Summary
Denne protokollen presenterer hvordan du kvantifiserer AAV-transduksjonseffektivitet i musenett ved hjelp av digital dråpe PCR (dd-PCR) sammen med liten AAV-produksjon, intravitreal injeksjon, retinal avbildning og retinal genomisk DNA-isolasjon.
Abstract
Mange retinal cellebiologiske laboratorier bruker nå rutinemessig Adeno-tilknyttede virus (AAVs) for genredigering og regulatoriske applikasjoner. Effektiviteten til AAV-transduksjon er vanligvis kritisk, noe som påvirker de generelle eksperimentelle resultatene. En av de viktigste determinantene for transduksjonseffektivitet er serotypen eller varianten av AAV-vektoren. For tiden er ulike kunstige AAV-serotyper og varianter tilgjengelige med forskjellige affiniteter for å være vert for celleoverflatereseptorer. For retinal genterapi resulterer dette i varierende grad av transduksjonseffektivitet for forskjellige netthinnecelletyper. I tillegg kan injeksjonsruten og kvaliteten på AAV-produksjonen også påvirke retinal AAV-transduksjonseffektiviteten. Derfor er det viktig å sammenligne effektiviteten til forskjellige varianter, partier og metoder. Den digitale dråpe-PCR-metoden (dd-PCR) kvantifiserer nukleinsyrene med høy presisjon og gjør det mulig å utføre absolutt kvantifisering av et gitt mål uten standard eller referanse. Ved hjelp av dd-PCR er det også mulig å vurdere transduksjonseffektiviteten til AAVer ved absolutt kvantifisering av AAV-genomkopinumre i en injisert netthinne. Her tilbyr vi en enkel metode for å kvantifisere transduksjonshastigheten til AAVer i retinalceller ved hjelp av dd-PCR. Med mindre modifikasjoner kan denne metodikken også være grunnlaget for kopieringsnummer kvantifisering av mitokondrie-DNA samt vurdere effektiviteten av baseredigering, kritisk for flere netthinnesykdommer og genterapiapplikasjoner.
Introduction
Adeno assosierte virus (AAVs) brukes nå ofte til en rekke retinal genterapistudier. AAVer gir en sikker og effektiv måte å levere gen på med mindre immunogenisitet og færre genomintegrasjoner. AAV-oppføring i målcellen skjer gjennom endokytose, som krever binding av reseptorer og koreseptorer på celleoverflaten1,2. Derfor avhenger transduksjonseffektiviteten til AAVer for forskjellige celletyper hovedsakelig av capsid og dens interaksjoner med vertscellereseptorene. AAVer har serotyper og hver serotype kan ha distinkte cellulære / vevtropismer og transduksjonseffektivitet. Det er også kunstige AAV-serotyper og varianter generert av kjemisk modifikasjon av viruskapsiden, produksjon av hybridkapsider, peptidinnsetting, kapsidstokking, rettet evolusjon og rasjonell mutagenese3. Selv mindre endringer i aminosyresekvens eller kapsidstruktur kan ha innflytelse på interaksjoner med vertscellefaktorer og resultere i forskjellige tropismer4. I tillegg til capsid-varianter kan andre faktorer som injeksjonsrute og batch-til-batch-variasjon av AAV-produksjon påvirke transduksjonseffektiviteten til AAVer i nevronal netthinnen. Derfor er pålitelige metoder for sammenligning av transduksjonshastigheter for forskjellige varianter nødvendig.
De fleste metodene for å bestemme AAV-transduksjonseffektivitet er avhengige av reportergenuttrykk. Disse inkluderer fluorescerende avbildning, immunhiistokjemi, vestlig blot eller histokjemisk analyse av reportergenproduktet5,6,7. På grunn av størrelsesbegrensningen til AAVer er det imidlertid ikke alltid mulig å inkludere reportergener for å overvåke transduksjonseffektiviteten. Bruk av sterke promotorer som hybrid CMV enhancer / kylling beta-actin eller Woodchuck hepatitt posttranskripsjonelt regulatorisk element (WPRE) som en mRNA-stabilisatorsekvens kompliserer ytterligere størrelsesproblemet8. Derfor vil det også være gunstig å definere transduksjonshastigheten til injiserte AAVer med en mer direkte metodikk.
