Summary
在这里，我们提出了一种方案，用于在基因工程小鼠模型衍生 的肿瘤中 执行胚胎在体内致命的基因敲除，然后评估敲除对肿瘤生长，增殖，存活，迁移，侵袭以及 体外 和 体内转录组的影响。
Abstract
精确靶向人类癌症中关键蛋白质的新药的开发正在从根本上改变癌症治疗方法。然而，在使用这些药物之前，它们的靶蛋白必须被验证为特定癌症类型的治疗靶点。这种验证通常是通过在癌症的基因工程小鼠（GEM）模型中敲除编码候选治疗靶标的基因并确定其对肿瘤生长的影响来进行的。不幸的是，诸如传统淘汰赛中的胚胎杀伤力和有条件淘汰赛中的镶嵌性等技术问题经常限制这种方法。为了克服这些限制，开发了一种在GEM模型中产生的恶性周围神经鞘肿瘤（MPNSTs）短期培养物中烧蚀的未光斑胚胎致死性目的基因的方法。
本文描述了如何建立具有适当基因型的小鼠模型，从这些动物中提取短期肿瘤培养物，然后使用表达Cre重组酶和增强绿色荧光蛋白（eGFP）的腺病毒载体消融未发酵的胚胎致死基因。然后详细阐述使用荧光激活细胞分选（FACS）纯化用腺病毒转导的细胞，并定量基因消融对细胞增殖，活力，转录组和原位同种异体移植物生长的影响。这些方法为 在体外 和体内鉴定和验证治疗靶点提供了一种有效且可推广的方法 。 这些方法还提供了低传代肿瘤衍生细胞的可再生来源，减少了 体外 生长伪影。这使得靶向基因的生物学作用可以在各种生物过程中进行研究，例如由分泌组介导的迁移，入侵，转移和细胞间通信。
Introduction
在过去二十年之前，人类癌症的治疗严重依赖放疗和化疗药物，这些药物通过破坏DNA或抑制DNA合成来广泛靶向快速增殖的细胞群。虽然这些方法确实抑制了癌细胞的生长，但它们对正常快速增殖的细胞类型（如肠上皮细胞和毛囊细胞）也有有害的副作用。最近，癌症治疗已经开始利用化疗药物，这些药物精确地靶向信号通路中的蛋白质，这对个体患者肿瘤的生长至关重要。这种方法通常被称为“精准医疗”，导致了不断扩大的单克隆抗体和小分子抑制剂库的发展。这些药物有效地抑制肿瘤细胞的增殖和存活，同时避免了常规化疗药物和放疗对正常细胞类型的有害副作用。用于治疗人类癌症的单克隆抗体最常靶向细胞表面分子，例如生长因子受体1 （例如，跨膜受体酪氨酸激酶的大家族）和免疫应答调节剂2 （例如，程序性细胞死亡蛋白1，程序性死亡配体1）。小分子抑制剂可以抑制细胞表面蛋白或位于细胞内的信号蛋白3。然而，为了有效地利用这些新的治疗剂，必须确定特定的癌症依赖于候选治疗剂所靶向的分子。
虽然这些新的治疗剂具有更集中的作用，但其中许多仍然抑制一种以上蛋白质的作用。此外，通常可以使用具有不同有效性和特异性的多种试剂来靶向特定蛋白质。因此，在临床前研究期间，明智的做法是使用其他方法（例如遗传消融）来验证候选蛋白质作为治疗靶标。验证蛋白质作为治疗靶点的一种特别有用的方法是在基因工程动物模型中消融编码候选蛋白质的基因，该模型开发特定的癌症类型。如果具有零突变（自然突变，基因工程零突变[“敲除”]或基因陷阱引入的零突变）的小鼠可用，并且小鼠存活到成年期，则这种方法可能相对简单。不幸的是，符合这些标准的具有零突变的小鼠通常不可用，通常是因为零突变导致胚胎死亡或在产后生命的最初几天死亡。在这种情况下，容易发生肿瘤型感兴趣的小鼠可以转而杂交到目的基因的关键片段被loxP位点（“floxed”）两侧的小鼠杂交，这允许通过将表达Cre重组酶的转基因引入肿瘤细胞（条件敲除）来消融该基因。此方法具有几个优点。首先，如果Cre驱动剂在肿瘤中表达，但不在导致常规敲除中死亡的细胞类型中表达，则这种方法可以潜在地验证候选治疗靶点。其次，在肿瘤细胞中烧蚀编码候选蛋白的基因，而不是在其他肿瘤内元素（如肿瘤相关成纤维细胞或免疫细胞）中，使研究者能够区分治疗靶点的细胞自主和非细胞自主效应。最后，他莫昔芬诱导的Cre驱动因子（CreERT2）允许研究者在肿瘤发展的不同阶段删除目的基因，并确定候选治疗剂最有可能有效的窗口。
不幸的是，还有一些技术问题可能会限制在GEM模型中出现的肿瘤中使用有条件敲除。例如，在肿瘤细胞中表达并避免生命所必需的正常细胞中基因缺失的Cre驱动器可能不可用。另一个可能被低估的问题是，Cre和CreERT2 驱动者经常可变地消融小鼠中絮状等位基因，导致GEM癌症中零突变的嵌合体。当这种情况发生时，靶向基因尚未消融的肿瘤细胞将继续快速增殖，用消融的等位基因过度生长肿瘤细胞。Cre驱动谱系中的马赛克化可能是由于目标谱系中非普遍的Cre表达以及独立于Cre表达4的单个细胞中的重组失败而发生的。这是Cre驱动因素的已知现象，与细胞类型有关，应在实验设计和数据解释期间考虑。Mosaicism可以掩盖敲除的影响，并导致研究人员错误地得出结论，即目的基因对肿瘤细胞增殖和/或存活不是必需的，因此不是有效的治疗靶点。
在之前的一项研究中遇到了其中一些问题，该研究试图确定受体酪氨酸激酶erbB4是否是MPNST细胞中的潜在治疗靶标5。在这些研究中，在施万细胞特异性髓鞘蛋白零启动子（P 0-GGFβ3小鼠）的控制下，使用表达编码神经肽-1（NRG1）同种型神经胶质生长因子-β3（GGFβ3）的转基因的小鼠。P 0-GGFβ3小鼠发展为多个丛状神经纤维瘤，通过概括常染色体显性肿瘤易感综合征1型（NF1）6型神经纤维瘤病的神经纤维瘤发病机制和丛状神经纤维瘤-MPNST进展的过程进展为MPNST。当与具有Trp53零突变的小鼠杂交时，所得P 0-GGFβ3;Trp53 +/-小鼠从头发展MPNSTs，如顺式Nf1 + / -;Trp53+/- 小鼠。
这些 MPNST 概括了在人类中从世界卫生组织 （WHO） II 级病变进展到 WHO IV 级病变7。在P 0-GGFβ3小鼠中，MPNSTs出现在三叉神经（58%）和脊髓背神经根（68%）7中预先存在的丛状神经纤维瘤内;在 P 0-GGFβ3 中产生的甲基物质免疫吸附剂;Trp53 +/-小鼠具有高度相似的分布。在人类中，MPNSTs最常出现在坐骨神经中，其次是臂丛神经，脊神经根，迷走神经，股骨，正中，骶丛，腘腘闭塞器以及胫骨后神经和尺神经8。这些GEM模型中的这种肿瘤分布与人类中的肿瘤分布有些不同。然而，在P 0-GGFβ3和P0-GGFβ3中出现的甲基卫星;Trp53 + / -小鼠在组织学上与人类MPNST相同，携带许多与人类MPNTS相同的突变，并概括了NF1患者中可见的神经纤维瘤 - MPNST进展过程。生成 P 0-GGFβ3 或 P0-GGFβ3;Erbb4-/-的Trp53+/-小鼠是不可行的，因为具有两个Erbb4空等位基因的小鼠在继发于心脏缺陷的胚胎第10.5天在子宫内死亡9。因为通过引入心脏特异性Erbb4转基因（α肌球蛋白重链（MHC）-Erbb4）来拯救心脏中的Erbb4表达导致活的Erbb4-/-小鼠10，产生具有复杂P 0-GGFβ3的小鼠;Trp53+/-α-麦格-埃尔布4;尝试了 Erbb4-/- 基因型。
