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Neuroscience

In vivo Métodos para avaliar a função e estrutura do gânglio de gânglios da retina e da estrutura em animais grandes

Published: February 26, 2022 doi: 10.3791/62879
Automatic Translation
*1, *1, *1, 1, 1, 1, 1, 1, 1, 1
1The Eye Hospital, School of Ophthalmology & Optometry, Wenzhou Medical University
* These authors contributed equally

Summary

Aqui demostramos vários testes in vivo (flash visual evocado potencial, eletroretinograma padrão e tomografia de coerência óptica) em cabra e macaque rhesus para entender a estrutura e função do nervo óptico e seus neurônios.

Abstract

O nervo óptico coleta sinais de axônios das células gânglios da retina e transmite sinal visual para o cérebro. Grandes modelos animais de lesão do nervo óptico são essenciais para traduzir novas estratégias terapêuticas desde modelos de roedores até aplicação clínica devido às suas semelhanças mais próximas com os humanos em tamanho e anatomia. Aqui descrevemos alguns métodos in vivo para avaliar a função e estrutura das células gânglios da retina (RGCs) e nervo óptico (ON) em animais de grande porte, incluindo potencial visual evocado (VEP), eletroretinograma padrão (PERG) e tomografia de coerência óptica (OUT). Tanto o primata de cabra quanto o não-humano foram empregados neste estudo. Ao apresentar esses métodos in vivo passo a passo, esperamos aumentar a reprodutibilidade experimental entre diferentes laboratórios e facilitar o uso de grandes modelos animais de neuropatias ópticas.

Introduction

O nervo óptico (ON), que consiste em axônios das células gânglios da retina (RGC), transmite sinal visual da retina para o cérebro. Doenças on, como glaucoma, neuropatia óptica traumática ou isquêmica, muitas vezes causaram degeneração irreversível on/RGC e perda visual devastadora. Embora existam atualmente muitos avanços na regeneração ON e na proteção do RGC em modelos de roedores1,2,3,4,5,6, os tratamentos clínicos para a maioria das doenças ON permaneceram essencialmente os mesmos ao longo do último meio século com resultados insatisfatórios7,8 . Para preencher a lacuna entre a pesquisa básica e a prática clínica, estudos translacionais utilizando um grande modelo animal de doenças ON são muitas vezes necessários e benéficos devido à sua semelhança anatômica mais próxima com os humanos do que os modelos de roedores.

Os macaques de cabra e rhesus são duas grandes espécies animais usadas em nosso laboratório para modelar a doença ON humana. O tamanho do globo ocular de uma cabra, ON, e a estrutura adjacente (cavidade orbital e nasal, base do crânio, etc.) é semelhante ao de um humano baseado na tomografia do crânio 9. Como tal, o modelo de cabra oferece uma oportunidade de avaliar e refinar dispositivos terapêuticos ou procedimentos cirúrgicos antes do uso em humanos. O macaque rhesus, como primata não humano (NHP), tem um sistema visual único semelhante ao humano que não existe em outras espécies10,11. Além disso, as respostas fisiopatológicas a lesões e tratamentos em NHP são muito semelhantes às dos seres humanos12.

Testes in vivo para avaliar a estrutura e função on e RGC longitudinalmente são importantes em grandes estudos em animais. O eletroretinograma padrão (PERG) tem sido usado para avaliar a função RGC. O potencial evocado visual flash (FVEP) reflete a integridade da via retino-geniculo-cortical no sistema visual. Assim, o PERG combinado com o FVEP pode refletir a função ON9,13,14 . A tomografia de coerência óptica da retina (OCT) pode mostrar a estrutura da retina com alta resolução temporal e espacial, o que permite a medição da espessura do complexo gânglio da retina (GCC)9,15. Para exames eletrofisiológicos neste estudo, o monitoramento de sinais vitais (taxa de calor, taxa de quebra, pressão arterial) e nível de saturação de oxigênio (SpO2) antes dos testes são cruciais, pois esses parâmetros têm impactos potentes no fluxo sanguíneo ocular e, portanto, na função do sistema visual. No entanto, não monitoramos os sinais vitais ao realizar imagens de retina OCT por uma questão de simplicidade. De acordo com nosso estudo anterior9, a espessura do GCC medida pela imagem da retina OCT é bastante estável, com coeficiente inter-sessão de variação próximo a 3%. Estes testes in vivo em cabra e rhesus macaque foram descritos em detalhes em nosso estudo anterior9. Aqui apresentamos esses métodos para ajudar a aumentar a transparência experimental e a reprodutibilidade.