Digital droplet PCR (dd-PCR) er en kraftig teknikk for å kvantifisere mål-DNA fra små mengder prøver. dd-PCR-teknologi avhenger av innkapsling av målet DNA og PCR reaksjon blanding av oljedråper. Hver dd-PCR-reaksjon inneholder tusenvis av dråper. Hver dråpe behandles og analyseres som en uavhengig PCR-reaksjon9. Analyse av dråper gjør det mulig å beregne absolutt kopi antall mål-DNA-molekyler i en hvilken som helst prøve ved å bruke Poisson-algoritmen. Siden transduksjonseffektiviteten til AAVene er korrelert med kopinummeret til AAV-genomer i nevronal netthinnen, brukte vi dd-PCR-metoden for å kvantifisere AAV-genomer.
Her beskriver vi en dd-PCR-metodikk for å beregne transduksjonseffektiviteten til AAV-vektorer fra retinal genomisk DNA6,10. Først ble AAVer som uttrykker tdTomato reporter generert ved hjelp av den lille skalaprotokollen, og titered av dd-PCR-metoden11. For det andre ble AAVs intravitrealt injisert i nevronal netthinnen. For å demonstrere transduksjonseffektiviteten kvantifiserte vi først tdTomato-uttrykket ved hjelp av fluorescerende mikroskopi og ImageJ-programvare. Dette ble etterfulgt av isolering av genomisk DNA for kvantifisering av AAV-genomer injisert netthinner ved hjelp av dd-PCR. Sammenligning av tdTomato-uttrykksnivåer med de transinduserte AAV-genomene kvantifisert av dd-PCR viste at dd-PCR-metoden nøyaktig kvantifiserte transduksjonseffektiviteten til AAV-vektorer. Våre protokoller viste en detaljert beskrivelse av en dd-PCR-basert metodikk for å kvantifisere AAV-transduksjonseffektivitet. I denne protokollen viser vi også det absolutte antallet AAV-genomer som transduseres etter intravitreale injeksjoner ved ganske enkelt å bruke fortynningsfaktoren etter genomisk DNA-isolasjon og dd-PCR-resultatene. Totalt sett gir denne protokollen en kraftig metode, som ville være et alternativ til reporteruttrykk for å kvantifisere transduksjonseffektivitet av AAV-vektorer i netthinnen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle eksperimentelle protokoller ble akseptert av Sabanci University etikkkomité og eksperimenter ble utført i samsvar med uttalelsen fra 'The Association for Research in Vision and Ophthalmology' for bruk av dyr i forskning.
1. Liten AAV-produksjon12
- Kultur HEK293T celler ved hjelp av 15 cm plater i fullstendig 10 ml DMEM / 10% FBS til 70-80% samløp.
- Forbered transfeksjonsblandingen med 20 μg hjelperplasmid (pHGT1-Adeno1), 7 μg capsid plasmid og 7 μg AAV2-CBA-tdTomato-WPRE-vektor og 136 μL PEI-oppløsning (1 mg / ml) i 5 ml DMEM.
- Tilsett den 5 ml tilberedte transfeksjonsblandingen i en cellekulturfat som inneholder 10 ml kulturmedier og inkuber de transfiserte cellene i 48-60 timer ved 37 °C.
- Samle media på 48-60 h post-transfection og fordøye det med DNase I ved en endelig konsentrasjon på 250 U / ml i 30 min ved 37 °C.
- Sentrifuger det fordøyde mediet ved 4000 x g, 4 °C i 30 minutter og filtrer det deretter med et 0,22 μm sprøytefilter i den forhåndsfuktede regenererte cellulosemembranen i 100 kDa.
- Sentrifuger den regenererte cellulosemembranen ved 4000 x g, 4 °C i 30 minutter og kast mediet.
- Vask og sentrifuger den regenererte cellulosemembranen med PBS som inneholder 0,001% Pluronic F-68 tre ganger ved 4000 x g,4 °C i 30 minutter. Kast PBS på hvert trinn.
- Samle konsentrertE AAVer fra den øverste delen av den regenererte cellulosemembranen og aliquot for videre bruk.
- Fordøye 5 μL nylaget AAV med DNase I (0,2U/μl) i 15 min ved 37 °C for titering. Dette etterfølges av 10 min ved 95 °C inkubasjon for både å inaktivere DNase I og forringe de virale capsidene.
- Forbered en 10 ganger seriell fortynning fra fordøyde AAVer ved hjelp av 0,05% Pluronic F-68. Bruk AAV2-ITR- og WPRE-primere til titrering (tabell 1). Titerne ble beregnet ved å multiplisere dd-PCR-resultater med fortynningsfaktorene. Resultatene ble konvertert til genomkopi/ml (GC/ml).
MERK: AAV-konsentrasjoner for liten AAV-produksjon forventes å være rundt 1 x 1012 GC/ml. Denne protokollen gjelder ikke for AAV-stammer som ikke effektivt frigir AAVer til medier som AAV213.