然而，交配没有产生预期孟德尔比例的小鼠，表明所需的基因型是有害的。因此，生成P 0-GGFβ3;尝试使用具有絮状Erbb4等位基因11和CreERT2驱动程序的Trp53 + / -小鼠允许在这些小鼠中出现的MPNST中去除Erbb4。在这些动物中，许多具有完整Erbb4等位基因的肿瘤细胞仍然存在（嵌合体）。观察到的嵌合体可能是由于他莫昔芬递送效率低下造成的，这导致组织内重组效率的差异。自发代偿机制的可能性可以通过绕过Erbb4表达的要求，进一步促进他莫昔芬介导的重组中的嵌合体。Trp53的丢失使肿瘤细胞容易受到其他自发“允许”突变的影响，这可能会混淆对数据的解释。由于Erbb4完整的MPNST细胞似乎有可能掩盖在其他肿瘤细胞中烧蚀Erbb4的后果，因此这种方法被放弃了。
这些障碍导致了一种使用表达Cre重组酶和eGFP的腺病毒在非常早期的传代MPNST细胞中烧蚀Erbb4的方法。这些细胞可以使用FACS从未感染的细胞中分离出来，这显着减少了烧蚀的Erbb4基因的嵌合体。下面描述了用于实现这一目标的方法，以及用于评估基因消融在体外和体内效果的方法。以下方案是如何产生荷瘤小鼠的一个例子，这些小鼠在体内同种异体移植肿瘤生长评估之前产生携带目标胚胎致死基因的絮状等位基因的肿瘤。这包括描述用于分析Erbb4消融对体外肿瘤细胞增殖，存活和基因表达的影响以及原位同种异体移植物中的增殖，存活和血管生成的作用的方法。
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Protocol
在与小鼠进行任何程序之前，所有程序必须由机构动物护理和使用委员会审查和批准。本手稿中描述的协议已获得南卡罗来纳医科大学机构动物护理和使用委员会的批准。该协议由经过适当培训的人员按照MUSC的机构动物护理指南执行。
1. 生成MPNSTs纯合子的 小鼠的Erbb4 flox 等位基因
- 产生 F1 代 P 0-GGFβ3;53+/-;埃尔布4fl/+ 动物通过交配 P 0-GGFβ3;Trp53+/-小鼠7与Erbb4fl/fl小鼠11。使用Punett方块（图1）来指导育种方案，以确保用所需的P 0-GGFβ3产生足够的雄性和雌性F1幼崽;53+/-;埃尔布4fl/+ 基因型。
- 基因型F1后代，通过从根据IACUC指南收集的尾剪中分离基因组DNA，然后使用先前描述的引物进行PCR，以检测P 0-GGFβ3转基因12，Trp53野生型（+）和零（-）等位基因7，以及Erbb4flox和Erbb4野生型等位基因13。
- 使用 jacks-lab.mit.edu/protocols 详述的方法分离尾部DNA。
- 使PCR反应与25ng DNA，0.25 nM dNTP，0.02 U / μL Taq，每个引物的0.5μM和1x PCR缓冲液混合。进行PCR反应，单次95°C孵育（熔化基因组DNA并激活Taq）1分钟，然后进行35次94°C，10秒（熔化）的PCR循环;55 °C， 30 秒 （退火）;72 °C，40秒（延长），然后是单个72°C（延长）5分钟。将反应储存在4°C，直到准备在1.2-1.5%琼脂糖凝胶上电泳。
注意：退火温度取决于所使用的PCR缓冲液系统;建议执行退火温度梯度以确定适当的退火温度。
- 产生F2代P 0-GGFβ3;53+/-;Erbb4通过交配适当的F1后代（P 0-GGFβ3;Trp53-/+;Erbb4fl/+） 彼此相伴。
注意： 图1 显示了用于计算具有所需基因型的F2后代的预期数量的Punet平方预测。 - 鉴定具有所需P 0-GGFβ3的动物;Trp53-/+;Erbb4fl/fl 基因型如步骤 1.2 中所述。
- 将F2后代相互交配以维持P 0-GGFβ3;Trp53-/+;Erbb4fl / fl菌落和基因型所有幼崽。确认新引入的絮状等位基因不影响存活或肿瘤潜伏期。通过建立P 0-GGFβ3的队列（20只小鼠/队列）来实现这一目标;53+/- 和 P 0-GGFβ3;53+/-;Erbb4fl/fl小鼠并跟踪它们的存活率和肿瘤发生频率。
- 每周监测动物几次，直到达到实验终点（IACUC批准的最大允许肿瘤大小/人道终点）。
- 在每周监测期间，评估体重，正常的社交和美容行为以及肿瘤大小测量。在体重减轻>10%、社交隐居和驼背的情况下，安排兽医评估。
- 当识别出荷瘤小鼠并已达到其人道终点时，使用二氧化碳吸入人道对动物实施安乐死，然后进行颈椎脱位，并使用手术刀无菌切除肿瘤。通过使用卡尺和重量肿瘤（质量和体积）测量长度，宽度和深度来进行肿瘤测量。快速工作以避免自溶。
- 在无菌条件下，使用面包面包叶式手术刀切割肿瘤分成三个部分，以产生用于福尔马林固定/石蜡包埋（FFPE），早期传代培养物生成和速冻材料的组织段（图2A）。
- 确保第1部分（对于早期传代培养生成，步骤1.7.2）约为总肿瘤体积的10%，第2部分（用于固定和IHC，步骤1.7.3）为总肿瘤体积的70%，第3部分（对于快速冷冻，步骤1.7.4）是总肿瘤体积的20%。
- 取肿瘤的第1部分用于制备早期传代培养物（见下文）。
- 将肿瘤的第2部分在4°C下在4%多聚甲醛中固定过夜，然后包埋在石蜡中（福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）用于诊断性病情检查。
- 用于分析分析的速冻第3部分（例如，免疫印迹以验证由靶向絮凝基因编码的蛋白质是否适当表达）。
- 用苏木精和曙红（H&E）染色5μm厚的FFPE组织切片，以确认合格病理学家的肿瘤诊断。如果合适，进行免疫组织化学染色（IHC）以确认肿瘤诊断。
- 免疫染色MPNSTs用于S100钙结合蛋白B（S100β），巢蛋白和性别决定区Y（SRY）-盒转录因子10（Sox10）-在MPNTS和施万细胞（肿瘤细胞起源）中表达的三个标记物5，6，14，15。用识别erbB4的抗体染色肿瘤，erbB4是由下游步骤中靶向消融的基因编码的蛋白质。
- 为确认诊断，请合格的兽医或人类病理学家按照世卫组织诊断和分级标准5，6，7，16评估所有染色的肿瘤载玻片。
