방법 논문

시간 해결 된 단백질 유발 형광 향상을 활용하여 안정적인 지역 적합성을 식별하기 위해 한 번에 한 α 시뉴클레인 단백기를 식별합니다.

DOI:

10.3791/62655

⸱

2021년 5월 30일

 , 
1Department of Biological Chemistry, The Alexander Silberman Institute of Life Sciences, Faculty of Mathematics & Science, The Edmond J. Safra Campus, The Hebrew University of Jerusalem, 2The Center for Nanoscience and Nanotechnology, The Hebrew University of Jerusalem

이 논문에서

요약

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시간 해결된 단일 분자 단백질 유도 형광 향상은 단백질의 국소 구조적 변화에 민감한 유용한 형광 분광 근접 센서이다. 여기서 우리는 그렇지 않으면 구형비정형및 불안정으로 알려진 α-시뉴클레인에서 안정적인 지역 적합성을 발견하는 데 사용할 수 있음을 보여줍니다.

초록

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분광 눈금을 사용하여 단일 생체 분자와 역학의 여러 적합성을 추적함으로써 구조적 역학에 대한 이해와 생물학에 대한 기여에 혁명을 일으켰습니다. FRET 기반 눈금자는 3-10 nm 범위에서 염료 간 거리에 대해 보고하는 동안, 단백질 유발 형광 향상(PIFE)과 같은 다른 분광 기술, 짧은 0-3 nm 범위에서 염료와 단백질 표면 사이의 근접성에 대한 보고. 선택의 방법에 관계없이, 한 번에 하나씩 자유롭게 확산되는 생체 분자를 측정하는 데 사용하는 것은 각 하위 집단이 밀리초 이내에 변경되지 않은 단일 형태 또는 밀리초보다 훨씬 빠르게 상호 변환되는 다중 적합성을 나타내는 생체 분자의 분리된 중앙 분산 하위 집단을 산출하는 실험 파라미터의 히스토그램을 검색합니다. 히스토그램에 보고된 파라미터가 염료 FRET 효율인 단일 분자 FRET에서, 완충제의 α-시뉴클레인 단조근과 같은 본질적으로 무질서한 단백질은 이전에 빠르게 상호 변환하는 다중 적합성의 단일 평균 아웃 하위 집단을 나타내는 것으로 보고되었다. 이러한 과거 발견은 FRET 기반 통치자의 3-10 nm 범위에 의존하는 동안, 우리는 우리가 사이트 특정 sCy3 표지 α-시뉴클레인 단백질의 형광 수명을 추적 단일 분자 PIFE를 사용하여 테스트에이 단백질을 넣어 하고자 한 번에 하나씩. 흥미롭게도, 이 짧은 범위 분광 근접 센서를 사용하여, sCy3 표지 α-Synuclein는 10-100 ms에서 상호 변환하는 명백하게 다른 평균 수명을 가진 몇몇 일생 하위 인구를 전시합니다. 이러한 결과는 α-시뉴클레인이 전 세계적으로 무질서할 수 있지만, 그럼에도 불구하고 안정적인 지역 구조를 달성한다는 것을 보여줍니다. 요약하자면, 이 작품에서는 한 번에 하나의 생체 분자를 로컬 또는 글로벌 구조 변화를 추적하는 다양한 분광 근접 센서를 사용하는 이점을 강조합니다.

서론

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지난 2년간, 단일 분자 형광계 방법은 생체 분자1,2,다른 생체 분자 파라미터가 어떻게 분포되는지뿐만 아니라 하위 밀리초 해상도3,4,5에서이러한 매개 변수의 상이한 하위 집단 간에 동적으로 상호 작용하는 방법을 탐구하는 강력한 도구가 되었다. 이러한 기술의 파라미터는 FRET 측정 6,7,형광 이소트로피8,9,형광 양자 수율 및 수명10,11에서에너지 전달 효율을 포함하며, 12 또는 개선 된13 메커니즘의 상이한 형광의 함수로서. 단백질 유발 형광 향상(PIFE) (PIFE)(PIFE) 14는 염료<....

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프로토콜

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1. 플라스미드 변환

  1. SOC 배지 0.5 L 준비
    1. 트라이프톤 10g, 효모 추출물 2.5g, 염화나트륨 0.25g(NaCl), 염화칼륨 0.1g(KCl)의 무게를 측정합니다.
    2. 총 부피가 0.5L까지 이중 증류수(DDW)를 추가합니다.
    3. 수산화 나트륨(NaOH)을 추가하여 pH 7에 적응합니다.
    4. 100mL 및 오토클레이브의 주식 알리쿼트를 준비합니다.
    5. 사용하기 전에 멸균 마그네슘 염화물(MgCl2)과1.8mL의 멸균 포도당을 SOC100mL에 추가합니다.
  2. 얼음에 해동 BL21 (DE3) 유능한 대장균 세포.
  3. 유능한 셀을 부드럽게 섞습니다.
  4. 15mL 튜브 2개를 준비합니다. 하나는 변형 반응 튜브로 표시하고 다른 하나는 제어 튜브로 레이블을 지정합니다.
  5. 관에 유능한 세포의 알리쿼트 100 μL.
  6. 변환 반응 튜브에 0.1 ng/μL의 농도로 플라스미드 1 μL을 추가합니다.
  7. 42°C 수조에 SOC 배지를 가열하여 1.8단계에서 사용한다.
  8. 42°C 수조에서 2개의 튜브를 45초동안....

