Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Udnyttelse af tidsforelt protein-induceret fluorescensforbedring til at identificere stabile lokale konformationer En α-Synuclein Monomer ad gangen

Published: May 30, 2021 doi: 10.3791/62655
Automatic Translation
1, 1,2
1Department of Biological Chemistry, The Alexander Silberman Institute of Life Sciences, Faculty of Mathematics & Science, The Edmond J. Safra Campus, The Hebrew University of Jerusalem, 2The Center for Nanoscience and Nanotechnology, The Hebrew University of Jerusalem

Summary

Tidsforeltigt proteininduceret fluorescensforbedring med et enkeltmolekyle er en nyttig fluorescensspektspekter, der er følsom over for lokale strukturelle ændringer i proteiner. Her viser vi, at det kan bruges til at afdække stabile lokale konformationer i α-Synuclein, som ellers er kendt som kugleformet ustruktureret og ustabil, når den måles ved hjælp af den længere rækkevidde FRET lineal.

Abstract

Brug af spektroskopiske linealer til at spore flere konformationer af enkelte biomolekyler og deres dynamik har revolutioneret forståelsen af strukturelle dynamikker og dens bidrag til biologi. Mens den FRET-baserede lineal rapporterer om interfarveafstande i 3-10 nm-området, rapporterer andre spektroskopiske teknikker, såsom proteininduceret fluorescensforbedring (PIFE), om nærheden mellem et farvestof og en proteinoverflade i det kortere 0-3 nm-interval. Uanset valgmetoden henter dens anvendelse til måling af frit diffust biomolekyler en ad gangen histogrammer af forsøgsparameteren, der giver separate centralt fordelte underpopulationer af biomolekyler, hvor hver underpopulation enten repræsenterer en enkelt kropsbygning, der forblev uændret inden for millisekunder, eller flere konformationer, der interkonverterer meget hurtigere end millisekunder og dermed en gennemsnitlig subpopulation. I enkeltmolekyle FRET, hvor den rapporterede parameter i histogrammer er inter-dye FRET effektivitet, en iboende uordnet protein, såsom α-Synuclein monomer i buffer, blev tidligere rapporteret som udviser en enkelt gennemsnitlig-out delpopulation af flere konformationer inter konvertering hurtigt. Mens disse tidligere fund afhænger af 3-10 nm rækkevidde af FRET-baserede lineal, vi forsøgte at sætte dette protein på prøve ved hjælp af enkelt-molekyle PIFE, hvor vi spor fluorescens levetid stedspecifikke sCy3-mærket α-Synuclein proteiner én ad gangen. Interessant, ved hjælp af denne kortere rækkevidde spektroskopisk nærhed sensor, sCy3-mærket α-Synuclein udstiller flere levetid subpopulationer med tydeligt forskellige gennemsnitlige levetider, interkonvertere i 10-100 ms. Disse resultater viser, at mens α-Synuclein kan være uorden globalt, det ikke desto mindre opnår stabile lokale strukturer. Sammenfattende fremhæver vi i dette arbejde fordelen ved at bruge forskellige spektroskopiske nærhedssensorer, der sporer lokale eller globale strukturelle ændringer en biomolekyle ad gangen.

Introduction

I løbet af de sidste to årtier er fluorescensbaserede metoder med enkeltmolekyler blevet et kraftfuldt værktøj til måling af biomolekyler1,2, hvilket undersøger, hvordan forskellige biomolekylære parametre fordelersig,samt hvordan de dynamisk interkonverterer mellem forskellige underpopulationer af disse parametre ved sub millisekunders opløsning3,4,5. Parametrene i disse teknikker omfatter energieffektivitet i FRET målinger 6,7, fluorescens anisotropi8,9, fluorescens quantum udbytter oglevetider 10,11, som en funktion af forskellige fluorescens slukke12 eller ekstraudstyr13 mekanismer. En af disse mekanismer, bedre kendt som protein-induceret fluorescens ekstraudstyr (PIFE)14 introducerer forbedring af fluorescens quantum udbytte og levetid som en funktion af sterisk obstruktion til fri isomerisering af fluorophore når i ophidset tilstand, forårsaget af proteinoverflader i nærheden af farvestoffet14,15,16,17,18,19 . Både FRET og PIFE betragtes som spektroskopiske linealer eller nærhedssensorer, da deres målte parameter er direkte forbundet med en rumlig foranstaltning inden for den mærkede biomolekyle under måling. Mens FRET-effektiviteten er relateret til afstanden mellem et par farvestoffer inden for en rækkevidde på 3-10 nm20, øger PIFE-spor i fluorescens quantum udbytter eller levetider relateret til afstanden mellem farvestoffet og en overflade af et nærliggende protein i intervallet 0-3 nm19.

Enkeltmolekyle FRET har været meget udbredt til at give strukturel indsigt i mange forskellige proteinsystemer, herunder iboende uorganiseret proteiner (IIV'er)21, såsom α-Synuclein (α-Syn)22. α-Syn kan danne ordnede strukturer efter binding til forskellige biomolekyler og under forskellige forhold23,24,25,26,27,28,29,30. Men når den er ubundet, er α-Syn-monomer karakteriseret ved høj kropsbygnings heterogenitet med hurtigt interkonverterende konformationer31,32.

Overensstemmelserne mellem α-Syn er tidligere blevet undersøgt ved hjælp af forskellige teknikker, der hjælper med at identificere kropsbygningsdynamikken i sådanne meget heterogene og dynamiske proteinsystemer33,34,35,36,37,38,39. Interessant, enkelt-molekyle FRET (smFRET) målinger af α-Syn i buffer rapporterede en enkelt FRET befolkning39,40, der er et resultat af tid-gennemsnit af konformationer dynamisk interkonvertere til tider meget hurtigere end den typiske diffusion tid α-Syn gennem confocal stedet (gange så hurtigt som få mikrosekunder og endnu hurtigere end det, i forhold til typiske millisekunder diffusion gange)40, 41. Men ved hjælp af en FRET spektroskopisk lineal med 3-10 nm afstand følsomhed undertiden rapporterer kun om generelle strukturelle ændringer i et lille protein som α-Syn. Målinger med enkeltmolekyler, der anvender spektroskopiske nærhedssensorer med kortere afstandsfølsomhed, har potentiale til at rapportere om dynamikken i lokale strukturer. Heri udfører vi enkeltmolekylet PIFE-målinger af α-Syn og identificerer forskellige underpopulationer af fluorescens levetid kortlægning til forskellige lokale strukturer med overgange mellem dem så langsomt som 100 ms. Dette arbejde opsummerer tidsforbestemte smPIFE-målinger af frit diffuserende α-Syn-molekyler en ad gangen, i buffer og når de er bundet til SDS-baserede membraner som en kortrækkende enkeltmolekylespektroskopisk nærhedssensor.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