2. Intravitreal injeksjon av AAV
-
Forberedelse av utstyr
- Før du starter, forberede 10 μL mikrosyringe med en 36 G stump nål. Skyll fem ganger med 70% EtOH, fem ganger i ddH2O, og til slutt fem ganger med PBS.
- Legg riktig mengde AAV i mikrosyringen for hver injeksjon.
- Forbered den kirurgiske nålen (sutur, silke, 6/0), tape, tang og saks.
-
Intravitreal injeksjon
- Påfør 1 dråpe 0,5% tropicamid og 2,5% fenylefrinhydroklorid (f.eks. Mydfrin) som inneholder øyedråpe før anestesi for å utvide elevene.
- Bedøv mus med isofluran 5% (1 L/min) og fortsett med 1,5% isofluran (1 L/min) under prosedyren. Et lite isoflurankammer brukes til den første induksjonen.
- Kontroller dybden av anestesi ved tap av høyre refleks, abstinensrefleks og haleklemmerespons.
- Påfør 0,3% tobramycin og 0,1% deksametason steril oftalmisk oppløsning på hvert øye før injeksjonsprosedyren. Påføring av øyedråpe forhindrer tørrhet og utøver antiinflammatoriske og antibakterielle effekter.
- Bruk den kirurgiske kroken til å stabilisere øvre øyelokk. Trekk litt tilbake for å eksponere den dorsale delen av øyet. Teip kroken til benken for å holde den på plass.
- Fjern konjunktivene (mindre enn 1 mm2) med den buede irisaksen for å eksponere øyets sklerra under dissekeringsmikroskopet. Bruk en frisk og steril insulinsprøyte (30 G) for å punktere scleraen.
- Sett nålen på mikrosyringen gjennom den samme punkteringen ved hjelp av en mikromanipulator. Plasser spissen av nålen bak linsen midt i øyemusken.
- Injiser 1 μL AAV2/BP2 og AAV2/PHP. S vektorer har 1,63 x 1012 GC / ml og 1,7 x 1012 GC / ml konsentrasjoner sakte inn i glasslegemet i øyet. Innsprøytingsvolumkontroll gjøres manuelt. La nålen stå på plass i 1 min og trekk kanylen langsomt tilbake.
- Slipp øyelokket og påfør antiinflammatorisk og antibakteriell lokal gelbehandling som inneholder 0,3% tobramycin og 0,1% deksametason til øyemusløp. Overvåk og evaluer musene i de følgende dagene i henhold til resultatarket når det gjelder utseende (lyse øyne, preparert frakk, hunching), oppførsel (aktivitet, immobilisering, selvlemlestelse) og kroppsvekt på en skala fra 0 til 3. Hver betingelse har en poengsum fra 0-3 og en total poengsum på 3 eller høyere er et oppsigelseskriterium.
- Plasser dyrene i buret etter utvinning.
3. Fluorescens og fundusavbildning
- Sil av musen og fortynn eleven ved å plassere dråper på 0,5% tropicamid og 2,5% fenylefrinhydroklorid i hvert øye.
- Bedøv dyret med ovennevnte prosedyre med isofluran. Vurder dybden av anestesi nøye ved å klemme potene.
- Plasser musen på bildestadiet og kontroller riktig utvidelse ved å sjekke gjennom funduskameraet. Påfør aktuell gel (0,2% karbomer 980) på overflaten av øynene for å beskytte øynene mot dehydrering under anestesi og for å bruke den som koblingsgel for avbildning.
- Manipuler bildestadiet slik at det er på linje med nesestykket til målet. Juster scenen etter behov for å midtstille museøyet. Når øyet er sentrert, beveger du sakte målet til det kommer i kontakt med øyet.
- Utfør fundus- og fluorescensavbildning på begge øynene for å følge opp tdTomato-uttrykk ved 1 uke og 2 uker etter intravitreal injeksjon (Figur 3B)14. Ta fundus- og fluorescensbilder med identiske innstillinger for sammenligning av reporteruttrykk.
4. Retina-isolasjon
- Avlive dyr etter fundus og fluorescensavbildning ved CO 2-innånding for netthinneinnsamling ved 2 ukers tidsrom.
- Skift øyebollet fremover ved hjelp av en 13,5 cm splitter tang.
- Fjern linsen sammen med rester av glasslegemet ved å påføre forsiktig trykk med tangene.
- Klipp tilkoblingen av øyebollet til synsnerven med presisjonsbuede tang og klem forsiktig netthinnen med de samme buede tangene.
- Overfør dissekerte netthinner til et mikrosenterrør.
- Trykk på fryse netthinnen ved å plassere rørene i det flytende nitrogenet.
