Summary
Qui, descriviamo un protocollo per la messa a punto delle regioni di interesse (ROI) per le tecnologie di omiche spaziali per caratterizzare meglio il microambiente tumorale e identificare specifiche popolazioni cellulari. Per i saggi di proteomica, i protocolli personalizzati automatizzati possono guidare la selezione del ROI, mentre i saggi di trascrittomica possono essere ottimizzati utilizzando ROI di soli 50 μm.
Abstract
Il multiplexing consente la valutazione di diversi marcatori sullo stesso tessuto, fornendo al contempo un contesto spaziale. Le tecnologie di omiche spaziali consentono il multiplexing sia di proteine che di RNA sfruttando rispettivamente anticorpi e sonde oligo-marcati foto-scissibili. Gli oligo vengono scissi e quantificati da regioni specifiche attraverso il tessuto per chiarire la biologia sottostante. Qui, lo studio dimostra che i protocolli di visualizzazione automatica degli anticorpi personalizzati possono essere utilizzati per guidare la selezione del ROI in combinazione con saggi di proteomica spaziale. Questo metodo specifico non ha mostrato prestazioni accettabili con saggi di trascrittomica spaziale. Il protocollo descrive lo sviluppo di un test immunofluorescente (IF) a 3 plessi per la visualizzazione dei marcatori su una piattaforma automatizzata, utilizzando l'amplificazione del segnale del tiramido (TSA) per amplificare il segnale fluorescente da un determinato bersaglio proteico e aumentare il pool di anticorpi tra cui scegliere. Il protocollo di visualizzazione è stato automatizzato utilizzando un test 3-plex accuratamente convalidato per garantire qualità e riproducibilità. Inoltre, è stato valutato lo scambio di DAPI per coloranti SYTO per consentire l'imaging di saggi IF basati su TSA sulla piattaforma di profilazione spaziale. Inoltre, abbiamo testato la capacità di selezionare piccoli ROI utilizzando il saggio di trascrittomica spaziale per consentire l'indagine di aree di interesse altamente specifiche (ad esempio, aree arricchite per un determinato tipo di cellula). Sono stati raccolti ROI di 50 μm e 300 μm di diametro, che corrispondono rispettivamente a circa 15 cellule e 100 celle. I campioni sono stati inseriti in librerie e sequenziati per studiare la capacità di rilevare segnali provenienti da piccoli ROI e regioni specifiche del profilo del tessuto. Abbiamo determinato che le tecnologie di proteomica spaziale traggono grande vantaggio da protocolli automatizzati e standardizzati per guidare la selezione del ROI. Sebbene questo protocollo di visualizzazione automatizzata non fosse compatibile con i saggi di trascrittomica spaziale, siamo stati in grado di testare e confermare che specifiche popolazioni cellulari possono essere rilevate con successo anche in piccoli ROI con il protocollo di visualizzazione manuale standard.
Introduction
I progressi nelle tecniche di multiplexing continuano a fornire migliori strumenti di caratterizzazione per i bersagli presenti nei tumori. Il microambiente tumorale (TME) è un sistema complesso di cellule tumorali, cellule immunitarie infiltranti e stroma, in cui le informazioni spaziali sono fondamentali per comprendere e interpretare meglio i meccanismi di interazione tra biomarcatori di interesse1. Con tecniche emergenti come GeoMx Digital Spatial Profiler (DSP) e 10x Visium, è possibile rilevare e quantificare contemporaneamente più target all'interno del loro contesto spaziale. L'uso di protocolli di immunofluorescenza che facilitano la visualizzazione dei tessuti può migliorare ulteriormente le capacità di profilazione spaziale di queste tecnologie.
La tecnologia Spatial Omics su cui ci siamo concentrati per lo sviluppo di questo metodo consiste in saggi di proteomica spaziale e trascrittomica in cui gli oligonucleotidi sono attaccati ad anticorpi o sonde di RNA tramite un linker fotocliviale sensibile ai raggi UV. I vetrini istologici sono etichettati con questi anticorpi o sonde oligo-coniugati e quindi visualizzati sulla piattaforma di profilazione spaziale. Successivamente, vengono selezionati ROI di diverse dimensioni e forme per l'illuminazione e gli oligonucleotidi fotoscissi vengono aspirati e raccolti in una piastra da 96 pozzetti. Gli oligonucleotidi fotoscissi sono preparati per essere quantificati con il sistema Nanostring nCounter o Next Generation Sequencing (NGS)2,3 (Figura 1)4,5.
Le distribuzioni cellulari variano all'interno dei tessuti e la capacità di caratterizzare posizioni specifiche delle cellule utilizzando marcatori selezionati e diverse dimensioni del ROI è di grande importanza per comprendere appieno l'ambiente tissutale e identificare caratteristiche specifiche. Nella tecnologia Spatial Omics qui menzionata, il protocollo di visualizzazione standard utilizza anticorpi coniugati direttamente ed è un protocollo manuale. I marcatori standard per distinguere tra tumore e stroma sono panCytokeratin (panCK) e CD456,7, ma sono necessari ulteriori marcatori per indirizzare specifiche popolazioni cellulari di interesse. Inoltre, l'uso di anticorpi fluorescenti direttamente coniugati manca di amplificazione, il che limita la selezione degli anticorpi a marcatori abbondanti. Inoltre, i saggi manuali sono soggetti a una maggiore variabilità rispetto ai flussi di lavoro automatizzati8. Pertanto, è auspicabile disporre di un protocollo di visualizzazione personalizzabile, automatizzato e amplificato per la selezione del ROI.