1. Plasmid transformation

  1. Fremstilling af 0,5 L SOC medium
    1. 10 g tryptone, 2,5 g gærekstrakt, 0,25 g natriumchlorid (NaCl), 0,1 g kaliumchlorid (KCl).
    2. Tilsæt dobbeltdestilleret vand (DDW) indtil det samlede volumen på 0,5 L.
    3. Juster til pH 7 ved tilsætning af natriumhydroxid (NaOH).
    4. Forbered lager aliquots på 100 mL og autoklave.
    5. Før du bruger, tilsættes 0,5 mL steril magnesiumchlorid (MgCl2) og 1,8 mL steril glukose til 100 mL SOC.
  2. Optø BL21 (DE3) kompetente Escherichia coli celler på is.
  3. Bland de kompetente celler forsigtigt.
  4. Forbered to 15 ML rør. Mærk den ene som transformationsreaktionsrør og den anden som kontrolrøret.
  5. Aliquot 100 μL af kompetente celler i rørene.
  6. Der tilsættes 1 μL plasmid ved en koncentration på 0,1 ng/μL i transformationsreaktionsrøret.
  7. Opvarmes i 42 °C vandbad til brug i trin 1.8.
  8. Varmepulser de to rør i 42 °C vandbad i en varighed på 45 sekunder. (Kritisk skridt!)
  9. Der tilsættes 900 μL opvarmet SOC-medium til hvert rør.
  10. Inkuberes ved 37 °C i en periode på 45 minutter med rystehastighed på 225 omdrejninger.
  11. Spred 200 μL af cellerne med den transformerede plasmid på en LB (Luria-Bertani)-agarplade indeholdende 100 μg/mL ampicillin ved hjælp af en steril cellespreder.
  12. Spred 200 μL af cellerne med den transformerede plasmid på en LB-agarplade uden ampicillin ved hjælp af en steril spreder (positiv kontrol).
  13. 200 μL af kontrolcellerne (uden plasmid) fordeles på en LB-agarplade, der indeholder 100 μg/mL ampicillin, ved hjælp af en steril spreder (negativ kontrol).
  14. Pladerne inkuberes natten over ved 37 °C.

2. Proteinpræparat

  1. Rekombinant α-Synuclein udtryk og rensning
    1. Vælg en enkelt koloni og vokse i 100 mL autoklavet LB (Luria-Bertani) flydende medium, der indeholder 100 μg/mL ampicillin ved 37 °C (starter).
    2. Der fremstilles fire 2 L Erlenmeyer kolber, der hver indeholder 1 L autoklavet LB-medium og 100 μg/mL ampicillin (stor podning).
    3. Mål den optiske tæthed (OD ved λ = 600 nm) af celleopløsningen. Når startens celletæthed når en ODλ=600nm på 0,6-0,7, tilsættes 10 mL starteropløsning pr. 1 L LB-medium, der blev forberedt i det foregående trin.
    4. Vækst bakteriemedierne i en inkubator shaker ved 37 °C og en hastighed på 200 omdrejninger.
    5. Når celletætheden når en ODλ=600nm af 0,6-0,8, fremkalde protein udtryk ved at tilføje isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) pr hver 1 L vækstmedium til en endelig koncentration på 1 mM.
      BEMÆRK: Opløs 0,96 g IPTG i 4 mL DDW, og der tilsættes 1 minut af den resulterende IPTG-opløsning pr. 1 L bakterievækst.
    6. Dyrk cellerne i en varighed på 4 timer og saml dem ved centrifugering i 50 mL rør med en hastighed på 5.170 x g for en varighed på 8 minutter.
      BEMÆRK: I hver runde skal du kassere supernatanten, holde pelleten og fylde de samme rør igen med bakterievækst.
    7. Opbevar bakteriepillen i dybfryseropbevaring (f.eks. -80 °C) den næste dag.
    8. Den næste dag skal du forberede 200 mL lysisbuffer: 40% (w/v) saccharose og buffer A, som omfatter 30 mM Tris-HCl, 2 mM ethylendiamintetraacetic acid (EDTA), 2 mM dithiothreitol (DTT) ved pH 8.0.
    9. Tilsæt 25 mL lysis buffer til hvert rør med bakteriel pellet.
    10. Pjetten (brug sterile pasteurpipetter af plast) i Lysis-bufferen (se 2.1.8).
    11. Forbered steril 250 mL Erlenmeyer kolbe med en omrører magnet på is.
    12. Tilsæt 5 mL lysis buffer, og overfør derefter de homogene genophængte celler til den.
    13. Rør cellerne i en varighed på 20 minutter ved 200 rpm ved stuetemperatur.
    14. Opløsningen opdeles i 50 mL-rør og centrifuge ved 4 °C i en varighed på 30 minutter med en hastighed på 17.400 x g.
    15. Kassér supernatanten.
    16. Forbered steril 250 mL Erlenmeyer kolbe med omrører magnet på is.
    17. Der tilsættes 15 mL opløsningsbuffer (90 mL afkølet buffer A og 37 μL mgcl2 opløst ud over opløselighedsgrænsen og filtreres) i hvert rør. Brug sterile plast Pasteur pipetter og opløse pellet.
    18. Når en del af opløsningen bliver homogen, skal du flytte den til en omrørt Erlenmeyer kolbe på is.
    19. Find ud af opløsningsvolumenet i Erlenmeyer.
    20. Der tilsættes 10 mg streptomycinsulfat pr. 1 mL opløsning (før der tilsættes, opløses streptomycinsulfat i 2 mL buffer A).
      BEMÆRK: Dette trin udføres for at fjerne DNA'et og ribosomer væk.
    21. Rør opløsningen i en varighed på 10-20 minutter ved stuetemperatur.
    22. Opløsningen opdeles i 50 mL-rør og centrifuge ved 4 °C og med en hastighed på 20.700 x g i en varighed på 30 minutter.
    23. Saml supernatant og kassere pellet.
    24. Forbered en steril 250 mL Erlenmeyer kolbe på is med en omrører.
    25. Supernatanten filtreres med 0,22 μm sprøjtefilter i den rene Erlenmeyer-kolbe.
    26. Opløsningsvolumen og veje 0,3 g ammoniumsulfat pr. opløsning på hver 1 mL.
    27. Tilsæt gradvist ammoniumsulfatet til den omrørte opløsning.
      BEMÆRK: Dette trin udføres for at udfælde proteiner. Når ammoniumsulfatet binder proteinerne, bliver opløsningen tilsløret og sløret, hvilket viser sig som hvid farve.
    28. Rør i 30 minutter ved stuetemperatur.
    29. Opløsningen opdeles i 50 mL-rør og centrifuge ved 4 °C og med en hastighed på 20.700 g i en varighed på 30 minutter.
    30. Kassér forsigtigt supernatanten og behold pelleten.
    31. Pellet opløses med 20 mL buffer A.
    32. Foren alle løsningerne i ét rør, og mål derefter opløsningens UV-absorptionsspektrum.
      BEMÆRK: Hvis spektret viser en signatur af sammenlægning (absorption over en bølgelængde på 300 nm), skal du fortsætte til næste trin. Hvis ikke, skal du springe det næste trin over og gå til trin 2.1.34.
      BEMÆRK: Aggregeringsindekset (A.I.) beregnet ud fra UV-spektret som ODλ=350nm/ (ODλ=280nm - ODλ=350nm) ×100. 41
    33. Brug 100 kDa cutoff centriprep rør og centrifuge med en hastighed på 3.590 x g ved 4 °C i en varighed på 15 minutter. Saml den væske, der passerede gennem filteret.
    34. Dialyze opløsningen ved 4 °C natten over, mod Buffer A, ved hjælp af dialyseposer med en 3,5 kDa cutoff.
    35. Udfør endnu en runde dialyse i mindst 4 timer.
    36. Læg den manuelt stillede prøve på en 1 mL MonoQ anion udveksling kolonne. Brug 30 mM Tris hydrochlorid (Tris-HCl) buffer ved pH 7,5 som vaskebuffer og 30 mM Tris-HCl buffer pH 7,5 med 500 mM NaCl som elution buffer.
    37. Indsprøjt prøven i kolonnen. Vask derefter med 20 kolonnevolumener (CV'er) af 0% elutionbuffer og 100% vaskebuffer for at fjerne de ubundne proteiner.
    38. Vask med 7 CV'er med 30% elution buffer.
    39. Eluter α-Syn proteinprøven ved hjælp af en gradient, der ændres fra 30% til 100% elution buffer for 30 CV'er, med en strømningshastighed på 1,5 mL / min.
      BEMÆRK: α-Syn elutes ved 46-66 CV'er ved ledningsevne 20-24 mS/cm, hvilket refererer til 38-50% elution buffer.
    40. Saml fraktioner af de vigtigste elution peak. Kontroller tilstedeværelsen af α-Syn ved at køre prøver i 15% natrium dodecyl sulfat polyacrylamidgelelektroforese (SDS-PAGE) efter farvning med enten Coomassie Blue eller Fast SeeBand farvningsopløsning. Et band på 15 kDa forventes.
    41. Foren de relevante fraktioner og dialyze dem natten over, mod buffer A, ved hjælp af dialyseposer med en 3,5 kDa cutoff ved 4 °C.
    42. Tilbered aliquots af proteinprøven og opbevar dem ved -20 °C.
  2. Cy3-mærket α-Synuclein
    1. Reducer thiolen af cysteinresterne i α-Syn A56C-mutanten ved at tilføje DTT til en endelig koncentration på 2 mM i en varighed på 1 time ved stuetemperatur.
    2. Fjern DTT ved at udføre to runder dialyse ved hjælp af 3,5 kDa cutoff dialyseposer. For den første runde, dialyze mod 30 mM Tris-HCl pH 8,0 og 2 mM EDTA. For anden runde, dialyze mod 50 mM HEPES pH 7,2 og 2 mM EDTA.
    3. Reducer cysteinresterne ved at tilsætte Tris(2-carboxyethyl)fosphinhydrochlorid (TCEP) til proteinprøven til en endelig koncentration på 50 μM i en varighed på 30 minutter ved stuetemperatur.
      BEMÆRK: TCEP er et ikke-sulfhydrylreducerende middel, og derfor holder det thiolgrupperne reduceret uden at reagere med farvestoffet. Vi har tilføjet 0,5 μL fra en lageropløsning på 1 M TCEP.
    4. Beregn de mængder protein, der kræves til den endelige reaktionsvolumen på 1 mL.
      BEMÆRK: Her er et eksempel på den beregning, vi brugte:
      20 μM endelig proteinkoncentration × 1 mL sidste volumen = 56 μM indledende proteinkoncentration × V-protein, der skal tilsættes
    5. Beregn mængden af farvestof, der kræves til den endelige reaktionsvolumen på 1 mL. Farvemærkning af en enkelt cystein skal udføres med overskydende farvestof ved et farvestof:protein molarforhold på mindst 3:1.
      BEMÆRK: Et eksempel på den beregning, vi brugte:
      60 μM endelig farvestofkoncentration × 1 mL sidste volumen = 370 μM indledende farvestofkoncentration × V farvestof, der skal tilføjes
    6. Beregn mængden af buffer ud fra det dialyse, der kræves for at justere den samlede reaktionsvolumen til 1 mL.
      BEMÆRK: Beregningseksempel: 1 mL - (V beregnet ud fra trin 2.2.4 + V beregnet ud fra trin 2.2.5)
    7. Forbered reaktion hætteglas med en magnet på toppen af en omrører.
    8. For det første tilsættes den beregnede mængde af proteinet og bufferen. Derefter tilsættes den beregnede mængde af farvestoffet (sulfo-Cy3 maleimid).
    9. Hold reaktionen ved stuetemperatur i mørke i en varighed på 3-5 timer.
    10. Afslut reaktionen ved at tilføje 2 mM DTT og fortsætte i en varighed på 1 time.
    11. Udfør tre runder dialyse mod Buffer A ved hjælp af dialyseposer med en 3,5 kDa cutoff for at fjerne overskydende frit farvestof fra opløsningen.
    12. Læg prøven på en størrelsesspaltekolonne for yderligere at adskille den mærkede α-Syn fra det frie farvestof.
    13. Bestem koncentrationen af ren mærket α-Syn ved at måle absorptionen af farvestoffet (absorptionskoefficient for sulfo-Cy3 er 162.000 M-1cm-1ved λ=548 nm).
    14. Hvis det er nødvendigt, skal du koncentrere den rene α-Syn-opløsning ved hjælp af en vakuumkoncentrator (f.eks. SpeedVac). Derefter udføre en runde dialyse mod buffer A, ved hjælp af dialyse poser med en 3,5 kDa cutoff og igen bestemme koncentrationen af mærket protein.
    15. Tilbered aliquots af den mærkede proteinprøve og opbevar dem ved -20 °C.