2. MPNST细胞中絮状Erbb4等位基因的离体消融
- 通过将第1节（步骤1.7.3）的组织置于冰冷的无菌磷酸盐缓冲盐水（PBS）中，然后将其转移到无菌工作区域（图2B）16，从新鲜收集的MPNST组织中建立早期传代培养物。
注意：所有后续程序均应在无菌组织培养罩中进行。 - 将肿瘤组织切碎成2-4mm片，并在10cm2 处理的组织培养皿中用10mL生长培养基研磨8-10次。将这些制剂培养在高葡萄糖DMEM-10生长培养基（杜尔贝科修饰的鹰培养基（DMEM），含有10%胎牛血清，1%谷氨酰胺，10μg/ mL链霉素和10 IU / mL青霉素）中，并补充10 nM神经肽-1β（NRG1β）和2μM毛喉素。在此阶段添加毛喉素以抑制成纤维细胞等常见污染细胞类型的生长。
- 在5%CO2 气氛中将机械解离的组织和细胞在37°C下维持长达3天，以建立早期传代培养。此时不要分离分散的细胞和剩余的组织碎片。
- 每3-4天用新培养基刷新一次培养物。让肿瘤细胞增殖，直到它们汇合。
- 通过将融合培养物分成几道菜来扩展早期通道培养物。取出生长培养基并用1x dPBS洗涤细胞。然后，每10厘米2处理的细胞培养皿在室温下加入1mL0.25 %胰蛋白酶2-5分钟。轻轻研磨培养物以促进分离并产生单细胞悬浮液。
- 通过加入2mL DMEM-10生长培养基终止胰蛋白酶消化。收集胰蛋白酶消化的细胞混合物并将其转移到5 mL无菌离心管中。通过在室温下以500× g 离心5分钟来沉淀细胞。
- 将细胞沉淀重悬于5mL DMEM-10中。将细胞分成两到四个10厘米的细胞培养皿，每个培养皿含有10mL生长培养基（每个培养皿约1×10个6 个细胞）。
- 5次传代后（在2.5中重复步骤），使用不含NRG1β和毛喉素的生长培养基。用抗S100β抗体对培养物样品进行免疫染色，以验证培养物仅由肿瘤细胞组成。在所有后续传代中将细胞保持在DMEM-10生长培养基中。
- 在下一次传代时，计数细胞并冷冻P 0-GGFβ3的一部分;53+/-;从融合培养物（3 ×106个细胞/小瓶）中收集的Erbb4 fl / fl MPNST细胞。
- 板 P 0-GGFβ3;53+/-;Erbb4fl/fl早期传代MPNST细胞的密度为每10cm处理过的细胞培养皿在DMEM-10生长培养基中的1.5×106个细胞。
- 第0天： （接种后约12-16小时），用2-4mL dPBS洗涤贴壁培养物，并在10mL无血清DMEM（即每10cm培养皿30μL2×1010 pfu病毒）中以约400个斑块形成单位（pfu）/细胞感染Ad5CMV-Cre / eGFP或Ad5CMV-eGFP。根据经验确定的，使用腺病毒以最大耐受病毒浓度（感染多重性，MOI）消融絮状的 Erbb4 等位基因。有关此消融工作流程的示意图，请参阅 图 2C 。
- 第1天： 大约16小时后，通过在感染鸡尾酒中加入10mL DMEM-10来挽救培养物。
- 第2 - 3天： FACS按照核心设施的推荐方案对感染细胞进行分类，以在感染后约48小时对eGFP阳性细胞进行分选。在FACS分选之前，在荧光显微镜上短暂检查细胞的eGFP信号，以确保培养物已被有效感染（〜50-100%阳性细胞）。将FACS后恢复的细胞恢复到10厘米组织培养皿中;保留一个培养皿用于基因组DNA分离。
- 第4 - 5天： FACS分选后，让细胞在组织培养箱中恢复至少24-48小时，然后准备细胞进行基于 体外 细胞的分析或 体内 移植。使用从分选的eGFP阳性细胞的一部分分离的基因组DNA通过PCR确认 Erbb4 缺失。通过PCR或用抗 erbB4抗体对培养物样品进行免疫染色来验证eGFP阳性细胞是否为ErbB4阴性。
- 使用标准的酸性胍酚和基于氯仿的DNA分离方法从细胞中分离基因组DNA17。
- 进行标准PCR以区分脱色的 Erbb4 等位基因和消融的 Erbb4 等位基因。用2 ng DNA，20μM引物1 + 2进行40次循环，以产生250 bp Erbb4-null产物和350 bp絮凝产物13。在没有可靠的抗体可用时，同时进行PCR和基于抗体的方法以确认敲除。
注意：细胞已准备好进行基于细胞的体外测定，如下所述。许多类型的下游分析都可以用这种方式制备的细胞进行。下面介绍的方案的目的是提供这些肿瘤细胞在Erbb4基因消融后的体外和体内应用的一些例子。
3. 具有消融 的Erbb4 等位基因的MPNST细胞中的增殖和活力测定
- 在接下来的七天内，使用基于图像的自动细胞仪对接种在多孔板中的分选MPNST细胞进行增殖测定。
- 第6天： 在96孔板中将最终体积为150μL（〜13，300个细胞/ mL）的生长培养基中培养2，000个细胞。对每个实验队列和4个每日终点读数（3次重复x 2个条件x 4天）进行一式三份的测量。
-
第7、9、11、13天： 用 Hoechst 和碘化丙啶 （PI） 染料染色细胞，并在自动读板器上对它们进行成像，以计数每个孔中活细胞和死细胞的数量。为了实现这一点，同时用Hoechst染料染色细胞以染色活细胞和死细胞的细胞核，并用碘化丙啶（PI）标记死细胞。每天或每隔一天在同一时间执行所有读取。
- 向当天（例如，仅第7天）定量的每个孔中加入50μL 4x PI / Hechst染色溶液（每个4μg/ mL），并在组织培养箱中于37°C下孵育30分钟。保护板材避光。
注意：Hoechst的染色浓度需要根据经验确定，根据细胞类型，范围可以从1到10μg/ mL。 - 孵育后，使用自动细胞成像仪上的适当荧光通道读取染色的孔。读数后，将板放回培养箱，以便在随后的几天（即第9天，第11天，第13天）进行将来的读数。
- 根据所使用的成像系统量化染色强度，并使用以下设置计算死细胞，活细胞和总细胞的数量：蓝色通道（377 / 50nm，Hoechst）：总细胞（活细胞和死细胞）;红色通道（531/40 nm，PI）：仅死细胞;蓝色 - 红色（总计 - 死亡）=活细胞。
- 向当天（例如，仅第7天）定量的每个孔中加入50μL 4x PI / Hechst染色溶液（每个4μg/ mL），并在组织培养箱中于37°C下孵育30分钟。保护板材避光。
- 如果需要，按照测定制造商的方案，在三天内进行细胞活力测定。
注意：通过进行三重染色，包括钙黄绿素AM（488/32nm，绿色通道，特异性标记活细胞），PI和Hoechst，活性测定可以与增殖测定相结合。细胞凋亡测定也可以使用如上所述设置的培养物进行;具体方案将取决于成像系统。- 第6天： 将每孔4，000个细胞以150μL的最终体积在96孔板中一式三份。
