Summary
该协议介绍了如何使用数字液滴PCR（dd-PCR）以及小规模AAV生产，玻璃体内注射，视网膜成像和视网膜基因组DNA分离来量化小鼠视网膜中的AAV转导效率。
Abstract
许多视网膜细胞生物学实验室现在经常使用腺相关病毒（AAV）进行基因编辑和调控应用。AAV转导的效率通常是至关重要的，这会影响整体实验结果。转导效率的主要决定因素之一是AAV载体的血清型或变体。 目前，各种人工AAV血清型和变体可用于宿主细胞表面受体的不同亲和力。对于视网膜基因治疗，这导致不同视网膜细胞类型的转导效率不同。此外，注射路线和AAV生产的质量也可能影响视网膜AAV转导效率。因此，比较不同变体、批次和方法的效率至关重要。数字液滴PCR（dd-PCR）方法以高精度定量核酸，并允许在没有任何标准品或参考的情况下对给定靶标进行绝对定量。使用dd-PCR，通过绝对定量注射视网膜内的AAV基因组拷贝数来评估AAV的转导效率也是可行的。在这里，我们提供了一种使用dd-PCR量化视网膜细胞中AAV转导率的简单方法。通过微小的修改，这种方法也可以成为线粒体DNA拷贝数定量的基础，以及评估碱基编辑的效率，这对于几种视网膜疾病和基因治疗应用至关重要。
Introduction
腺相关病毒（AAV）现在通常用于各种视网膜基因治疗研究。AAV提供了一种安全有效的基因递送方式，免疫原性较低，基因组整合较少。AAV通过内吞作用进入靶细胞，这需要细胞表面受体和共受体结合1，2。因此，AAV对不同细胞类型的转导效率主要取决于衣壳及其与宿主细胞受体的相互作用。AAV具有血清型，每种血清型可以具有不同的细胞/组织向性和转导效率。还有人工AAV血清型和变异，通过化学修饰病毒衣壳，杂交衣壳的产生，肽插入，衣壳洗牌，定向进化和合理诱变产生3。即使氨基酸序列或衣壳结构的微小变化也会对与宿主细胞因子的相互作用产生影响，并导致不同的趋向性4。除了衣壳变异体外，其他因素，如注射途径和AAV生产的批次间变异，都会影响AAV在神经元视网膜中的转导效率。因此，需要可靠的方法来比较不同变体的转导速率。
大多数测定AAV转导效率的方法依赖于报告基因表达。这些包括荧光成像，免疫组织化学，蛋白质印迹或报告基因产物5，6，7的组织化学分析。然而，由于AAV的大小限制，包括报告基因来监测转导效率并不总是可行的。使用强启动子，如杂交CMV增强子/鸡β-肌动蛋白或Woodchuck肝炎转录后调节元件（WPRE）作为mRNA稳定剂序列，进一步使大小问题8复杂化。因此，使用更直接的方法定义注入的AAV的转导率也是有益的。
数字液滴PCR（dd-PCR）是一种从微量样品中定量靶DNA的强大技术。dd-PCR技术依赖于通过油滴封装靶DNA和PCR反应混合物。每个dd-PCR反应都含有数千个液滴。每个液滴作为独立的PCR反应进行处理和分析9。液滴分析只需使用泊松算法即可计算出任何样品中靶DNA分子的绝对拷贝数。由于AAV的转导效率与神经元视网膜中AAV基因组的拷贝数相关，因此我们使用dd-PCR方法量化AAV基因组。
在这里，我们描述了一种dd-PCR方法，用于计算来自视网膜基因组DNA6，10的AAV载体的转导效率。首先，使用小规模方案生成表达tdTomato报告的AAV，并通过dd-PCR方法11滴定。其次，AAV被玻璃体内注射到神经元视网膜中。为了证明转导效率，我们首先使用荧光显微镜和ImageJ软件量化了tdTomato表达。随后使用dd-PCR分离基因组DNA，用于定量注射视网膜中的AAV基因组。tdTomato表达水平与dd-PCR定量转导的AAV基因组的比较表明，dd-PCR方法准确量化了AAV载体的转导效率。我们的实验方案展示了一种基于dd-PCR的量化AAV转导效率的方法的详细说明。在该协议中，我们还显示了玻璃体内注射后转导的AAV基因组的绝对数量，只需使用基因组DNA分离和dd-PCR结果后的稀释因子即可。总体而言，该协议提供了一种强大的方法，该方法将成为报告表达的替代方法，以量化视网膜中AAV载体的转导效率。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
所有实验方案均被萨班哲大学伦理委员会接受，实验按照"视觉和眼科研究协会"的声明进行，用于研究动物
1. 小规模AAV生产12
- 使用15cm板在完整的10 mL DMEM / 10%FBS中培养HEK293T细胞，直到70-80%汇合。