3. Målinger

  1. smPIFE eksperimentel opsætning
    BEMÆRK: Brug følgende konfokalbaserede opsætning eller lignende.
    1. Brug en pulserende laserkilde (i vores tilfælde λ = 532 nm picosecond pulserende laser med pulsbredde på ~ 100 ps FWHM), der opererer med en passende gentagelseshastighed (20 MHz i vores tilfælde) og dirigeres til SYNC af et tidskorreleret enkeltfototællingskort (TCSPC) som kilde til sulfo-Cy3 (sCy3) excitation.
    2. Brug et dichroisk spejl med høj reflektionsevne ved 532 nm, for at adskille excitation og spredning fra fluorescens.
    3. Brug en 100 μm diameter pinhole i fokus af det udsendte lys, efter at den kolimerede emissionsstråle var fokuseret af en linse, og før emissionsstrålen er blevet re-kollokveret af en anden linse.
    4. Brug et båndpasfilter (585/40 nm i vores tilfælde) til yderligere at filtrere sCy3 fluorescens fra andre lyskilder.
    5. Detekter fluorescens ved hjælp af en detektor (single-photon lavine diode eller hybrid photomultiplier, i vores tilfælde) dirigeres (gennem en 4-til-1 router, i vores tilfælde) til en TCSPC modul (Becker &Hickl SPC-150, i vores tilfælde).
      BEMÆRK: I vores tilfælde udføres dataindsamling via VistaVision-softwaren (ISSTM)i TTTR-filformatet (time-tagged-time-resolved).
  2. smPIFE prøveforberedelse
    1. Forbered 25 pM sCy3-mærket α-Syn i målinger buffer: 10 mM natriumacetat, 10 mM natrium dihydrogen fosfat, 10 mM glycin pH 8,0, 20 mM NaCl, 10 mM cysteamin og 1 mM 6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic syre (TROLOX), i et lavt proteinbindingsrør.
      BEMÆRK: Hvis α-Syn måles i nærværelse af SDS-vesikler, skal du også tilføje den relevante SDS-mængde.
    2. Skyl en 18-kammermikroskopicover slide med 100 μL på 1 mg/mL kvæg serum albumin (BSA) i en varighed på 1 minut, og fjern derefter BSA.
    3. Der tilsættes 100 μL af den 25 pM'erCy3-mærket α-Syn-prøve til et kammer i coverlip-diaset.
    4. Udfør smPIFE-måling af prøven ved hjælp af den beskrevne opsætning som følger i de næste trin.
  3. smPIFE dataindsamling
    1. Brug en høj numerisk blænde vand nedsænkning objektiv linse (i vores tilfælde, Olympus UPLSAPO 60x N.A. 1.2), og tilføje en dråbe ultra-rent vand på toppen af den objektive linse.
    2. Fix coverlip slide i et scenekammer og installere det på toppen af mikroskop fase.
    3. Bring den objektive linse opad, indtil vanddråben på toppen af den objektive linse udstrygninger i bunden af coverlip slide.
    4. Åbn laserskodderen, og bring objektivlinsen opad, mens du inspicerer mønsteret på et CMOS-kamera og samler lys spredt fra prøven. Overhold luftige ringe mønster: den første repræsenterer fokus på vand-glas interface, og derefter den anden repræsenterer fokus på grænsefladen mellem glasset og prøven løsning.
    5. Forøg højden af den objektive linse med yderligere 75 μm, hvilket bringer laserfokus dybt ind i opløsningen for at minimere auto-fluorescens fra glasoverfladen af coverlip.
    6. Tune laser magt på den objektive linse til at være ~ 100 μW.
    7. Start erhvervelsen af fundne fotoner i en foruddefineret tid (2 timer, i vores målinger).
      BEMÆRK: Størstedelen af købssignalet skal have en sats (målt i antal pr. sekund, cps), der svarer til den, der opnås ved måling af blot bufferen; millisekunder-binned data bør vise knappe foton burst begivenheder, med de fleste skraldespande har en gennemsnitlig sats, der kan sammenlignes med den typiske detektor baggrundsfrekvens (< 1.000 cps, i vores tilfælde).

