (F) ikke-fosforerede neurofilamenter i NMJs af ikke-overskritiske (faste kolonner) og overførte (stribede kolonner) dyr. Billederne og grafikken viser tegn på, at NMJs fra transgene dyr udgør et lavere dækningsindeks end ikke-transgene. Desuden er dækningsindekserne for fosforlaterede neurofilamenter lavere ( 18 %) for transgene dyr end dem, der opnås ved påvisning af den ikke-fosforerede form ( 25 %). Dette bekræftes af forholdet mellem de to indekser som vist i tabel 1. Bemærk, at kvaliteten af præparaterne giver mulighed for at opnå 50% af dækningsindekset fastsat for NMJs forventes som "fuldt innerveret". Skalastang = 50 μm. Repræsenterede data er gennemsnitlige ± SEM. (***) og (****) angivet p<0.001 og p<0.0001. Klik her for at se en større version af dette tal.
Tabel 1. Morfometriske parametre og nøgletal opnået fra hele monterede NMJs af ikke-transgene og transgene EDL-fibre. Klik her for at hente denne tabel.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne artikel præsenterer vi en detaljeret protokol for dissektion af to rotte skeletmuskler (en langsom-twitch og den anden hurtige ryk), fiber muskelisolering og immunfluorescens påvisning af præ- og postsynaptiske markører for kvantitativt at vurdere NMJ-ændringer samt samling / demonteringsprocesser. Denne form for protokol kan være nyttig i gnavermodeller41,42 til evaluering af NMJ under fysiologiske eller patologiske processer som eksemplificeret her i en model af motorisk neurondegeneration som fundet i ALS hSOD1G93A rotter.
For at opnå succes og gavnlige resultater er det nødvendigt at huske på nogle tip. For eksempel tillader den beskrevne protokol øjeblikkelig brug af dissekerede muskler. Men når det er nødvendigt for at bevare musklen længere brugen af DPBS med 0,05% natrium azide plus 4 °C opbevaring giver forlænge fremragende muskel bevarelse op til 4 uger. Når du bruger denne mulighed, skal der udføres omfattende vaske med DPBS (5x, 10 min hver), før farvningsprocessen påbegyndes. En anden nyttig mulighed for at opnå billeder af god kvalitet omfatter sænkning af PFA-koncentrationen ved 0,5%, fordi det reducerede muskel autofluorescens. Dette skal ledsages af længere fiksering op til 24 timer ved 4 °C.
Med hensyn til fiberisolering producerer mindre grupper af fibre bedre immunodetection kvaliteter. Fibrene tørret på silaniserede dias skal anvendes inden for 2 til 3 dage. Efter denne tid er immunodetections ikke af god kvalitet.
Et alternativ til tørrede fibre på silaniserede dias er at generere et sæt delvist isolerede fibre, der holdes sammen af senenvævet i en af fibrenes ende (en "tuft" af muskelfibre) og udføre inkubationer i mikrocentrifugerør ved hjælp af den "fritflydende" metode. Brug af denne mulighed er nødvendig for at øge antistofinkubationstiden med flere timer (24-48 timer) samt antallet af vaske (mindst 6 af 10 min hver).
I forhold til fiberisolering uden skade er det nødvendigt at udføre "drille" ved at fjerne enderne, hvor senen forsigtigt trækkes i modsatte retninger for at opnå fiberadskillelse.
Et andet kritisk skridt til at forbedre immunodetection er tilsætning af 1% Triton X-100 og 50 mM glycin i BB. Dette er vigtigt for at opnå præparater, der har homogen farvning og lidt baggrund. Det er også værd at nævne, at det kan være gavnligt at have en lille baggrund, når ikke-indgroede fibre skal afbildes. Fiberdiameteren er god til at blive målt langt fra NMJ-feltet, da det beskrives, at den kan øges på dette niveau. Derfor bestemmes fiberdiameteren i en afstand svarende til værdien af en NMJ-profil.