Qui, lo studio dimostra che, per i saggi di proteomica spaziale, la tecnologia TSA può essere utilizzata per protocolli di visualizzazione su una piattaforma automatizzata con conseguente test più mirato e standardizzato. Inoltre, i saggi basati su TSA consentono l'uso di marcatori a bassa espressione, aumentando la gamma di obiettivi che possono essere selezionati per la visualizzazione. Un test 3-plex per panCK, FAP e Antibody X è stato sviluppato utilizzando una piattaforma automatizzata in cui panCK e FAP sono stati utilizzati per differenziare tra tumore e stroma, rispettivamente. L'anticorpo X è una proteina stromale frequentemente riscontrata nei tumori, ma la sua biologia e l'impatto sull'immunità antitumorale non sono completamente compresi. La caratterizzazione del contesto immunitario in aree ricche di anticorpi X può chiarire il suo ruolo nell'immunità antitumorale e nella risposta terapeutica, nonché il suo potenziale come bersaglio farmacologico.
Mentre i pannelli di visualizzazione automatizzati TSA personalizzati si sono dimostrati efficaci per i saggi di proteomica spaziale, l'applicazione di questi saggi per i saggi di trascrittomica spaziale non ha potuto essere confermata. Ciò è probabilmente dovuto ai reagenti e al protocollo utilizzato per i protocolli di visualizzazione automatica, che sembrano compromettere l'integrità dell'RNA. Riconoscere che un protocollo di etichettatura automatizzato per i marcatori di visualizzazione può essere utilizzato per i saggi di proteomica spaziale ma non per i saggi di trascrittomica spaziale fornisce importanti indicazioni sui progetti di analisi della tecnologia Spatial Omics.
Inoltre, lo studio dimostra che il saggio di trascrittomica spaziale può essere utilizzato per profilare bersagli in regioni di diametro fino a 50 μm o circa 15 cellule. Sono stati selezionati due ROI di dimensioni diverse per testare la capacità del test di rilevare anche trascrizioni in piccoli ROI. Per ogni regione di interesse, gli oligo corrispondenti a 1.800 bersagli di mRNA sono stati raccolti e trasformati in librerie secondo il protocollo della piattaforma di profilazione spaziale. Le librerie sono state indicizzate singolarmente, successivamente raggruppate e sequenziate. Ciò ha permesso di valutare sia l'efficienza del pooling che la capacità di identificare specifiche popolazioni cellulari in piccoli ROI.
Questo articolo mostra che per i saggi di proteomica spaziale, un protocollo automatizzato per guidare la selezione del ROI su specifici marcatori di interesse può essere utilizzato per indirizzare selettivamente l'interrogazione di aree tissutali rilevanti e caratterizzare l'ambiente spaziale del tessuto. Inoltre, dimostriamo che ROI più piccoli possono essere utilizzati per saggi trascrittomici spaziali per rilevare e caratterizzare specifiche popolazioni cellulari.
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Protocol
Tutti i tessuti umani sono stati acquisiti da biobanche commerciali o banche di tessuti accreditate con la garanzia che sono stati ottenuti l'approvazione appropriata del Comitato di revisione istituzionale e il consenso informato.
NOTA: il protocollo viene eseguito utilizzando Discovery Ultra e GeoMx Digital Spatial Profiler. Vedere la tabella dei materiali per i dettagli su reagenti, apparecchiature e software utilizzati in questo protocollo.
1. Protocollo di visualizzazione automatizzata per saggi di proteomica spaziale
- Programma autostainer per applicare anticorpi di visualizzazione fluorescente
- Nel software autostainer, fare clic sul pulsante Home e scegliere Protocolli. Quindi, fare clic su Crea / Modifica protocolli e selezionare RUO DISCOVERY Universal come procedura.
- Fare clic su Prima sequenza > Deparaffinizzazione > Depar v2. Per Temperatura media, scegliere 72 ° C, quindi fare clic su Pretrattamento e selezionare Condizionamento cellulare e CC1 Reservoir. Per Temperatura molto elevata, scegliere 100 ° C, quindi fare clic su CC1 8 Min e continuare a fare clic fino a selezionare CC1 64 Min.
- Fare clic su Inibitore > Inibitore DISCOVERY e, per Tempo di incubazione, scegliere 8 minuti. Quindi, fare clic su Anticorpo > Incubazione Ab ad alta temperatura; per Bassa temperatura, scegli 37 ° C; per Anticorpo, scegliere il numero di anticorpi dall'etichetta del distributore (Anticorpo 6 in questo esempio); per Plus Incubation Time, selezionare 32 minuti.