4. smPIFE burst analyse

  1. Konvertering af rådata
    BEMÆRK: Dataene gemmes normalt i en binær fil med et format, der var foruddefineret af det firma, der fremstiller TCSPC-kortet (.spc-filer i vores tilfælde).
    1. Konverter den rå datafil til foton-HDF5 universelle filformat42, ved hjælp af software suite phconvert (https://github.com/Photon-HDF5/phconvert). Ring til den rå datafil som input og konverter til en raw data .hdf5-fil ved hjælp af den relevante kode i phconvert-pakken (Convert ns-ALEX Becker-Hickl-filerne til Photon-HDF5.ipynb Jupyter notebook, i vores tilfælde).
      BEMÆRK: Konverteringen til en .hdf5-fil omfatter: (1) bestemmelse af de relevante fotonstrømme i de rå data (dvs. fotonstrømme af registrerede fotoner af det relevante detektor-id); (2) de relevante foton nanotider (fotondetekteringstiderne i forhold til excitations SYNC-tiden) og (3) tilføjede metadata.
  2. Burst Søg og markering ved hjælp af FRETbursts43
    BEMÆRK: Alle foton-HDF5 raw data filer af smPIFE målinger, samt koden opsummerer analysen af de rå data, er gemt i Zenodo (https://doi.org/10.5281/zenodo.4587698). Alle nedenstående trin er detaljerede og vist i Jupyter notebooks, også leveret i Zenodo repository link.
    1. Åbn Jupyter Notebooks (inden for Anaconda-rammen, i vores tilfælde).
    2. Åbn den bærbare pc smPIFE-aSyn 56C(Cy3) 25 pM newBuffer (Endelig notesbog).ipynb (den findes i Zenodo-linket).
    3. Indlæs FRETbursts.
    4. Indlæs foton HDF5-datafilen.
    5. BG-ratevurdering: Ved hjælp af histogrammet af inter-foton gange beregnes baggrundsfrekvenserne (BG) for hvert 30. sekund af dataindsamlingen i foton HDF5-datafilen.
      BEMÆRK: Følgende trin beskriver burst-søgningen ved hjælp af skydevinduets algoritme44,45,46.
    6. Flytte et tidsvindue med m=20 på hinanden følgende fotoner, én foton ad gangen.
    7. Indsamle foton data kun, hvis den øjeblikkelige foton sats, ( Equation 1 ), er mindst F = 11 gange større end BG sats for denne periode af dataindsamlingen.
      BEMÆRK: En burst er konstrueret ud af alle de på hinanden følgende fotoner, der blev indsamlet ved at skubbe vinduet en foton ad gangen (trin 4.2.6.) og enig med foton sats kriterium (trin 4.2.7).
    8. Beregn følgende burst-egenskaber:
      Burst størrelse: mængden af fotoner i en burst.
      Burst varighed: tidsforskellen mellem den sidste og første foton afsløring gange i en burst.
      Burst lysstyrke: den største værdi af den øjeblikkelige fotonhastighed i en burst.
      Burst adskillelse: tidsintervallet mellem fortløbende byger.
      BEMÆRK: Følgende punkter beskriver den yderligere burst udvælgelsesprocedure.
    9. Plot histogrammet af burst lysstyrke værdier (den højeste øjeblikkelige foton sats i en burst), med begivenhedernes akse i logaritmisk skala.
    10. Definer tærsklen for burst lysstyrke som den minimale burst lysstyrke værdi, hvorfra histogrammet udviser et forfaldent mønster.
    11. Vælg bursts med lysstyrkeværdier, der er større end tærsklen for burst-lysstyrke.
      BEMÆRK: De næste skridt beskriver burst betyde fluorescens levetid.
    12. Plot histogrammet af foton nanotider for alle fotoner i alle udvalgte byger med foton tæller akse i logaritmisk skala.
    13. Definer nanotidstærsklen som den minimale nanotidsværdi, hvorfra histogrammet af foton nanotider udviser et forfaldent mønster.
    14. Vælg kun fotoner med nanotider, der er større end nanotidsgrænsen.
    15. Beregn det algebraiske gennemsnit af alle valgte foton nanotider.
    16. Træk nanotidstærsklen fra foton nanotime algebraisk gennemsnit. Resultatet er den gennemsnitlige foton nanotime af burst, som er direkte proportional med den gennemsnitlige fluorescens levetid.
    17. Plot histogramme af alle brast betyde fluorescens levetid. Centralt fordelte underpopulationer af fluorescenslevetid kan forekomme. Subpopulationer med lave værdigennemsnit repræsenterer molekylearter med sCy3, der ikke var sterisk blokeret, mens underpopulationer med højere værdigennemsnit repræsenterer molekylearter med sCy3, der var mere sterisk blokeret.
      BEMÆRK: De næste trin beskriver langsom mellem-burst dynamik baseret på burst gentagelse analyse47
    18. Plot histogrammet af burst separation gange, med adskillelse tid akse i logaritmisk skala.
      BEMÆRK: Der vises to delpopulationer af burst separationstider:
      En stor delpopulation med separationstider på sekunder, der repræsenterer på hinanden følgende udbrud, der stammer fra forskellige fortløbende målte molekyler.
      En mindre underpopulation med separationstider ~ <100 ms, der repræsenterer fortløbende udbrud, der begge stammer fra det samme molekyle, tilbagevendende tilbage gennem det konfokale volumen.
    19. Vælg denne indstilling for at gemme alle par på hinanden følgende udbrud, der er adskilt af mindre end en maksimal separationstid, der definerer underpopulationen af samme molekyle (<100 ms, i vores tilfælde).
    20. Plot et histogramme eller en scatter plot af den gennemsnitlige fluorescens levetid for den første og anden brister for alle par byger, der gentog sig under en vis adskillelse tid tærskel

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Som en IDP, når det ikke er bundet til en anden biomolekyle, α-Syn udviser strukturelle dynamik mellem flere konformationer, med overgange på få mikrosekunder40 og selv på hundredvis af nanosekunder41. Når α-Syn krydser det konfokale sted, kan det gennemgå tusindvis af overgange mellem konformationer. Dette var faktisk tilfældet , da smFRET blev brugt39,40. Her udfører vi smPIFE-målinger for at sondere den lokale kropsbygningsdynamik i α-Syn.

Målingen registrerer fluorescens fotoner, der udsendes fra en sulfo-Cy3 (sCy3) farvestof, knyttet til thiol gruppen af cystein i α-Syn A56C mutant. Den sCy3 fluorophore kan gennemgå isomerisering, når i ophidset tilstand. Men sCy3 udsender en foton, når det de-ophidser fra sin trans isomer. Derfor, hvis intet sterisk hindrer sCy3 ophidset-tilstand isomerisering, vil det udsende få fotoner i gennemsnit, men vil udvise en lav fluorescens quantum udbytte og kort fluorescens levetid. Men hvis den ophidsede tilstand isomerisering af sCy3 er blokeret af for eksempel overfladen af et nærliggende protein, vil isomeriseringshastigheden falde, hvilket igen vil føre til flere de-excitationer fra transisomeren og dermed flere fotoner, et højere fluorescenskvante udbytte og længere fluorescens levetid. Dette er bedre kendt som PIFE-effekten.

