Summary
Burada, doğrudan ölüme neden olan sinyal kompleksinde (DISC) caspase-8 işlemenin algılanmasını sağlayan ve bu kompleksin bileşimini belirleyen deneysel bir iş akışı sunulmaktadır. Bu metodoloji, hücre ölüm yollarının moleküler mekanizmalarının çözülmesinden apoptoz ağlarının dinamik modellemesine kadar geniş uygulamalara sahiptir.
Abstract
Dış apoptoz, CD95/Fas/APO-1 veya tümör nekroz faktörüne bağlı apoptoz indükleyici ligand (TRAIL)-reseptör 1/reseptör 2 (TRAIL-R1/R2) gibi ölüm reseptörlerinin (DR) aktivasyonu ile aracılık eder. Bu reseptörlerin konyak ligandları ile uyarılması, ölüme neden olan sinyal kompleksinin (DISC) montajına yol açar. DISC, ölüm etki alanı (FADD), prokaspazlar-8/-10 ve hücresel FADD benzeri interlökin (IL)-1β dönüştürücü enzim inhibitör proteinleri (c-FLIP'ler) ile Fas ilişkili protein olan DR'den oluşur. DISC, procaspase-8 işleme ve etkinleştirme için bir platform görevi görür. İkincisi, DISC'de bir araya getirilen ölüm efektörü etki alanı (DED) filamentlerinde küçültme/oligomerizasyon yoluyla gerçekleşir.
Procaspase-8'in aktivasyonu, birkaç adımda gerçekleşen işlenmesi ile takip edilir. Bu çalışmada, bu komplekste DISC oluşumunun ölçülmesine ve procaspaz-8'in işlenmesine olanak sağlayan yerleşik bir deneysel iş akışı açıklanmaktadır. İş akışı, batı blot analizi tarafından desteklenen immün önksepitasyon tekniklerine dayanmaktadır. Bu iş akışı, DISC'ye prokaspaz-8 işe alımının farklı adımlarının ve işlenmesinin dikkatli bir şekilde izlenmesine izin verir ve dışsal apoptozun moleküler mekanizmalarını araştırmak için son derece önemlidir.
Introduction
En iyi çalışılan ölüm reseptörlerinden (DR) biri CD95'tir (Fas, APO-1). Dışsal apoptotik yol, DR'nin konyak ligand ile etkileşimi ile başlar, yani CD95L, CD95 veya TRAIL-Rs'ye bağlanır. Bu, ilgili DR. DISC'de DİSK oluşumu ile sonuçlanır CD95, FADD, procaspaz-8/-10 ve c-FLIP proteinleri1,2'den oluşur. Ayrıca, DISC, CD95 ve FADD gibi ölüm alanı (DD) içeren proteinler ile FADD, procaspase-8/-10 ve c-FLIP gibi DED içeren proteinler arasındaki etkileşimlerle bir araya getirilir (Şekil 1). Procaspase-8, DED'lerinin ilişkilendirilmesi yoluyla oligomerizasyondan geçer, bu da DED filamentlerinin oluşumuna ve ardından prokaspaz-8 aktivasyonu ve işlenmesine neden olarak ortaya çıkır. Bu, hücre ölümüne yol açan bir kaspaz kaskad tetikler (Şekil 1)3,4. Bu nedenle, prokaspaz-8, ILGILI makromoleküler platform DISC'de etkinleştirilen CD95 veya TRAIL-Rs tarafından aracılık edilen dış apoptoz yolunun merkezi bir başlatıcı kaspazıdır.
İki procaspase-8 izoformunun, yani procaspase-8a (p55) ve -8b 'nin (p53), DISC5'ealındığı bilinmektedir. Her iki izoform da iki DED'den oluşur. DED1 ve DED2, prokaspaz-8a/b'nın N-terminal kısmında ve ardından katalitik p18 ve p10 etki alanlarında bulunur. Prokaspaz-8 DED'lerin detaylı kriyo-elektron mikroskopisi (kriyo-EM) analizi, prokaspaz-8 proteinlerinin DED filamentleri4,6adı verilen filamentli yapılara bir araya topladığını ortaya koydu. Dikkat çekici bir şekilde, doğrusal prokaspaz-8 zincirlerinin başlangıçta dimerizasyon ve ardından DISC'de prokaspaz-8 aktivasyonu ile meşgul olduğu öne sürüldü. Şimdi, bu zincirlerin prokaspaz-8 DED filamentinin sadece bir alt yapısı olduğu bilinmektedir, ikincisi üçlü sarmal3, 4,6,7içine monte edilmiş üç zincirden oluşur.
DED filamentinde küçültme üzerine, prokaspaz-8a/b'daki konformasyonel değişiklikler prokaspaz-8'in aktif merkezinin oluşumuna ve aktivasyonuna yol açar3,8. Bunu, iki yoldan aracılık edilen procaspase-8 işleme takip eder: birincisi bir p43 / p41 dekolte ürününün üretimi ve ikincisi bir p30 dekolte ürününün ilk neslinden geçer. p43/p41 yolu, Asp374'te prokaspaz-8a/b'nın bölünmesiyle başlatılır ve p43/p41 ve p12 bölünme ürünleriyle sonuçlanır (Şekil 2). Ayrıca, bu parçalar Asp384 ve Asp210/216'da otomatik olarak bölünür ve aktif kaspaz-8 heterotetramer, p102/p18 29,10,11oluşumuna neden olarak. Ek olarak, p43/p41 işleme yoluna paralel olarak, Procaspase-8a/b'nın da Asp216'da bölündlüğü, bu da C-terminal bölünme ürünü p30'un oluşumuna yol açar, ardından proteolizi p10 ve p1810'a (Şekil 2).