NOTA: Questo protocollo ha tre diversi numeri di anticorpi. Il primo anticorpo è FAP, il secondo è Pan-citocheratina e il terzo è Anticorpo X. - Fare clic su Multimer HRP > Multimer HRP Blocker, quindi per Antibody Blocking, scegliere Gt Ig Block, e per Tempo di incubazione, scegliere 4 minuti. Quindi, su Multimer HRP Reagent, selezionare OMap anti-Rb HRP e, per Tempo di incubazione, scegliere 16 minuti. Quindi, fai clic su Cy5 e, per Tempo di incubazione lungo, scegli 0 Hr 8 Min.
- Fare clic su Doppia sequenza e scegliere Denaturazione anticorpale, quindi selezionare Denatura anticorpale CC2-1 e, per Temperatura molto elevata, scegliere 100 ° C. Assicurarsi che il tempo di incubazione sia di 8 minuti. Quindi, fare clic su DS Inhibitor e selezionare Neutralizza.
- Fare clic su Anticorpo DS e, per Temperatura molto bassa, scegliere 37 ° C. Quindi, in Anticorpo, scegliere il numero di anticorpi dall'etichetta del distributore (Anticorpo 3 in questo esempio) e per Plus Incubation Time, selezionare 32 minuti.
- Fare clic su DS Multimer HRP e scegliere DS Multimer HRP Blocker. Quindi, per Blocco anticorpi, selezionare Gt Ig Block e per Tempo di incubazione, scegliere 4 minuti. Quindi, su Multimer HRP Reagent, selezionare OMap anti-Ms HRP e, per Tempo di incubazione, scegliere 16 minuti. Quindi, fai clic su DS Rhodamine 6G e, per un lungo tempo di incubazione, scegli 0 Hr 8 Min.
- Fare clic su Triple Stain e selezionare TS Antibody Denaturation, quindi selezionare Antibody Denature CC2-2 e, per Very High Temperature, selezionare 100 ° C. Assicurarsi che il tempo di incubazione sia di 8 minuti. Quindi, fare clic su TS Inhibitor e selezionare TS Neutralize.
- Fare clic su Anticorpo TS e, per Temperatura molto bassa, selezionare 37 ° C. Quindi, in Anticorpo, selezionare il numero di anticorpi dall'etichetta del distributore (Anticorpo 7 in questo esempio) e per Plus Incubation Time, selezionare 32 minuti.
- Fare clic su TS Multimer HRP e scegliere TS Multimer HRP Blocker. Quindi, per Blocco anticorpi, selezionare Gt Ig Block e per Tempo di incubazione, scegliere 4 minuti. Quindi, su Multimer HRP Reagent, selezionare OMap anti-Rb HRP e, per Tempo di incubazione, scegliere 16 minuti. Quindi, fai clic su TS FAM e, per Tempo di incubazione lungo, scegli 0 Hr 8 Min.
- Aggiungere un titolo al protocollo. Seleziona un numero di protocollo, aggiungi un commento e fai clic su Attivo seguito da Salva.
- Preparare diapositive, stampare etichette e avviare l'esecuzione dell'autostainer
- Il fornitore di prodotti da forno ha acquistato sezioni di tessuto umano FFPE (fissate in formalina, incorporate in paraffina) in un forno impostato a 70 °C per 20-60 minuti. Mentre le diapositive cuociono, stampa le etichette facendo clic su Crea etichetta nel software autostainer. Quindi, fare clic su Protocolli, selezionare il numero di protocollo e fare clic su Chiudi / Stampa. Aggiungere le informazioni pertinenti sull'etichetta della diapositiva e fare clic su Stampa.
- Rimuovere i vetrini dal forno e lasciarli raffreddare a temperatura ambiente (RT). Applicare le etichette di protocollo stampate in precedenza alle diapositive corrispondenti.
- Caricare distributori di anticorpi ricaricabili con anticorpi in base al numero di etichetta dell'anticorpo assegnato al punto 1.1. In questo protocollo, utilizzare l'anticorpo 6 per FAP a 1 μg / ml, utilizzare l'anticorpo 3 per pan-citocheratina a 0,1 μg / ml e utilizzare l'anticorpo 7 per l'anticorpo X a 2,5 μg / ml. Diluire ciascun anticorpo nel diluente specificato e innescare i distributori di anticorpi ricaricabili.
- Raccogliere i distributori di reagenti preriempiti di blocco, rilevamento e amplificazione sopra menzionati e posizionarli su un vassoio di reagenti. Caricare le diapositive nei vassoi delle diapositive (fino a 30 diapositive per esecuzione) e fare clic su In esecuzione seguito da Sì. Si noti che DAPI non viene utilizzato per la controcolorazione nucleare.
- Confermare l'inizio dell'esecuzione controllando la durata dell'esecuzione sul software autostainer. Il protocollo richiede ~ 11 h per il completamento e può essere eseguito durante la notte.
- Il giorno successivo, assicurarsi del completamento della corsa osservando le luci lampeggianti verdi sugli slot del vassoio di scorrimento. Quindi, togliere i vetrini dallo strumento e sciacquarli energicamente in 1x tampone di reazione fino a quando la soluzione liquida di coprislip non viene completamente rimossa.
- Protocollo della piattaforma di profilazione spaziale per il saggio di proteomica
- Seguire il protocollo di proteomica spaziale indicato nella nota sottostante. Includere le seguenti modifiche al protocollo per abilitare la procedura di etichettatura automatizzata 3-plex.