Ved hjælp af smPIFE målte vi den gennemsnitlige fluorescenslevetid for sCy3-mærkning α-Syn ved rest 56 en α-Syn ad gangen, hvor sCy3-farvestoffet registrerer proteinmiljøet omkring restkoncentration 56. Proteinet blev målt i en koncentration på 25 pM, hvor det hovedsageligt findes som en monomer. Resultaterne af smPIFE-målingerne er vist som histogrammer af middelstofcens levetid for enkelt- α-Syn molekyler (Figur 1). Den gennemsnitlige fluorescenslevetid kan grupperes i to større underpopulationer (figur 1A). Den første delpopulation udviser korte fluorescens levetid, med en karakteristisk fluorescens levetid på 1,6 ns, der repræsenterer α-Syn kropsbygningstilstande med ingen eller få proteinoverflader findes i nærheden af restkoncentrationer 56. Den anden delpopulation udviser længere fluorescens levetid, med en karakteristisk fluorescens levetid på 3,5 ns, der repræsenterer α-Syn kropsbygningstilstande med flere proteinoverflader findes i nærheden af rest 56.

Det er kendt, at i nærværelse af ~ 5-10 mM SDS, N-terminal og NAC segmenter af næsten alle de α-Syn molekyler i opløsning vedtage en spiralformet hårnål struktur ved binding til SDS vesikler40. Da rest 56 er placeret inden for NAC-segmentet, forventes fluorescens fra sCy3 mærkningsrest 56 at fornemme et ret ensartet mikromiljø, da størstedelen af næsten alle α-Syn-molekyler bør erhverve den vesikelbundne spiralformede hårnålstruktur. Derfor udførte vi lignende smPIFE målinger, men i nærværelse af 5 mM SDS som en kontrol, forventer at identificere en enkelt population af fluorescens levetid. Faktisk resulterer disse målinger i en enkelt population af fluorescens levetid med en karakteristisk fluorescens levetid på 3,1 ns (Figur 1B). Den karakteristiske fluorescenslevetid peger på en lokal struktur i nærheden af rest 56, der ikke findes i ~1,5 ns levetidsunderpopulation af α-Syn i opløsning, der understreger den strukturerende α-undergo Synes, når den spiralformede hårnål dannes, og bindingen til SDS-vesikeloverfladen er opstået. Interessant, at en enkelt befolkning har en kortere karakteristisk fluorescens levetid i forhold til ~ 3,5 ns levetid delpopulation af α-Syn i opløsning.

Udseendet af to forskellige centralt fordelte underpopulationer af enkeltmolekyleudbrud er en velkendt signatur af molekylær heterogenitet. Da der ikke er tale om en blanding af separate mærkede molekyler, repræsenterer begge underpopulationer af levetid to separate arter af sCy3-mærkningsrest 56 i α-Syn (Figur 1A). Derfor rapporterer resultaterne dynamisk heterogenitet. Dette skyldes, at parameteren, der rapporteres i histogrammet, beregnes ved hjælp af alle fotoner i en burst i løbet af de få ms varighed af den diffuse α-Syn inde i den konfokale volumen. Derfor krydsede sCy3-mærkede α-Syn molekyler det konfokale volumen, enten når de udviste en kort eller en lang gennemsnitlig levetid. Overgangene mellem disse arter skal ske langsommere end de karakteristiske diffusionstider gennem det konfokale sted, og dermed langsommere end nogle få millisekunder. For at vurdere denne dynamiske adfærd udførte vi burst-recurrence analyse47. Kort sagt, da vi søger at vurdere dynamikker, der forekommer til tider længere end varigheden af et enkeltmolekyle burst, testede vi muligheden for, at et enkelt α-Syn-molekyle udviser en ændring i sCy3 betyder fluorescenslevetid mellem på hinanden følgende krydsninger af det konfokale sted. For at gøre dette skelner vi først mellem to typer på hinanden følgende udbrud: i) på hinanden følgende byger af forskellige α-Syn molekyler med burst separation gange, der distribuerer på få sekunder, og ii) på hinanden følgende byger af samme α-Syn molekyle, der gentages i den confocal volumen efter en burst separation tid, til tider så langsomt som ~ 100 ms (Figur 2A). Efter de to gennemsnitlige underpopulationer i den gennemsnitlige levetid valgte vi at inspicere par på hinanden følgende udbrud, der er adskilt af højst 100 ms (Figur 2A), hvor den første ud af par af byger udviste gennemsnitlig fluorescenslevetid inden for den korte levetidsunderpopulation (0-2 ns) eller inden for den lange levetidsunderpopulation (>3,5 ns; Figur 2B, farvede nuancer). Inspektionstestene, hvilke af udbrud af tilbagevendende byger, repræsenteret ved den anden burst i par på hinanden følgende byger, udviser betyder fluorescens levetid inden for levetiden delpopulation modsat den i den første burst. Man kan konstatere, at en brøkdel af molekyler, der starter som en brast i den korte levetid delpopulation recur som en brast uden for dette interval og selv inden for den lange levetid delpopulation (Figur 2C), og at en brøkdel af molekyler, der starter som en brast i den lange levetid delpopulation recur som en brast uden for dette interval og endda inden for den korte levetid subpopulation (Figur 2D), alle inden for 10-100 ms.

Figure 1
Figur 1: Gennemsnitlige underpopulationer af sCy3-mærkningsrester i α-Syn A56C. gennemsnitlig fluorescens levetid histogrammer af frit diffuserende sCy3-mærket α-Syn A56C (ved 25 pM) i mangel (A) og tilstedeværelse (B) af 5 mM SDS. Klik her for at se en større version af dette tal.

Figure 2
Figur 2: PIFE burst gentagelsesanalyse viser, at enkelte molekyler gennemgår overgange mellem forskellige gennemsnitlige levetidsværdier inden for 100 ms. Fra top til bund: (A) histogrammet af separationstider mellem på hinanden følgende enkeltmolekyle brister. Den orange nuance repræsenterer adskillelsestider mellem på hinanden følgende byger af tilbagevendende molekyler, hvor den første og anden byger opstår fra det samme molekyle. (B) Den gennemsnitlige fluorescens levetid histogram af alle enkelt-molekyle brister. De gule og grønne nuancer repræsenterer rækkevidden af gennemsnitlige levetidsværdier, der er valgt til at repræsentere værdier inden for henholdsvis korte og lange gennemsnitlige underpopulationer for den gennemsnitlige levetid. (C) eller (D). Den gennemsnitlige fluorescens levetid histogrammer af byger, der blev adskilt fra en tidligere burst med en tid inden for orange-skraveret tidsskala (i A), og hvor den tidligere burst havde en gennemsnitlig levetid inden for området repræsenteret ved de gule eller grønne nuancer, henholdsvis. Klik her for at se en større version af dette tal.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Omfattende biokemiske og biofysiske undersøgelser blev udført for at studere de strukturelle egenskaber ved α-Syn og dens uordnede natur33,34,35,36,37,38. Flere værker har allerede brugt frit diffuserende smFRET til at undersøge den intra-molekylære dynamik i α-Syn monomer fri for binding. Disse værker rapporterede den høje dynamiske heterogenitet af α-Syn, hvilket fører til gennemsnit af flere forskellige strukturelle arter inden for de typiske diffusionstider gennem det konfokale sted, hvilket fører til udseendet af en enkelt FRET-population39,40. Man skal dog huske, at smFRET målinger rapport om ændringer i inter-dye afstande forekommer inden for 3-10 nm, en skala, der karakteriserer de samlede strukturelle ændringer i et lille protein som α-Syn.