- 第7 – 9天： 加入2，000x生物发光细胞活力测定试剂（材料表），将板返回培养箱，并在1小时后读取板。每天在同一时间执行后续读取。对于生物发光（MTT）测定，使用光度计读板器每24小时严格按照制造商说明中概述的测定，持续72小时。
4. RNA-Seq分析和鉴定其表达因 Erbb4 丢失而改变的基因
- 第6天： 使用标准的酸性胍酚和基于氯仿的方法从分选的MPNST细胞中分离总RNA。对于旨在检测两个队列之间mRNA水平变化的实验，请从每个队列中的至少三个生物重复中制备总RNA。
- 为了消除由腺病毒载体或eGFP表达引起的事件而不是Erbb4损失，从P 0-GGFβ3的三个生物重复中分离RNA;53+/-;用Ad5CMV-Cre / eGFP转导的Erbb4 fl / fl MPNST细胞和用Ad5CMV-eGFP转导的三个生物重复。
注意：分离的RNA必须具有≥8的RNA完整性数（RIN）评分才能进行RNA-Seq分析。在构建文库之前，确保测序核心确定所有样品的 RIN。
- 为了消除由腺病毒载体或eGFP表达引起的事件而不是Erbb4损失，从P 0-GGFβ3的三个生物重复中分离RNA;53+/-;用Ad5CMV-Cre / eGFP转导的Erbb4 fl / fl MPNST细胞和用Ad5CMV-eGFP转导的三个生物重复。
- 使用来自每个样品的100-200ng高质量总RNA来制备RNA-Seq文库（使用核心测序工具进行此步骤）。使用下一代 DNA 测序仪执行高通量测序。对于mRNA定量，执行单端测序以生成Fastq文件。确保每个样品至少读取 5000 万次。
注意：请参阅 图3 ，了解用于处理RNA-Seq数据和量化差异表达转录本表达的工作流程的示意图。以Fastq文件形式存在的序列数据受到质量控制程序的约束;>80% 的读数应得出 30 分的 Phred 评分，以被认为适合后续分析。这些序列还使用 Trimmomatic18 进行预处理（修剪），以删除适配器序列并过滤掉低质量的读数。 - 使用任何功能强大的软件程序（例如，DNAStar19，20 或 Partek21）对 fastq 生成的文件执行 RNA-Seq 比对和分析。使用默认设置按照程序特定的步骤将 fastq 文件与小鼠参考基因组 （GRCm38/mm10） 对齐。
注意：以 DNAStar 为例，一般工作流程如下所述（补充图 1）。- 选择分析方法，RNA-酶。
- 选择参考基因组， 小鼠。
- 上传 BED 文件（如果排序内核提供）。
- 上传 fastq 测序文件，为它们分配唯一的复制名称。
- 对 fastq 文件进行分组复制，并将它们指定为复制集（即 GFP、CRE）
注意：每个对齐程序都有其特定的步骤，用户必须查阅程序用户指南以了解程序特定的协议。然后，该程序将从这些Fastq文件生成基因特异性原始计数数据。
- 如4.3所述，使用任何功能强大的软件程序对原始计数数据执行统计和归一化分析（DESeq2，EdgeR），将Ad5CMV-eGFP样本集作为对照数据集，以强大的统计能力22，23识别差异基因表达信号。
- 选择 GFP 快速 q 文件 作为控制数据集。
- 选择 DESeq2 作为统计和归一化方法。
- 开始组装和分析。
注意：每个对齐程序都有其特定的步骤，用户必须查阅程序用户指南以了解程序特定的协议。然后，该程序将从这些Fastq文件生成基因特异性原始计数数据。统计和归一化分析是序列比对协议中许多程序中的内置步骤，如此处的示例所示。如果使用的替代序列比对软件程序不提供此后续内置步骤，请使用用R编写的DESeq2或EdgeR编码包在终端级别对原始计数数据执行统计和归一化分析，这些包可在 Bioconductor.org 上免费下载。
- 使用这些方法识别相对于对照至少增加或减少1.5倍的变化（在这种情况下，用Ad5CMV-eGFP病毒转导的细胞）。仅使用那些被确定为具有统计学显著性的差异表达基因（DEG），这些基因显示≥1.5倍的变化和 p值0.05或padj为0.1，用于后续的功能富集分析。
注意：这将生成DEG基因及其功能富集分析的统计功效列表。 - 使用任何免费提供的基于Web的工具，使用排名基因列表文件对4.4中鉴定的具有统计显着性的Erbb4介导的DEG进行功能富集分析。通过集成在这些开放获取功能富集分析工具24，25，26，27中的基因本体数据集来确定Erbb4基因丢失的生物学和通路意义（参见材料表的示例和图3，了解使用Panther的示例工作流程）。
- 将步骤 4.4 中获得的数据导出为电子表格。
- 按 log2 折叠更改和/或 p/padj 值对数据进行排名。
- 请务必删除所有非统计显著性数据。
- 仅将具有基因ID的排名基因列表导出为.txt文件，并将其上传到网站。
注意：仅使用具有统计显著性的 DEG（p/padj 值分别< 0.05 或 0.1）来生成使用 log2 折叠更改（从高到低）、p/padj 值（从低到高）或两者 [（-log10（pval）*符号 （log2FC）] 的排名输入基因列表。有几种方法可以生成排名基因列表，并根据经验确定数据集和所问的问题。所使用的特定类型的功能富集分析工具也有助于确定适当类型的等级基因列表。有关RNA-Seq的其他资源，请参阅以下论文28，29，30。
5. MPNST细胞与消融 Erbb4 等位基因的原位同位异体移植及 Erbb4 消融效果分析
- 在对分选的MPNST细胞进行原位同种异体移植之前，请确保所有程序都经过机构动物护理和使用委员会的审查和批准，并且所有程序都由经过适当培训的人员执行。
- 在注射当天，使用非酶细胞解离溶液（例如，螯合剂混合物，参见 材料表）从细胞培养板或烧瓶中除去低传代细胞（约85%汇合度），并使用血细胞计数器计数细胞。对于坐骨神经的原位注射，在DMEM-10 31中以16，667个细胞/ mL（每只动物每3μL50，000个细胞）重建细胞。将细胞保持在冰上。
注意：除非将细胞注射到低生长因子基底膜基质中，否则某些培养物将无法成功建立移植物。必须根据经验确定对基底膜基质（10-50%）的要求。 - 通过将MPNST细胞注射到8-10个麻醉Hsd的坐骨神经中来评估感染后细胞中的体内同种异体移植物生长潜力：每个队列（4-8周龄）的无胸腺Nude-Foxn1 nu小鼠。对于肿瘤细胞的原位注射，参见Turk等人31。在这里，演示了皮下注射。