DED filamentinde procaspase-8a/b aktivasyonu kesinlikle c-FLIPs12adlı proteinler tarafından düzenlenir. c-FLIP proteinleri üç izoformda oluşur: c-FLIPLong (c-FLIPL),c-FLIPShort (c-FLIPS)ve c-FLIPRaji (c-FLIPR). Her üç izoform da N-terminal bölgelerinde iki DED içerir. c-FLIPL ayrıca C-terminal katalitik olarak aktif olmayan kaspaz benzeri etki alanı12,13 'esahiptir. C-FLIP-c-FLIPS ve c-FLIPR'ninher iki kısa izoformu da DISC6, 14,15'teDED filament oluşumunu bozarak anti-apoptotik bir şekilde hareket eder. Ek olarak, c-FLIPL kaspaz-8 aktivasyonunu konsantrasyona bağlı bir şekilde düzenleyebilir. Bu hem pro- hem de anti-apoptotik etkilere neden olabilir16,17,18. Katalitik olarak aktif prokaspaz-8/c-FLIPL heterodimerini oluşturan c-FLIPL, prokaspaz-8'in aktif merkezinin stabilizasyonuna ve aktivasyonuna yol açar. c-FLIPL'nin pro-veya anti-apoptotik işlevi doğrudan DED filamentlerindeki miktarına ve sonraki monte edilmiş prokaspaz-8/c-FLIPL heterodimers19miktarına bağlıdır. DISC'deki düşük veya ara c-FLIPL konsantrasyonları, kaspaz-8'in aktivasyonunu destekleyen DED filamentinde yeterli miktarda prokaspaz-8/c-FLIPL heterodimer ile sonuçlanır. Buna karşılık, artan c-FLIPL miktarları doğrudan DISC20'deanti-apoptotik etkilerine yol açar.
Birlikte ele alındığında, DISC'de procaspase-8a/b'nın etkinleştirilmesi ve işlenmesi, birkaç adımı içeren son derece düzenlenmiş bir süreçtir. Bu makalede, prokaspaz-8 işleminin doğrudan DISC'de ölçülmesi ve bu kompleksin bileşiminin analizi tartışılmaktadır. Bu, örnek DR kompleksi olarak CD95 DISC kullanılarak sunulacaktır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
T hücre deneyleri 42502-2-1273 Uni MD etik anlaşmasına göre gerçekleştirilmiştir.
1. Deney için hücrelerin hazırlanması
NOT: Bu immün önkseçasyon için ortalama hücre sayısı 1 × 107'dir. Yapışan hücrelerin deneyden bir gün önce tohumlanması gerekir, böylece deney gününde 1 ×10 7 hücre vardır.
- Yapışan hücreleri deneye hazırlama
- Tohum 5-8 ×10 6 yapışan hücre 20 mL orta (kompozisyon için Malzeme Tablosuna bakınız) deney başlamadan bir gün önce 14,5 cm'lik yemeklerde her durum için.
- Deney gününde, hücrelerin% 80-90 birleştiğinden ve yemeğe yapışmasını sağlayın. Ortamı atın ve yapışık hücrelere taze ortam ekleyin.
- Deneme için süspansiyon hücrelerini hazırlama
- Deney başlamadan hemen önce 14,5 cm'lik yemeklere durum başına 1 × 107 süspansiyon hücresini 10 mL kültür ortamına dikkatlice yerleştirin (kompozisyon için Malzeme Tablosuna bakın).
- Birincil hücreleri kullanıyorsanız, birincil T hücrelerini daha önce açıklanan yordam21'egöre yalıtın. Birincil T hücrelerini 24 saat boyunca 1 μg/mL fitohemagglutinin ile tedavi edin, ardından 6 gün boyunca 25 U/mL IL2 tedavisi.
- Deney başlamadan hemen önce 14,5 cm'lik yemeklere durum başına 1 × 108 birincil T hücresini 10 mL kültür ortamına dikkatlice yerleştirin (kompozisyon için Malzeme Tablosuna bakın).
NOT: Bu hücreler daha küçük olduğu için bu daha yüksek sayıda birincil T hücresi önerilir.
2. CD95L stimülasyon
- Hücreleri CD95L ile uyarın (daha önce20 veya ticari olarak mevcut olarak açıklandığı gibi üretilir (Bkz. Malzeme Tablosu)).
NOT: CD95L konsantrasyonu ve stimülasyon süresi hücre tipibağımlıdır 13,15,22,23,24,25. Paralel olarak bir 'boncuk kontrolü' örneği oluşturmak için bir stimülasyon koşulu iki kez hazırlayın.- Seçilen CD95L konsantrasyonu ile yapışan hücreleri uyarın. Plakayı bir açıda tutun ve ligand'ı yapışan hücrelere dokunmadan ortama borun.
- Ligand çözeltisini hücre süspansiyonuna pipetleyarak SÜSPANSIYON hücrelerini CD95L ile uyarın.
3. Hücre hasadı ve liziz
- Hücre tabaklarını buza yerleştirin.
NOT: Ortamı atmayın. Ölmekte olan hücreler ortamda yüzer ve analiz için önemlidir. - Hücre süspansiyonu içine 10 mL soğuk fosfat tamponlu salin (PBS) ekleyin ve ekli hücreleri plakadan kazıyın. Hücre süspansiyonu 50 mL tüpte toplayın.
- Hücre kabını 10 mL soğuk PBS ile iki kez yıkayın ve yıkama çözeltisini aynı 50 mL tüpe yerleştirin. Hücre süspansiyonu 5 dakika, 4 °C için 500 × g'da santrifüj edin.
- Üstnatant atın ve hücre peletini 1 mL soğuk PBS ile yeniden depolayın. Hücre süspansiyonu 1,5 mL'lik bir tüpe aktarın.
- Hücre süspansiyonu 5 dakika, 4 °C için 500 × g'da santrifüj edin. Üstnatant atın ve hücre peletini 1 mL soğuk PBS ile yeniden depolayın.