Ved hjælp af den præsenterede procedure er det muligt at identificere og kvantificere NMJ-komponenter under fysiologiske forhold. Det giver også mulighed for at studere tidlige vigtige patologiske hændelser som NMJ demontering24 og tab af fosforlateret neurofilament i terminalender39 som beskrevet i ALS patogenese. Af denne grund tilbyder den beskrevne protokol en alternativ og enkel tilgang til at hjælpe med at få en bedre forståelse af NMJ-remodeling, hvilket tyder på, at morfologiske træk visualiseret kan være nyttige værktøjer til at diagnosticere degenererende tilstand af NMJs eller til at vurdere forskellige terapeutiske tilgange. Det gælder også for andre sygdomsmodeller som dem i Charcot-Marie-Tooth41 og spinal muskelatrofi42, der udgør NMJ-forstyrrelse.
Derudover kan tilgange, der er beskrevet i dette arbejde, anvendes til at identificere De Schwann-celler, der integrerer denne trepartssynapse og i sidste ende at vurdere nogle af dens roller under NMJ-ombygning43. Undersøgelser kan udføres i nyfødte, indtil voksne, under fysiologiske forhold eller som en reaktion på forskellige behandlinger, der påvirker det neuromuskulære system.
Endelig, på trods af den fremragende håndtering er nødvendig for at dissekere og mærke prøver sammen med tid, der forbruges til at foretage manuelle målinger, metode præsenteret her muliggør en optimal mærkning af de forskellige NMJ komponenter på grund af den lettede indtrængen af antistoffer og sonder. Selvom bedre penetration kan opnås i sektionsopdelede muskelpræparater, bevarer drilleri 3D morfologisk integritet af alle de synaptiske komponenter, der kan gå tabt i muskelsektioner. Det undgår også alle de forberedelser, der er nødvendige for at lave sektioner som inkludering af muskelstykket og yderligere antigenudtagning for at opnå mulig anerkendelse. Desuden, sammenlignet med hele mount præparater, der bevarer den komplette innervation mønstre, drilleri gør det muligt at studere isolerede fibre. Dette kan være en betydelig fordel, når det er nødvendigt for at vurdere fiber heterogenitet rapporteret i patologiske forhold.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har intet at afsløre.
Acknowledgments
Mange tak til CSIC og PEDECIBA for den finansielle støtte til dette arbejde. til Natalia Rosano for hendes manuskript rettelser; til Marcelo Casacuberta, der gør videoen og til Nicolás Bolatto for udlån hans stemme for det.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Stereomicroscope with cool light illumination | Nikon | SMZ-10A | |
| Rocking platform | Biometra (WT 16) | 042-500 | |
| Cover glasses (24 x 32 mm) | Deltalab | D102432 | |
| Premium (Plus) microscope slides | PORLAB | PC-201-16 | |
| Tweezers | F.S.T | 11253-20 | |
| Uniband LA-4C Scissors 125mm | E.M.S | 77910-26 | |
| Disponsable surgical blades #10 | Sakira Medical | 1567 | |
| Disponsable sterile syringe (1 ml) | Sakira Medical | 1569 | |
| Super PAP pen | E.M.S | 71310 | |
| 100 μl or 200 μl pipette | Finnpipette | 9400130 | |
| Confocal microscope | Zeiss | LSM 800 - AiryScan | |
| NTac:SD-TgN(SOD1G93A)L26H rats | Taconic | 2148-M | |
| 1X PBS (Dulbecco) | Gibco | 21600-010 | |
| Paraformaldehyde | Sigma | 158127 | |
| Triton X-100 | Sigma | T8787 | |
| Glycine | Amresco | 167 | |
| BSA | Bio Basic INC. | 9048-46-8 | |
| Glycerol | Mallinckrodt | 5092 | |
| Tris | Amresco | 497 | |
| Purified anti-Neurofilament H (NF-H), Phosphorylated Antibody | BioLegend | 801601 | Previously Covance # SMI 31P |
| Purified anti-Neurofilament H (NF-H), Nonphosphorylated Antibody | BioLegend | 801701 | Previously Covance # SMI-32P |
| Alexa Fluor 488 goat anti-Mouse IgG (H+L) | Thermo Scientific | A11029 | |
| α-Bungarotoxin, biotin-XX conjugate | Invitrogen | B1196 | |
| Streptavidin, Alexa Fluor 555 conjugate | Invitrogen | S32355 | |
| Diaminophenylindole (DAPI) | Sigma | D8417 |
References
- Araque, A., Parpura, V., Sanzgiri, R. P., Haydon, P. G. Tripartite synapses: Glia, the unacknowledged partner. Trends Neuroscience. 22, 208-215 (1999).