注意：要确定统计显著性所需的实验动物数量，请咨询生物统计学家，或者建议使用G *Power3，一个免费提供的软件32。 - 在注射后的第一周，每天密切监测动物两次，以发现任何疼痛迹象。此后，每周监测移植小鼠三次卡尺测量并评估身体状况评分（BCS），如前所述5，31。如IACUC指南中所述，对BCS为2或更低的动物实施安乐死。
- 由于接种细胞以不同的速率生长，在进行本节中描述的实验之前，请使用对照（未修饰）细胞根据经验确定移植物时间。为了在实验终点收集移植物，使用二氧化碳吸入，然后宫颈脱位作为次要措施，对小鼠进行人道安乐死。记录每个移植物的最终体积和质量测量值。
注：作为未修饰的 P 0-GGFβ3;53+/-;Erbb4fl / fl MPNST细胞通常在30-45天内达到IACUC允许的最大尺寸，典型的时间表约为注射后30-45天。 - 分离和切片组织，如步骤1.6-1.8所述。将部分移植物组织在4%多聚甲醛中固定过夜（图2），然后将其包埋在石蜡中。从FFPE组织中制备5μm切片并将其安装在载玻片上。进行H&E染色和其他必要的免疫染色，以确认移植物组织由肿瘤细胞组成，如1.8.1所述。快速冷冻肿瘤组织的其余部分以进行下游分析，例如验证 Erbb4 表达的损失和评估 Erbb4 丢失对其他 Erbb 家族成员表达的影响。
注意：必须确认移植物组织中的肿瘤细胞，因为免疫缺陷小鼠容易发生肿瘤。在小移植物的情况下，重要的是要确保疤痕组织或炎症不会被误认为是肿瘤。- 在FFPE组织上进行标准IHC染色，以比较从Ad5CMV-eGFP和Ad5CMV-Cre / eGFP处理的细胞生长的同种异体移植物中目标蛋白质的表达。使用erbB4特异性抗体对切除的移植物组织进行染色，以确认两种实验条件之间 体内 erbB4表达的差异。通过Ki67染色确定增殖指数，并通过末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP切口标记（TUNEL）染色确定细胞凋亡水平。
注意：任何感兴趣的蛋白质靶标也可以通过IHC进行评估。例如，通过用抗CD31抗体（1：50稀释）对同种异体移植物进行免疫染色来评估血管密度，以确定由基因消融介导的体内血管微环境差异。可以计算每个40x场的血管轮廓数量以进行量化。对于这些基于 IHC 的检测，请遵循染色程序的标准 IHC 方案和制造商的 TUNEL 染色方案。要量化图像，请使用 ImageJ 插件“单色图像的自动计数”。
- 在FFPE组织上进行标准IHC染色，以比较从Ad5CMV-eGFP和Ad5CMV-Cre / eGFP处理的细胞生长的同种异体移植物中目标蛋白质的表达。使用erbB4特异性抗体对切除的移植物组织进行染色，以确认两种实验条件之间 体内 erbB4表达的差异。通过Ki67染色确定增殖指数，并通过末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP切口标记（TUNEL）染色确定细胞凋亡水平。
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Representative Results
图4示出了转导P 0-GGFβ3时获得的典型结果;Trp53-/+;具有腺5CMV-eGFP腺病毒或AD5CMV-cre/eGFP腺病毒的Erbb4 fl/fl MPNST细胞（图4A）。用荧光显微镜观察培养物以鉴定表达eGFP的细胞，并通过相差显微镜确定同一场中存在的细胞总数为10x（顶部）和40x（底部）。如果需要，可以计算表达eGFP的细胞的百分比。代表性的FACS输出数据如补充图S2所示。在FACS之后，表达eGFP的细胞的百分比将显着增加，几乎每个场中的所有细胞都表达eGFP。根据转染效率，Cre介导的基因消融后预期的典型PCR基因分型结果是完全基因敲除（100%效率）或诱导和未育出细胞的异质性群体（<100%效率），与对照转导结果（仅GFP，fl / fl）相比（图4B）。图4C说明了在P 0-GGFβ3的原位同种异体移植物中发现的特征性组织病理学;53+/-;Erbb4fl / fl MPNST与来自原始GEM动物模型的肿瘤进行比较。
在这些实验中，Erbb4消融导致体外和体内细胞增殖和细胞密度降低，体内TUNEL标记指数增加，体内血管密度降低。图5显示了使用基于图像的自动细胞仪获得的代表性结果，显示Ad5CMV-Cre消融细胞与对照Ad5CMV-GFP转导细胞的细胞增殖减少（图5A）;这些实验是用早期传代培养的细胞进行的。ErbB4通过免疫组化在P 0-GGFβ3中的表达;53+/-;与对照的Ad5CMV-eGFP治疗的同种异体移植肿瘤相比，用Ad5CMV-Cre或eGFP病毒转导的Erbb4 fl / fl MPNST细胞在所得的Ad5CMV-Cre转导同种异体移植物中减少（图5B）。通过CD31的免疫反应性检测评估血管密度;可以看到Ad5CMV-Cre转导细胞的同种异体移植物中的血管密度显着降低（图5C）。如果需要，可以使用ImageJ量化信号强度。
图1：生成和杂交P 0-GGFβ3时预期基因型比率的普奈方块计算;Trp53 +/-小鼠与Erbb4fl /fl小鼠（F1）。生成和维持P 0-GGFβ3时预期基因型比率的普奈特方块计算;Trp53-/+;Erbb4fl/+ 相互之间 （F2）。缩写：fl = 浮标。请点击此处查看此图的大图。
图2：在源自P 0-GGFβ3的MPNST细胞的早期传代培养物中消融出的Ferbb4等位基因的过程的工作流程;Trp53-/+;埃尔布4fl/fl 小鼠。（A）收获表达絮凝基因的肿瘤。（B）从切除的肿瘤中建立早期传代培养物。（C）感染早期传代培养物以消融絮凝的基因并进行下游测定。简称：MPNST=恶性周围神经鞘肿瘤;IHC = 免疫组化;PFA = 多聚甲醛;FFPE = 福尔马林固定石蜡包埋;H&E = 苏木精和曙红;FACS = 荧光活化细胞分选;GFP = 绿色荧光蛋白;K / O = 淘汰赛;PCR = 聚合酶链反应。请点击此处查看此图的大图。
图 3：RNA-Seq 工作流程示意图。 该工作流程用于鉴定对照（GFP诱导）和 Erbb4-null（Cre诱导）细胞之间的差异表达转录本以及由此产生的生物学意义。缩写：GFP = 绿色荧光蛋白;核糖核酸序列 = 核糖核酸测序。 请点击此处查看此图的大图。