- Hücre süspansiyonu 5 dakika, 4 °C için 500 × g'da santrifüj edin. Süpernatant atın ve hücre peletini 1 mL lizis tamponu ile yeniden canlandırın (%4 proteaz inhibitörü kokteyli içerir). Buzda 30 dakika kuluçkaya yatır.
- Lisatı maksimum hızda (~17.000 × g)15 dakika, 4 °C'ye santrifüj edin.
- Süpernatantı (lysate) temiz bir tüpe aktarın. Peletin at. Başka bir tüpe 50 μL likür alın. Bradford tahlil ile protein konsantrasyonu analiz ve bir şişede 25 μg proteine karşılık gelen lysate miktarını alın. Şişeye yükleme tamponu (kompozisyon için Malzeme Tablosuna bakın) ekleyin. -20 °C'de lisat kontrolü olarak saklayın.
4. İmmün Önseçme (IP)
- 2 μL anti-APO-1 antikorları ve 10 μL protein A sepharose boncuklarını (üretici tarafından önerildiği gibi) lisate ekleyin. Bir 'boncuk kontrolü' oluşturmak için lysate (uyarılmış örnek) içeren ayrı bir tüpe boncukların sadece 10 μL'sini ekleyin.
NOT: A sepharose boncuk proteinini kullanırken uçları keserek veya IP için özel ipuçları satın alarak geniş delikli pipet uçlarını kullanın. - Lysate karışımını antikorlar / protein A sepharose boncukları ile 4 ° C'de bir gecede hafif karıştırma ile kuluçkaya bırakın. Lysates antikorlar / protein A sepharose boncukları ile 4 dakika, 4 ° C için 500 × g'da santrifüj. Süpernatant atın, boncuklara 1 mL soğuk PBS ekleyin ve bu adımı en az üç kez tekrarlayın.
- Üstnatant atın. Boncukları tercihen 50 μL Hamilton şırıncı ile aspire edin.
5. Batı lekesi
- Boncuklara 20 μL 4x yükleme tamponu ekleyin (bileşim için Malzeme Tablosuna bakın) ve 10 dakika boyunca 95 °C'de ısıtın. Lisat kontrollerini 95 °C'de 5 dakika ısıtın.
- Lysates, IPs ve bir protein standardını % 12,5 sodyum dodecyl sülfat (SDS) jeline yükleyin (jel hazırlama için Malzeme Tablosuna bakın) ve 80 V sabit voltajla çalıştırın.
- Proteinleri SDS jelinden nitroselüloz membrana aktarın.
NOT: Burada, ilgi proteinleri için optimize edilmiş yarı kuru teknik, 12 dakika (25 V; 2.5 A= sabit) üzerinden transfer için kullanılmıştır. Nitroselüloz membranını ve iki mini boyutlu transfer yığınını elektroforez tamponunda bekletin (kompozisyon için Malzeme Tablosuna bakın, üreticinin talimatlarına göre hazırlayın) batı şişkinliğinden önce birkaç dakika bekletin. - Şişmiş zarı bir kutuya yerleştirin ve blokaj çözeltisinde 1 saat boyunca engelleyin (PBS'de (PBST) % 0,1 Ara-20 + % 5 süt). Membranı nazik ajitasyon altında blokaj çözeltisi ile kuluçkaya yatırın.
- Membranı PBST ile her yıkamada 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.
6. Batı leke tespiti
- Belirtilen seyreltmede ilk birincil antikoru ekleyin (Malzeme Tablosunabakın) zara ekleyin ve hafif ajitasyonla 4 °C'de bir gecede kuluçkaya yatırın.
- Membranı PBST ile her yıkamada 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.
- Membranı 20 mL ikincil antikorla (PBST+%5 sütte 1:10.000 seyreltilmiş) oda sıcaklığında 1 saat hafif sallanarak kuluçkaya yatırın.
- Membranı PBST ile her yıkamada 5 dakika boyunca üç kez yıkayın.
- PBST'yi atın ve zara yaklaşık 1 mL yaban turpu peroksidaz substratı ekleyin.
- Kemomuminsan sinyalini tespit edin (Bkz. Malzeme Tablosu).
NOT: Pozlama süresi ve yakalanan görüntü sayısı hücredeki protein miktarına ve kullanılan antikorların özgüllüğüne bağlıdır. Tespit için kullanılan her antikor için ampirik olarak kurulmalıdır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Diske caspase-8 işe alımını ve CD95 DISC'deki işlenmesini analiz etmek için, bu makalede CD95 DISC'nin IP'sini batı blot analiziyle birleştiren klasik bir iş akışı açıklanmaktadır. Bu, DISC'de caspase-8 aktivasyonunun birkaç temel özelliğin algılanmasını sağlar: caspase-8-aktive edici makromoleküler platformun montajı, DISC'ye procaspase-8'in işe alınması ve bu başlatıcı caspazın işlenmesi (Şekil 1 ve Şekil 2). Bu iş akışı, hassas hücrelerin CD95L ile zamana bağlı bir şekilde tedavisini, ardından lizizlerini, anti-CD95 (anti-APO-1) antikorları kullanılarak immün önkekopitasyonunu ve sonraki batı leke analizini içerir (Şekil 3).
Rahim ağzı kanseri HeLa-CD95 hücreleri DISC oluşumunu analiz etmek için örnek olarak kullanılmıştır26. Bu hücrelerin CD95L ile uyarılması, CD95-immün önksepitasyon yoluyla izlenen yüksek düzeyde CD95 DISC oluşumuna neden oldu (Şekil 4). Cd95, FADD, procaspase-8, procaspase-10 ve c-FLIP'ler bu CD95-immünopekritasyonlarda etkili DISC oluşumunu gösteren gözlendi. Daha da önemlisi, PROCASPE-8a/b: p43/p41, p30 ve p18'in dekolte ürünleri DISC'de tespit edildi, bu da prokaspaz-8'in aktivasyonunu ve daha sonra işlenmesini gösterir. Özellikle, prokaspaz-8 p43/p41 ve p18'in dekolte ürünleri tespit edildi ve bu da p43 işleme yolunun yukarıda belirtilen iki adımını gösterdi. Ek olarak, p30 ürünü tespit edildi, bu da caspase-8 işleminin alternatif yolunu gösteriyordu. Ayrıca, DISC'de prokaspaz-8'in aktivasyonu, c-FLIP proteinleri gibi alt tabakalarının bölünmesi ile takip edilir.