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Protocol

Os experimentos foram realizados estritamente de acordo com as diretrizes da ARRIVE e o guia dos Institutos Nacionais de Saúde para o cuidado e uso de animais de laboratório, e seguem os protocolos aprovados pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais na Universidade Médica de Wenzhou (WMU) e pelo Laboratório Joinn (Suzhou). As cabras Saanen machos, com idades entre 4 e 6 meses com peso de 19 a 23 kg, estavam alojadas na instalação de animais da OMH. Os macaques Rhesus machos, com idades entre 5 e 6 anos com peso de 5 a 7 kg, estavam alojados na instalação de animais de Joinn. Todos os animais foram mantidos em uma sala climatizado com temperatura controlada (21 ± 2 °C) sob um ciclo escuro de 12 h/12h com ad libitum alimentar.

1. Flash visual evocou potencial (FVEP) em cabra

  1. Anestesia geral
    1. Raspe o cabelo com uma navalha eletrônica.
    2. Prepare a pele esfregando com 70% de álcool três vezes para limpar a pele e, em seguida, exponha a veia subcutânea.
    3. Insira um cateter venoso periférico por via intravenosa (0,9 mm x 25 mm) e, em seguida, injete atropina (0,025 mg/kg) e propofol (5 mg/kg).
    4. Entubar a cabra com um tubo traqueal de 6 mm e conectá-la a um respirador artificial.
    5. Mantenha a anestesia com 3,5% de isoflurane em oxigênio a uma taxa de fluxo constante de 2 L/min.
      NOTA: A cabra se recupera da anestesia induzida pelo propofol em poucos minutos, por isso seja rápido para entubar a cabra.
  2. Monitoramento cardiopulmonar
    1. Coloque o sensor de temperatura sob a língua.
    2. Conecte o oxímetro de pulso à extremidade proximal da orelha.
    3. Amarre o manguito da pressão arterial na base da coxa.
    4. Fixar os clipes ECG nos membros em conformidade.
      NOTA: A frequência cardíaca normal das cabras é de 68-150 bpm. Devido ao uso de anestesia gasosa, a frequência cardíaca das cabras aumentará. Portanto, nossa frequência cardíaca durante a inspeção é de 170 ± 30 bpm. A pressão arterial sistólica das cabras em condições normais é de 110-130 mmHg, e a pressão arterial diastólica é de 50-60 mmHg. No estado de inalação de oxigênio, a saturação de oxigênio sanguíneo da cabra pode ser sempre mantida em 99%. A taxa de respiração das cabras sob anestesia é sincronizada com a do ventilador, que é de 10 respirações/min. Como a temperatura foi medida sob a língua da cabra, não a temperatura do núcleo, a temperatura da cabra é geralmente de 35 ± 2 °C.
  3. Implante de parafusos do crânio e colocação de eletrodos
    1. Raspe o cabelo com um cortador. Desinfete a pele no centro do osso frontal esfregando com uma bola de algodão encharcada em betadina e 70% de álcool três vezes.
    2. Use parafusos esterilizados e tesouras.
      NOTA: Autoclave todos os instrumentos cirúrgicos para esterilização (121 °C, 20 min).
    3. Faça uma incisão de pele de 5 mm para expor o osso frontal com uma tesoura oftálmica e, em seguida, implante um parafuso esterilizado no centro do osso frontal usando uma chave de fenda.
    4. Raspe o cabelo e desinfete a pele no osso occipital central entre duas orelhas com betadina e 70% de álcool, uma seguida da outra, três vezes.
    5. Faça uma incisão de pele de 5 mm para expor o osso occipital com uma tesoura oftálmica e, em seguida, implante um parafuso esterilizado no centro do osso occipital.
      NOTA: O eletrodo da agulha moída é inserido subcutâneamente sob o parafuso frontal do crânio. Os eletrodos ativos e de referência estão conectados aos parafusos occipital e frontal, respectivamente, com clipes de jacaré para reduzir a impedância do eletrodo16.
  4. Preparação animal
    1. Use pano à prova de luz para cobrir o olho e fixe pela venda para remendar um olho.
    2. Aplique colírios anestésicos tópicos (colírios de cloridrato de hidrococaína proparacaina) em ambos os olhos. As pupilas bilaterais são dilatadas pela administração tópica de colírios midriáticos com tropicamida (5%) e fenilefrina (5%).
    3. Coloque a cabeça da cabra no estimulador ganzfeld e diminua a luz ambiente.
      NOTA: Verificou-se que as cabras podem manter uma boa fixação do globo ocular sob anestesia, de modo que não é necessária nenhuma intervenção extra de fixação do globo ocular.
    4. Cubra o estimulador e a cabeça da cabra com um cobertor preto por 5 minutos para adaptação.
    5. Use espéculo das pálpebras para expor a conjuntiva bulbar. Dobre o anel superior, puxe a pálpebra superior para cima e insira o anel superior primeiro no saco conjuntivo da pálpebra superior e, em seguida, na pálpebra inferior de forma semelhante.
    6. Pressione o botão Impedance para verificar a impedância de contato do tecido eletrodo e os valores de impedância serão mostrados em cada canal.
    7. Certifique-se de que a impedância está abaixo de 10 kΩ para cada eletrodo para evitar interferência eletromagnética de outros dispositivos elétricos na mesma sala.
      NOTA: Se estiver acima de 10 kΩ, reconecte ou substitua o eletrodo. A impedância pode parecer anormalmente alta se o leito cirúrgico de metal elétrico, onde a cabra está, estiver plugado. A impedância deve diferir em menos de 1 kΩ entre os eletrodos ativos e de referência para reduzir as interferências elétricas17.
    8. Pressione o botão Oscillograph para verificar o ruído da linha de base sem estimulação da luz.
      NOTA: Se houver um grande ruído de linha de base, desligue todos os outros dispositivos elétricos na mesma sala e desligue os celulares. Se o problema da linha de base persistir, pule para o passo 1.3.10. para verificar se uma forma de onda FVEP típica pode ser provocada. Caso não, remarque o teste FVEP em outro momento.
    9. Inicie a gravação do FVEP escolhendo a intensidade de luz de 0,025, 0,5 e 3,0 cd·s/m2, respectivamente na caixa de fundo branca no canto superior direito. Em seguida, pressione o botão Exame. Observe que a gravação de FVEP em cada intensidade de luz é realizada duas vezes.
      NOTA: Se as duas formas de onda parecerem obviamente diferentes, mais uma repetição é necessária.
    10. Moist a córnea com colírios artificiais, se aparecer seco na câmera infravermelha.
      NOTA: Monitore a posição dos olhos a partir da câmera infravermelha incorporada antes de gravar para ter certeza de que o olhar visual está correto e que a pupila esteja totalmente exposta (de modo que o tamanho do campo de um estímulo flash seja de 90°. A posição ocular de uma cabra anestesiada pode ser ajustada girando a cabeça de acordo. Com base em nossa observação, o olhar vagando raramente ocorre durante a gravação de FVEP (~10 min) em cabra sob anestesia geral9. Portanto, não há necessidade de pausar e reajustar o olhar durante a gravação.
    11. Repita os passos acima para o olho contralateral.
    12. Cessar a oferta de isoflurano e aumentar ligeiramente o volume da maré no ventilador para ajudar a cabra a se recuperar da anestesia geral.
    13. Após anestesia geral, trate a cabra com gentamicina (4 mg/kg, IM) e ceftiofur sódio (cefosporina, 2 mg/kg, IM) para prevenir a infecção.
  5. Medição e análise quantitativa do FVEP
    NOTA: Como mostrado na Figura 1A, os primeiros picos positivos e negativos na forma de onda FVEP são designados como P1 e N1, e o segundo pico positivo como P2. O tempo implícito típico de P1, N1 e P2 são em torno de 40, 60 e 120 ms, respectivamente. As amplitudes P1 e P2 são medidas desde o cocho da forma de onda N1 até os picos de formas de onda P1 e P2, respectivamente.
    1. Em caso de lesão monocular, use comparação interocular de amplitude e tempo implícito para ajudar a reduzir a variação de intersessão e aumentar a sensibilidade17.