图4：通过显微镜评估P 0-GGFβ3的代表性转导效率结果;Trp53-/+;Erbb4液态/液种MPNST 细胞。（A）用腺病毒或腺5中微病毒转录/真戊二醇增殖腺病毒转导的细胞。（B）Ad5CMV感染后潜在基因群的PCR结果。（C）特征性组织病理学，将原始GEM模型中产生的肿瘤与原位同位移植的P 0-GGFβ3进行比较;Trp53-/+;通过 H&E 染色的 Erbb4 液态/液种普通细胞。图像以40倍拍摄。使用同种型匹配的阴性对照抗体进行对照染色。比例尺 = 400 μm （A， 上面板）;100 微米（A，下面板），20 微米（C）。简称：MPNST=恶性周围神经鞘肿瘤;GFP = 绿色荧光蛋白;高炉 = 明场;FACS = 荧光活化细胞分选;阴性 Ctrl = 阴性对照;PCR = 聚合酶链反应;GEM = 基因工程小鼠;fl = 浮肿。请点击此处查看此图的大图。
图5：在用AD5CMV-eGFP或AD5CMV-Cre/ eGFP转导后，在培养的MPNST早期传代培养物和原位同位移植MPNST细胞中获得的代表性结果。量化数据在第 1、3 和 5 天（左）绘制图表。右侧显示使用基于图像的自动流式细胞仪拍摄的第1天和第5天的汇合图像（使用明场显微镜以4倍放大倍率拍摄的图像）。误差线表示至少 3 个不同独立实验的均值 （SEM） 的标准误差。（B）在用20倍放大镜下用AD5CMV-eGFP或AD5CMV-Cre / eGFP腺病毒转导的同种异体移植肿瘤中的代表性ErbB4染色。红色通道（Alexa 564，CD31），蓝色通道（赫希斯特，原子核）。（C）P 0-GGFβ3同种异体移植物中血管密度的代表性图像;53+/-;用 Ad5CMV-eGFP 转导的 Erbb4 液态/液态 MPNST 细胞与 Ad5CMV-克雷/eGFP 病毒的比较。图像以40倍拍摄。使用同种型匹配的阴性对照抗体进行对照染色。比例尺 = 100 μm。简称：MPNST=恶性周围神经鞘肿瘤;eGFP = 增强型绿色荧光蛋白;IgG = 免疫球蛋白 G;NEG = 阴性对照;CD = 分化群集。请点击此处查看此图的大图。
补充图S1：说明序列比对和分析工作流程的示意图。DNAStar 中用于对齐和分析 RNA 测序文件（快速 q 文件）的工作流程。缩写：GFP = 绿色荧光蛋白;RNA-Seq = RNA 测序，DEG = 差异表达基因。 请按此下载此档案。
补充图S2：使用绿色荧光蛋白的早期传代培养物的代表性FACS数据。 （A）在设置非感染细胞的荧光门参数后，通过FACS对表达GFP的细胞进行分类。（B）设置适当的检测门后，将GFP阳性（转导）细胞与GFP阴性（非转导）细胞分离。缩写：SSC-A = 峰的侧散射面积;FSC-H = 峰的前向散射高度;FSC-W = 峰值的前向散射宽度;GFP = 绿色荧光蛋白;FACS = 荧光激活的细胞分选。 请按此下载此档案。
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Discussion
这里介绍的详细方法是使用MPNST的GEM模型开发的。然而，如果感兴趣的肿瘤组织可以分散到单个细胞中，这些方法很容易适应GEM中出现的各种肿瘤类型。重要的是要确保絮状等位基因不会导致i）存活率下降，这可能使获得足够的小鼠难以筛查肿瘤，或ii）肿瘤潜伏期增加，可能使获得足够的荷瘤小鼠变得困难。如果絮状等位基因不影响存活，则两个队列的存活率将是相等的。如果它对肿瘤潜伏期没有影响，则在具有相似时间过程的两个队列中应出现相同数量的荷瘤小鼠。
类似的方法已被用于研究神经纤维瘤和MPNST，使用条件敲除和他莫昔芬诱导的Cre动物产生诱导的条件敲除动物33，34。这些研究与本研究之间的区别在于，除了如前所述使用他莫昔芬进行Cre诱导外，这些研究的重点是具有NF1组织特异性敲除的肿瘤发展。由于这项研究和这些其他研究也使用GEMM产生的肿瘤，因此区别在于所提出的问题。在该协议中，我们没有研究NF1丢失在MPNST发病机制中的作用，而是研究GEMM生成的MPNST中的特定基因（Erbb4）对 体内 肿瘤生长的作用，否则由于胚胎致命，这是不可能的。此外，该协议避免了将他莫昔芬用于需要这些参数的方法。
其他人研究了异种移植模型中已建立的人类MPNST细胞系35。该研究与这项研究的不同之处在于，所使用的移植细胞是经过充分研究但高传代的人MPNST细胞系，它侧重于在异种移植物中建立药物反应。这些研究人员没有研究特定基因在这些MPNST细胞 中对体内 生长的作用以及基因丢失对药物反应的影响。另一项与此类似的研究由Dodd等人进行，使用腺病毒Cre重组酶（Ad-Cre）介导的NF1丢失以时间和空间依赖性方式进行，再次成为扩展MPNST翻译努力的强大方法36。该研究的重点是 NF1 和 Ink4a / Arf 丢失的作用，这是人类MPNTS中两个非常常见的共同删除基因，通过Ad-Cre注射在坐骨神经中的作用。所述 P0-聚酰胺β3;53+/-;本研究中描述的Erbb4fl / fl 小鼠可以通过将Ad-Cre注射到施万细胞前体谱系中以这种方式使用。然而，本研究中提出的问题并不集中在 Erbb4 对MPNST启动的进化作用上，而是集中在MPNST如何劫持 Erbb4 信号传导以获得肿瘤生长优势上。
这里描述的方法有替代方案，包括通过RNA干扰（RNAi）敲低基因表达或在人类癌细胞系中用CRISPR灭活目的基因。这些替代方法是有价值的，可以与来自GEM肿瘤的细胞中的基因消融合作，以验证在小鼠肿瘤细胞中观察到的效果在人类对应物中被概括。但是，此处描述的方法有一些明显的优点。首先，GEM癌细胞中的基因的基因消融是快速的，并且导致靶向基因的完全失活。相比之下，经常观察到使用短发夹RNA仅导致基因表达的部分敲低。虽然CRISPR可以产生完全的基因失活，但鉴定具有完全失活的克隆需要延长的选择过程。
此外，必须检查多个克隆，以确保不同克隆之间CRISPR消融产生的影响不会有所不同。其次，在早期传代GEM肿瘤培养物中消融絮状等位基因的能力是有利的，因为这最大限度地减少了选择在培养物中有效生长的不同肿瘤细胞亚群的可能性。相比之下，通常在培养物中维持多年的人类细胞系通常来自不同的亚群，这些亚群非常适合培养，并且在此过程中经常经历遗传漂移。这导致这些细胞系产生在其母体肿瘤中不存在的新突变。最后，尽管本手稿描述了将GEM肿瘤细胞移植到免疫缺陷小鼠中，但值得注意的是，来自近交小鼠品系中出现的肿瘤的GEM肿瘤细胞可以同种异体移植到相同菌株的小鼠中。这将使研究人员能够在存在或不存在靶向基因的情况下评估具有完整免疫系统的动物的肿瘤生物学。