Nitekim, immünopipiasyonlarda, kaspaz-8 aktivasyonunu gösteren c-FLIP-p43-FLIP ve p22-FLIP-'in dekolte ürünleri tespit edilmiştir (Şekil 4). Daha da önemlisi, disc-immünöteritasyonun özgüllüğünün altını çizen tedavi edilmemiş hücrelerden alınan immün önkseçim örneklerinde ne FADD, procaspase-8, procaspase-10 ve c-FLIP'ler ne de dekolte ürünleri tespit edilmiştir (Şekil 4). Prokaspaz-8'in farklı dekolte ürünlerine karşılık gelen bantlar ölçülerek bu deneylerden önemli bilgiler elde edilebilir (Şekil 4). Bu bilgiler, apoptoz ağlarının matematiksel modellemesinde kullanılabilir ve yol düzenlemesi hakkında nicel içgörüler sağlar.
DISC'deki caspase-8 aktivasyon seviyesi c-FLIP'ler tarafından modüle edilir. Bu nedenle, c-FLIPL (HeLa-CD95-FL)15'i aşırı ifade eden HeLa-CD95 hücreleri ikinci örnek olarak seçilmiştir (Şekil 5). Bu deneylerde c-FLIPL izoformunun etkileri gözlemlenebilir, bu da Hillert ve diğerleri tarafından tanımlandığı gibi ebeveyn HeLa-CD95 hücrelerindeki DISC'deki prokaspaz-8'in karşılık gelen proteolizi ile karşılaştırıldığında DISC'de p43/p41'e farklı bir prokaspaz-8a/b işleme oranı ile sonuçlanabilir. 15. Şekil 4'tekigözlemlere benzer şekilde, bu immünopipiasyonların özgüllüğünü destekleyen CD95L tedavisi olmayan HeLa-CD95-FL hücrelerinden elde edilen immünopipitasyonlarda FADD, procaspase-8, procaspase-10, c-FLIP proteinlerinin ve bölünme ürünlerinin işe alınmaması tespit edildi. İmmün prempripozasyonların özgüllüğü için daha fazla kanıt, CD95L ile tedavi edilen immünopipitasyonlarda gözlenen DISC'ye prokaspaz-3 ve poli (ADP-riboz)polimeraz 1 (PARP1) alımının olmamasıdır (Şekil 5). Bu proteinler kompleksin bir parçası değildir ve immün önkeklim sinyallerindeki yoklukları, bol hücresel proteinlerin spesifik olmayan bağlanmasının yokluğu için kanıt olarak hizmet edebilir.
Son olarak, CD95 DISC'nin süspansiyon hücrelerinden immün önkeksepitasyonları üçüncü bir örnek olarak gerçeklenmiştir, örneğin, aktif birincil T hücreleri (Şekil 6). Bu hücreler ayrıca dekolte ürünleri ile birlikte anti-CD95-immünopipitasyonlarda gözlenen yüksek CD95, FADD, prokaspaz-8, prokaspaz-10 ve c-FLIP seviyeleri ile karakterizedir (Şekil 6). İmmün önkemeritasyonlarda prokaspaz-8 bölünme ürünlerinin tespiti, birincil T hücrelerinden DISC-immün önkupekte bu başlatıcı kaspazın aktivasyonunu ve işlenmesini gösterir. Bu deneyler, DISC'nin birçok yapışık ve süspansiyon hücresinden immün önsezilenebileceğini ve caspase-8 işleme ve aktivasyonun batı blot analizi ile doğrulanabileceğini göstermektedir.
Şekil 1: CD95 sinyal yolunun şematik sunumu. CD95L, DISC derlemesini tetikler. DISC CD95, FADD, procaspase-8/-10 ve c-FLIP'den oluşur. FADD, DD'si aracılığıyla CD95'e bağlanırken, prokaspaz-8, prokaspaz-10 ve c-FLIP'ler DED'leri aracılığıyla etkileşime girerek DED filamentleri oluşturur. DED filamentlerinin oluşumu, prokaspaz-8 dimerizasyonu, işlenmesi ve sonraki etkinleştirme için bir platform görevi görür. Aktif kaspaz-8 heterotetramer, p182/p102, apoptoza yol açan bölünme ile caspase-3'ü aktive eder. Kısaltmalar: CD = farklılaşma kümesi; CD95L = CD95 ligand; DISC = ölüme neden olan sinyal kompleksi; DD = ölüm etki alanı; FADD= Fas ile ilişkili ölüm alanı; c-FLIP = hücresel FADD benzeri interleukin (IL)-1β dönüştürücü enzim inhibitör protein; DED = ölüm efektörü etki alanı; c-FLIPL = c-FLIPUzun. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: DISC'de Procaspase-8 işleme. DISC'de procaspase-8a/b işlemenin iki yolu gösterilmiştir. İlk yol p43/p41 kuşağını ve ardından p18 oluşumunu içerir. İkinci yol p30 neslini ve ardından p18 ve p10'a işlenmesini içerir. Kalıntılar procaspase-8a dizisine göre numaralandırılıyor. Kısaltmalar: DED = ölüm efektör etki alanı. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: DISC-IP'nin deneysel kurulumunun şematik sunumu. Hücreler CD95L ile uyarılır. Stimülasyondan sonra, hücreler toplanır ve toplanır, ardından farklı yıkama adımları atlatır. Hücreler daha sonra lislenir ve lysates toplanır. Daha sonra, protein A-sepharose boncukları ve anti-APO-1 (anti-CD95) antikorları bir gecede lysate ve inkübe edildi. Birkaç yıkama adımından sonra, immün önksepektüsler batı şişkinliği ile analiz edildi. Kısaltmalar: DISC = ölüme neden olan sinyal kompleksi; IP = immün önseçme; CD95L = CD95 ligand. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: HeLa-CD95 hücrelerinde CD95 DISC oluşumu. HeLa-CD95 hücreleri 30 dk boyunca 125 ng/mL CD95L ile uyarıldı veya anti-APO-1 (anti-CD95) antikorlar kullanılarak 1 h. CD95 DISC-IPs yapıldı. IP'lerin bileşimi, belirtilen proteinler için antikorlar kullanılarak batı leke analizi ile incelendi. Actin yükleme kontrolü olarak kullanıldı. Girişler gösterilir. DISC'deki procaspase-8 dekolte ürünlerinin nicelemesi cd95 sinyaline göre gösterilir ve normalleştirilir. Kısaltmalar: yani = uzun pozlama; s.e. = kısa pozlama; BC = antikor ilavesi olmadan IP'yi 'yalnızca boncuklarla' kontrol edin; CD95L = CD95 ligand; DISC = ölüme neden olan sinyal kompleksi; IP = immün önseçme; FADD = Fas ile ilişkili ölüm alanı; c-FLIP = hücresel FADD benzeri interleukin (IL)-1β dönüştürücü enzim inhibitör protein; c-FLIPL = c-FLIPUzun; c-FLIPS = c-FLIPKısa; M = kiloDalton (kDa) cinsinden moleküler ağırlık. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: C-FLIP L-overexpressing HeLa-CD95 hücrelerinde CD95 DISC oluşumu. HeLa-CD95-FL hücreleri belirtilen zaman noktaları (1-3 saat) için 250 ng/mL CD95L ile uyarıldı. CD95 DISC-IP'ler anti-APO-1 (anti-CD95) antikorları kullanılarak gerçekleştirildi. IP'lerin bileşimi batı leke analizi ile incelendi ve belirtilen proteinler için analiz edildi. Actin yükleme kontrolü olarak kullanıldı. Girişler gösterilir. DISC'deki procaspase-8 dekolte ürünlerinin nicelemesi CD95 sinyaline gösterilir ve normalleştirilir. İkiden bir temsili deney gösterilir. Kısaltmalar: yani = uzun pozlama; s.e. = kısa pozlama; BC = antikor ilavesi olmadan IP'yi 'yalnızca boncuklarla' kontrol edin; CD95L = CD95 ligand; DISC = ölüme neden olan sinyal kompleksi; IP = immün önseçme; FADD = Fas ile ilişkili ölüm alanı; c-FLIP = hücresel FADD benzeri interleukin (IL)-1β dönüştürücü enzim inhibitör protein; c-FLIPL = c-FLIPUzun; PARP1 = poli(ADP-riboz)polimeraz 1; M = kiloDalton (kDa) cinsinden moleküler ağırlık. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Birincil T hücrelerinde CD95 DISC oluşumu. Primer aktif T hücreleri 15 dk ve 30 dk boyunca 500 ng/mL CD95L ile uyarıldı. IP'lerin bileşimi batı leke analizi ile incelendi ve belirtilen proteinler için analiz edildi. Actin yükleme kontrolü olarak kullanıldı. DISC'deki procaspase-8 dekolte ürünlerinin nicelemesi CD95 sinyaline gösterilir ve normalleştirilir. Girişler gösterilir. Kısaltmalar: yani = uzun pozlama; s.e. = kısa pozlama; CD95L = CD95 ligand; DISC = ölüme neden olan sinyal kompleksi; IP = immün önseçme; FADD = Fas ile ilişkili ölüm alanı; c-FLIP = hücresel FADD benzeri interleukin (IL)-1β dönüştürücü enzim inhibitör protein; c-FLIPL = c-FLIPUzun; M = kiloDalton (kDa) cinsinden moleküler ağırlık. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Bu yaklaşım ilk olarak Kischkel ve ark.27 tarafından tanımlanmıştır ve o zamandan beri birkaç grup tarafından başarıyla geliştirilmiştir. Bu komplekste etkili DISC-immün önsepitasyon ve izleme kaspaz-8 işleme için birkaç önemli konu göz önünde bulundurulmalıdır.
İlk olarak, immün önseçme sırasında tüm yıkama adımlarını takip etmek önemlidir. Özellikle önemli olan sepharose boncuklarının son yıkama adımları ve sepharose boncuklarının kurumasıdır. Bu, immün önkeklim sinyal/ gürültü oranını artırmak için doğru yapılmalıdır, disc'te caspase-8 işe alım ve işlemenin tespit edilmesine izin verir. Bununla birlikte, birkaç çalışma, bu ön inceleme adımının, batı blotting 7,23ile DISC'ye caspase-8 işe alımının tespiti için gerekli olmadığını göstermiştir. Bununla birlikte, belirtildiği gibi, immün önksepitasyonun sonunda boncukların yıkanması güvenilir sonuçlar elde etmek için gereklidir. Bol hücresel proteinlerin sepharose boncuklarına spesifik olmayan bağlanması, esasen çekirdek DISC bileşenlerinin spesifik sinyallerini azaltabilir. Spesifik olmayan bağlamanın yokluğu için önemli bir kontrol olarak, DISC'de bulunmadığı bildirilen proteinlerin batı leke analizi yapılabilir. Bu analizin bir örneği, PARP1 ve caspase-3'ün DİSK-immün özürlülüme alımının gözlenmediği Şekil 5'teverilmiştir. Bu, belirli bir immün önseçmenin özgüllüğünü ve deney sırasında sepharose boncuklarının yeterli yıkanması gerektiğini gösterir.