2. PVEP em rhesus macaque

NOTA: Os VEPs padrão podem ser obtidos em macaques9 rhesus e são mais estáveis que o Flash VEP em amplitude e tempo implícito17. Assim, o PVEP foi utilizado para detectar a integridade da via retino-geniculo-cortical em primatas não humanos.

  1. Preparação animal
    1. Anestesiar o macaco com isoflurane (1,5%-2%) após indução com Zoletil50 (4-8 mg/kg IM, tiletamina/zolazepam).
    2. Posicione o eletrodo terrestre esterilizado no lóbulo da orelha. Insira os eletrodos ativos e de referência esterilizados subcutâneamente ao longo da linha média no osso frontal e occipital, respectivamente.
    3. Aplique espéculo das pálpebras para expor a conjuntiva bulbar.
    4. Use fita preta adesiva opaca para remendar o olho contralateral.
  2. Gravação PVEP
    1. Pressione o botão Impedance para verificar a impedância de contato eletrodo-tecido e os valores de impedância serão mostrados em cada canal; garantir que esteja abaixo de 10k Ω. Se não, reconecte ou substitua o eletrodo.
    2. Verifique os valores de impedância na Janela de Teste de Impedância e certifique-se de que a impedância difere em menos de 1 kΩ entre os eletrodos ativos e de referência para reduzir as interferências elétricas17.
    3. Pressione o botão Oscillograph para verificar o ruído da linha de base sem estimulação.
      NOTA: Se houver um grande ruído de linha de base, desligue todos os outros dispositivos elétricos na mesma sala e desligue os celulares. Se o problema da linha de base persistir, refaça o teste PVEP em outro dia.
    4. Registique as respostas PVEP do olho não reparado escolhendo a intensidade de luz de 0,5 e 1,0 ciclo/grau, respectivamente na caixa de fundo branca no canto superior direito e, em seguida, pressione o botão Exame.
      NOTA: Para cada gravação, 64 traços são mediados para produzir uma forma de onda. Para cada frequência, são adquiridas mínimas duas gravações para verificar a reprodutibilidade dos sinais PVEP.
    5. Repita o procedimento para o olho contralateral.
    6. Uma vez feito, cessar o suprimento isoflurane para acordar o macaco.
    7. Após anestesia geral, trate o macaco com gentamicina (4 mg/kg IM) e ceftiofur sódio (2 mg/kg IM) para prevenir infecções.
  3. Medição pvEP e análise quantitativa
    1. Como mostrado na Figura 1B, os primeiros picos negativos e positivos na forma de onda PVEP foram designados como N1 e P1, que normalmente ocorrem em torno de 50 e 90 ms. A amplitude P1 é medida do cocho de N1 até o pico de P1.
    2. Em caso de lesão monocular, use comparação interocular de amplitude e tempo implícito para ajudar a reduzir a variação de intersessão e aumentar a sensibilidade17.