- 用20μg辅助质粒（pHGT1-Adeno1），7μg衣壳质粒和7μgAAV2-CBA-tdTomato-WPRE载体和136μLPEI溶液（1mg / mL）在5mL DMEM中制备转染混合物。
- 将5mL制备的转染混合物加入含有10mL培养基的细胞培养皿中，并在37°C下孵育转染的细胞48-60小时。
- 转染后48-60小时收集培养基，并在37°C下以终浓度为250 U / mL用DNase I消化30分钟。
- 将消化的培养基在4000×g，4°C下离心30分钟，然后用0.22μm注射器过滤器将其过滤到预润湿的再生纤维素膜中100kDa。
- 将再生纤维素膜在4000×g，4°C下离心30分钟并弃去培养基。
- 用含有0.001%Pluronic F-68的PBS洗涤再生纤维素膜并在4000×g，4°C下离心30分钟。在每个步骤中丢弃 PBS。
- 从再生纤维素膜的顶部收集浓缩的AAV并等分试样以备进一步使用。
- 用DNase I（0.2U / μl）在37°C下消化5μL新鲜制作的AAV15分钟以滴定。随后在95°C下孵育10分钟，以灭活DNase I和降解病毒衣壳。
- 使用0.05%Pluronic F-68从消化的AAV中制备10倍连续稀释液。使用AAV2-ITR和WPRE引物进行滴定（表1）。通过将dd-PCR结果与稀释因子相乘来计算滴度。将结果转换为基因组拷贝/mL（GC/mL）。
注：小规模AAV生产的AAV浓度预计约为1 x 1012 GC/mL。该协议不适用于不能有效地将AAV释放到AAV213等介质中的AAV菌株。
2. 玻璃体内注射AAV
-
设备准备
- 在开始之前，用36 G钝针准备10μL微量注射器。用70%EtOH冲洗五次，在ddH2O中冲洗五次，最后用PBS冲洗五次。
- 每次注射将适量的AAV加载到微量注射器中。
- 准备手术针（缝合线，丝绸，6/0），胶带，镊子和剪刀。
-
玻璃体内注射
- 麻醉前涂抹 1 滴含 0.5% 托吡卡胺和 2.5% 去氧肾上腺素盐酸盐（例如 Mydfrin）滴眼液，以扩张瞳孔。
- 在手术过程中用异氟醚5%（1升/分钟）麻醉小鼠，并继续使用1.5%异氟醚（1升/分钟）。一个小的异氟醚腔室用于第一次诱导。
- 通过矫正反射丧失、戒断反射和尾部捏反应来验证麻醉深度。
- 在注射程序之前，将0.3%妥布霉素和0.1%地塞米松无菌眼用溶液涂抹在每只眼睛上。滴眼液可防止干燥，并发挥抗炎和抗菌作用。
- 使用手术钩稳定上眼睑。稍微向后拉，露出眼睛的背侧部分。将挂钩用胶带粘在长凳上，使其固定到位。
- 用弯曲的虹膜剪刀去除结膜（小于1mm2），在解剖显微镜下暴露眼睛的巩膜。使用新鲜无菌的胰岛素注射器（30 G）刺穿巩膜。
- 使用显微操作器通过相同的穿刺插入微注射器的针头。将针尖放在眼罩中间的晶状体后面。
- 注射1μL AAV2 / BP2和AAV2 / PHP。具有1.63 x 1012 GC / mL和1.7 x 1012 GC / mL浓度的S载体缓慢进入眼睛的玻璃体。注射量控制是手动完成的。将针头留在原位1分钟，然后慢慢取出针头。
- 松开眼睑，将含有0.3%妥布霉素和0.1%地塞米松的抗炎和抗菌局部凝胶治疗涂抹在眼罩上。在接下来的几天里，根据评分表在外观（明亮的眼睛，修饰的外套，驼背），行为（活动，固定，自残）和体重方面监测和评估小鼠，范围为0至3。每个条件的评分从0-3开始，总分为3分或以上是终止标准。
- 恢复后将动物放入笼子中。
3. 荧光和眼底成像
- 将0.5%托吡卡胺和2.5%去氧肾上腺素盐酸盐滴入每只眼睛，使小鼠应变并扩张瞳孔。
- 用异氟醚用上述程序麻醉动物。通过捏住爪子仔细评估麻醉深度。
- 将鼠标放在成像台上，并通过检查眼底相机来验证扩张是否正确。将局部凝胶（0.2%卡波姆980）涂抹在眼睛表面，以保护眼睛在麻醉下不脱水，并将其用作成像的耦合凝胶。
- 操纵成像载物台以与物镜的物镜转换器对齐。根据需要调整载物台以使鼠标眼睛居中。一旦眼睛居中，慢慢移动物镜，直到它与眼睛接触。
- 在玻璃体内注射后1周和2周对双眼进行眼底和荧光成像，以随访tdTomato表达（图3B）14。在相同设置下拍摄眼底和荧光图像，以比较报告者表达。
4. 视网膜隔离
- 在2周的时间点通过CO2 吸入进行足底和荧光成像以收集视网膜后对动物实施安乐死。