İkinci olarak, sadece boncuk kontrolü veya immün önkseçme kontrolü gibi negatif kontrollerin, immün önkseçme için kullanılan antikorla aynı izotipe sahip bir antikorla yapılması çok önemlidir. Anti-APO-1 antikorları için anti-fare IgG3 antikorları izotip kontrolü olarak kullanılabilir. Üçüncü olarak, sadece CD95'in gözlenmesi gereken tedavi edilmemiş örneklerden immün önksepitasyonun sonuçlarını izlemek önemlidir. Bu örneklerde FADD, c-FLIP veya procaspase-8'in tespiti tipik olarak immün önseçme protokolünde veya yıkama adımlarında bazı eksikliklerin varlığını gösterir. Bu, FADD veya c-FLIP'in CD95 ile stimülasyondan bağımsız ilişkisine ilişkin varsayımlara yol açabilir, bu da tamamen doğru olmayabilir ve bunun yerine immün önkupsepitasyondaki kusurları gösterebilir. Dördüncüsü, her immünoselipitasyon için, immünoprecipitasyon tarafından analiz edilen çekirdek proteinlerin ekspresyonunu ve posttranslational modifikasyonlarını ölçmek için girişler veya lysatlar dikkatle analiz edilmelidir.
Beşinci olarak, zamana bağlı analiz, kompleksteki değişikliklerin zaman içinde takip edilmesine izin verir ve komplekse alınan proteinlerin özgüllüğü hakkında başka bir önemli onay sağlar. Bu bağlamda, önemli bir konu, her hücre hattının farklı bir CD95 ekspresyon seviyesine ve bu kompleksin hücre içi bileşenlerine sahip olmasıdır. Buna göre, CD95 DISC oluşumunun kesin zamanlaması her bir hücre tipi için dikkatlice belirlenmek zorundadır. Son olarak, DISC dinamiklerinin analizi için en önemli konu, her immün önksepitasyondaki protein miktarının karşılaştırılmasıdır. Anti-APO-1 antikorları kullanılarak gerçekleştirilen CD95 DISC-immün özürlürasyonlar için CD95 miktarı, karşılaştırılan komplekslerin eşit miktarının önemli bir ölçüsüdür. İmmün önksezilerde CD95 sinyalinin yoğunluğu nispeten yüksek olduğu için bu zor olabilir. Bununla birlikte, ilgili batı leke sinyalini ölçmek için en uygun zaman aralığını bulmak gerekir. Diğer bir engel, CD95'in, birkaç 'bulanık' bandın belirli bir deseninin varlığı nedeniyle immün özürlülükte tespit edilmesindeki zorluklara da katkıda bulunan oldukça glikosillenmiş bir protein olmasıdır28.
DISC-immünprecipitasyon analizi, kaspaz aktivasyonunu ve işlenmesini tespit etmek için en uygun temeli sağlar. Gerçekten de, batı şişkinliği ile birlikte immün önkupitasyon, prokaspaz-8a/b: p43/p41, p30 ve p18'in bölünme ürünlerinin bu çalışmada gösterildiği gibi nicel olarak tespit edilmesine izin verir (Şekil 4, Şekil 5ve Şekil 6). Bu da deneycilerin zaman içinde procaspase-8a/b işlemedeki değişiklikleri takip etmelerine ve prokaspaz-8'in farklı bölünme adımlarını ayırt etmelerine olanak tanır. Bu yaklaşım, matematiksel modellerde caspase-8 aktivasyonunu tanımlamak ve DISC 7,20,29'daki inter-ve intramoleküler prokaspaz-8 işlemlerini ayırt etmek için başarıyla kullanılmıştır. Ayrıca, caspase-8 dekolte ürünlerinin batı şişkinliği ile ölçülmesi, IETD substratı temel alan geleneksel caspase-8 aktivite testlerine kıyasla açık avantajlara sahiptir. İkinci durumda, IETD'nin diğer kaspazlar için de bir substrat görevi yaptığı iyi belirlenmiştir. Bu nedenle, IETD aktivitesinin tespitinin hücredeki kaspaz aktivitesinin genel bir artışına işaret ettiğine dair kanıtlar artmaktadır. Buna karşılık, batı leke analizinin kullanılması, batı blottaki ilgili bantların özellikle caspase-8'e atanmasına yardımcı olabilir ve araştırmacının bu komplekste caspase-8'in etkinleştirildiğinden emin olmasını sağlayabilir. Ayrıca, yukarıda belirtildiği gibi, DISC'de caspase-8 işlemenin ölçülmesi matematiksel modelleme ve sistem biyolojisi çalışmaları için mükemmel bir araç sunun. Birlikte ele alındığında, hücre ölümünün moleküler mekanizmalarının çözülmesi için gerekli olan prokaspaz-8 aktivasyon ve işlemenin farklı adımlarının izlenmesine izin veren klasik bir iş akışı sunulmaktadır.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak çıkar çatışmaları yoktur.