- Eseguire i passaggi 1.2.1-1.2.6 il giorno prima di iniziare il protocollo di proteomica spaziale e passare direttamente alla fase di recupero dell'antigene del protocollo di proteomica spaziale dopo aver eseguito il passaggio 1.2.6. Omettere la procedura di visualizzazione descritta nel protocollo di proteomica di profilazione spaziale.
- Sostituire SYTO 13 con SYTO 64 a 5000 nM per consentire l'integrazione dei fluorofori. Diluire SYTO 64 in 1x TBS e incubare in una camera di umidità per 15 min.
- Quando si impostano i parametri di scansione nella piattaforma di profilazione spaziale, selezionare i filtri e i canali di messa a fuoco in base ai fluorofori utilizzati nel pannello di visualizzazione per consentire l'integrazione di 3-plex. Utilizzare FITC per DISCOVERY FAM e impostare l'esposizione a 200 ms, utilizzare Cy3 per DISCOVERY Rhodamine 6G e impostare l'esposizione su 200 ms, utilizzare Texas Red per SYTO 64 e impostare l'esposizione su 50 ms (specificare questo come canale di messa a fuoco) e, infine, utilizzare Cy5 per DISCOVERY Cy5, impostare l'esposizione su 200 ms, e salvare le modifiche.
NOTA: le istruzioni dettagliate del protocollo di proteomica di profilazione spaziale si trovano nella scheda Supporto del sito Web ufficiale selezionando Documentazione > Manuali utente. Qui, cerca il protocollo proteico per nCounter usando Bond RX.
2. Selezione del ROI per i saggi di trascrittomica spaziale
- Cuocere le sezioni di pellet a celle FFPE in forno impostato a 70 °C per 20-60 min. Seguire il protocollo NGS della piattaforma di profilazione spaziale indicato nella nota sottostante e scansionare le diapositive sulla piattaforma di profilazione spaziale, selezionando dimensioni di 50 μm e 300 μm. La seguente raccomandazione è evidenziata per il saggio di trascrittomica spaziale:
- Quando si prepara la libreria, se sono state selezionate varie dimensioni di ROI, raggruppare ROI di dimensioni simili per creare una libreria per dimensione. Questo per garantire che vengano raggiunte profondità di sequenziamento sufficienti per tutti i ROI senza distorsioni dalle dimensioni.
NOTA: le istruzioni dettagliate della piattaforma di profilazione spaziale si trovano nella scheda Supporto del sito Web ufficiale selezionando Documentazione > Manuali utente. Qui, cerca il protocollo RNA per applicazioni NGS utilizzando Bond RX.
- Quando si prepara la libreria, se sono state selezionate varie dimensioni di ROI, raggruppare ROI di dimensioni simili per creare una libreria per dimensione. Questo per garantire che vengano raggiunte profondità di sequenziamento sufficienti per tutti i ROI senza distorsioni dalle dimensioni.
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Representative Results
Protocollo di visualizzazione automatizzato per guidare la selezione del ROI
In questo documento, presentiamo l'uso di un protocollo IF automatizzato e personalizzato basato su TSA per visualizzare il tessuto e selezionare ROI specifici. Lo sviluppo del pannello di visualizzazione utilizzando il melanoma e la pelle umana normale come tessuti di controllo consisteva in test di stabilità dell'epitopo, messa a punto delle intensità dei marcatori e valutazione del sanguinamento attraverso controlli esclusi. Per verificare se la stabilità dell'epitopo degli anticorpi è influenzata da fasi di eluizione ripetitive, i segnali FAP e Antibody X sono stati valutati qualitativamente dopo l'etichettatura in ciascuna posizione del 3-plex. Il segnale dell'anticorpo X è rimasto costante in tutte le posizioni, mentre l'intensità del segnale FAP è diminuita dopo un'eluizione (Figura 2). Precedenti studi interni hanno dimostrato che l'epitopo panCK è stabile durante un test 3-plex. Pertanto, FAP è stato scelto per essere nella 1 ° posizione nel 3-plex, panCK è stato posizionato nel 2 ° e Anticorpo X nella 3° posizione. Poiché il segnale FAP era complessivamente più debole rispetto all'anticorpo X e al panCK, FAP è stato accoppiato con il fluoroforo più luminoso, Cy5.
Il 3-plex automatizzato è stato ottimizzato con controlli leave one out, in cui ogni marcatore è stato omesso dal protocollo 3-plex una volta per confermare che non vi era spurgo nei canali vicini (Figura 3).
I fluorofori utilizzati sulla piattaforma di colorazione automatizzata sono stati testati sulla piattaforma di profilazione spaziale per confermare che i filtri sono compatibili con i fluorofori TSA nel pannello di visualizzazione 3-plex. Poiché il protocollo 3-plex utilizza FITC, Cy3 e Cy5 e il canale DAPI viene utilizzato per la scissione UV sulla piattaforma di profilazione spaziale, è stato necessario utilizzare una controcolorazione nucleare nel canale Texas Red. Sono stati testati due diversi coloranti nucleari, SYTO 59 e SYTO 64, e i coloranti hanno mostrato un segnale nucleare distinto nei tessuti del colon. Tuttavia, SYTO 59 ha anche mostrato un segnale di bleedthrough nel canale Cy5 mentre il canale Cy5 era pulito quando si utilizzava SYTO 64 (Figura 4). Pertanto, SYTO 64 era la scelta preferita per il rilevamento nucleare.