- 在13.5厘米的分离器镊子的帮助下将眼球向前移动。
- 用镊子轻轻按压，将晶状体与剩余的玻璃体一起取下。
- 用精密弯曲的镊子切断眼球与视神经的连接，并使用相同的弯曲镊子轻轻挤压视网膜。
- 将解剖的视网膜转移到微量离心管中。
- 通过将管子放入液氮中来快速冻结视网膜。
5. 组织基因组DNA分离
- 使用商业化的蛋白酶K消化组织基因组DNA试剂盒分离基因组DNA。
- 在55°C，200×g下用蛋白酶K消化视网膜30分钟，蛋白酶K已经在试剂盒中提供。
- 根据制造商的协议执行RNase孵育步骤，用洗涤缓冲液I和II洗涤步骤，最后洗脱步骤。
- 在最后一次洗涤后加入一个额外的旋转步骤，以除去残留的乙醇。
- 测量基因组DNA的浓度并将样品储存在-20°C。
6. 小鼠视网膜样品的飞沫数字PCR分析，用于病毒基因组的定量
- 将注射的视网膜中的基因组DNA稀释在0.05%Pluronic F-68溶液中，以达到每个样品的1 ng / μL的最终浓度。
- 使用目标特异性引物对WPRE和18S进行单独的反应，每个引物的终浓度为125 nM。
- 在 20 μL PCR 反应混合物中生成液滴，包括 1 ng 基因组 DNA、125 nM 引物和 2x evagreen 超混合。
- 将样品混合物装入墨盒的中间部分以产生液滴。
- 将样品加载到墨盒后，将70μL液滴生成油加入墨盒的底部行。
- 将垫圈放在墨盒顶部，然后将其放入液滴发生器中。确保垫圈和墨盒之间没有间隙。
- 轻轻取顶部孔中产生的约40μL液滴。将液滴溶液加入半裙边96孔PCR反应板中。
- 使用铝密封箔用PCR板密封器密封PCR板。
- 将PCR板放入96孔热封热循环仪中。使用PCR方案;95 °C 持续 5 分钟，40 次循环 95 °C 持续 30 秒，60 °C 循环 1 分钟，4 °C 持续 5 分钟，90 °C 循环 5 分钟，4 °C 无限保持。在每个循环中应用2°C / s的斜坡速率，以确保液滴在循环过程中达到每个步骤的正确温度
- 将PCR板放入液滴读数仪中，使用dd-PCR软件对液滴进行定量。模板是使用 evagreen 的特定设置设置的。
- 使用每个样品的一维绘图图分析数据，了解荧光强度与液滴数的关系。阈值的排列使得高于阈值的液滴被指定为正数，而下面的液滴被指定为负数。接下来是应用泊松算法来确定以拷贝/μL为单位的靶DNA起始浓度。计算WPRE与18S的比率，用于测量AAV转导效率。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
小规模AAV生产是一种快速有效的方法，可为玻璃体内注射提供载体（图1）。小规模AAV生产通常使滴度在1 x 1012 GC / ml的范围内，足以检测视网膜中的报告表达（图2）。使用滴定聚合酶链反应对 AAV 进行滴定可提供一致的结果。常规使用ITR2和WPRE特异性引物，并使用dd-PCR软件通过建模为泊松分布来计算每个靶分子的起始浓度。通过增殖稀释因子并最终确定计算，并转换为每mL的基因组拷贝。为该方案生产的AAV的滴度分别为1.63 x 1012 GC / mL和1.7x10 12 GC / ml，用于AAV2 / BP2和AAV2 / PHP.S 7，15。为了进行比较，对两种菌株使用相同的tdTomato表达结构。我们注射了大致相同滴度的AAV，用于AAV转导效率的定量。从上述浓度的AAV中注射1μL后，在1周和2周的时间点对动物进行成像。将眼底和荧光成像系统用于AAV2 / BP2和AAV2 / PHP。S注射的视网膜产生类似的报告者表达谱，除了视网膜#1（图3A，B）。使用ImageJ软件对TdTomato表达进行平均灰度值（平均荧光强度）的定量，以便交叉比较转导效率和报告者表达（图3A，B）。这基本上是选择中所有像素的灰度值之和除以像素数16。视网膜#1的荧光图像仅显示tdTomato表达的小面积，很可能是由于玻璃体内注射后的回流或泄漏。与这一发现一致，视网膜#1的荧光强度为0.9，与玻璃体内注射和成像的所有视网膜相比，这是最低的。平均荧光强度在4-11之间。这表明tdTomato表达的荧光图像的定量是成功的，并且与显示的图像相关（图3A，B）。