5. Vev genomisk DNA-isolasjon
- Isoler genomisk DNA med et kommersialisert Proteinase K fordøyelsesbasert vev genomisk DNA-sett.
- Fordøye netthinnen ved 55 °C, 200 x g i 30 minutter med Proteinase K, som allerede leveres i settet.
- Utfør RNase inkubasjon trinn, vask trinn med vaskebuffer I og II, og til slutt elution trinn i henhold til produsentens protokoll.
- Legg til et ekstra spinntrinn etter siste vask for å fjerne gjenværende etanol.
- Mål konsentrasjonen av genomisk DNA og lagre prøver ved -20 °C.
6. Droplet digital PCR analyse av mus netthinne prøver for kvantifisering av virale genomer
- Fortynn genomiske DNAer fra injiserte netthinner i 0,05 % Pluronic F-68-oppløsning for å oppnå en endelig konsentrasjon på 1 ng/μL for hver prøve.
- Utfør separate reaksjoner for WPRE og 18S ved hjelp av målspesifikke primere med en endelig konsentrasjon på 125 nM for hver primer.
- Utfør dråpegenerering i en 20 μL PCR-reaksjonsblanding, inkludert 1 ng genomisk DNA, 125 nM primere og 2x evagreen supermix.
- Legg prøveblandingen i midtre del av patronen for dråpegenerering.
- Etter at prøvelastingen til patronen er fullført, tilsetter du 70 μL dråpegenereringsolje i den nederste raden av patronen.
- Sett pakningen oppå patronen og legg den i dråpegeneratoren. Pass på at det ikke er noe mellomrom mellom pakningen og patronen.
- Ta forsiktig ca 40 μL dråper som genereres i toppbrønnen. Tilsett dråpeløsningen på den halvskjørte 96-brønns PCR-reaksjonsplaten.
- Forsegle PCR-platen med PCR-plateforsegler ved hjelp av aluminiumsforseglingsfolie.
- Plasser PCR-platen i 96-brønns varmeforseglet termisk syklist. Bruk PCR-protokollen. 95 °C i 5 minutter, 40 sykluser på 95 °C i 30 s, 60 °C i 1 min, 4 °C i 5 minutter, 90 °C i 5 minutter og 4 °C uendelig hold. Påfør 2 °C/s rampehastighet ved hver syklus for å sikre at dråpene når riktig temperatur for hvert trinn under syklingen
- Plasser PCR-platen i dråpeleseren for å kvantifisere dråper ved hjelp av dd-PCR-programvare. En mal defineres ved hjelp av bestemte innstillinger for evagreen.
- Analyser data ved hjelp av en 1D-plottgraf med hvert eksemplar for fluorescensintensitet vs dråpenummer. Terskelverdien er ordnet slik at slippverktøyene over terskelen tilordnes som positive og de nedenfor som negative. Dette etterfølges av anvendelsen av Poisson-algoritmen for å bestemme startkonsentrasjonen av mål-DNA i enheter av kopier / μL. Forholdet mellom WPRE og 18S beregnes for måling av AAV-transduksjonseffektivitet.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
AAV-produksjon i liten skala er en rask og effektiv metode som gir vektorer for intravitreale injeksjoner (figur 1). Litenskala AAV-produksjon gir vanligvis titere innenfor området 1 x 1012 GC/ml som er tilstrekkelig til å oppdage reporteruttrykk i netthinnen (figur 2). Titering av AAV ved bruk av dd-PCR gir konsistente resultater. ITR2- og WPRE-spesifikke primere brukes rutinemessig, og startkonsentrasjonen av hvert målmolekyl ble beregnet med dd-PCR-programvare ved å modellere som en Poisson-distribusjon. Beregningene ble sluttført ved multiplikasjon av fortynningsfaktorer og konvertert til genomkopi per ml. AAVer som er produsert for denne protokollen hadde titere på henholdsvis 1,63 x10 12 GC/ml og 1,7x10 12 GC/ml for henholdsvis AAV2/BP2 og AAV2/PHP.S7,15. Til sammenligning ble identiske tdTomato-uttrykkskonstruksjoner brukt til begge stammer. Vi injiserte omtrent like titere av AAV for kvantifisering av AAV-transduksjonseffektivitet. Etter injeksjon på 1 μL fra de nevnte konsentrasjonene av AAVer ble dyr avbildet på 1 uke og 2 ukers tidspunkter. Et fundus- og fluorescensavbildningssystem ble brukt for både AAV2/BP2 og AAV2/PHP. S injiserte netthinner som genererer lignende reporteruttrykksprofiler bortsett fra netthinne #1 (Figur 3A,B). TdTomato-uttrykket ble kvantifisert ved hjelp av ImageJ-programvare for gjennomsnittlig gråverdi (gjennomsnittlig fluorescensintensitet) for å kryssoverveie transduksjonseffektivitet og reporteruttrykk (Figur 3A,B). Dette er i utgangspunktet summen av de grå verdiene for alle bildepunktene i markeringen delt på antall piksler16. Fluorescerende bilder av Retina #1 viste bare et lite område med tdTomato-uttrykk, mest sannsynlig på grunn av tilbakestrømning eller lekkasje etter intravitreale injeksjoner. I samsvar med dette funnet var fluorescensintensiteten til netthinnen #1 0,9, som var den laveste sammenlignet med alle netthinner som ble intravitrealt injisert og avbildet. Gjennomsnittlig fluorescensintensitet var mellom 4 - 11. Dette viste at kvantifiseringen av fluorescerende bilder av tdTomato-uttrykket var vellykket og korrelert med bildene som ble vist (Figur 3A,B).