Ulteriori test su SYTO 64 hanno dimostrato che questo colorante non era fotostabile e fotosbiancato rapidamente durante l'imaging. Una volta che il segnale viene sbiancato, il sistema di imaging si concentra sullo sfondo, che potrebbe essere interpretato come un segnale non specifico (Figura 5). Aumentare la concentrazione del colorante nucleare per aumentare l'intensità del segnale ha contribuito a ridurre al minimo questo problema.
I tessuti marcati con il protocollo di visualizzazione manuale panCK/CD45, che utilizza anticorpi coniugati direttamente, sono stati confrontati con i tessuti marcati con il protocollo di visualizzazione personalizzato automatizzato panCK/FAP/Antibody X. Entrambi i protocolli condividono panCK come marcatore comune e il segnale era comparabile tra i due protocolli (Figura 6).
Per garantire che un protocollo di visualizzazione modificato non abbia alcun impatto sul saggio di proteomica spaziale a monte, abbiamo confrontato i valori di conteggio ottenuti dopo la raccolta della piattaforma di profilazione spaziale e l'elaborazione della piattaforma di conteggio quando si utilizza il protocollo di visualizzazione manuale panCK / CD45. Questo utilizza anticorpi coniugati direttamente o il protocollo di visualizzazione personalizzata automatizzato 3-plex, che utilizza TSA. Quattro tessuti del cancro del colon-retto (CRC) sono stati etichettati con il protocollo di visualizzazione manuale panCK / CD45 o il protocollo di visualizzazione personalizzata automatizzato 3-plex in combinazione con il saggio di proteomica spaziale. Per ciascun protocollo sono stati scelti ROI simili e i dati di conteggio dei ROI corrispondenti sono stati confrontati utilizzando la normalizzazione delle pulizie per S6 e Histone. Tendenze simili sono state osservate tra questi ROI, come mostrato nella mappa di calore log2 (Figura 7A), con un valore R di Spearman di 0,88 per tutti i marcatori inclusi nel saggio di proteomica spaziale (Figura 7B). Dei 31 anticorpi utilizzati nei test, 23 anticorpi avevano un valore R di Spearman superiore o uguale a 0,5.
Poiché la proteomica spaziale e i protocolli trascrittomici differiscono, abbiamo valutato se il protocollo di visualizzazione automatica potesse essere applicato anche ai saggi di trascrittomica spaziale. Il protocollo di visualizzazione automatica richiede che il test IHC venga eseguito prima del rilevamento dell'RNA, mentre il protocollo manuale originale rileva l'RNA prima di applicare il protocollo di visualizzazione. Il protocollo di visualizzazione automatizzata 3-plex è stato testato fianco a fianco con il protocollo di visualizzazione manuale CK/CD45 in combinazione con il saggio di trascrittomica spaziale. I dati di sequenziamento per il conteggio del quartile 3 (Q3) del protocollo di visualizzazione automatizzata 3-plex, normalizzati sul software di profilazione spaziale, hanno presentato valori inferiori rispetto al protocollo di visualizzazione manuale CK/CD45 (Figura 8A), che si riflette anche nei bassi valori R di Spearman di 0,15 (Figura 8B). Inoltre, è stata osservata una perdita di gamma dinamica quando si utilizza il protocollo automatizzato di visualizzazione 3-plex (Figura 8C).
Questa perdita di conteggi con il protocollo di visualizzazione automatica indica che questo protocollo compromette l'integrità dell'RNA e che è necessario rilevare l'RNA prima di eseguire il test di visualizzazione per conservare la qualità dell'RNA. Poiché questo pannello di visualizzazione automatizzato richiede che la parte proteica venga eseguita prima del rilevamento dell'RNA, questo protocollo non è adatto per i saggi dell'RNA.
Dimensione della selezione del ROI nei saggi di trascrittomica spaziale
Per comprendere meglio l'impatto della dimensione del ROI sull'output dei dati dell'RNA, sono stati confrontati i conteggi degli RNA di ROI di dimensioni diverse. Il saggio di trascrittomica spaziale è stato eseguito su linee cellulari SUDHL1 e JURKAT per ridurre al minimo le differenze inerenti ai tessuti. Sono stati selezionati ROI circolari di 50 μm e 300 μm di diametro e confrontati tra loro utilizzando la normalizzazione Q3 sul software di profilazione spaziale. I conteggi dell'RNA per bersagli selezionati su diverse linee cellulari erano comparabili tra le due dimensioni del ROI dopo la normalizzazione (Figura 9A, B).