在视网膜成像后，在2周的时间点从注射的视网膜中分离出基因组DNA。使用WPRE引物进行dd-PCR进行AAV基因组定量。小鼠18S用于将AAV基因组归一化为小鼠基因组（图3C）17。与平均荧光强度和图像一致，视网膜#1相对于18S具有非常低的AAV基因组拷贝数，比视网膜#2低0.011倍。此外，视网膜#2，3，4和5具有相似的折叠水平差异。与视网膜#2相比，视网膜#3，4和5的折叠差异分别为1.75，0.55和0.99。其中，视网膜#3都给出了最高的荧光强度和AAV基因组拷贝数。这已经表明，用dd-PCR定量转导的AAV基因组与荧光强度相关，从而与观察到的tdTomato表达相关。dd-PCR方法还使我们能够对转导的AAV进行绝对定量。每个视网膜总AAV基因组的绝对定量只需将dd-PCR鉴定的总数和基因组DNA的稀释因子相乘即可计算。与18S归一化AAV基因组转导效率相比，这产生了类似的结果（图3D）。
图1：实验程序流程图。 小规模 AAV 生产之后是基于滴滴 PCR 的 AAV 滴定。AAV在玻璃体内注射到成人视网膜中。使用眼底和荧光成像系统对动物进行随访，以分析报告者表达。眼底和荧光图像在1周和2周的时间点拍摄。从注射的视网膜中分离出基因组DNA，以便使用dd-PCR进行分析，以量化注射视网膜中存在的总AAV基因组。 请点击此处查看此图的放大版本。
图2：使用滴滴定量PCR法进行AAV滴定（A）Dd-PCR法受益于液滴内的封装PCR反应。使用evagreen化学进行PCR反应后，分析靶基因的正负液滴，以确定溶液中靶DNA的绝对数量。（绿色液滴中的红色框）。（B） 用于 AAV 滴度的代表性 dd-PCR 数据。使用ITR2引物滴定几批AAV。正液滴和负液滴在阈值上方和下方分开（紫色线）。请点击此处查看此图的放大版本。
图3：通过dd-PCR定量视网膜中转导的AAV基因组， 将16周龄的野生动物在玻璃体内注射AAV2 / BP2和AAV2 / PHP。S 载体分别具有 1.63 x 1012 GC/mL 和 1.7x 1012 GC/mL 浓度。两个AAV具有相同的tdTomato表达构建体，所有AAV的注射体积为1μL.注射视网膜 （1-7） 随访眼底和荧光成像。使用Image J软件对拍摄的图像进行了量化。尽管衣壳存在差异，但所有动物的荧光平均强度值（平均灰度值）都在4到11之间，除了视网膜#1，其强度最低，为0.9，tdTomato表达较弱。红色和灰色列是 AAV2/BP2 和 AAV2/PHP。S注射视网膜，分别（A-B）。dd-PCR使用WPRE引物在2周时间点进行AAV基因组和18S引物进行归一化。视网膜#1也显示出每18S拷贝（C）的AAV拷贝数明显较低。 还使用WPRE拷贝数和稀释因子计算每个视网膜的总AAV基因组，用于基因组DNA分离（D）。红色和灰色方块是 AAV2/BP2 和 AAV2/PHP。S分别注射了视网膜。 请点击此处查看此图的放大版本。
| 滴滴聚氯乙烯引物 | |
| 国际检索报告2 F | GGAACCCCTAGTGATGGAGTT |
| 国际检索线2 R | CGGCCTCAGTGAGCGA |
| 断续器 | GGCTGTTGGGCACTGACAA |
| WPRE R | CCAAGGAAAGGACGATGATTTC |
| 18秒 F | GGCCGTTCTTAGTTGGTGGA |
| 18S R | CCCGGACATCTAAGGGCATC |
表1：dd-PCR引物序列。 用于WPRE，ITR2和小鼠18S的正向和反向引物序列。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
在该协议中，我们生成了两个具有不同衣壳蛋白的AAV载体，然后相应地滴定它们。该协议最关键的步骤之一是产生足够量的AAV，这将在转导12，13之后产生可检测的报告者表达。
AAV的滴度也是调整玻璃体内注射AAV剂量的重要因素。一旦达到这些重要标准，就可以通过dd-PCR方法量化AAV的转导效率。
许多实验室正在使用定量 PCR （qPCR） 方法进行 AAV 滴定。基于qPCR的绝对定量方法需要具有已知量的目标DNA18的稀释度的标准曲线。然而，dd-PCR不需要标准曲线，因为它通过检测具有至少一个靶DNA拷贝的阳性液滴，直接量化给定样品中靶分子的总数。由于dd-PCR是一种终点分析，不需要标准曲线，因此qPCR反应过程中发生的效率问题与低效率PCR或标准曲线的质量一样，对dd-PCR来说不太重要 9。dd-PCR方法可以应用于已经为qPCR制备的样品。正如在 AAV 滴度的方法部分已经提到的，dd-PCR 需要稀释的样品。这是一个关键步骤，因为样品浓度应以有足够的负液滴来执行泊松算法的方式进行调整。换句话说，不可能对目标DNA浓度过高且不产生阴性液滴的样品进行dd-PCR反应。