Vi var nysgerrige efter, hvilke resultater vi kunne finde, når vi bruger en anden fluorescensbaseret sensor af rumlige ændringer inden for et protein, der er følsomt over for lokal strukturel dynamik, og som også er blevet udnyttet på enkeltmolekyleniveau. smPIFE kan spore lokale rumlige ændringer i nærheden sCy3 mærkning en bestemt aminosyre rest i 0-3 nm rækkevidde.

I denne undersøgelse brugte vi smPIFE til at undersøge dynamikken i lokale strukturer inden for α-Syn og mere specifikt lokale strukturændringer i nærheden af NAC-restkoncentrationen 56. Resultaterne tyder på, at regionen i nærheden af restkoncentrationer 56 i α-Syn udviser et par forskellige strukturelle underpopulationer, der er stabile nok termodynamisk til at interkonvertere så langsomt som 100 ms, og måske endnu langsommere. Disse underpopulationer identificeres ved inspektion af de gennemsnitlige fluorescenslevetid for målte sCy3-mærkede enkelt- α-Syn-molekyler. I disse underpopulationer, jo længere den karakteristiske fluorescens levetid delpopulationen er, jo mere nærliggende en protein overflade hindrer ophidset tilstand isomerisering af sCy3, og dermed jo tættere, at proteinoverfladen er til at sCy3-mærket rest.

Ligesom andre internt fordrevne er α-Syn blevet rapporteret at have interaktioner med andre biomolekyler samt selvtilknytning, hvor disse bindende hændelser i mange tilfælde indebærer stabilisering af en bestemt struktur inden for α-Syn-underenheden56,57,58,59. Nogle proteiner erhverver en bestemt struktur ved binding, via en induceret-fit mekanisme. Men andre proteiner spontant interkonvertere mellem flere forskellige konformationer, og den bindende begivenhed til en bestemt biomolekyle blot stabiliserer en af de allerede eksisterende konformationer. I sidstnævnte tilfælde er et af kravene, at den kropsbygning, der skal stabiliseres, vil overleve længe nok til at rumme den oprindelige binding. Derfor, jo længere en strukturel region i et protein overlever, jo højere vil bindingseffektiviteten være. Vi foreslår, at de observerede millisekunder-stabile underpopulationer repræsenterer eksistensen af forskellige arter af lokal struktur i nærheden af restkoncentration 56. Disse peger på forskellige lokale strukturarter i nærheden midt i NAC- og NTD-segmenterne. I et nyligt arbejde rapporterer vi dette og andre sCy3-mærkede rester i disse segmenter udviser også sådanne underpopulationer60. Dette resultat viser, at den strukturelle dynamik i den frie α-Syn monomer bedst kan beskrives som hurtig (få mikrosekunder højst40)samlede proteindynamik, der bærer lokale strukturelle segmenter, der forbliver stabile for millisekunder. Andre internt fordrevne såsom Tau og amyloid-β var kendt for at have lignende karakteristika ved at bære en lokal struktureret region48,49,50.

smPIFE er hovedsagelig blevet anvendt til at studere samspillet mellem separate biomolekyler. Her anvender vi smPIFE til at undersøge PIFE inden for segmenter af samme protein. Det er vigtigt at nævne, at de fleste tidligere smPIFE eksperimenter blev udført ved at spore relative ændringer i fluorescens intensiteter af enkelt immobiliseret sCy3-mærket molekyler13,14,15,16,17,18,19,51,52,53 . Selvom det er nyttigt for immobiliserede molekyler, er denne procedure mindre informativ, når du måler frit diffuserende enkeltmolekyler. Hwang et al. har vist, hvordan man måler PIFE-effekten også ved at spore ændringer i fluorescens levetider, som rapporterer direkte om ændringen i ophidset tilstand isomerisering dynamik sCy319. Her sonderer vi PIFE-effekten af enkelt diffusing α-Syn via sCy3 betyder fluorescens levetid, snarere end at spore relative ændringer i fluorescens intensiteter. Dermed var vi i stand til at erhverve PIFE-relaterede underpopulationer på trods af den korte opholdstid for hvert enkelt α Syn-molekylet på det konfokale sted. Faktisk viste den gennemsnitlige fluorescenslevetid sig at være nyttig, ikke kun ved definitionen af PIFE-relaterede underpopulationer, men også i vurderingen af langsom PIFE-relateret dynamik ved hjælp af burst recurrence analysis framework47. Der kræves dog mere arbejde med at udvikle procedurer, der gør det muligt at vurdere hurtigere PIFE-dynamik korrekt. Der er masser af eksisterende foton statistik værktøjer, der anvendes til at vurdere hurtig FRET dynamik i frit diffuse smFRET eksperimenter, som vi agter at genbruge til at blive brugt i smPIFE54,55.

Sammenfattende brugte vi i dette arbejde den relativt nye kombination af PIFE-målinger af frit diffuserende enkeltmolekyler til at identificere ms-stabile underpopulationer af lokale strukturer i α-Syn, som ikke blev genvundet af smFRET. Vi anvendte smPIFE-målinger til at studere α-Syn som model IDP, og vores resultater rækker ud over tidligere resultater af, at α-Syn er globalt uordnet. Resultaterne tyder på α-Syn kan bære ms-stabil bestilt lokale strukturer, og vi hypotese disse lokale strukturer kan tjene en rolle i bindende anerkendelse.

Hidtil har smPIFE været anvendt som middel til at studere interaktioner mellem sCy3-mærkede nukleinsyrer med deres umærkede proteinmodstykker51. Ved at smPIFE blev udnyttet som et kraftfuldt værktøj til at fornemme biomolekylær interaktioner, og derfor ville det naturlige næste skridt i den retning være at bruge det for at fornemme protein-protein interaktioner og deres dynamik, et kompleks ad gangen.

Kraften i at bruge en kortrækkende nærhedssensor som smPIFE kan hjælpe med at identificere stabil lokal strukturering inden for andre proteinsystemer, der betragtes som uorganiseret og strukturelt ustabil. Men kraften i at bruge en enkelt-molekyle fluorescens-baseret kort nærhed sensor stopper ikke der. Der er mange biomolekyliske systemer, der udviser kortskala kropsbygningsdynamik for at lette deres funktion, såsom mange ionkanaler. Vi mener, at smPIFE kan tjene som et værktøj, der supplerer enkeltmolekylet FRET, i sådanne tilfælde, hvor nærhedsændringernes dynamiske område ikke matcher det dynamiske afstandsområde, som FRET kan registrere og løse. Sammenfattende fremmer vi brugen af smPIFE som nærhedssensor, der supplerer FRET-målinger med et enkelt molekyle, for at dække en bredere skala af biomolekylær nærhed og observerer måske klare millisekunders gennemsnitlige underpopulationer af de målte parametre, der rapporterer om stabile strukturer, der enten er lokale eller overordnede.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Alle forfattere deler ingen interessekonflikt.