- Robitaille, R. Modulation of synaptic efficacy and synaptic depression by glial cells at the frog neuromuscular junction. Neuron. 21, 847-855 (1998).
- Cappello, V., Francolini, M. Neuromuscular Junction Dismantling in Amyotrophic Lateral Sclerosis. International Journal of Molecular Sciences. 18 (10), 2092-2108 (2017).
- Deschenes, M. R., Tenny, K. A., Wilson, M. H. Increased and decreased activity elicits specific morphological adaptations of the neuromuscular junctions. Neuroscience. 137, 1277-1283 (2006).
- Desaulniers, P., Lavoie, P. A., Gardiner, P. F. Habitual exercise enhances neuromuscular transmission efficacy of rat soleus muscle in situ. Journal Applied Physiology. 90, 1041-1048 (2001).
- Deschenes, M. R., Roby, M. A., Glass, E. K. Aging influences adaptations of the neuromuscular junction to endurance training. Neuroscience. 190, 56-66 (2011).
- Valdez, G., et al. Attenuation of age-related changes in mouse neuromuscular synapses by caloric restriction and exercise. Proceedings National Academy of Science U.S.A. 107, 14863-14868 (2010).
- Arnold, A. -S., et al. Morphological and functional remodeling of the neuromuscular junction by skeletal muscle PGC-1α. Nature Communications. 5, 3569-3595 (2014).
- Hill, R. R., Robbins, N., Fang, Z. P. Plasticity of presynaptic and postsynaptic elements of neuromuscular junctions repeatedly observed in living adult mice. Journal of Neurocytology. 20 (3), 165-182 (1991).
- Brown, M. C., Hopkins, W. G., Keynes, R. J., White, J. A comparison of early morphological changes at denervated and paralyzed endplates in fast and slow muscles of the mouse. Brain Research. 248, 382-386 (1982).
- Rosenheimer, J. L. Effects of chronic stress and exercise on age related changes in end-plates architecture. Journal of Neurophysiology. 53, 1582-1589 (1985).
- Andonian, M. H., Fahim, M. A. Effects of endurance exercise on the morphology of mouse neuromuscular junctions during ageing. Journal of Neurocytology. 16, 589-599 (1987).
- Tomas, J., Fenoll, R., Santafé, M., Batlle, J., Mayayo, E. Motor nerve terminal morphologic plasticity induced by small changes in the locomotor activity of the adult rat. Neuroscience Letters. 106, 137-140 (1989).
- Deschenes, M. R., Maresh, C. M., Crivello, J. F., Armstrong, L. E., Kramer, W. J., Covault, J. The effects of exercise training of different intensities on neuromuscular junction morphology. Journal of Neurocytology. 22, 603-615 (1993).
- Nishimune, H., Stanford, J. A., Mori, Y. Role of exercise in maintaining the integrity of the neuromuscular junction. Muscle Nerve. 49 (3), 315-324 (2014).
- Andonian, M. H., Fahim, M. A. Endurance exercise alters the morphology of fast- and slow-twitch rat neuromuscular junction. International Journal of Sports Medicine. 9, 218-223 (1988).
- Fahim, M. A. Endurance exercise modulates neuromuscular junction of C57BL\6N in ageing mice. Journal of Applied Physiology. 83, 59-66 (1997).
- Waerhaug, O., Dahl, H. A., Kardel, K. Different effects of physical training on morphology of motor nerve terminals in rat extensor digitorum longus and soleus muscles. Anatomy and Embryology. 186, 125-128 (1992).
- Desaulniers, M. R., Lavoie, P. A., Gardiner, P. F. Endurance training increases acetylcholine receptor quantity at neuromuscular junctions of adult rat skeletal muscle. Neuroreport. 9, 3549-3552 (1998).
- Deschenes, M. R., et al. Effects of resistance training on neuromuscular junction morphology. Muscle Nerve. 23, 1576-1581 (2000).
- Lepore, E., Casola, I., Dobrowolny, G., Musarò, A. Neuromuscular Junction as an Entity of Nerve-Muscle Communication. Cells. 8 (8), 906-921 (2019).
- Braak, H., et al. Amyotrophic lateral sclerosis-A model of corticofugal axonal spread. Nature Review Neurology. 9, 708-714 (2013).