Etter avbildning av netthinner ble genomisk DNA isolert fra injiserte netthinner på 2-ukers tidspunkt. dd-PCR ble utført ved hjelp av WPRE primere for AAV genom kvantifisering. Mouse 18S ble brukt til normalisering av AAV genomer til musen genom (Figur 3C)17. I samsvar med gjennomsnittlig fluorescensintensitet og bilder hadde netthinnen #1 et svært lavt AAV-genomkopieringsnummer i forhold til 18S, 0,011 ganger lavere sammenlignet med netthinne #2. Videre gir netthinner # 2, 3, 4 og 5 lignende forskjeller på brettnivå. Foldforskjellene sammenlignet med netthinne #2 for netthinner #3, 4 og 5 var henholdsvis 1,75, 0,55 og 0,99. Blant disse ga netthinnen #3 begge den høyeste fluorescerende intensiteten og AAV-genomkopinummeret. Dette viste allerede at kvantifisering av transinduserte AAV-genomer med dd-PCR korrelerer med fluorescensintensiteten og dermed til tdTomato-uttrykket som observeres. Dd-PCR-metoden tillot oss også å gjøre absolutt kvantifisering av transinduserte AAVer. Absolutt kvantifisering av det totale AAV-genomet per netthinne ble beregnet ganske enkelt ved å multiplisere det totale antallet identifisert fra dd-PCR og fortynningsfaktoren for genomisk DNA. Dette ga lignende resultater sammenlignet med 18S normalisert AAV genomtransduksjonseffektivitet (Figur 3D).
Figur 1: Flytskjema over eksperimentelle prosedyrer. Liten AAV-produksjon etterfølges av dd-PCR-basert AAV-titering. AAVer injiseres intravitrealt i voksen netthinnen. Oppfølging av dyr ble utført ved hjelp av et fundus- og fluorescerende bildebehandlingssystem for å analysere reporteruttrykket. Fundus og fluorescerende bilder ble tatt på 1 uke og 2-ukers tidspoeng. Genomisk DNA er isolert fra injiserte netthinner for analyse med dd-PCR for å kvantifisere det totale AAV-genomet som er tilstede i de injiserte netthinnene. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: AAV-titering ved hjelp av dd-PCR-metoden. (A) Dd-PCR-metoden drar nytte av innkapslede PCR-reaksjoner i et dråpe. Etter PCR-reaksjon ved hjelp av evagreenkjemi ble positive og negative dråper for målgenet analysert for å bestemme absolutt antall mål-DNAer i en løsning. (røde bokser i grønne dråper). (B) Representative dd-PCR-data for AAV-titering. Flere partier med AAVer ble titerert ved hjelp av ITR2 primere. Positive og negative dråper skilles over og under terskelen (lilla linje). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Kvantifisering av transinduserte AAV-genomer i netthinnen av dd-PCR. 16 uker gamle villdyr ble intravitrealt injisert med AAV2/BP2 og AAV2/PHP. S-vektorer som har henholdsvis 1,63 x10 12 GC/ml og 1,7x10 12 GC/ml. Begge AAVene hadde identisk tdTomato-uttrykkskonstruksjon og injeksjonsvolum for alle AAVer var 1 μL. Injiserte netthinner (1-7) ble fulgt opp med fundus og fluorescensavbildning. Bilder som er tatt, ble kvantifisert ved hjelp av Image J-programvare. Til tross for kapsidforskjellen hadde alle dyrene en fluorescens gjennomsnittlig intensitetsverdi (gjennomsnittlig grå verdi) som spenner mellom 4 og 11 bortsett fra netthinne # 1 som hadde lavest intensitet, 0,9 og svakt tdTomato-uttrykk. Røde og grå kolonner er AAV2/BP2 og AAV2/PHP. S injiserte netthinner, henholdsvis (A-B). dd-PCR ble utført ved hjelp av WPRE primere for AAV-genom og 18S primer for normalisering ved 2-ukers tidspunkt. Retina # 1 viste også karakteristisk lavere AAV-kopinumre per 18S-kopier (C). Totalt AAV-genomer per netthinne ble også beregnet ved hjelp av WPRE-kopinummer og fortynningsfaktor for genomisk DNA-isolasjon (D). Røde og grå firkanter er AAV2/BP2 og AAV2/PHP. S injiserte netthinner, henholdsvis. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| ddPCR Primere | |
| ITR2 F | GGAACCCCTAGTGATGGAGTTT |