Acknowledgments
Çalışmalarımızı desteklediği için AB programı ERDF (Avrupa Bölgesel Kalkınma Fonu) ve DFG (LA 2386) tarafından finanse edilen Wilhelm Sander Vakfı (2017.008.02), Dinamik Sistemler Merkezi 'ni (CDS) kabul ediyoruz. Karina Guttek'e deneylerimizi desteklediği için teşekkür ederiz. Prof. Dirk Reinhold'u (OvGU, Magdeburg) bize birincil T hücreleri sağladığı için kabul ediyoruz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 12.5% SDS gel | self made | for two separating gels: 3.28 mL distilled H2O 2.5 mL Tris; pH 8.8; 1.5 M 4.06 mL acrylamide 100 µL 10% SDS 100 µL 10% APS 7.5 µL TEMED for two collecting gels: 3.1 mL distilled H2O 1.25 mL Tris; pH 6.8; 1.5 M 0.5 mL acrylamide 50 µL 10% SDS 25 µL 10% APS 7.5 µL TEMED |
|
| 14.5 cm cell dishes | Greiner | 639160 | |
| acrylamide | Carl Roth | A124.1 | |
| Aerosol filter pipet tips with high recovery filter and wide orifice | VWR | 46620-664 (North America) or 732-0559 (Europe) | Used for pipetting beads to the lysate |
| anti-actin Ab | Sigma Aldrich | A2103 | dilution: 1:4000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-APO-1 Ab | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by Enzo | ALX-805-038-C100 | used only for immunoprecipitation |
| anti-caspase-10 Ab | Biozol | MBL-M059-3 | dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-caspase-3 Ab | cell signaling | 9662 S | dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-caspase-8 Ab C15 | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ALX-804-242-C100 | dilution: 1:20 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-CD95 Ab | Santa Cruz | sc-715 | dilution: 1:2000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-c-FLIP NF6 Ab | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ALX-804-961-0100 | dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-FADD 1C4 Ab | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ADI-AAM-212-E | dilution: 1:10 in PBST + 1:100 NaN3 |
| anti-PARP Ab | cell signaling | 9542 | dilution: 1:1000 in PBST + 1:100 NaN3 |
| APS | Carl Roth | 9592.3 | |
| β-mercaptoethanol | Carl Roth | 4227.2 | |
| Bradford solution Protein Assay Dye Reagent Concentrate 450ml |
Bio Rad | 500-0006 | used according to manufacturer's instructions |
| CD95L | provided in these experiments by Prof. P. Krammer or can be purchased by ENZO | ALX-522-020-C005 | |
| chemoluminescence detector Chem Doc XRS+ |
Bio Rad | ||
| cOmplete Protese Inhibitor Cocktail (PIC) | Sigma Aldrich | 11 836 145 001 | prepared according to manufacturer's instructions |
| DPBS (10x) w/o Ca, Mg | PAN Biotech | P04-53500 | dilution 1:10 with H2O, storage in the fridge |
| eletrophoresis buffer | self made | 10x electrophoresis buffer: 60.6 g Tris 288 g glycine 20 g SDS ad 2 L H2O 1:10 dilution before usage |
|
| glycine | Carl Roth | 3908.3 | |
| Goat Anti-Mouse IgG1 HRP | SouthernBiotech | 1070-05 | dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk |
| Goat Anti-Mouse IgG2b HRP | SouthernBiotech | 1090-05 | dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk |
| Goat Anti-Rabbit IgG-HRP | SouthernBiotech | 4030-05 | dilution 1:10.000 in PBST + 5% milk |
| Interleukin-2 Human(hIL-2) | Merckgroup/ Roche | 11011456001 | for activation of T cells |
| KCl | Carl Roth | 6781.2 | |
| KH2PO4 | Carl Roth | 3904.1 | |
| loading buffer 4x Laemmli Sample Buffer,10 mL |
Bio Rad | 161-0747 | prepared according to manufacturer's instructions |
| Luminata Forte Western HRP substrate | Millipore | WBLUFO500 | |
| lysis buffer | self made | 13.3 mL Tris-HCl; pH 7.4; 1.5 M 27.5 mL NaCl; 5 M 10 mL EDTA; 2 mM 100 mL Triton X-100 add 960 mL H2O |
|
| medium for adhaerent cells DMEM F12 (1:1) w stable Glutamine, 2,438 g/L | PAN Biotech | P04-41154 | adding 10% FCS, 1% Penicillin-Streptomycin and 0.0001% Puromycin to the medium |
| medium for primary T cells | gibco by Life Technologie | 21875034 | adding 10% FCS and 1% Penicillin-Streptomycin to the medium |
| milk powder | Carl Roth | T145.4 | |
| Na2HPO4 | Carl Roth | P030.3 | |
| NaCl | Carl Roth | 3957.2 | |
| PBST | self made | 20x PBST: 230 g NaCl 8 g KCl 56.8 g Na2HPO4 8 g KH2PO4 20 mL Tween-20 ad 2 L H2O dilution 1:20 before usage |
|
| PBST + 5% milk | self made | 50 g milk powder + 1 L PBST | |
| PHA | Thermo Fisher Scientific | R30852801 | for activation of T Cells |
| Power Pac HC | Bio Rad | ||
| Precision Plus Protein Standard All Blue | Bio Rad | 161-0373 | use between 3-5 µL |
| Protein A Sepharose CL-4B beads | Novodirect/ Th.Geyer | GE 17-0780-01 | affinity resin beads prepared according to manufacturer's instructions |
| scraper | VWR | 734-2602 | |
| SDS | Carl Roth | 4360.2 | |
| shaker | Heidolph | ||
| sodium azide | Carl Roth | K305.1 | |
| TEMED | Carl Roth | 2367.3 | |
| Trans Blot Turbo mini-size transfer stacks | Bio Rad | 170-4270 | used according to manufacturer's instructions |
| TransBlot Turbo 5x Transfer Buffer | Bio Rad | 10026938 | prepared according to manufacturer's instructions |
| TransBlot Turbo Mini-size nictrocellulose membrane | Bio Rad | 170-4270 | used according to manufacturer's instructions |
| Trans-Blot-Turbo | Bio Rad | ||
| Tris | Chem Solute | 8,08,51,000 | |
| Triton X-100 | Carl Roth | 3051.4 | |
| Tween-20 | Pan Reac Appli Chem | A4974,1000 |
References
- Lavrik, I. N., Krammer, P. H. Regulation of CD95/Fas signaling at the DISC. Cell Death and Differentiation. 19 (1), 36-41 (2012).
- Krammer, P. H., Arnold, R., Lavrik, I. N. Life and death in peripheral T cells. Nature Reviews Immunology. 7 (7), 532-542 (2007).