3. Padrão ERG (PERG) em cabra

NOTA: No estudo anterior, não foi observado nenhum crosstalk interocular de sinal PERG em cabras, de modo que as respostas PERG podem ser registradas simultaneamente a partir de ambos os olhos9.

  1. Preparação do exame
    1. Anestesiar o bode usando xilazina (3 mg/kg, IM) e colocar em uma mesa de exame.
    2. Coloque um sensor de temperatura sob a língua da cabra.
    3. Conecte o oxímetro de pulso à extremidade proximal da orelha da cabra.
    4. Amarre o manguito de pressão arterial na coxa.
    5. Fixar os clipes de ECG nos membros em conformidade.
    6. Para reduzir a impedância do eletrodo, coloque um parafuso esterilizado no osso frontal e conecte-se ao eletrodo moído com um clipe de jacaré.
    7. Coloque dois eletrodos de referência de agulha esterilizada subcutâneamente 1 cm atrás do canthi lateral em ambos os lados.
    8. Use o espéculo das pálpebras para expor a conjuntiva bulbar.
    9. Coloque dois eletrodos de gravação ERG-Jet desinfetados no centro das córneas bilaterais após aplicação tópica de lágrima artificial.
    10. Coloque dois monitores led de 47,6 cm x 26,8 cm na frente de ambos os olhos com uma distância de visualização de 50 cm.
    11. Ajuste cada monitor para ser paralelo ao plano pupilar do mesmo lado e alinhe o centro do monitor ao plano pupilo.
    12. Certifique-se de que o tabuleiro de verificação invertido de contraste (frequência temporal, 2,4 Hz) seja exibido em ambos os monitores e tenha uma proporção máxima de 4:3, que é definida pelas configurações do equipamento.
    13. Certifique-se de que o contraste entre damas brancas e pretas permanece em 96%, e a luminância média é de 200 cd/m2 (Candela por metro quadrado), que é verificada pelo medidor de luminância.
      NOTA: De acordo com o ISCEV, uma luminância fotográfica média de 40-60 cd/m2 é necessária em humanos17. Em outro estudo utilizando o modelo de camundongos, o padrão permaneceu em uma luminância média de 800 cd/m2,18. Um tamanho de campo de pelo menos 15° em sua dimensão mais estreita é necessário para um teste PERG padrão em humanos17. Ajuste a posição do eletrodo córnea se não estiver no centro da superfície da córnea.
  2. Gravação PERG
    1. Diminua a luz ambiente e pressione o botão Impedance para verificar a impedância de contato do tecido eletrodo. Os valores de impedância serão mostrados em cada canal.
    2. Verifique os valores de impedância na janela de teste impedance e certifique-se de que a impedância está abaixo de 10 kΩ. Se não, reconecte ou substitua o eletrodo.
    3. Pressione o botão Oscillograph para verificar o ruído da linha de base sem estimulação da luz.
      NOTA: Preste atenção para proteger os frágeis eletrodos de gravação ERG-Jet. O ruído da linha de base em PERG é geralmente menor do que o da FVEP em cabra.
    4. Inicie a gravação perg de ambos os olhos simultaneamente nas frequências espaciais de 0,1, 0,3, 1,0, 3,0 e 12,6 ciclos/graus consecutivamente. Para cada frequência espacial, 64 traços são mediados para produzir uma leitura.
    5. Finalmente, desligue o monitor para gravar PERG sem estímulo visual como um controle negativo.
      NOTA: Os sinais PERG são geralmente estáveis e não precisam ser repetidos.
    6. Remova o parafuso do crânio dianteiro e acorde a cabra injetando Idzoxan (1,5 mg/kg), que é um antagonista da xilazina.
    7. Após anestesia geral, trate a cabra com gentamicina (4 mg/kg IM) e ceftiofur sódio (2 mg/kg IM) para prevenir a infecção.
  3. Medição perg e análise quantitativa
    1. Defina o filtro bandpass para variar de 1 a 75 Hz. Para 3,0 cpd PERG, o filtro bandpass está programado para ser de 1 a 50 Hz para suavizar o traço sem afetar sua amplitude.
    2. Como mostrado na Figura 1C, os primeiros picos positivos e negativos na forma de onda são designados como P1 (tipicamente em torno de 25 ms) e N1 (tipicamente em torno de 55 ms). A amplitude PERG é medida de N1 a P1.
    3. Em caso de lesão monocular, utilizamos comparação interocular de amplitude e tempo implícito para ajudar a reduzir a variação de intersessão e reduzir a sensibilidade17.