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결과

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IDP로서, 다른 생체 분자에 바인딩되지 않을 때, α-Syn은 몇 마이크로초40에서, 심지어 수백 나노초41에서전이와 함께 다중 적합성 사이의 구조적 역학을 나타낸다. α-Syn이 공초점 지점을 교차하면 적합성 간에 수천 번의 전환이 발생할 수 있습니다. 실제로, 이것은 smFRET가39,40을사용했을 때의 경우였습니다. 여기서 우리는 α-Syn의 로컬 형태 역학을 조사하기 위해 smPIFE 측정을 수행합니다.

이 측정은 α-Syn A56C 돌연변이체에서 시스테인의 티올 그룹에 부착된 설포-Cy3(sCy3) 염료로부터 방출되는 형광광자를 기록한다. sCy3 플루오로포어는 흥분된 상태에서 이소성화를 겪을 수 있습니다. 그러나 sCy3은 트랜스 이좀러에서 흥분을 일으킬 때 광자.......

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토론

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광범위한 생화학 적 및 생물리 연구는 α 신과 그 무질서한 자연33,34,35,36,37,38의구조적 특성을 연구하기 위해 수행되었다. 여러 작품은 이미 자유롭게 확산 smFRET를 활용하여 결합이 없는 α-Syn 단조량의 분자 내 역학을 조사합니다. 이러한 작품들은 α-Syn의 높은 동적 이질성을 보고하여, 공초점 지점을 통해 일반적인 확산 시간 내에 여러 가지 구조 종의 평균 아웃으로 이어져 단일 FRET 인구39,40의출현으로 이어진다. 그러나, smFRET 측정은 3-.......

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공개 사항

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모든 저자는 이해 상충을 공유하지 않습니다.

감사의 글

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A56C α-Syn 돌연변이를 코딩하는 pT-t7 플라스미드는 아사프 그루피 박사, 댄 아미르 박사, 엘리샤 하스 박사의 선물로 우리에게 주어졌습니다. 이 논문은 국립 보건원 (NIH, 보조금 R01 GM130942 E.L. 하위 상으로), 이스라엘 과학 재단 (보조금 3565/20 킬코로나 내에서 - 코로나 바이러스 연구 프로그램을 억제), 밀너 기금과 예루살렘히브리어 대학 (시작 기금).

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재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
Amicon Ultra-15 원심 필터 장치MercC7715컷오프: 100kDa
황산암모늄Sigma-AldrichA4418
BSASigma-AldrichA9647
시스테아민Sigma-Aldrich30070
투석 백 - MEGA GeBaFlex-tubeGene Bio-ApplicationMEGA320
디티오트레이톨(DTT)시그마-알드리치43815
에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA)시그마-알드리치E5134
패스트 시밴드 염색 용액유전자 바이오 응용SB050
글리신시그마-알드리치50046
D-글루코스시그마-알드리치G7021
HEPES시그마-알드리치54457
HiTrap 탈염 5mL시그마-알드리치GE17-1408
6-하이드록시-2,5,7,8-테트라메틸크로만-2-카르복실산(트롤록스)시그마-알드리치238813
이소프로필 &베타;-d-1-티오갈락토피라노사이드(IPTG)시그마-알드리치I5502
LB 육수시그마-알드리치L3152
마그네슘 염화물Sigma-Aldrich63068
MonoQ 컬럼Sigma-Aldrich54807
단백질 LoBind 튜브Sigma-AldrichEP00301080940.5 mL
헹굼 µ-slide 18Ibidi81816
SDSSigma-Aldrich75746
아세트산 나트륨Sigma-AldrichS2889
수산화나트륨Sigma-AldrichS8045
인산나트륨 일염기성 일수화물Sigma-Aldrich71507
멸균 세포 스프레더, Drigalski 주걱미니 플라스트815-004-05-001
스트렙토마이신 황산염Sigma-AldrichS9137
sulfo-Cy3  maleimideabcamab146493
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP)Sigma-Aldrich75259
Tris-HClSigma-Aldrich93363
TryptoneSigma-AldrichT7293
효모 추출물Sigma-AldrichY1625

참고문헌

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Gust, A., et al. A starting point for fluorescence-based single-molecule measurements in biomolecular research. Molecules. 19 (10), 15824-15865 (2014).
  2. Weiss, S. Fluorescence spectroscopy of single biomolecules. Science. 283 (5408), 1676-1683 (1....

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재인쇄 및 허가

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태그

PIFE

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