这里描述的方案中的关键步骤是用Ad5CMV-Cre / eGFP消融絮凝基因，并确保肿瘤细胞在基因消融和FACS后的存活。由于这是一个依赖于Cre重组酶消融絮凝基因的能力的过程，因此它可能会受到一些与在体内烧蚀絮状基因时可能遇到的相同问题的影响。这些问题将表现为靶等位基因的不完全消融。请注意，与使用CreERT2进行体内基因消融相比，纯化已经用表达eGFP的腺病毒载体成功转导的细胞的能力似乎确实可以最大限度地减少嵌合。然而，在编码蛋白质的靶向基因的情况下，例如在细胞表面表达的ErbB4，可以通过利用eGFP和识别目标蛋白的抗体（即对eGFP阳性/ erbB4阴性细胞）进行FACS来进一步确保靶基因的丢失。
因为，正如在引言中所指出的，许多单克隆抗体靶向治疗的蛋白质是细胞表面蛋白，这种方法通常应该是可行的。还应该注意的是，如果要对肿瘤细胞进行RNA-Seq以评估基因消融对转录组的影响，则让肿瘤细胞在FACS后至少恢复2-3天非常重要。在FACS之后不久获得的RNA-Seq数据集通常在某些细胞类型的生物重复之间显示出更多的基因表达变异性。这可能是细胞在通过FACS时遭受的创伤的结果;因此，在此过程之后，必须允许细胞恢复期。可以使用 DESeq2 分析 RNA-Seq 数据集，DESeq2 使用负二项式分布和分布方差的收缩估计器。在这些分析中，样品根据其 q值进行排序，这是最小的错误发现率（FDR），其中转录本水平的变化显着;FDR是使用本杰明-霍赫伯格多重测试调整程序计算的。或者，可以使用其他能够进行RNA-Seq分析工作流程的可用软件来鉴定DEG。
对于此MPNST动物模型，确定实验终点需要了解正在使用的动物模型中肿瘤的自然历史。通过跟踪一系列44只P 0-GGFβ3小鼠6和19只P0-GGFβ3的存活率来确定该GEM中MPNST的自然史;Trp53 + / -小鼠7，然后在达到生存终点时对所有这些动物进行完全尸检。在每个动物模型中确定了典型的存活时间和MPNST通常出现的位置。在大多数这些小鼠中，MPNSTs出现在三叉神经中。三叉神经中出现的MPNSTs通常产生与角膜浑浊相关的上睑下垂（上睑下垂产生的撕裂分布问题的结果），这为识别荷瘤小鼠提供了临床上有用的体征。肿瘤诊断应通过进行H&E染色和几个额外的诊断染色（S100β，巢蛋白Sox 10，H&E，Mart1）来确认，然后由合格的兽医或人类病理学家进行检查。这也很重要，因为该模型中的Trp53零等位基因使小鼠易患其他肿瘤，如淋巴瘤，并且必须将这些肿瘤与MPNST区分开来。
最后，这种方法有几个潜在的应用尚未探索，但在未来的调查中可能是可行的。例如，神经肽1（NRG1）是激活erbB3和erbB4的配体，以趋化方式促进MPNST细胞的迁移;erbB3 和 erbB4 都位于 MPNST 细胞37 的入侵足中。然而，目前尚不清楚 erbB3 或 erbB4 是否介导了对 NRG1 的趋化反应。因此，用这种方法消融erbB4的细胞可用于解决这个问题。这些实验的自然后续工作是使用常用的方法评估转移是否需要erbB4，其中通过尾静脉注射肿瘤细胞，然后评估肺转移的数量。与其他方法相比，这种方法具有明显的优势，例如使用shRNA来敲低 erbB4 表达，因为shRNA表达通常在一段时间后在细胞中沉默。此外，预计早期传代培养物将包含肿瘤衍生亚群的混合物，包括容易转移的细胞亚群。使用此处描述的方法制备的细胞进行转移测定将允许评估转移电位，该转移电位比已建立的细胞系更能代表母体肿瘤。当然，这只是未来可以使用这种方法的应用程序的一个例子。我们希望其他研究人员将这种方法与特别感兴趣的问题相结合，以提高识别作为人类癌症关键治疗靶点的蛋白质的能力。
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Disclosures
作者没有利益冲突要披露。
Acknowledgments
这项工作得到了美国国家神经疾病和中风研究所（R01 NS048353，R01 NS109655），美国国家癌症研究所（R01 CA122804），国防部（X81XWH-09-1-0086，W81XWH-11-1-0498，W81XWH-12-1-0164，W81XWH-14-1-0073和W81XWH-15-1-0193）和儿童肿瘤基金会（2014-04-001和2015-05-007）的资助。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ad5CMV-eGFP | Gene Transfer Vector Core, Univ of Iowa | VVC-U of Iowa-4 | |
| Ad5CMVCre-eGFP | Gene Transfer Vector Core, Univ of Iowa | VVC-U of Iowa-1174 | |
| alexa 568 secondary antibody | Thermo/Fisher | GaR A11036 | |
| Bioconductor Open Source Software for Bioninformatics | Bioconductor | http://www.bioconductor.org | alternative statistical analysis tool used for step 4.4 |
| CD31 | Abcam | ab28364 | |
| Celigo Image Cytometer | Nexcelom Bioscience | N/A | |
| Cell Stripper | Corning | 25-056-Cl | mixture of chelators |
| DAB staining kit | Vector Labs | MP-7800 | |
| DAVID (Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery) | DAVID | https://david.ncifcrf.gov | functional enrichment analysis software used for step 4.5 |
| DMEM | Corning | 15-013-Cl | |
| DreamTaq and Buffer (Genotyping PCR) | Thermo/Fisher | EP0701 and K1072 | |