Figura 1: Flusso di lavoro di profilazione spaziale digitale. (A) I vetrini sono etichettati con anticorpi (saggio di proteomica spaziale) o sonde (saggio di trascrittomica spaziale) e marcatori di visualizzazione. (B) Le diapositive vengono posizionate sulla piattaforma di profilazione spaziale per visualizzare e selezionare i ROI. (C) Gli oligo vengono scissi dalla luce UV e raccolti in una piastra da 96 pozzetti. Questo processo viene ripetuto per ogni ROI selezionato. (D) I campioni vengono elaborati e i dati vengono generati utilizzando la piattaforma di conteggio o un sequenziatore. Questa cifra è stata modificatadal sito web 4,5 di Nanostring technologies. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 2: Stabilità dell'epitopo. (A-C) Anticorpo X e (D-F) FAP testati rispettivamente sulla pelle umana normale e sul melanoma. Ogni marcatore nella (A,D) 1st, (B,E) 2 °, e (C,F) 3 ° posizione di un 3-plex. L'anticorpo X è stabile in tutte le posizioni, mentre (D) FAP mostra un'intensità di segnalazione decrescente dopo (E-F) rispettivamente una e due eluizioni. Anticorpo X in verde, FAP in rosso, DAPI in grigio. Le barre di scala sono a 200 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 3: Escludere uno dei controlli per il protocollo di visualizzazione personalizzata automatizzato 3-plex sui tessuti pancreatici umani. Per tutte le immagini, Antibody X è raffigurato in verde, panCK in ciano e FAP in rosso. La prima riga mostra il (A) 3-plex e i singoli canali per (B) Anticorpo X in FITC, (C) panCK in Cy3 e (D) FAP in Cy5. La seconda riga mostra il controllo di esclusione 3-plex per (E) Anticorpo X e (F-H) i singoli canali per ciascun marcatore. La terza riga mostra il controllo leave one out 3-plex per (I) panCK e (J-L) i singoli canali per ciascun marcatore. La quarta riga mostra il controllo di esclusione 3-plex per (M) FAP e (N-P) i singoli canali per ciascun marcatore. Non è stato osservato alcun bleedthrough in nessuno dei controlli leave one out, come indicato dalla mancanza di segnale nei canali corrispondenti quando testato (F) senza FAP, (K) senza panCK e (P) senza anticorpo X. Le barre della scala sono a 500 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 4: Test del colorante SYTO. Il canale Texas Red visualizza il segnale nucleare nel colon per (A) SYTO 59 con bleedthrough in (B) Cy5 channel (red). Il canale Texas Red mostra il segnale nucleare nel colon per (D) SYTO 64 senza sanguinamento nel canale (E) Cy5. I canali Texas Red e Cy5 in Colon visualizzati insieme per mostrare (C) bleedthrough di SYTO 59 e (F) nessun bleedthrough per SYTO 64. Le barre della scala sono a 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 5: Fotostabilità SYTO 64. Campioni di colon marcati con SYTO 64 (A) prima e (B) dopo il fotosbiancamento. L'immagine B mostra il segnale non specifico che diventa più visibile dopo la perdita del segnale nucleare. Le barre della scala sono a 50 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 6: Confronto dell'etichettatura panCK . Segnale panCK su campioni di cancro del colon-retto (CRC) con (A) protocollo di visualizzazione manuale panCK/CD45 e (B) protocollo di visualizzazione automatica panCK/FAP/Antibody X. Non sono state osservate differenze nel segnale panCK tra i due protocolli. Le barre di scala sono a 200 μm. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 7: Confronto dei valori di conteggio per il saggio di proteomica spaziale utilizzando due diversi protocolli di visualizzazione su ROI simili di quattro tessuti CRC. (A) Log 2 Mappa termica di tutti i marcatori inclusi nel saggio di proteomica spaziale confrontando il protocollo manuale panCK/CD45 (nero) con il protocollo automatico 3-plex (grigio). (B) La correlazione di Spearman del registro 2 per tutti i marcatori presenta un valore R di 0,88. L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando il software GraphPad Prism 7 o con il linguaggio di programmazione Python. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 8: Confronto dei valori di conteggio per il saggio di trascrittomica spaziale utilizzando due diversi protocolli di visualizzazione. (A) Registro 2 Mappa termica dei target selezionati inclusi nel saggio di trascrittomica spaziale confrontando il protocollo manuale panCK/CD45 (nero) con il protocollo automatizzato 3-plex (grigio). (B) La correlazione di Log 2 Spearman per tutti i marcatori presenta un valore R di 0,15. (C) La media (blu) e la deviazione standard in cui l'intervallo dinamico viene perso nel protocollo automatizzato 3-plex. L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando il software GraphPad Prism 7 o con il linguaggio di programmazione Python. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
Figura 9: Confronto dei valori di conta dell'RNA per il saggio di trascrittomica spaziale su pellet cellulari. Risultati comparabili sono stati osservati per ROI di diametro 50 μm (nero) e 300 μm (grigio) per target selezionati su linee cellulari (A) SUDHL1 e (B) JURKAT. Nessuna differenza significativa è stata osservata utilizzando il t-test. Deviazione media e standard mostrata per n = 3 ROI per dimensione. L'analisi statistica è stata eseguita utilizzando il software GraphPad Prism 7. Fare clic qui per visualizzare una versione ingrandita di questa figura.