4. PERG em rhesus macaque

NOTA: Não está claro se há um crosstalk interocular de sinal PERG em rhesus macaque, portanto, as respostas PERG de ambos os olhos são registradas separadamente.

  1. Preparação do exame
    1. Anestesiar o macaco com isoflurane (1,5%-2%) após injeção de Zoletil50 (4-8 mg/kg IM, tiletamina/zolazepam) e intubação traqueal.
    2. Coloque um eletrodo terrestre esterilizado subcutâneamente no osso frontal. Insira um eletrodo de referência de agulha esterilizado subcutâneamente, 1 cm atrás do canthus lateral do mesmo lado.
    3. Coloque um eletrodo de gravação ERG-Jet desinfetado na córnea central após a aplicação tópica de lágrima artificial.
      NOTA: Ajuste a posição do eletrodo córnea, se não estiver no centro da superfície da córnea.
    4. Use fita preta adesiva opaca para remendar um olho.
    5. Coloque um monitor (47,6 x 26,8 cm) a uma distância de visualização de 50 cm.
    6. Certifique-se de que o monitor seja ajustado para ser paralelo ao plano pupilo. Alinhe o centro do monitor ao plano pupilo.
    7. Certifique-se de que o tabuleiro de dama preto e branco está invertendo em uma frequência de 2,4 Hz, e a proporção é de 4:3, que é definida por configurações do equipamento.
    8. Certifique-se de que o contraste entre os damas brancos e pretos é de 96%, e a luminância média permanece em 200 cd/m2, que é verificada pelo medidor de luminância.
  2. Gravação PERG
    1. Diminua a luz ambiente e verifique a impedância de contato eletrodo-tecido.
    2. Certifique-se de que a impedância está abaixo de 10 kΩ. Se não, reconecte ou substitua o eletrodo.
    3. Verifique o ruído da linha de base sem estimulação da luz.
    4. Remenda um olho e inicie a gravação perg do outro olho em frequências espaciais de 0,1, 0,3, 1.0, 3.0 e 12,6 ciclos/grau consecutivamente.
    5. Repita as etapas 4.2.1-4.2.4 para o olho contralateral.
    6. Cesse o suprimento isoflurane para despertar o macaco.
    7. Após anestesia geral, trate o macaco com gentamicina (4mg/kg IM) e ceftiofur sódio (2 mg/kg IM) para prevenir infecções.
  3. Medição perg e análise quantitativa
    1. Como mostrado na Figura 1D, os primeiros picos positivos e negativos na forma de onda são designados como P1 (tipicamente em torno de 40ms) e N1 (tipicamente em torno de 85 ms). A amplitude PERG é medida de N1 a P1.
    2. Em caso de lesão monocular, usamos comparação interocular de amplitude e tempo implícito para ajudar a reduzir a variação de intersessão e aumentar a sensibilidade17.