| ITR2 R | CGGCCTCAGTGAGCGA |
| WPRE F | GGCTGTTGGGCACTGACAA |
| WPRE R | CCAAGGAAAGGACGATGATTTC |
| 18S F | GGCCGTTCTTAGTTGGTGGA |
| 18S R | CCCGGACATCTAAGGGCATC |
Tabell 1: dd-PCR primer sekvenser. Sekvenser av fremover og bakover primere for WPRE, ITR2 og mus 18S.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denne protokollen genererte vi to AAV-vektorer som har forskjellige kapsidproteiner og deretter titered dem deretter. Et av de viktigste trinnene i denne protokollen er å produsere tilstrekkelige mengder AAVer som vil gi detekterbart reporteruttrykk etter transduksjonen12,13.
Titering av AAVs er også en viktig faktor for å justere doser av AAV for intravitreale injeksjoner. Når disse viktige kriteriene er oppnådd, er det mulig å kvantifisere transduksjonseffektiviteten til AAVer ved dd-PCR-metodikk.
Mange laboratorier bruker den kvantitative PCR-metoden (qPCR) for AAV-titering. qPCR-basert absolutt kvantifiseringsmetode krever en standardkurve som har fortynning av kjente mengder mål-DNA18. Dd-PCR krever imidlertid ikke en standardkurve, da den direkte kvantifiserer det totale antallet målmolekyler i en gitt prøve ved å oppdage de positive dråpene som har minst en kopi av mål-DNA. Siden dd-PCR er en sluttpunktanalyse og ingen standardkurve er nødvendig, er effektivitetsproblemene som oppstod under qPCR-reaksjonen, mindre bekymret for dd-PCR som laveffektive PCR-er eller kvaliteten på standardkurvene 9. dd-PCR-metoden kan brukes på prøver som allerede er klargjort for qPCR. Som det allerede var nevnt i metodeseksjonen for AAV-titering, krever dd-PCR fortynnede prøver. Dette er et kritisk skritt siden prøvekonsentrasjonen bør justeres på en måte som er tilstrekkelig negative dråper til å utføre Poisson-algoritmen. Det er med andre ord ikke mulig å utføre dd-PCR-reaksjonen med prøver med for høye konsentrasjoner av mål-DNA som ikke gir negative dråper.
For både AAV-titerings- og transduksjonseffektivitetsmålinger er forskjellige målsett mulig å bruke. For AAV-titering bruker vi hovedsakelig AAV2 ITR-spesifikke primere på grunn av AAV2-ryggraden i våre konstruksjoner. Det er også mulig å bruke WPRE og andre genspesifikke mål avhengig av AAV-konstruksjonen som er analysert.
For å evaluere transduksjonseffektiviteten til AAVer i nevronal netthinnen, brukte vi dd-PCR-metoden ved hjelp av hele netthinneprøver for å kvantifisere den totale mengden AAV-genomer per netthinne. Vi vurderte nøyaktigheten av metodikk ved å bruke en AAV-vektor som uttrykker tdTomato reporter. Sammenligning av dd-PCR resultater med tdTomato uttrykk nivåer korrelert bortsett fra de to outliers. Netthinner #6 og #7 ga overflødige AAV-genomkopier til tross for at de viste lignende fluorescensintensiteter sammenlignet med netthinner #2,3 4 eller 5. Dette kan skyldes at disse netthinnene har høyere transduksjonshastigheter med begrensede uttrykksnivåer eller delvis kan være relatert til varige AAV-partikler eller vektor-DNA i glasslegemet eller nevronal netthinnen19,20. Totalt sett var dette den eneste begrensende faktoren for vår metode og kan enkelt identifiseres blant andre prøver. Vi kvantifiserte også det totale antallet AAV-genomer per netthinne som var en av styrkene til denne metoden. Dette gjør det mulig å sammenligne data mellom forskjellige laboratorier og grupper av dyr. Derfor kan denne metoden enkelt brukes til å vurdere transduksjonseffektiviteten til en ny serotype, variant eller batch til batchvariasjon for AAV-vektorer som ikke har noe reporteruttrykk og hjelper oss med å kryss-sammenligne data på forskjellige innstillinger. Dette er kritisk for AAV-vektorer som ikke tillater uttrykk for en reporter på grunn av størrelsesbegrensninger.