对于AAV滴定和转导效率测量，可以使用不同的靶标集。对于AAV滴定，我们主要使用AAV2 ITR特异性引物，因为我们的结构中有AAV2骨架。 也可以使用WPRE和其他基因特异性靶标，具体取决于已分析的AAV构建体。
为了评估AAV在神经元视网膜中的转导效率，我们应用dd-PCR方法使用整个视网膜样本来量化每个视网膜的AAV基因组总量。我们通过使用表达tdTomato报告基因的AAV载体来评估方法的准确性。dd-PCR结果与tdTomato表达水平的比较与两个异常值除外。视网膜#6和#7产生了过量的AAV基因组拷贝，尽管与视网膜#2，3 4或5相比显示出相似的荧光强度。这可能是因为这些视网膜具有较高的转导率和有限的表达水平，或者可能部分与玻璃体或神经元视网膜内的持久性AAV颗粒或载体DNA有关19，20。总体而言，这是我们方法的唯一限制因素，可以很容易地在其他样品中识别。我们还量化了每个视网膜的AAV基因组总数，这是这种方法的优势之一。这允许比较不同实验室和动物批次之间的数据。因此，该方法可以很容易地应用于评估没有报告者表达的AAV载体的新血清型，变体或批次间间变异的转导效率，并帮助我们在不同设置下交叉比较数据。这对于由于大小限制而不允许表达式报告器的 AAV 向量至关重要。
该方法还为利用靶DNA的其他类型的敏感测定提供了基础。使用相同的方案，我们可以用适当的引物量化线粒体基因组拷贝数。进一步的改进也是可能的，包括视网膜解离和流式细胞术分选步骤，以量化单个细胞或批次细胞中的靶DNA。此外，使用这种方法21，22评估碱基编辑的校正效率也是可行的，这对于几种视网膜疾病和基因治疗也至关重要。
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
作者没有什么可透露的。
Acknowledgments
我们要感谢Oezkan Keles，Josephine Jüttner和巴塞尔分子与临床眼科研究所的Botond Roska教授，复杂病毒平台对AAV生产的帮助和支持。我们还要感谢宾夕法尼亚大学佩雷尔曼医学院的Jean Bennett教授的AAV8 / BP2菌株。动物工作在盖布泽技术大学动物设施进行。为此，我们感谢Leyla Dikmetas和Uygar Halis Tazebay教授对畜牧业的技术援助和支持。我们还要感谢Fatma Ozdemir博士对手稿的评论。这项工作得到了TUBITAK，授权号118C226和121N275以及Sabanci University Integration grant的支持。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-Well Semi-Skirted ddPCR plates | BioRad | 12001925 | ddPCR |
| Amicon Filter | Millipore | UFC910096 | AAV |
| C1000 TOUCH 96 DEEP WELLS | BioRad | 1851197 | ddPCR |
| C57BL/6JRj mice strain | Janvier | C57BL/6JRj | Mice |
| DG8 gaskets | BioRad | 1863009 | ddPCR |
| DG8 Cartridges | BioRad | 1864008 | ddPCR |
| DMEM | Lonza | BE12-604Q | AAV |
| DPBS | PAN BIOTECH | L 1825 | AAV |
| Droplet generation oil eva green | BioRad | 1864006 | ddPCR |
| Droplet reader oil | BioRad | 1863004 | ddPCR |
| FBS | PAN BIOTECH | p30-3306 | AAV |