- Dickens, L. S., et al. A death effector domain chain DISC model reveals a crucial role for caspase-8 chain assembly in mediating apoptotic cell death. Molecular Cell. 47 (2), 291-305 (2012).
- Fu, T. -M., et al. Cryo-EM structure of caspase-8 tandem DED filament reveals assembly and regulation mechanisms of the death-inducing signaling complex. Molecular Cell. 64 (2), 236-250 (2016).
- Scaffidi, C., Medema, J. P., Krammer, P. H., Peter, M. E. FLICE is predominantly expressed as two functionally active isoforms, caspase-8/a and caspase-8/b. Journal of Biological Chemistry. 272 (43), 26953-26958 (1997).
- Fox, J. L., et al. Cryo-EM structural analysis of FADD:Caspase-8 complexes defines the catalytic dimer architecture for co-ordinated control of cell fate. Nature Communications. 12 (1), 1-17 (2021).
- Schleich, K., et al. Stoichiometry of the CD95 death-inducing signaling complex: experimental and modeling evidence for a death effector domain chain model. Molecular Cell. 47 (2), 306-319 (2012).
- Hughes, M. A., et al. Reconstitution of the death-inducing signaling complex reveals a substrate switch that determines CD95-mediated death or survival. Molecular Cell. 35 (3), 265-279 (2009).
- Lavrik, I., et al. The active caspase-8 heterotetramer is formed at the CD95 DISC [2]. Cell Death and Differentiation. 10 (1), 144-145 (2003).
- Hoffmann, J. C., Pappa, A., Krammer, P. H., Lavrik, I. N. A new C-terminal cleavage product of procaspase-8, p30, defines an alternative pathway of procaspase-8 activation. Molecular and Cellular Biology. 29 (16), 4431-4440 (2009).
- Golks, A., et al. The role of CAP3 in CD95 signaling: New insights into the mechanism of procaspase-8 activation. Cell Death and Differentiation. 13 (3), 489-498 (2006).
- Oztürk, S., Schleich, K., Lavrik, I. N. Cellular FLICE-like inhibitory proteins (c-FLIPs): Fine-tuners of life and death decisions. Experimental Cell Research. 318 (11), 1324-1331 (2012).
- Golks, A., Brenner, D., Fritsch, C., Krammer, P. H., Lavrik, I. N. c-FLIPR, a new regulator of death receptor-induced apoptosis. Journal of Biological Chemistry. 280 (15), 14507-14513 (2005).
- Hughes, M. A., et al. Co-operative and hierarchical binding of c-FLIP and caspase-8: A unified model defines how c-FLIP isoforms differentially control cell fate. Molecular Cell. 61 (6), 834-849 (2016).
- Hillert, L. K., et al. Long and short isoforms of c-FLIP act as control checkpoints of DED filament assembly. Oncogene. 39 (8), 1756-1772 (2020).
- Yu, J. W., Jeffrey, P. D., Shi, Y. Mechanism of procaspase-8 activation by c-FLIPL. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 106 (20), 8169-8174 (2009).
- Micheau, O., et al. The long form of FLIP is an activator of caspase-8 at the Fas death-inducing signaling complex. Journal of Biological Chemistry. 277 (47), 45162-45171 (2002).
- Chang, D. W., et al. C-FLIPL is a dual function regulator for caspase-8 activation and CD95-mediated apoptosis. EMBO Journal. 21 (14), 3704-3714 (2002).
- Hillert, L. K., et al. Dissecting DISC regulation via pharmacological targeting of caspase-8/c-FLIPL heterodimer. Cell Death and Differentiation. 27 (7), 2117-2130 (2020).
- Fricker, N., et al. Model-based dissection of CD95 signaling dynamics reveals both a pro- and antiapoptotic role of c-FLIPL. Journal of Cell Biology. 190 (3), 377-389 (2010).
- Arndt, B., et al. Analysis of TCR activation kinetics in primary human T cells upon focal or soluble stimulation. Journal of Immunological Methods. 387 (1-2), 276-283 (2013).
- Pietkiewicz, S., Eils, R., Krammer, P. H., Giese, N., Lavrik, I. N. Combinatorial treatment of CD95L and gemcitabine in pancreatic cancer cells induces apoptotic and RIP1-mediated necroptotic cell death network. Experimental Cell Research. 339 (1), 1-9 (2015).
- Schleich, K., et al. Molecular architecture of the DED chains at the DISC: regulation of procaspase-8 activation by short DED proteins c-FLIP and procaspase-8 prodomain. Cell Death and Differentiation. 23 (4), 681-694 (2016).
- Lavrik, I. N., et al. Analysis of CD95 threshold signaling: Triggering of CD95 (FAS/APO-1) at low concentrations primarily results in survival signaling. Journal of Biological Chemistry. 282 (18), 13664-13671 (2007).
- Sprick, M. R., et al. Caspase-10 is recruited to and activated at the native TRAIL and CD95 death-inducing signalling complexes in a FADD-dependent manner but can not functionally substitute caspase-8. EMBO Journal. 21 (17), 4520-4530 (2002).
- Neumann, L., et al. Dynamics within the CD95 death-inducing signaling complex decide life and death of cells. Molecular Systems Biology. 6 (1), 352 (2010).
- Kischkel, F. C., et al. Cytotoxicity-dependent APO-1 (Fas/CD95)-associated proteins form a death-inducing signaling complex (DISC) with the receptor. EMBO Journal. 14 (22), 5579-5588 (1995).
- Seyrek, K., Richter, M., Lavrik, I. N. Decoding the sweet regulation of apoptosis: the role of glycosylation and galectins in apoptotic signaling pathways. Cell Death and Differentiation. 26 (6), 981-993 (2019).
- Kallenberger, S. M., et al. Intra- and interdimeric caspase-8 self-cleavage controls strength and timing of CD95-induced apoptosis. Science Signaling. 7 (316), 23 (2014).