5. OCT em cabra

  1. Preparação animal
    1. Anestesiar a cabra usando xilazina (3mg/kg, IM) e, em seguida, entubar.
    2. Dilatar a pupila por administração tópica de colírios midriáticos com tropicamida (5%) e fenilefrina (5%).
    3. Use o espéculo das pálpebras para expor totalmente a pupila.
    4. Coloque a cabeça da cabra no descanso do queixo.
      NOTA: Embora a anestesia do gás não seja realizada, entubar a cabra regularmente para proteger as vias aéreas de serem comprimidos pelo resto do queixo.
  2. Imagem de OUTUBRO
    NOTA: A imagem de OCT da retina é realizada usando o sistema OCT em um comprimento de onda de 870 nm neste estudo. A resolução óptica do scanner OCT é de 12 μm. O modo de varredura circular é usado para escanear a cabeça do nervo óptico (ONH) com modo de alta resolução. 100 quadros são mediados para otimizar a qualidade da imagem. O guia de treinamento detalhado está disponível online (ver Tabela de Materiais).
    1. Varredura inicial de OCT (exame de linha de base)
      1. Clique no botão Iniciar para entrar na interface de detecção. Aguarde que a máquina termine o carregamento e pressione o botão iniciar imagens amarelas.
      2. Alinhe a cabra com a câmera infravermelha para centralizar o ONH na imagem confocal Scanning Laser Oftalmoscopy (cSLO) modificando sua posição da cabeça.
      3. Ajuste o joystick para iluminar uniformemente toda a imagem infravermelha para melhorar a qualidade da imagem.
      4. Mova o joystick para a frente até que uma imagem oct de retina vertical seja mostrada na tela vertical.
      5. Modifique o joystick para ter uma imagem OCT retinal uniformemente densa e horizontalmente colocada.
      6. Pressione o botão no joystick para capturar a imagem automaticamente e segure o joystick para manter a qualidade da imagem na tela de imagem ao vivo até que a aquisição da imagem seja concluída. Então, pressione Acquire.
      7. Desperte a cabra injetando Idzoxan (1,5 mg/kg), que é um antagonista xilazino.
        NOTA: A centralização do ONH no exame de linha de base ajuda a alinhar a varredura da linha de base e o acompanhamento de acordo com a nossa experiência.
    2. Varredura de OCT de acompanhamento
      1. Selecione uma imagem de OCT inicial de alta qualidade; clique com o botão direito do mouse e selecione Definir referência.
      2. Inicie imagens oct como mencionado acima.
      3. Pressione o botão Follow-up para permitir a correspondência automática da verificação atual à varredura de referência.
      4. Uma vez combinado (o anel de varredura circular fica verde), pressione o botão no joystick para ativar o rastreamento automático em tempo real.
      5. Desperte a cabra injetando Idzoxan (1,5 mg/kg), que é um antagonista xilazína.
        NOTA: Para facilitar o processo de correspondência, (1) mova o ONH na janela ao vivo girando a cabeça em conformidade ou (2) gire o ONH na janela ao vivo inclinando a cabeça para fazer com que a imagem atual da cSLO pareça mais semelhante à imagem da linha de base. Este reflexo vestibulo-ocular funciona bem sob anestesia xilazina19.
  3. Medição de OUTUBRO
    1. Clique no botão Medir para entrar na janela de medição.
    2. Escolha a ferramenta de borracha e limpe a linha RNFL, que é automaticamente rotulada pelo programa.
    3. Escolha a ferramenta Desenho de linha para delinear manualmente o limite entre IPL e INL (Figura 2).
      NOTA: A espessura do GCC em seis regiões peripapillary (T, TS, TI, N, NS, NI) e a espessura média do GCC ao redor do ONH (G) podem ser lidas na tela (Figura 2). O teste do aluno, ANOVA unidirecional ou ANOVA bidirecional pode ser usado para quantificar os dados de OCT em caso de distribuição normal.

6. OUT em rhesus macaque

  1. Realize imagens de S OCT de retina em rhesus macaque utilizando o mesmo equipamento e procedimento feito no caso da cabra.

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Representative Results

Figura 1A mostra resultados representativos da FVEP em cabra. Embora as formas de onda na mesma intensidade flash tenham relativa semelhança, ainda recomendamos examinar as formas de onda duas vezes. Ondas eletromagnéticas geradas por dispositivos eletrônicos interferirão com os sinais elétricos coletados, resultando em alto ruído de linha de base e baixa repetibilidade da forma de onda. Portanto, recomenda-se garantir que não haja dispositivos eletrônicos redundantes conectados ao ambiente circundante durante o exame eletrofisiológico para evitar tal interferência, e recomenda-se repetir pelo menos duas medidas para determinar a estabilidade e a repetibilidade dos resultados experimentais. Ao remendar os dois olhos, as formas de onda são totalmente planas em ambos os olhos, o que mostra que as formas de onda estão certamente gerando a partir de nosso estímulo flash. A Figura 1B mostra resultados representativos de PERG em cabra. Devido à sua estabilidade e alto sinal, adquirimos forma de onda confiável apenas por uma medição de tempo em cada frequência espacial. À medida que a frequência espacial aumenta, o tamanho do tabuleiro de xadrez gradualmente excederá o reconhecimento dos olhos da cabra. Então podemos ver que a 12,7 cpd, a forma de onda PVEP caiu muito. Análogo ao FVEP, a forma de onda desaparece quando fechamos a tela. A Figura 1C mostra resultados representativos de PVEP em rhesus macaque. Repetimos a medição duas vezes em cada frequência espacial. À medida que a frequência espacial aumenta, a amplitude diminuirá. Isso se deve ao fato de que a frequência espacial excede a percepção do olho. A Figura 1D mostra resultados representativos de PERG em rhesus macaque. A razão pela qual a amplitude diminui com a frequência espacial é a mesma descrita acima. Ao analisar esses dados, você pode optar por analisar a amplitude entre os picos e cochos ou o tempo de latência dos picos ou cochos como as estatísticas.