Denne metoden gir også grunnlag for andre typer sensitive analyser som benytter mål-DNA. Ved hjelp av de identiske protokollene kan vi kvantifisere mitokondriegenomkopinumre med passende primere. Ytterligere forbedringer er også mulig, inkludert dissosiasjon av netthinnen og strømning cytometri sortering trinn for å kvantifisere målet DNA i enten enkeltceller eller grupper av celler. Videre er det også mulig å vurdere korreksjonseffektiviteten til baseredigering ved hjelp av denne metoden21,22, som også er kritisk for flere netthinnesykdommer og genterapier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har ingenting å avsløre.
Acknowledgments
Vi vil takke Oezkan Keles, Josephine Jüttner og prof. Botond Roska, Institute of Molecular and Clinical Ophthalmology Basel, Complex Viruses Platform for deres hjelp og støtte til AAV-produksjon. Vi vil også takke professor Jean Bennett, Perelman School of Medicine, University of Pennsylvania for AAV8/BP2-stammen. Dyrearbeid utføres ved Gebze Technical University dyreanlegg. For det takker vi Leyla Dikmetas og prof. Uygar Halis Tazebay for teknisk assistanse og støtte til husdyrhold. Vi vil også takke Dr. Fatma Ozdemir for hennes kommentarer til manuskriptet. Dette arbeidet støttes av TUBITAK, tilskuddsnummer 118C226 og 121N275, og Sabanci University Integration grant.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 96-Well Semi-Skirted ddPCR plates | BioRad | 12001925 | ddPCR |
| Amicon Filter | Millipore | UFC910096 | AAV |
| C1000 TOUCH 96 DEEP WELLS | BioRad | 1851197 | ddPCR |
| C57BL/6JRj mice strain | Janvier | C57BL/6JRj | Mice |
| DG8 gaskets | BioRad | 1863009 | ddPCR |
| DG8 Cartridges | BioRad | 1864008 | ddPCR |
| DMEM | Lonza | BE12-604Q | AAV |
| DPBS | PAN BIOTECH | L 1825 | AAV |
| Droplet generation oil eva green | BioRad | 1864006 | ddPCR |
| Droplet reader oil | BioRad | 1863004 | ddPCR |
| FBS | PAN BIOTECH | p30-3306 | AAV |
| Foil seals for PX1 PCR Plate sealer | BioRad | 1814040 | ddPCR |
| Insulin Syringes | BD Medical | 320933 | Intravitreal injection |
| Isoflurane | ADEKA ILAC SANAYI VE TICARET | N01AB06 | anesthetic |
| Microinjector MM33 | World Precision Instruments | 82-42-101-0000 | Intravitreal injection |
| Micron IV | Phoenix Research Labs | Micron IV | Microscopy system based on 3-CCD color camera, frame grabber, and off-the-shelf software enables researchers to image mouse retinas. |
| Mydfrin (%2.5 phenylephrine hydrochloride) | Alcon | S01FB01 | pupil dilation |
| Nanofil Syringe 10 μl | World Precision Instruments | NANOFIL | Intravitreal injection |
| Needle RN G36, 25 mm, PST 2 | World Precision Instruments | NF36BL-2 | Intravitreal injection |
| PEI-MAX | Polyscience | 24765-1 | AAV |
| Penicillin-Streptomycin | PAN BIOTECH | P06-07100 | AAV |
| Plasmid pHGT1-Adeno1 | PlasmidFactory | PF1236 | AAV |
| Pluronic F-68 | Gibco | 24040032 | AAV |
| PX1 PCR Plate Sealer system | BioRad | 1814000 | ddPCR |
| QX200 ddPCR EvaGreen Supermix | BioRad | 1864034 | ddPCR |
| QX200 Droplet Reader/QX200 Droplet Generator | BioRad | 1864001 | ddPCR |
| SPLITTER FORCEP WATCHER MAKER - LENGTH = 13.5 CM |
endostall medical | EJN-160-0155 | Retina isolation |
| Steril Syringe Filter | AISIMO | ASF33PS22S | AAV |
| Tissue Genomic DNA Kit | EcoSpin | E1070 | gDNA isolation |
| Tobradex (0.3% tobramycin / 0.1% dexamethasone) | Alcon | S01CA01 | anti-inflammatory / antibiotic |
| Tropamid (% 0.5 tropicamide) | Bilim Ilac Sanayi ve Ticaret AS. | S01FA06 | pupil dilation |
| Turbonuclease | Accelagen | N0103L | AAV |
| Viscotears (carbomer 2 mg/g) | Bausch+Lomb | S01XA20 | lubricant eye drop |
References
- Herrmann, A. K., Grimm, D. High-throughput dissection of AAV-host interactions: The fast and the curious. Journal of Molecular Biology. 430 (17), 2626-2640 (2018).