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Discussion
Ad oggi, gli anticorpi fluorescenti direttamente coniugati in un protocollo manuale sono più comunemente usati come pannelli di visualizzazione per la proteomica spaziale o saggi di trascrittomica spaziale 9,10. Tuttavia, l'uso di anticorpi fluorescenti direttamente coniugati può essere difficile per marcatori meno abbondanti, limitando la selezione di anticorpi adatti. Questo protocollo mostra che l'etichettatura dei marcatori di visualizzazione può essere automatizzata su una piattaforma di colorazione automatizzata utilizzando le tecnologie TSA per supportare i saggi di proteomica spaziale. Ciò consente una maggiore flessibilità nella personalizzazione dei pannelli di visualizzazione, che consente una selezione del ROI più mirata e l'acquisizione di dati biologici rilevanti da aree specifiche di un tessuto. La tecnologia TSA consente inoltre la visualizzazione di marcatori a bassa abbondanza e quindi aumenta il numero di potenziali anticorpi adatti. Inoltre, l'automazione del protocollo di visualizzazione garantisce la riproducibilità e la qualità della procedura di etichettatura.
Lo sviluppo di un test IF 3-plex richiede un'attenta valutazione delle intensità del segnale marcatore/fluoroforo su tessuti di controllo appropriati. Si raccomanda di titolare le concentrazioni di anticorpi per ottenere il miglior rapporto segnale-rumore, che contribuirà a ridurre al minimo il sanguinamento nei canali adiacenti. Inoltre, la stabilità dell'epitopo per ciascun marcatore di interesse dovrebbe essere testata per garantire che l'epitopo non sia influenzato da ripetute fasi di eluizione. Una volta confermato l'ordine degli anticorpi nel pannello, il test deve essere messo a punto utilizzando i controlli di esclusione di uno escluso. Qui, un marcatore specifico viene omesso nel pannello e il canale corrispondente nell'immagine acquisita viene esaminato per bleedthrough e cross-talk.
È stato dimostrato qui che i saggi basati sulla TSA possono essere visualizzati sulla piattaforma di profilazione spaziale e che le alternative DAPI devono essere utilizzate per la colorazione nucleare. Abbiamo testato i coloranti SYTO e abbiamo determinato che quando si decide quale colorante SYTO utilizzare, il segnale deve essere attentamente valutato per evitare il sanguinamento nei canali adiacenti. Un'altra limitazione dell'uso dei coloranti SYTO è che alcuni coloranti SYTO fotocandeggina più velocemente, come SYTO 64 e SYTO 83 (dati interni), che potrebbero influenzare la quantificazione nucleare. Pertanto, l'esposizione alla luce dei vetrini macchiati dovrebbe essere evitata il più possibile. Altri gruppi hanno mostrato l'uso di SYTO 1311,12, che è più fotostabile (dati interni) e potrebbe essere utilizzato in un pannello purché i marcatori di interesse siano assegnati a fluorofori compatibili con il colorante nucleare di scelta.
Mentre i saggi fluorescenti automatizzati basati sulla TSA hanno funzionato bene per la visualizzazione in combinazione con saggi di proteomica spaziale, è stato determinato qui che la combinazione di un protocollo di visualizzazione automatizzata 3-plex con un protocollo di trascrittomica spaziale ha comportato la perdita della gamma dinamica, che potrebbe essere dovuta alle condizioni di protocollo più difficili dell'aggiunta di ulteriori passaggi di recupero / eluizione dell'antigene che potrebbero influire sull'integrità dell'RNA. Pertanto, il protocollo di visualizzazione automatizzata 3-plex dovrebbe essere adattato solo per i saggi di proteomica, che è una limitazione e richiede approcci di visualizzazione alternativi per i saggi basati sull'RNA. In alternativa alla visualizzazione della stessa diapositiva, le sezioni seriali colorate con marcatori di interesse potrebbero essere sovrapposte per facilitare la selezione del ROI13. Inoltre, la letteratura descrive l'uso dell'ibridazione in situ su vetrini adiacenti per guidare la selezione del ROI14. Tuttavia, questi approcci potrebbero essere limitati dalla disponibilità dei tessuti, dalla variabilità da sezione a sezione e dalle registrazioni da cellula a cellula.
Abbiamo anche testato l'usabilità di diverse dimensioni del ROI per i saggi di trascrittomica spaziale. L'utilizzo di piccoli ROI di 50 μm consente al ricercatore di acquisire dati di regioni specifiche consentendo una lettura più dettagliata di cellule o aree di interesse selezionate. I limiti della selezione di piccoli ROI sono che il numero di celle presenti potrebbe non essere abbastanza abbondante da ottenere valori di conteggio che possono essere distinti dallo sfondo. Un'opzione è quella di selezionare popolazioni di cellule pure per catturare bersagli meno abbondanti. Tuttavia, la selezione del ROI per le singole celle è limitata dall'elevato rapporto segnale-rumore15. Inoltre, è importante considerare le dimensioni del ROI per la preparazione della libreria se in un singolo esperimento vengono raccolti ROI di dimensioni diverse. Se le dimensioni del ROI differiscono in modo significativo, può essere utile raggruppare i ROI in base alle loro dimensioni e costruire librerie separate per evitare che i ROI di grandi dimensioni vengano sovrarappresentati in una libreria. Ciò garantirà anche che ogni ROI ottenga una copertura di sequenziamento sufficiente in base alle sue dimensioni.