A Figura 2 mostra os resultados representativos de OUTUBRO em cabra. A imagem mais à esquerda mostra uma foto de fundus tirada por câmera infravermelha. Firmemente à direita está um tomograma da retina, mostrando a espessura geral da retina ao redor do ONH e a espessura de cada camada. Como mostrado na imagem, podemos ver claramente que as cabras têm vasos sanguíneos de retina maiores que os macacos. Os discos verdes da extrema direita são uma análise quantitativa da espessura do GCC em torno do ONH. G significa geral, T significa lado temporal, N significa lado nasal, S significa superior, e eu defendo inferior. A fonte preta representa o valor de medição da espessura do GCC em micrômetros, e o verde é o valor de medição de referência clínica para humano, não como referência para este experimento.

Figure 1
Figura 1: Formas de onda eletrofisiológica representativas em macaques de cabra e rhesus. (A) O representante FVEP forma em diferentes intensidades de luz de uma cabra individual na mesma sessão anestésico. (B,D) As formas de onda PERG representativas em diferentes frequências espaciais de uma cabra individual (B) ou rhesus macaque (D) dentro da mesma sessão anestésico. (C) As formas de onda PVEP representativas em diferentes frequências espaciais de um macaque rhesus individual na mesma sessão anestésica. O tempo implícito típico de cada forma de onda é mencionado na seção Protocolo. n = 1 assunto para cada teste. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figure 2
Figura 2: Resultados de OUTUBRO. Imagens retinárias representativas ao redor da cabeça do nervo óptico (painel esquerdo) e da espessura do GCC em diferentes regiões peripapillary (painel direito) em cabra (A) e rhesus macaque (B). n = 1 assunto para cada teste. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Discussion

Neste estudo, apresentamos um protocolo de VEP, PERG e OCT em cabra e rhesus macaque. Esses métodos in vivo podem ser aplicados em grandes modelos animais de várias neuropatias ópticas, como glaucoma, neuropatia isquêmica ou óptica traumática e neurite óptica9.

PvEP é mais estável e sensível que o FVEP17; no entanto, não pode ser provocado em cabra9. Como tal, a FVEP é realizada em cabra e pvep é realizada em rhesus macaque em nosso laboratório para avaliar a integridade da via retino-bulosto-cortical. O mecanismo subjacente à observação de que perg, mas não PVEP, pode ser induzido em cabra ainda não está claro de acordo com nosso conhecimento. É possível que a função do nervo óptico e a estrutura da cabra possam ser diferentes do humano.

Como a amplitude do FVEP pode ser afetada pelo tamanho pupilar e luz ambiente, dilatamos a pupila e colocamos um cobertor preto sobre a cabeça da cabra durante a gravação do FVEP. Deve-se notar que a dilatação pupilar não é necessária para a FVEP em clínicas17. Da mesma forma, embora a adaptação escura não seja necessária para a gravação de FVEP em clínicas, descobrimos que uma adaptação de 5 minutos à luz ambiente antes da gravação de FVEP pode aumentar a repetibilidade de repetição de intrasessão em amplitude.

Acredita-se que o sinal PERG tenha origem nos RGCs e, portanto, sua amplitude poderia ser usada para estimar a função dos RGCs13,20. Em comparação com alguns componentes especiais do Flash ERG, como resposta a limiar scotopic (STR) e resposta negativa fotopica (PhNR), perg é mais sensível à disfunção RGC13. As limitações potenciais do teste PERG neste estudo são as seguintes. Primeiro, o ISCEV recomenda o uso de estimulador clássico de CRT (tubo de raios cátodo) para gravação perg para manter a luminosidade média constante. No entanto, o clássico estimulador CRT está menos disponível do que o display de cristal líquido (LCD). Embora a tela do LCD geralmente apresente mudanças transitórias de luminância durante a reversão de padrão, potencialmente causando artefato de luminância17, ele não contribuiu para a amplitude de PERG em cabra de acordo com nosso achado anterior: a amplitude de PERG na frequência espacial de 12,6 cpd é geralmente negligencialável em comparação com aqueles em frequências espaciais mais baixas9 . Outra limitação é que não corrigimos erro de refração antes do teste PERG por uma questão de simplicidade. Para compensar essa limitação, a amplitude PERG da linha de base deve ser registrada como referência.