| Foil seals for PX1 PCR Plate sealer | BioRad | 1814040 | ddPCR |
| Insulin Syringes | BD Medical | 320933 | Intravitreal injection |
| Isoflurane | ADEKA ILAC SANAYI VE TICARET | N01AB06 | anesthetic |
| Microinjector MM33 | World Precision Instruments | 82-42-101-0000 | Intravitreal injection |
| Micron IV | Phoenix Research Labs | Micron IV | Microscopy system based on 3-CCD color camera, frame grabber, and off-the-shelf software enables researchers to image mouse retinas. |
| Mydfrin (%2.5 phenylephrine hydrochloride) | Alcon | S01FB01 | pupil dilation |
| Nanofil Syringe 10 μl | World Precision Instruments | NANOFIL | Intravitreal injection |
| Needle RN G36, 25 mm, PST 2 | World Precision Instruments | NF36BL-2 | Intravitreal injection |
| PEI-MAX | Polyscience | 24765-1 | AAV |
| Penicillin-Streptomycin | PAN BIOTECH | P06-07100 | AAV |
| Plasmid pHGT1-Adeno1 | PlasmidFactory | PF1236 | AAV |
| Pluronic F-68 | Gibco | 24040032 | AAV |
| PX1 PCR Plate Sealer system | BioRad | 1814000 | ddPCR |
| QX200 ddPCR EvaGreen Supermix | BioRad | 1864034 | ddPCR |
| QX200 Droplet Reader/QX200 Droplet Generator | BioRad | 1864001 | ddPCR |
| SPLITTER FORCEP WATCHER MAKER - LENGTH = 13.5 CM |
endostall medical | EJN-160-0155 | Retina isolation |
| Steril Syringe Filter | AISIMO | ASF33PS22S | AAV |
| Tissue Genomic DNA Kit | EcoSpin | E1070 | gDNA isolation |
| Tobradex (0.3% tobramycin / 0.1% dexamethasone) | Alcon | S01CA01 | anti-inflammatory / antibiotic |
| Tropamid (% 0.5 tropicamide) | Bilim Ilac Sanayi ve Ticaret AS. | S01FA06 | pupil dilation |
| Turbonuclease | Accelagen | N0103L | AAV |
| Viscotears (carbomer 2 mg/g) | Bausch+Lomb | S01XA20 | lubricant eye drop |
References
- Herrmann, A. K., Grimm, D. High-throughput dissection of AAV-host interactions: The fast and the curious. Journal of Molecular Biology. 430 (17), 2626-2640 (2018).
- Pillay, S., Carette, J. E. Host determinants of adeno-associated viral vector entry. Current Opinion in Virology. 24, 124-131 (2017).
- Castle, M. J., Turunen, H. T., Vandenberghe, L. H., Wolfe, J. H. Controlling AAV tropism in the nervous system with natural and engineered capsids. Methods in Molecular Biology. 1382, 133-149 (2016).
- Agbandje-McKenna, M., Kleinschmidt, J. AAV capsid structure and cell interactions. Methods in Molecular Biology. 807, 47-92 (2011).
- Han, I. C., et al. Retinal tropism and transduction of adeno-associated virus varies by serotype and route of delivery (intravitreal, subretinal, or suprachoroidal) in rats. Human Gene Therapy. 31 (23-24), 1288-1299 (2020).
- Muraine, L., et al. Transduction efficiency of adeno-associated virus serotypes after local injection in mouse and human skeletal muscle. Human Gene Therapy. 31 (3-4), 233-240 (2020).
- Cronin, T., et al. Efficient transduction and optogenetic stimulation of retinal bipolar cells by a synthetic adeno-associated virus capsid and promoter. EMBO Molecular Medicine. 6 (9), 1175-1190 (2014).
- Higashimoto, T., et al. The woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element reduces readthrough transcription from retroviral vectors. Gene Therapy. 14 (17), 1298-1304 (2007).
- Pinheiro, L. B., et al. Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification. Annals in Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).
- Albayrak, C., et al. Digital quantification of proteins and mrna in single mammalian cells. Molecular Cell. 61 (6), 914-924 (2016).
- Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. J., Wilson, J. M. Absolute determination of single-stranded and self-complementary adeno-associated viral vector genome titers by droplet digital PCR. Hum Gene Therapy Methods. 25 (2), 115-125 (2014).
- Juttner, J., et al. Targeting neuronal and glial cell types with synthetic promoter AAVs in mice, non-human primates and humans. Nature Neuroscience. 22 (8), 1345-1356 (2019).
- Vandenberghe, L. H., et al. Efficient serotype-dependent release of functional vector into the culture medium during adeno-associated virus manufacturing. Human Gene Therapy. 21 (10), 1251-1257 (2010).
- Barben, M., Schori, C., Samardzija, M., Grimm, C. Targeting Hif1a rescues cone degeneration and prevents subretinal neovascularization in a model of chronic hypoxia. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 12 (2018).
- Chan, K. Y., et al. Engineered AAVs for efficient noninvasive gene delivery to the central and peripheral nervous systems. Nature Neuroscience. 20 (8), 1172-1179 (2017).
- Guiet, R., Burri, O., Seitz, A. Open source tools for biological image analysis. Methods Molecular Biology. 2040, 23-37 (2019).
- Parks, M. M., et al. Variant ribosomal RNA alleles are conserved and exhibit tissue-specific expression. Science Advances. 4 (2), (2018).
- Aurnhammer, C., et al. Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences. Human Gene Therapy Methods. 23 (1), 18-28 (2012).
- Maclachlan, T. K., et al. Preclinical safety evaluation of AAV2-sFLT01- a gene therapy for age-related macular degeneration. Molecular Therapy. 19 (2), 326-334 (2011).
- Stieger, K., et al. Detection of intact rAAV particles up to 6 years after successful gene transfer in the retina of dogs and primates. Molecular Therapy. 17 (3), 516-523 (2009).
- Gyorgy, B., et al. Allele-specific gene editing prevents deafness in a model of dominant progressive hearing loss. Nature Medicine. 25 (7), 1123-1130 (2019).
- Cox, D. B. T., et al.