Altri fattori da considerare quando si eseguono esperimenti di omiche spaziali sono che i dati potrebbero mostrare variazioni dovute alla variabilità da diapositiva a diapositiva e una minore espressione di determinati obiettivi può far emergere lo sfondo e le differenze nei valori di correlazione. È necessario prendere in considerazione controlli adeguati e approcci di normalizzazione quando si pianificano esperimenti e si valutano i dati. Per i saggi di proteomica spaziale su nCounter, la normalizzazione agli obiettivi di housekeeping o alle IgG di controllo negativo sono i metodi preferiti in base all'esperienza interna e alle raccomandazioni dei fornitori in cui è necessario valutare la correlazione tra gli obiettivi di housekeeping o le IgG di controllo negativo16. Tuttavia, a seconda dei tessuti utilizzati, la migliore normalizzazione deve essere definita per ogni studio17,18. Ad esempio, la letteratura afferma che per gli studi di omiche spaziali sul cancro al seno, GAPDH, che è comunemente usato per normalizzare gli obiettivi di pulizia, è stato meno concordante di S6 e Histone19. Pertanto, S6 e Histone sono stati gli obiettivi di pulizia raccomandati per la normalizzazione nei tessuti del cancro al seno19.
Per i saggi di trascrittomica spaziale, le strategie di normalizzazione devono essere definite in base al disegno dello studio (ad esempio, tipi di tessuto e selezione del ROI). Alcune strategie utilizzate nell'RNA-Seq, come il quartile superiore o la normalizzazione dei valori M (TMM), potrebbero essere applicate per normalizzare i dati sequenziati19,20.
I saggi di trascrittomica spaziale forniscono informazioni su migliaia di bersagli e stanno diventando sempre più comunemente usati per esplorare l'intero trascrittoma, dove specifici compartimenti TME sono selezionati e analizzati in combinazione con RNA-seq20 a singolo nucleo o sequenziamento di RNA a singola cellula21. Abbiamo dimostrato che i protocolli di visualizzazione per guidare la selezione del ROI per valutare la distribuzione spaziale dei bersagli potrebbero essere automatizzati per i saggi di proteomica spaziale ma non per i saggi di trascrittomica spaziale. Inoltre, presentiamo che è possibile selezionare ROI fino a 50 μm per consentire un'indagine più approfondita di una particolare regione tissutale. Le future applicazioni di questa tecnologia miglioreranno la comprensione del microambiente tumorale.
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Disclosures
Veronica Ibarra-Lopez, Sangeeta Jayakar, Yeqing Angela Yang, Zora Modrusan e Sandra Rost sono dipendenti e azionisti di Genentech, membro del Gruppo Roche. Altre aziende che fanno parte di Roche producono reagenti e strumenti utilizzati in questo manoscritto. Ciara Martin è una dipendente a tempo pieno di NanoString Technologies Inc, che produce reagenti e strumenti utilizzati in questo manoscritto.
Acknowledgments
Gli autori riconoscono a Thomas Wu l'elaborazione dei file NGS. Ringraziamo James Ziai per le discussioni sui risultati e la revisione del manoscritto e Meredith Triplet e Rachel Taylor per la revisione interna del manoscritto.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 10x Tris buffered saline (TBS) | Cell Signaling Technologies | 12498S | Diluted to 1x TBS in DEPC treated water |
| Antibody X (not disclosed) | antibody blinded due to confidentiality | ||
| DEPC-treated water | ThermoFisher | AM9922 | Another can be used |
| DISCOVERY Cell Conditioning ( CC1) | Ventana | 950-500 | |
| DISCOVERY Cy5 Kit | Ventana | 760-238 | Referred as Cy5 |
| DISCOVERY FAM Kit | Ventana | 760-243 | Referred as FAM |
| DISCOVERY Goat Ig Block | Ventana | 760-6008 | Referred as Gt Ig Block |
| DISCOVERY OmniMap anti-Ms HRP | Ventana | 760-4310 | Referred as OMap anti-Ms HRP |
| DISCOVERY OmniMap anti-Rb HRP | Ventana | 760-4311 | Referred as OMap anti-Rb HRP |
| DISCOVERY Rhodamine 6G Kit | Ventana | 760-244 | Referred as Rhodamine 6G |
| DISCOVERY ULTRA Automated Slide Preparation System | Ventana | 05 987 750 001 / N750-DISU-FS | Referred as autostainer on the manuscript |
| FAP [EPR20021] Antibody | Abcam | Ab207178 | |
| GeoMx Digital Spatial Profiler | NanoString | GMX-DSP-1Y | Referred as spatial profiling platform on the manuscript |
| Humidity chamber | Simport | M920-2 | Another can be used |
| Pan-Cytokeratin [AE1/AE3] Antibody | Abcam | Ab27988 | |
| ProLong Gold Antifade Mountant | ThermoFisher | P36934 | |
| Python | Python | Statistical analysis | |
| Reaction Buffer (10x) | Ventana | 950-300 | |
| Statistical analysis software | GraphPad | Prism 7 | Statistical analysis |
| SYTO 64 | ThermoFisher | S11346 | |
| ULTRA Cell Conditioning (ULTRA CC2) | Ventana | 950-223 | |
| Ventana Antibody Diluent with Casein | Ventana | 760-219 | Referred as specified diluent on the manuscript |
| Ventana Primary antibody dispenser | Ventana | Catalog number depends on dispenser number |
References
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