Summary
肝脏疾病是由许多促进纤维化或肝硬化的原因引起的。移植是恢复健康的唯一选择。然而，鉴于可移植器官的稀缺性，必须探索替代方案。我们的研究提出了从动物模型中将胶原支架植入肝脏组织。
Abstract
肝病是全球死亡的主要原因。过量饮酒、高脂肪饮食和丙型肝炎病毒感染会促进纤维化、肝硬化和/或肝细胞癌。肝移植是临床推荐的手术，以改善和延长晚期疾病患者的寿命。然而，只有10%的移植是成功的，器官可用性，术前和术后手术以及与该结果直接相关的成本升高。细胞外基质（ECM）支架已成为组织修复的替代方案。生物相容性和接枝接受度是这些生物材料的主要有益特征。尽管在肝脏切除术模型中已经评估了恢复肝脏大小和正确功能的能力，但尚未评估使用支架或某种支持来替换已消失的肝脏肿块的体积。
在大鼠肝脏中进行部分肝切除术，从牛髁异种植入胶原基质支架（CMS）。切除左肝叶组织（约40%），手术植入相同比例的CMS。在手术前后评估肝功能检查。第3天，第14天和第21天后，对动物实施安乐死，并进行宏观和组织学评估。在第3天和第14天，在CMS周围观察到脂肪组织，没有排斥或感染的临床证据，第21天的血管新形成和CMS重吸收也是如此。有组织学证据表明，炎症过程和邻近细胞向CMS的迁移是微不足道的，用苏木精和曙红（H&E）以及Masson的三色染色观察到。CMS被证明在肝组织中表现良好，可能是研究慢性肝病组织再生和修复的有用替代方案。
Introduction
肝脏是参与维持体内平衡和蛋白质产生的最重要器官之一1。不幸的是，肝病是全球死亡的主要原因。在肝损伤的晚期阶段，包括肝硬化和肝细胞癌，肝移植是临床推荐的程序。然而，由于供体的稀缺和成功移植率低，组织工程（TE）和再生医学（RM）的新技术已经开发出来2，3。
TE涉及使用干细胞，支架和生长因子4来促进发炎，纤维化和水肿器官和组织的恢复1，5，6。支架中使用的生物材料模仿天然ECM，为引导细胞重塑提供物理，化学和生物线索7。胶原蛋白是从真皮，肌腱，肠和心包8，9中获得的最丰富的蛋白质之一。此外，胶原蛋白可以作为生物聚合物获得，通过生物打印或静电纺丝产生二维和三维支架10，11。该小组是第一个报告使用骨源胶原蛋白进行肝组织再生的组织。另一项研究报告了使用从牛胶原蛋白合成的支架，该支架是从皮肤获得的，具有均匀且紧密排列的毛孔，它们之间没有任何通讯12。
去细胞化保留了天然的ECM，允许随后掺入具有干细胞电位的细胞13，14。然而，该程序仍处于实验阶段，在肝脏，心脏，肾脏，小肠和膀胱中来自小鼠，大鼠，兔子，猪，羊，牛和马3，14。目前，切除的肝脏质量体积在任何动物肝切除术模型中都没有被替换。然而，使用额外的支持或网络（生物材料）使细胞增殖和血管生成对于迅速恢复肝实质功能可能是必不可少的。因此，支架可以用作再生或修复慢性肝病组织的替代方法，从而消除由于捐赠和肝移植的临床并发症而产生的局限性。
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Protocol
本研究已获得墨西哥国立自治大学医学院伦理委员会（DI/115/2015）和墨西哥总医院伦理委员会（CI/314/15）的批准。该机构符合实验动物生产，护理和使用的所有技术规范，并通过了国家法律（NOM-062-ZOO-1999）的法律认证。本研究从墨西哥国立自治大学医学院实验动物设施获得体重150-250克（6-8周龄）的雄性Wistar大鼠。
1. 从牛股骨获得胶原基质支架
- 从墨西哥卫生和农业当局认证的屠宰场从牛股骨获得髁突。
- 用手术器械仔细解剖髁突脂肪、肌肉和软骨。使用锯切刀将髁突碎片切成3 cm x 3 cm的碎片，并用毛巾清洁脂肪和血液。用水清洗髁突碎片。
- 用1L阴离子洗涤剂（10g / L）煮沸（92°C）片段30分钟。将髁突碎片洗涤两次，以除去阴离子洗涤剂的任何残留物。
- 使用滤纸（0.5毫米）干燥髁突碎片3小时。
- 准备一个三角形（1厘米x1厘米x1厘米）CMS，厚度为0.5厘米，距离步骤1.1中提到的碎片（图1A）。
- 在100 mL 0.5 M HCl中脱矿质10分钟，不断搅拌。取出盐酸盐。