| erbB4 antibodies | Santa Cruz | sc-284 | |
| erbB4 antibodies | Abcam | ab35374 | |
| erbB4 antibodies | Millipore | HFR1: 05-1133 | |
| FACS Sorter | BD Biosciences | Aria II | |
| Forskolin | Sigma | F6886 | |
| GenomeSpace Tools and Data Sources | GenomeSpace | https://genomespace.org/support/tools/ | general resource for several types of open source bioinformatic tools for step 4.5 |
| Glutamine | Corning | 25-005-Cl | |
| Gorilla Gene Ontology enRIchment anaLysis and visuaLizAtion tool | Gorilla | N/A, http://cbl-gorilla.cs.technion.ac.il | functional enrichment analysis software used for step 4.5 |
| GSEA Gene Set Enrichment Analysis | Broad Institute | N/A, https://www.gsea-msigdb.org/gsea/index.jsp | functional enrichment analysis software used for step 4.5 |
| HSD: Athymic Nude-FOxn1nu mice | Envigo (Previously Harlan Labs) | 69 | |
| Illumina HiSeq2500 (next generation DNA sequencer) | Illumina | Hi Seq 2500 | DNA sequencer used for step 4.2 |
| Lasergene: ArrayStar Gene expression and variant analysis | DNAStar LaserGene software | N/A | software statistical and normalization analysis used for step 4.4 |
| Lasergene: SeqMan NGen sequence alignment assembly | software alignment used for step 4.3 | N/A | software alignment used for step 4.3 |
| Matrigel, low growth factor basement membrane matrix | Corning | 354230 | |
| NRG1-beta | In house | Generated by SLC, also commercially available from R & D Systems(396-HB-050/CF). | |
| Nuclear Stain Hoeschst 33342 | Thermo | 62249 | |
| Panther Gene Ontology Classification System | Panther | http://pantherdb.org | functional enrichment analysis software used for step 4.5 |
| Partek (BWA aligner and analyzer) | Partek, Ver 7 | N/A | software alignment and statistical/normalization used for step 4.3 |
| Pen/Strep | Corning | 30-002-Cl | |
| Primer 1: 5′-CAAATGCTCTCTCTGTTCTTTGT GTCTG- 3′ |
Eurofins Genomics | Primer 1 + 2: 250 bp ErbB4 null product and a 350 bp Floxed ErbB4 product; | |
| Primer 2: 5′-TTTTGCCAAGTTCTAATTCCATC AGAAGC-3′ |
Eurofins Genomics | Primer 1 + 2: 250 bp ErbB4 null product and a 350 bp Floxed ErbB4 product; | |
| Primer 3: 5′-TATTGTGTTCATCTATCATTGCA |
Eurofins Genomics | Primer 1 + 3: 350 bp wild-type ErbB4 product. | |
| Propidium Iodine | Fisher | 51-351-0 | |
| Proteom Profiler Phospho-Kinase Arrays | R&D Systems | ARY003B | |
| Real time glo | Promega | G9712 | bioluminescent cell viability assay |
| ToppGene Suite | ToppGene | https://toppgene.cchmc.org | functional enrichment analysis software used for step 4.5 |
| Trizol (acid-quanidinium-phenol and choloroform based reagent) | Invitrogen | 15596026 | |
| Tyramide Signal Amplification Kit | Perkin Elmer | NEL721001EA |
References
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