Acknowledgments

Den pT-t7 plasmid kodning A56C α-Syn mutant blev givet til os som en gave fra Dr. Asaf Grupi, Dr. Dan Amir og Dr. Elisha Haas. Dette papir blev støttet af National Institutes of Health (NIH, tilskud R01 GM130942 til E.L. som en subaward), Israel Science Foundation (tilskud 3565/20 inden for KillCorona - Curbing Coronavirus Research Program), Milner Fonden og Hebrew University of Jerusalem (start midler).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Amicon Ultra-15 Centrifugal Filter Units Merc C7715 cutoff: 100 kDa
ammonium sulfate Sigma-Aldrich A4418
BSA Sigma-Aldrich A9647
cysteamine Sigma-Aldrich 30070
dialysis bags - MEGA GeBaFlex-tube Gene Bio-Application MEGA320
dithiothreitol (DTT) Sigma-Aldrich 43815
ethylenediaminetetraacetic acid (EDTA) Sigma-Aldrich E5134
Fast SeeBand staining solution Gene Bio-Application SB050
Glycine Sigma-Aldrich 50046
D-Glucose Sigma-Aldrich G7021
HEPES Sigma-Aldrich 54457
HiTrap Desalting 5 mL Sigma-Aldrich GE17-1408
6-hydroxy-2,5,7,8-tetramethylchroman-2-carboxylic acid (TROLOX) Sigma-Aldrich 238813
isopropyl β-d-1-thiogalactopyranoside (IPTG) Sigma-Aldrich I5502
LB broth Sigma-Aldrich L3152
Magnesium chloride Sigma-Aldrich 63068
MonoQ column Sigma-Aldrich 54807
protein LoBind tube Sigma-Aldrich EP0030108094 0.5 mL
Rinse a µ-slide 18 Ibidi 81816
SDS Sigma-Aldrich 75746
Sodium acetate Sigma-Aldrich S2889
Sodium hydroxide Sigma-Aldrich S8045
Sodium phosphate monobasic monohydrate Sigma-Aldrich 71507
Sterile Cell spreaders, Drigalski spatulas mini-plast 815-004-05-001
streptomycin sulfate Sigma-Aldrich S9137
sulfo-Cy3 maleimide abcam ab146493
Tris(2-carboxyethyl)phosphine hydrochloride (TCEP) Sigma-Aldrich 75259
Tris-HCl Sigma-Aldrich 93363
Tryptone Sigma-Aldrich T7293
Yeast Extract Sigma-Aldrich Y1625