注意：用氢氧化钠（10 M）中和HCl。 - 用100 mL蒸馏水冲洗碎片三次，每次15分钟，不断搅拌。用滤纸（0.5毫米）干燥CMS1小时。
- 使用立体显微镜15分析CMS的结构特性（孔的大小，孔隙形成和多孔互连）（图1B）。
- 使用扫描电子显微镜16分析CMS小梁的粗糙表面（图1C）。
- 使用解剖仪器进行混合和拉伸，以评估CMS的机械变化（可塑性和柔韧性）（图1D）。
- 将CMS装入灭菌袋中，并用过氧化氢等离子体灭菌38分钟。将无菌CMS存放在20-25°C的干燥区域的原始包装中，直到使用。
- 在100 mL 0.5 M HCl中脱矿质10分钟，不断搅拌。取出盐酸盐。
2. 手术区域的准备以及动物模型的处理和准备
- 用2%氯己定溶液消毒手术区域，工作台，显微手术显微镜和座椅。通过热灭菌对所有手术器械、手术海绵、拭子和一次性手术悬垂物进行灭菌 （121 °C/30 分钟/100 kPa）
- 将大鼠（n = 5）分为三组，每组五只大鼠：1.假，2.肝切除术和3.肝切除术加CMS，并在第3天，第14天和第21天跟踪所有组。
- 在后肢肌内注射氯胺酮（35 mg / kg）和木拉嗪（2.5 mg / kg）。
注意：镇静期通常持续30-40分钟。 - 使用手术肥皂和双刃刀片剃须腹部皮肤（5 cm x 2 cm），并使用局部10%聚维酮碘溶液在三轮中消毒皮肤17。
- 将动物放在位于背侧卧位的温板上，颈部过度伸展以保持可通透的气道（图2）。
- 通过呼吸模式评估麻醉深度和四肢戒断反射的丧失。
- 在剃须的皮肤周围放置一次性手术悬垂物，并用手术刀在白化线上做一个切口（2.5厘米），使用xiphoid工艺作为参考点。避免腹壁血管，防止出血。
- 将腹部牵开器放置到位并观察腹腔。使用解剖镊子，提取左肝叶并将其放在金属板上（图3A）。
注意：在假组中，仅提取左肝叶，然后将肝脏返回腹腔。用3-0尼龙缝合腹壁和皮肤。 - 在有和没有CMS的实验组中，使用手术刀刀片和无菌手术刀刀片（#15）进行肝切除术（约40%），并进行两次切割。使用三角形金属模板（1 cm x 1 cm x 1 cm）进行肝切除术（图3B）。
- 为了防止肝脏出血，用拭子在肝脏边缘保持手术按压5分钟。
- 在手术前将CMS在无菌盐水溶液中加水20分钟。在肝切除术部位植入CMS，在肝脏组织和CMS之间缝合四针，以防止生物材料的位移。使用7-0不可吸收的聚丙烯缝合线（图3C）。
注意：不要在第二次手术中移除缝合线;缝合线可用作识别CMS植入部位的参考。 - 将肝脏放回腹腔，并用3-0尼龙缝合腹壁和皮肤。用手术浸透碘的海绵分两轮清洁手术切口。观察和监测动物的生命体征。
- 在后肢肌内注射氯胺酮（35 mg / kg）和木拉嗪（2.5 mg / kg）。
3. 术后护理
- 在后肢肌内注射葡甲胺氟尼辛（2.5 mg / kg）。根据机构动物护理和使用委员会的批准管理镇痛药。
- 为了恢复麻醉，将动物放在带有实验室动物垫料的单独聚碳酸酯盒中，该盒子位于温度控制（23°C）的无噪音区域。
- 观察动物的恢复情况，并监测它们的水和食物消耗2小时。根据机构动物护理和使用委员会的批准，在术后监测动物。
4. 血清肝功能的评估
- 在手术前和评估第3天，第14天和第21天从麻醉动物的侧尾静脉收集血液样本（500μL）（基线值）。
- 在室温（23°C）下以850×g / 10分钟离心血液样品; 分离血清并将其储存在-80°C直至使用。
- 进行一系列肝功能检查：血清白蛋白（ALB），碱性磷酸酶（ALP），丙氨酸氨基转移酶（ALT），天冬氨酸氨基转移酶（AST），总胆红素（TB）和直接胆红素（DB）（表1）。
5. 安乐死和组织管理
- 按照上述方案对每次评估（第3天，第14天和第21天）的动物进行麻醉。
- 通过机构动物护理和使用委员会批准的方法实施安乐死。
- 用手术刀在 肺动脉上做一 个切口（5-6厘米），观察腹腔器官，并拍摄假体的肝切除术区域和实验组的照片，有和没有CMS。
- 从所有研究组动物中取出肝脏样本（2 cm x 2 cm; 0.40-0.45 g），并将它们置于4%甲醛溶液中24小时，以进行随后的组织学评估。
6. 组织学分析
- 将肝脏组织保存在4%甲醛中，并使用一系列酒精浓度（60%，70%，80%，90%，100%）使组织脱水;将它们置于二甲苯（1h）中并将它们嵌入石蜡16中。
- 用切片机将石蜡块切成4μm厚的部分，以制备八张载玻片。
- 执行H&E和Masson的三色染色16。
- 在光学显微镜下观察染色切片，以选择肝脏的代表性区域，有和没有CMS。获得4倍、10倍和40倍放大倍率的显微照片，并使用适当的软件18处理图像（参见 材料表）。
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Representative Results
骨脱矿质会影响CMS的机械性能，而不会改变其毛孔的原始形状或相互连接。CMS可以具有任何形状，因此，可以调整到所选器官或组织的大小和形状19。在目前的协议中，我们使用三角形CMS（图1A-D）。使用大鼠模型评估CMS异种激素在肝脏中的再生能力。尽管肝脏是一个易碎和柔软的器官，但在该协议中进行的外科手术确保了CMS保持在原位（图2和图3A-C）。左叶40%的部分肝切除术能够评估器官的一部分，保持肝脏的其余部分完整，以便可以比较植入物和天然实质的变化。此外，我们获得了血液样本，以评估CMS植入前后的肝功能。
假组和不植入CMS的实验组在3和14 d时生化参数的基线浓度没有差异;它们保持在参考值内（ALB： 0.43-2.41 g/dL;ALP： 134-357.3 U/L;ALT： 41-83.1 UI/L;AST： 61.4-276.2 学时/升;结核病： 0.01-0.43 毫克/分升;DB： 0.1 毫克/分升）20.此外，假组和实验组在21天时的白蛋白，ALP，ALT，AST，TB和DB水平没有差异，表明CMS不会破坏肝功能（表1）。
在安乐死期间，剖腹探查术揭示了肝脏的典型颜色以及正确的大小和形状。在任何病例中，在植入部位均未观察到炎症或感染。在第3天，器官相对于腹腔没有变化（图4A）。在含有肝脏组织和CMS的部分，观察到血液已经浸润CMS，具有早期粘附的网膜脂肪（图4B）。在第14天，脂肪量增加;存在血管新形成并将CMS整合到受体肝组织中，但小肠或腹腔器官没有变化（图5A）。与CMS植入部位的内脏区（图5C）相比，前区（图5B）的网膜脂肪更高。在评估第21天，CMS掺入肝脏更明显（图6A）。网膜脂肪的增加可以用作再生进展的指标，因为它是间充质干细胞21的来源。此外，在21天时，肝脏呈现出对应于降解和吸收的致密区域，改变了大小和原始形状（图6B）。
为了使用CMS植入物分析肝脏的微观结构，我们对植入部位的代表性组织片段进行了组织学分析，并将其与来自右肝叶的组织（对照）进行了比较。在第3天，第14天和第21天进行的活检被处理并接受H&E和Masson的三色染色。在第21天的假组中观察到肝实质的正常结构（图7A和图7E）。在第3天，组织学分析显示，肝脏中CMS的存在不会促进异物反应，并且观察到松弛结缔组织的明显存在（图7B和图7F）。在第14天和第21天，松弛的结缔组织更加丰富，CMS小梁被肝细胞包围，表明肝细胞已经迁移到CMS（图7C和图7G;图 7D 和图 7H）。结果还显示了由容器灌溉的肝细胞区域（图8A）。仔细检查显示，粘附在CMS小梁上的肝细胞有时被松弛的结缔组织包围（图8B-D）。两名双盲独立病理学家进行了组织病理学分析。基于免疫组织化学和聚合酶链反应的测定正在进行中，以评估与肝脏再生过程相关的不同蛋白质和基因。
因此，宏观和微观观察以及生化值支持我们的主张，即CMS是支持和促进肝脏再生的理想生物材料。然而，CMS植入必须评估超过21天，以确定其吸收时间和完整的肝组织恢复。此外，还应进行评估在存在CMS的情况下与肝脏再生相关的不同蛋白质和基因的研究。
图1：骨标本和CMS.（A）使用骨标本的三角形样本来制备CMS。（B） 通过电子显微镜观察CMS的孔隙和互连或小梁连接的详细视图。（C） CMS，如在体视显微镜下所见。（D） 使用仪器进行CMS操作以验证机械性能的修改。缩写：CMS = 胶原基质支架。请点击此处查看此图的放大版本。
图2：准备动物进行手术。 该动物处于褥疮背侧位置，显示剃光的腹部区域，准备进行肝切除术和CMS植入。缩写：CMS = 胶原基质支架。 请点击此处查看此图的放大版本。