Nosso estudo anterior havia avaliado e otimizado a variação intra e inter de sessão de VEP e PERG9. Descobrimos que, em comparação com a xilazina, o isoflurane resultou em FVEP mais repetitivo, mas mais variável formas de onda PERG em cabras9. Por isso, utilizamos isoflurano no teste FVEP e xilazine no teste PERG e OCT em cabras. Além disso, em comparação com o PERG, o registro VEP é potencialmente mais variável. Como tal, repetimos regularmente o registro VEP em cada intensidade de luz ou frequência espacial para verificar a variação de intrasessão. Em contraste, as formas de onda PERG são muito mais estáveis. Portanto, geralmente não repetimos a gravação PERG. Embora a gravação repetida em um dia diferente sobre o mesmo assunto seja geralmente recomendada, não repetimos regularmente a gravação de VEP ou PERG sobre o mesmo assunto em um dia diferente por uma questão de simplicidade e ética animal. No entanto, gravações de FVEP e PERG sem repetição inter-sessão são sensíveis o suficiente para detectar lesões no nervo óptico de acordo com nosso estudo anterior9.

A imagem DE RETINA OCT é uma técnica conveniente, confiável e não invasiva para monitorar e quantificar longitudinalmente mudanças dinâmicas na estrutura da retina. Em comparação com PERG e VEP, a imagem OCT tem uma repetibilidade de intersessão muito melhor9. Além disso, a imagem OCT pode capturar e quantificar toda a fibra nervosa óptica em poucos minutos sem erro de amostragem, oferecendo uma oportunidade muito mais barata e eficaz para examinar a estrutura da retina do que a análise histológica tradicional. No entanto, a resolução espacial da imagem atual do OCT ainda é muito limitada para dizer a soma de RGC ou fibra nervosa óptica individual. Além disso, deve-se notar que um GCC mais espesso medido por OCT não significa necessariamente uma retina interna mais intacta porque o espessamento do GCC pode ser causado por edema de retina ou hemorragia.

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Disclosures

Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.

Acknowledgments

Este estudo foi financiado pelas seguintes bolsas: National Key P&D Program of China (2021YFA1101200); Projeto de Pesquisa Médica de Wenzhou (Y20170188), Programa Nacional de P&D da China (2016YFC1101200); Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (81770926;81800842); Principal Programa de P&D da província de Zhejiang (2018C03G2090634); e Programa de P&D chave do Wenzhou Eye Hospital (YNZD1201902). O patrocinador ou organização de financiamento não teve papel no projeto ou condução desta pesquisa.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
47.6 x 26.8 cm monitors DELL Inc. E2216HV The visual stimuli of contrast-reversal black-white checkerboards were displayed on screens
6.0 mm tracheal tube Henan Tuoren Medical Device Co., Ltd PVC 6.0 ensure the airway
alligator clip
atropine Guangdong Jieyang Longyang Animal pharmaceutical Co.,Ltd. reduce bronchial secretion and protect heart from vagal nerve activation
Carbomer Eye Gel Fabrik GmbH Subsidiary of Bausch & Lomb moisten the cornea and stabilize the recording electrodes
ERG-Jet recording electrodes Roland Consult Stasche&Finger GmbH 2300 La Chaux-De-Fonds ERG recording
eye speculum Shanghai Jinzhong Medical Device Co., Ltd ZYD020 open palpebral fissure
Heidelberg Spectralis OCT system Heidelberg Engineering OCT system
Imaging (https://www.heidelbergengineering.com/media/e-learning/Totara-US/files/pdf-tutorials/2238-003_Spectralis-Training-Guide.pdf)
isoflurane RWD Life Science Co., Ltd R510-22 isoflurane anesthesia
male Saanen goats Caimu Livestock Company, country (Hangzhou, China) The male Saanen goats, aged from 4 to 6 months with weight of 19–23 kg
needle electrode Roland Consult Stasche&Finger GmbH U51-426-G-D use for FVEP ground electrode and PERG reference electrodes
periphery venous catheter intravenously BD shanghai Medical Device Co., Ltd 383019 intravenous access for atropine and propofol
propofol Xian Lipont Enterprise Union Management Co.,Ltd. induce Isoflurane anesthesia in goat
Tropicamide Phenylephrine Eye Drops SANTEN OY, Japan 5% tropicamide and 5% phenylephrine hydrochloride
visual electrophysiology device Gotec Co., Ltd GT-2008V-III use for FVEP & PERG
xylazine Huamu Animal Health Products Co., Ltd. xylazine anesthesia: intramuscular injection of xylazine 3mg/kg
zoletil50 Virbac induce Isoflurane anesthesia in monkey

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References

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Neurociência Edição 180
<em>In vivo</em> Métodos para avaliar a função e estrutura do gânglio de gânglios da retina e da estrutura em animais grandes
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Ye, Q., Yu, Z., Xia, T., Lu, S.,… More

Ye, Q., Yu, Z., Xia, T., Lu, S., Sun, J., Li, M., Xia, Y., Zhang, S., Wu, W., Zhang, Y. In Vivo Methods to Assess Retinal Ganglion Cell and Optic Nerve Function and Structure in Large Animals. J. Vis. Exp. (180), e62879, doi:10.3791/62879 (2022).

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