- Pillay, S., Carette, J. E. Host determinants of adeno-associated viral vector entry. Current Opinion in Virology. 24, 124-131 (2017).
- Castle, M. J., Turunen, H. T., Vandenberghe, L. H., Wolfe, J. H. Controlling AAV tropism in the nervous system with natural and engineered capsids. Methods in Molecular Biology. 1382, 133-149 (2016).
- Agbandje-McKenna, M., Kleinschmidt, J. AAV capsid structure and cell interactions. Methods in Molecular Biology. 807, 47-92 (2011).
- Han, I. C., et al. Retinal tropism and transduction of adeno-associated virus varies by serotype and route of delivery (intravitreal, subretinal, or suprachoroidal) in rats. Human Gene Therapy. 31 (23-24), 1288-1299 (2020).
- Muraine, L., et al. Transduction efficiency of adeno-associated virus serotypes after local injection in mouse and human skeletal muscle. Human Gene Therapy. 31 (3-4), 233-240 (2020).
- Cronin, T., et al. Efficient transduction and optogenetic stimulation of retinal bipolar cells by a synthetic adeno-associated virus capsid and promoter. EMBO Molecular Medicine. 6 (9), 1175-1190 (2014).
- Higashimoto, T., et al. The woodchuck hepatitis virus post-transcriptional regulatory element reduces readthrough transcription from retroviral vectors. Gene Therapy. 14 (17), 1298-1304 (2007).
- Pinheiro, L. B., et al. Evaluation of a droplet digital polymerase chain reaction format for DNA copy number quantification. Annals in Chemistry. 84 (2), 1003-1011 (2012).
- Albayrak, C., et al. Digital quantification of proteins and mrna in single mammalian cells. Molecular Cell. 61 (6), 914-924 (2016).
- Lock, M., Alvira, M. R., Chen, S. J., Wilson, J. M. Absolute determination of single-stranded and self-complementary adeno-associated viral vector genome titers by droplet digital PCR. Hum Gene Therapy Methods. 25 (2), 115-125 (2014).
- Juttner, J., et al. Targeting neuronal and glial cell types with synthetic promoter AAVs in mice, non-human primates and humans. Nature Neuroscience. 22 (8), 1345-1356 (2019).
- Vandenberghe, L. H., et al. Efficient serotype-dependent release of functional vector into the culture medium during adeno-associated virus manufacturing. Human Gene Therapy. 21 (10), 1251-1257 (2010).
- Barben, M., Schori, C., Samardzija, M., Grimm, C. Targeting Hif1a rescues cone degeneration and prevents subretinal neovascularization in a model of chronic hypoxia. Molecular Neurodegeneration. 13 (1), 12 (2018).
- Chan, K. Y., et al. Engineered AAVs for efficient noninvasive gene delivery to the central and peripheral nervous systems. Nature Neuroscience. 20 (8), 1172-1179 (2017).
- Guiet, R., Burri, O., Seitz, A. Open source tools for biological image analysis. Methods Molecular Biology. 2040, 23-37 (2019).
- Parks, M. M., et al. Variant ribosomal RNA alleles are conserved and exhibit tissue-specific expression. Science Advances. 4 (2), (2018).
- Aurnhammer, C., et al. Universal real-time PCR for the detection and quantification of adeno-associated virus serotype 2-derived inverted terminal repeat sequences. Human Gene Therapy Methods. 23 (1), 18-28 (2012).
- Maclachlan, T. K., et al. Preclinical safety evaluation of AAV2-sFLT01- a gene therapy for age-related macular degeneration. Molecular Therapy. 19 (2), 326-334 (2011).
- Stieger, K., et al. Detection of intact rAAV particles up to 6 years after successful gene transfer in the retina of dogs and primates. Molecular Therapy. 17 (3), 516-523 (2009).
- Gyorgy, B., et al. Allele-specific gene editing prevents deafness in a model of dominant progressive hearing loss. Nature Medicine. 25 (7), 1123-1130 (2019).
- Cox, D. B. T., et al.