- Fischer, L. R., et al. Amyotrophic lateral sclerosis is a distal axonopathy: Evidence in mice and man. Experimental Neurology. 185, 232-240 (2004).
- Moloney, E. B., de Winter, F., Verhaagen, J. ALS as a distal axonopathy: molecular mechanisms affecting neuromuscular junction stability in the presymptomatic stages of the disease. Frontiers in Neuroscience. 14 (8), 252-270 (2014).
- Scott, W., Stevens, J., Binder-Macleod, S. A. Human skeletal muscle fiber type classifications. Physical Therapy. 81, 1810-1816 (2001).
- Schiaffino, S., Hanzlíková, V., Pierobo, S. Relations between structure and function in rat skeletal muscle fibers. Journal of Cellular Biology. 47 (1), 107-119 (1970).
- Schiaffino, S., Reggiani, C. Fiber types in mammalian skeletal muscles. Review. Physiological Reviews. 91 (4), 1447-1531 (2011).
- Mech, A. M., Brown, A. L., Schiavo, G., Sleigh, J. N. Morphological variability is greater at developing than mature mouse neuromuscular junctions. Journal of Anatomy. 237 (4), 603-617 (2020).
- Jones, R. A., et al. NMJ-morph reveals principal components of synaptic morphology influencing structure-function relationships at the neuromuscular junction. Open Biology. 6 (12), 160240 (2016).
- Waerhaug, O., Lømo, T. Factors causing different properties at neuromuscular junctions in fast and slow rat skeletal muscles. Anatomy and Embryology. 190, 113-125 (1994).
- Wood, S. J., Slater, C. R. The contribution of postsynaptic folds to the safety factor for neuromuscular transmission in rat fast- and slow-twitch muscles. Journal of Physiology. 500, 165-176 (1997).
- Prakash, Y. S., Miller, S. M., Huang, M., Sieck, G. C. Morphology of diaphragm neuromuscular junctions on different fibre types. Journal of Neurocytology. 25, 88-100 (1996).
- Murray, L. M., Gillingwater, T. H., Parson, S. H. Using mouse cranial muscles to investigate neuromuscular pathology in vivo. Neuromuscular Disorders. 20 (11), 740-743 (2010).
- Mejia Maza, A., et al. NMJ-Analyser: high-throughput morphological screening of neuromuscular junctions identifies subtle changes in mouse neuromuscular disease models. bioRxiv. , (2020).
- Burke, S. R. A., Reed, E. J., Romer, S. H., Voss, A. A. Levator auris longus preparation for examination of mammalian neuromuscular transmission under voltage clamp conditions. Journal of Visualized Experiments. (135), e57482 (2018).
- Franco, J. A., Kloefkorn, H. E., Hochman, S., Wilkinson, K. A. An in vitro adult mouse muscle-nerve preparation for studying the firing properties of muscle afferents. Journal of Visualized Experiments. (91), e51948 (2014).
- Brill, M. S., Marinkovic, P., Misgeld, T. Sequential photo-bleaching to delineate single Schwann cells at the neuromuscular junction. Journal of Visualized Experiments. (71), e4460 (2013).
- Murray, L., Gillingwater, T. H., Kothary, R. Dissection of the transversus abdominis muscle for whole-mount neuromuscular junction analysis. Journal of Visualized Experiments. (83), e51162 (2014).
- Tsang, Y. M., Chiong, F., Kuznetsov, D., Kasarskis, E., Geula, C. Motor neurons are rich in non-phosphorylated neurofilaments: cross-species comparison and alterations in ALS. Brain Research. 861 (1), 45-58 (2000).
- Balice-Gordon, R. J., Thomposon, W. J. The organization and development of compartmentalized innervation in rat extensor digitorum longus muscle. Journal of Physiology. 398, 211-231 (1988).
- Cipriani, S., et al. Neuromuscular junction changes in a mouse model of Charcot-Marie-Tooth disease type 4C. International Journal of Molecular Science. 19 (12), 4072 (2018).
- Boido, M., Vercelli, A. Neuromuscular junctions as key contributors and therapeutic targets in spinal muscular atrophy. Frontiers in Neuroanatomy. 10 (6), (2016).
- Barik, A., Li, L., Sathyamurthy, A., Xiong, W. -C., Mei, L. Schwann cells in neuromuscular junction formation and maintenance. Journal of Neuroscience. 36 (38), 9770-9781 (2016).