图3：肝脏左叶的肝切除术。（A）将左叶提取并放置在金属板上进行肝切除术。（B）40%的左叶的肝切除术以三角形进行，如CMS。（C）肝切除术的区域被CMS取代。缩写：CMS = 胶原基质支架。请点击此处查看此图的放大版本。
图4：评估的第3天（A）评估第3天植入部位的宏观观察。植入（填充星形）CMS（虚线）的肝脏在颜色或大小上没有变化。小肠（空星）和腹部结构的其余部分没有变化。（B） 肝脏样本（填充星）和CMS（白色箭头）覆盖着网膜脂肪（红色箭头）。缩写：CMS = 胶原基质支架。请点击此处查看此图的放大版本。
图5：评估的第14天（A）评估第14天植入部位的宏观观察。带有CMS的肝脏组织（填充的星星）的颜色或大小没有变化。小肠（空星）和腹腔的其余部分结构和器官没有变化。植入CMS的肝脏样本：（B）前视图;（C） 后/内脏视图。红斑脂肪（红色箭头）覆盖该区域。CMS被整合到肝脏组织中。网膜脂肪（红色箭头）主要覆盖前视图的区域。虚线表示CMS植入的部位;缝合线（蓝色线）。缩写：CMS = 胶原基质支架。请点击此处查看此图的放大版本。
图6：评估的第21天。（A）评估第21天植入部位的宏观观察。植入CMS（虚线）的受体肝脏（填充星）没有改变颜色或大小。小肠（空星）和腹部结构的其余部分没有变化。（B） 植入CMS（虚线）的肝脏样本显示大小和形状的变化。缩写：CMS = 胶原基质支架。请点击此处查看此图的放大版本。
图7：CMS的肝脏和肝脏的组织学。 （A） 正常肝脏 （SHAM） 显示特征性组织结构。（B） CMS 植入的第 3 天显示 CMS 小梁（虚线椭圆形）中的结缔组织松弛。（C）天然肝脏（右侧）和CMS（左侧）之间的过渡带，以及CMS的小梁（箭头）。（D） 第21天与CMS（虚线）接触的天然肝脏。（E） 正常肝脏伴有马森三色染色。（F） 将CMS植入肝脏;第3天侵袭松弛结缔组织（虚线椭圆形）。（G） 在第14天，原生肝与CMS小梁，显示原生肝脏外的肝细胞（填充星）区域，表明原生肝细胞已经通过CMS迁移。（H） 在第21天，原生肝细胞已经向CMS迁移（箭头）。 A 和 E： 比例尺 = 200 μm： 4x， B-D 和 F-H： 比例尺 = 100 μm： 10x. A-D： H&E 染色; E-H： 马森的三色染色。缩写： CMS = 胶原基质支架;H&E = 苏木精和曙红。 请点击此处查看此图的放大版本。
图8：肝脏和CMS的组织学（A）CMS的小梁中存在的肝细胞池（白色箭头）（黑色箭头）。肝细胞由容器（填充的星星）灌溉。（B）肝细胞（白色箭头）已经迁移并粘附在CMS的小梁（黑色箭头）上。（C）在CMS的两个小梁（黑色箭头）之间观察到一组肝细胞（虚线圆圈）。（D）肝细胞在存在松弛的结缔组织（虚线椭圆形）的情况下粘附在CMS的小梁（黑色箭头）上。A和C： 比例尺 = 100 μm： 10x. B和D：比例尺 = 20 μm： 40x.缩写：CMS = 胶原基质支架。请点击此处查看此图的放大版本。
| 日 | 假 | 肝切除术 | 植入式内容管理系统 | |
| 肺碱度 （克/分升） | 3 | 1.4±0 | 2007±0.25 | 1.4±0 |
| 14 | 1.3±0.5 | 1.85±0.07 | 1.8±0.14 | |
| 21 | 1.3±05 | 1.6±0.1 | 1.7± 0 | |
| 备选案文 （国际单位/升） | 3 | 73±1.4 | 3.5±0.7 | 54.6±6.4 |
| 14 | 84±0 | 59.5±4.9 | 57±4.2 | |
| 21 | 58±0 | 73.5±14.8 | 73.5±14.8 | |
| 空闲置 技术（国际单位/升） | 3 | 106±1.4 | 80±6.6 | 90±1.4 |
| 14 | 127±5.5 | 94±21.2 | 83.5±17.6 | |
| 21 | 123.7±27.3 | 92.5±24.7 | 101±31.1 | |
| 结核 （毫克/分升） | 3 | 0.33±0.05 | 0.25±0.07 | 0.3±0 |
| 14 | 0.5±0 | 0.2±0 | 0.15±0 | |
| 21 | 0.3±0 | 0.4±0 | 0.4±0.14 | |
| 分贝 （毫克/分升） | 3 | 0.1±0 | 0.05±0.07 | 0.1±0 |
| 14 | 0.1±0 | 0.1±0 | 0.1±0 | |
| 21 | 0.1±0 | 0.1±0 | 0.1±0 |
表1：肝功能。 在3天，14天和21天对假组和没有CMS的假组和实验组进行肝功能检查。缩写： CMS = 胶原基质支架;ALB = 白蛋白;ALP = 碱性磷酸酶;ALT =丙氨酸氨基转移酶;AST = 天冬氨酸氨基转移酶;结核病=总胆红素;DB = 直接胆红素。
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Discussion
器官移植是肝纤维化或肝硬化患者的主要治疗方法。少数患者从这一程序中受益，因此有必要为等待名单上的患者提供治疗替代方案。组织工程是一种有前途的策略，采用支架和具有再生潜力的细胞2，4，13。切除肝脏的一部分是该过程的关键步骤，因为该血管化器官大量出血。因此，必须进行手术床止血以防止这种并发症。此外，通过使用缝合线促进肝组织与CMS的结合，这对于确保组织 - 生物材料相互作用至关重要。但是，必须小心谨慎，以避免撕裂肝脏并导致以后出血。
虽然这里提出的生物材料是牛源的（异种），但没有大鼠生物材料反应的数据，这使得选择性肝切除术成为可能。相比之下，2/3肝切除术模型已被证明由于切除了大量的肝脏组织而导致动物死亡14。此外，我们开发了一种不锈钢金属模板，因为我们难以标准化肝切除术和CMS中的尺寸。CMS的灭菌具有挑战性，因为现有技术改变了胶原蛋白的结构及其生化特性。因此，在确定过氧化氢的等离子体是最佳技术之前，探索了通过热，伽马辐射和环氧乙烷进行灭菌作为灭菌方法13。
必须确定可植入肝脏的CMS的最大尺寸，并在全身水平上评估生物学反应。此外，有必要优化和研究该技术在较大动物物种中的功效。此外，重要的是要研究CMS在肝脏中植入更长时间（>30天）的影响，这将允许评估CMS的生物吸收程度和肝脏组织的再生。此外，必须在肝损伤的动物模型中检查CMS植入的效果。这种植入方法为探索恢复切除组织的形状和体积的策略打开了大门，从而减少了麻醉，手术持续时间和恢复时间4，13。
CMS是从天然来源获得的，并且与使用复杂方法（例如生物打印或静电纺丝）制成的合成生物材料相比，保留了其物理和化学性质，这些材料不具有生物相容性或生物可吸收性2，3。该CMS的主要成分是I型胶原蛋白，它是ECM的主要蛋白质，可实现细胞粘附和增殖22。此外，CMS孔的小梁使细胞迁移和生长因子，血液和再生过程的其他介质的连续流动成为可能。根据要修复的组织，该研究小组具有设计不同形状的CMS，保留其3D结构的经验。例如，将圆柱形CMS植入猪的狗尿道和胆管中，并在组织再生中产生了有希望的结果23，24。
植入该CMS可能是一种替代疗法，以刺激组织再生并恢复肝硬化中由于不同病因（例如，病毒，酒精，代谢因素）而引起的纤维发生 - 纤维溶解平衡。必须进行增殖，迁移和炎症测定，以确定CMS触发的分子和细胞机制。总之，本文描述了一种可重复的肝切除术过程以及通过生物材料的异种植入来检查再生过程。
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Disclosures
作者声明他们没有相互竞争的经济利益。Benjamín León-Mancilla是墨西哥国立自治大学（UNAM）生物医学博士计划的博士生，他获得了DGAPA-UNAM奖学金。
Acknowledgments
作者要感谢实验医学部门实验动物设施的工作人员，护士Carolina Baños G.的技术和外科支持，Marco E. Gudiño Z.对显微照片的支持，以及Erick Apo对肝脏组织学的支持。国家委员会支持这项科学技术研究（CONACyT），批准号SALUD-2016-272579和PAPIIT-UNAM TA200515。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Anionic detergent | Alconox | Z273228 | |
| Biopsy cassettes | Leica | 3802453 | |
| Camera DMX | Nikon | DXM1200F | |
| Centrifuge | Eppendorf | 5424 | |
| Chlorhexidine gluconate 4% | BD | 372412 | |
| Cover glasses 25 mm x 40 mm | Corning | 2980-224 | |
| Eosin | Sigma-Aldrich | 200-M | CAS 17372-87-1 |
| Ethyl alcohol, pure | Sigma-Aldrich | 459836 | CAS 64-17-5 |
| Flunixine meglumide | MSD | Q-0273-035 | |
| Glass slides 75 mm x 25 mm | Corning | 101081022 | |
| Hematoxylin | Merck | H9627 | CAS 571-28-2 |
| Hydrochloric acid 37% | Merck | 339253 | CAS 7647-01-0 |
| Ketamine | Pisa agropecuaria | Q-7833-028 | |
| Light microscope | Nikon | Microphoto-FXA | |
| Microsurgery stereomicroscope | Zeiss | OPMI F170 | |
| Microtainer yellow cape | Beckton Dickinson | 365967 | |
| Microtome | Leica | RM2125 | |
| Model animal: Wistar rats | Universidad Nacional Autónoma de México | ||
| Nylon 3-0 (Dermalon) | Covidien | 1750-41 | |
| Polypropylene 7-0 | Atramat | SE867/2-60 | |
| Povidone-iodine10% cutaneous solution | Diafra SA de CV | 1.37E+86 | |
| Scanning electronic microscope | Zeiss | DSM-950 | |
| Sodium hydroxide, pellets | J. T. Baker | 3722-01 | CAS 1310-73-2 |
| Software ACT-1 | Nikon | Ver 2.70 | |
| Stereomicroscope | Leica | EZ4Stereo 8X-35X | |
| Sterrad 100S | Johnson and Johnson | 99970 | |
| Surgipath paraplast | Leica | 39601006 | |
| Synringe of 1 mL with needle (27G x 13 mm) | SensiMedical | LAN-078-077 | |
| Tissue Processor (Histokinette) | Leica | TP1020 | |
| Tissue-Tek TEC 5 (Tissue embedder) | Sakura Finetek USA | 5229 | |
| Trichrome stain kit | Sigma-Aldrich | HT15 | |
| Unicell DxC600 Analyzer | Beckman Coulter | BC 200-10 | |
| Xylazine | Pisa agropecuaria | Q-7833-099 | |
| Xylene | Sigma-Aldrich | 534056 | CAS 1330-20-7 |
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