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Gust, A., et al. A starting point for fluorescence-based single-molecule measurements in biomolecular research. Molecules. 19 (10), 15824-15865 (2014).
  2. Weiss, S. Fluorescence spectroscopy of single biomolecules. Science. 283 (5408), 1676-1683 (1999).
  3. Haran, G. Single-molecule fluorescence spectroscopy of biomolecular folding. Journal of Physics Condensed Matter. 15 (32), R1291 (2003).
  4. Schuler, B., Lipman, E. A., Eaton, W. A. Probing the free-energy surface for protein folding with single-molecule fluorescence spectroscopy. Nature. 419 (6908), 743-747 (2002).
  5. Michalet, X., Weiss, S., Jäger, M. Single-molecule fluorescence studies of protein folding and conformational dynamics. Chemical Reviews. 106 (5), 1785-1813 (2006).
  6. Ha, T., Enderle, T., Ogletree, D. F., Chemla, D. S., Selvin, P. R., Weiss, S. Probing the interaction between two single molecules: Fluorescence resonance energy transfer between a single donor and a single acceptor. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 93 (13), 6264-6268 (1996).
  7. Deniz, A. A., et al. Single-molecule protein folding: Diffusion fluorescence resonance energy transfer studies of the denaturation of chymotrypsin inhibitor 2. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 97 (10), 5179-5184 (2000).
  8. Bialik, C. N., Wolf, B., Rachofsky, E. L., Ross, J. B. A., Laws, W. R. Dynamics of biomolecules: Assignment of local motions by fluorescence anisotropy decay. Biophysical Journal. 75 (5), 2564-2573 (1998).
  9. Jameson, D. M., Sawyer, W. H. Fluorescence anisotropy applied to biomolecular interactions. Methods in Enzymology. 246, 283-300 (1995).
  10. Kempe, D., Schöne, A., Fitter, J., Gabba, M. Accurate Fluorescence Quantum Yield Determination by Fluorescence Correlation Spectroscopy. Journal of Physical Chemistry B. 119 (13), 4668-4672 (2015).
  11. Callis, P. R., Liu, T. Quantitative Prediction of Fluorescence Quantum Yields for Tryptophan in Proteins. Journal of Physical Chemistry B. 108, 4248-4259 (2004).
  12. Lehrer, S. S. Solute Perturbation of Protein Fluorescence. The Quenching of the Tryptophyl Fluorescence of Model Compounds and of Lysozyme by Iodide Ion. Biochemistry. 10 (17), 3254-3263 (1971).
  13. Xie, K. X., Liu, Q., Jia, S. S., Xiao, X. X. Fluorescence enhancement by hollow plasmonic assembly and its biosensing application. Analytica Chimica Acta. 1144, 96-101 (2021).
  14. Stennett, E. M. S., Ciuba, M. A., Lin, S., Levitus, M. Demystifying PIFE: The Photophysics behind the Protein-Induced Fluorescence Enhancement Phenomenon in Cy3. Journal of Physical Chemistry Letters. 6 (10), 1819-1823 (2015).
  15. Nguyen, B., Ciuba, M. A., Kozlov, A. G., Levitus, M., Lohman, T. M. Protein Environment and DNA Orientation Affect Protein-Induced Cy3 Fluorescence Enhancement. Biophysical Journal. 117 (1), 66-73 (2019).
  16. Song, D., Graham, T. G. W., Loparo, J. J. A general approach to visualize protein binding and DNA conformation without protein labelling. Nature Communications. 7, 10976 (2016).
  17. Ploetz, E., et al. Förster resonance energy transfer and protein-induced fluorescence enhancement as synergetic multi-scale molecular rulers. Scientific Reports. 6, 33257 (2016).
  18. Hwang, H., Myong, S. Protein induced fluorescence enhancement (PIFE) for probing protein-nucleic acid interactions. Chemical Society Reviews. 43 (4), 1221-1229 (2014).
  19. Hwang, H., Kim, H., Myong, S. Protein induced fluorescence enhancement as a single molecule assay with short distance sensitivity. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (18), 7414-7418 (2011).
  20. Ray, P. C., Fan, Z., Crouch, R. A., Sinha, S. S., Pramanik, A. Nanoscopic optical rulers beyond the FRET distance limit: Fundamentals and applications. Chemical Society Reviews. 43, 6370-6404 (2014).
  21. Chen, H., Rhoades, E. Fluorescence characterization of denatured proteins. Current Opinion in Structural Biology. 18 (4), 516-524 (2008).
  22. Alderson, T. R., Markley, J. L. Biophysical characterization of α-synuclein and its controversial structure. Intrinsically Disordered Proteins. 1 (1), 18-39 (2013).
  23. Mane, J. Y., Stepanova, M. Understanding the dynamics of monomeric, dimeric, and tetrameric α-synuclein structures in water. FEBS Open Bio. 6 (7), 666-686 (2016).
  24. Wang, W., et al. A soluble α-synuclein construct forms a dynamic tetramer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (43), 17797-17802 (2011).
  25. Bartels, T., Choi, J. G., Selkoe, D. J. α-Synuclein occurs physiologically as a helically folded tetramer that resists aggregation. Nature. 477 (7362), 107-110 (2011).
  26. Ulmer, T. S., Bax, A., Cole, N. B., Nussbaum, R. L. Structure and dynamics of micelle-bound human α-synuclein. Journal of Biological Chemistry. 280 (10), 9595-9603 (2005).
  27. Georgieva, E. R., Ramlall, T. F., Borbat, P. P., Freed, J. H., Eliezer, D. Membrane-bound α-synuclein forms an extended helix: Long-distance pulsed ESR measurements using vesicles, bicelles, and rodlike micelles. Journal of the American Chemical Society. 130 (39), 12856-12857 (2008).
  28. Trexler, A. J., Rhoades, E. α-Synuclein binds large unilamellar vesicles as an extended helix. Biochemistry. 48 (11), 2304-2306 (2009).
  29. Stephens, A. D., Zacharopoulou, M., Kaminski Schierle, G. S. The Cellular Environment Affects Monomeric α-Synuclein Structure. Trends in Biochemical Sciences. 44 (5), 453-466 (2019).
  30. Illes-Toth, E., Dalton, C. F., Smith, D. P. Binding of dopamine to alpha-synuclein is mediated by specific conformational states. Journal of the American Society for Mass Spectrometry. 24 (9), 1346-1354 (2013).
  31. Frimpong, A. K., Abzalimov, R. R., Uversky, V. N., Kaltashov, I. A. Characterization of intrinsically disordered proteins with electrospray inization mass spectrometry: Conformationl heterogeneity of α-synuciein. Proteins: Structure, Function and Bioinformatics. 78 (3), 714-722 (2010).
  32. Sandal, M., et al. Conformational equilibria in monomeric α-synuclein at the single-molecule level. PLoS Biology. 6 (1), e6 (2008).
  33. Brodie, N. I., Popov, K. I., Petrotchenko, E. V., Dokholyan, N. V., Borchers, C. H. Conformational ensemble of native α-synuclein in solution as determined by short-distance crosslinking constraint-guided discrete molecular dynamics simulations. PLoS Computational Biology. 15 (3), e1006859 (2019).
  34. Ullman, O., Fisher, C. K., Stultz, C. M. Explaining the structural plasticity of α-synuclein. Journal of the American Chemical Society. 133 (48), 19536-19546 (2011).
  35. Binolfi, A., Theillet, F. X., Selenko, P. Bacterial in-cell NMR of human α-synuclein: A disordered monomer by nature? Biochemical Society Transactions. 40 (5), 950-954 (2012).
  36. Waudby, C. A., et al. In-Cell NMR Characterization of the Secondary Structure Populations of a Disordered Conformation of α-Synuclein within E. coli Cells. PLoS ONE. 8 (8), e72286 (2013).
  37. Yu, J., Malkova, S., Lyubchenko, Y. L. α-Synuclein Misfolding: Single Molecule AFM Force Spectroscopy Study. Journal of Molecular Biology. 384 (4), 992-1001 (2008).
  38. Guerrero-Ferreira, R., Kovacik, L., Ni, D., Stahlberg, H. New insights on the structure of alpha-synuclein fibrils using cryo-electron microscopy. Current Opinion in Neurobiology. 61, 89-95 (2020).
  39. Trexler, A. J., Rhoades, E. Single molecule characterization of α-synuclein in aggregation-prone states. Biophysical Journal. 99 (9), 3048-3055 (2010).
  40. Ferreon, A. C. M., Gambin, Y., Lemke, E. A., Deniz, A. A. Interplay of α-synuclein binding and conformational switching probed by single-molecule fluorescence. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (14), 5645-5650 (2009).
  41. Rezaei-Ghaleh, N., et al. Local and Global Dynamics in Intrinsically Disordered Synuclein. Angewandte Chemie - International Edition. 57 (46), 15262-15266 (2018).
  42. Ingargiola, A., Laurence, T., Boutelle, R., Weiss, S., Michalet, X. Photon-HDF5: An Open File Format for Timestamp-Based Single-Molecule Fluorescence Experiments. Biophysical Journal. 110 (1), 26-33 (2016).
  43. Ingargiola, A., Lerner, E., Chung, S. Y., Weiss, S., Michalet, X. FRETBursts: An open source toolkit for analysis of freely-diffusing Single-molecule FRET. PLoS ONE. 11 (8), e0160716 (2016).
  44. Ingargiola, A., et al. Multispot single-molecule FRET: Highthroughput analysis of freely diffusing molecules. PLoS ONE. 12 (4), e0175766 (2017).
  45. Eggeling, C., Fries, J. R., Brand, L., Günther, R., Seidel, C. A. M. Monitoring conformational dynamics of a single molecule by selective fluorescence spectroscopy. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 95 (4), 1556-1561 (1998).
  46. Fries, J. R., Brand, L., Eggeling, C., Köllner, M., Seidel, C. A. M. Quantitative identification of different single molecules by selective time-resolved confocal fluorescence spectroscopy. Journal of Physical Chemistry A. 102, 6601-6613 (1998).
  47. Hoffmann, A., et al. Quantifying heterogeneity and conformational dynamics from single molecule FRET of diffusing molecules: Recurrence analysis of single particles (RASP). Physical Chemistry Chemical Physics. 13 (5), 1857-1871 (2011).
  48. Eakin, C. M., Berman, A. J., Miranker, A. D. A native to amyloidogenic transition regulated by a backbone trigger. Nature Structural and Molecular Biology. 13 (3), 202-208 (2006).
  49. Jahn, T. R., Parker, M. J., Homans, S. W., Radford, S. E. Amyloid formation under physiological conditions proceeds via a native-like folding intermediate. Nature Structural and Molecular Biology. 13 (3), 195-201 (2006).
  50. Chen, D., et al. Tau local structure shields an amyloid-forming motif and controls aggregation propensity. Nature Communications. 10 (1), 2493 (2019).
  51. Lerner, E., Ploetz, E., Hohlbein, J., Cordes, T., Weiss, S. A Quantitative Theoretical Framework for Protein-Induced Fluorescence Enhancement-Förster-Type Resonance Energy Transfer (PIFE-FRET). Journal of Physical Chemistry. B. 120 (26), 6401-6410 (2016).
  52. Valuchova, S., Fulnecek, J., Petrov, A. P., Tripsianes, K., Riha, K. A rapid method for detecting protein-nucleic acid interactions by protein induced fluorescence enhancement. Scientific Reports. 6, 39653 (2016).
  53. Qiu, Y., Myong, S. Single-Molecule Imaging With One Color Fluorescence. Methods in Enzymology. 581, 33-51 (2016).
  54. Lerner, E., et al. Toward dynamic structural biology: Two decades of single-molecule Förster resonance energy transfer. Science. 359 (6373), eaan1133 (2018).
  55. Lerner, E., et al. FRET-based dynamic structural biology: Challenges, perspectives and an appeal for open-science practices. Elife. 10, e60416 (2021).
  56. Wang, W., et al. A soluble α-synuclein construct forms a dynamic tetramer. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 108 (43), 17797-17802 (2011).
  57. Bartels, T., Choi, J. G., Selkoe, D. J. α-Synuclein occurs physiologically as a helically folded tetramer that resists aggregation. Nature. 477 (7362), 107-110 (2011).
  58. Ulmer, T. S., Bax, A., Cole, N. B., Nussbaum, R. L. Structure and dynamics of micelle-bound human α-synuclein. Journal of Biological Chemistry. 280 (10), 9595-9603 (2005).
  59. Georgieva, E. R., Ramlall, T. F., Borbat, P. P., Freed, J. H., Eliezer, D. Membrane-bound α-synuclein forms an extended helix: Long-distance pulsed ESR measurements using vesicles, bicelles, and rodlike micelles. Journal of the American Chemical Society. 130 (39), 12856-12857 (2008).
  60. Chen, J., et al. The structural heterogeneity of α-synuclein is governed by several distinct subpopulations with interconversion times slower than milliseconds. Structure. 29 (9), (2021).

Tags

Biokemi udgave 171 Enkeltmolekyle proteininduceret fluorescensforbedring fluorescenslevitet α-Synuclein konformationer dynamik iboende uorganiseret protein
Udnyttelse af tidsforelt protein-induceret fluorescensforbedring til at identificere stabile lokale konformationer En α-Synuclein Monomer ad gangen
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Zaer, S., Lerner, E. Utilizing… More

Zaer, S., Lerner, E. Utilizing Time-Resolved Protein-Induced Fluorescence Enhancement to Identify Stable Local Conformations One α-Synuclein Monomer at a Time. J. Vis. Exp. (171), e62655, doi:10.3791/62655 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter