Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biochemistry
Click here for the English version

Biochemistry

Immunopeptidomics: Isolering av mus och mänskliga MHC klass I- och II-associerade peptider för massspektrometrianalys

Published: October 15, 2021 doi: 10.3791/63052
Automatic Translation
*1, *1, 1, 1, 1,2
1CHU Sainte-Justine Research Center, 2Department of Pathology and Cellular Biology, Faculty of Medicine, Université de Montréal
* These authors contributed equally

Summary

Här presenterar vi ett protokoll för rening av MHC klass I och klass II peptidkomplex från mus och mänskliga cellinjer som ger högkvalitativa immunpeptidomics data. Protokollet fokuserar på provberedning med kommersiellt tillgängliga antikroppar.

Abstract

Immunopeptidomics är ett framväxande område som driver och vägleder utvecklingen av vacciner och immunterapier. Mer specifikt hänvisar det till vetenskapen om att undersöka sammansättningen av peptider som presenteras av stora histokompatibilitetskomplex (MHC) klass I och klass II-molekyler med hjälp av masspektrometri (MS) teknikplattformar. Bland alla steg i ett MS-baserat immunpeptidomics arbetsflöde är provberedning avgörande för att fånga högkvalitativa data av terapeutisk relevans. Här beskrivs steg-för-steg-instruktioner för att isolera MHC-klass I- och II-associerade peptider genom immunaffinitetsrening från kvalitetskontroller, från mus (EL4 och A20) och mänskliga (JY) cellinjer mer specifikt. De olika reagenserna och specifika antikroppar beskrivs noggrant för att isolera MHC-associerade peptider från dessa cellinjer, inklusive stegen för att verifiera antikroppens pärlbindande effektivitet och elutionseffektiviteten hos MHC-peptidkomplexen från pärlorna. Protokollet kan användas för att upprätta och standardisera ett immunopeptidomics arbetsflöde, samt för att jämföra nya protokoll. Dessutom utgör protokollet en bra utgångspunkt för alla icke-experter utöver att främja reproducerbarheten inom och mellan laboratorier av provberedningsförfarandet i immunpeptidomics.

Introduction

Under det senaste decenniet har intresset för att undersöka repertoaren av MHC-associerade peptider överträffat den akademiska sektorn och nått bioteknik- och läkemedelsindustrin. I cancer representerar upptäckten av handlingsbara tumörspecifika neoantigener ett stort forskningsfokus inom industrisektorn för att utveckla kliniska immunterapier som leder till personlig onkologi1,2,3. I grunden presenteras MHC-associerade peptider i hela kroppen, återspeglar cellens intracellulära stadium och är signifikanta i olika sjukdomstillstånd som autoimmunitet, transplantation, infektionssjukdomar, inflammation, cancer och allergier1,4. Således är MHC-associerade peptider, eller human leukocyt antigen (HLA) ligands hos människor, av stort medicinskt intresse och kallas kollektivt immunopeptidome5.

MS är ett kraftfullt analytiskt tillvägagångssätt för att karakterisera immunopeptidome6,7, inklusive upptäckten av tumör-specifika neoantigens8,9,10,11. Ett typiskt arbetsflöde för att utföra ett immunopeptidomics experiment innehåller tre huvudsteg: 1) prov förberedelse för isolering av MHC-associerade peptider, 2) datainsamling av MS och 3) data analys med hjälp av olika beräkningsprogram verktyg12. Generering av högkvalitativa prover som beskrivs i detta visualiserade protokoll är avgörande för framgången för alla projekt i MS-baserade immunpeptidomics. Protokollet som beskrivs nedan fokuserar på att isolera MHC klass I- och II-associerade peptider från väletablerade cellinjer som är lämpliga för att generera högkvalitativa immunpeptidomics data. Representativa resultat från dessa cellinjer visas i det aktuella protokollet.

Protocol

Protokollet som tillhandahålls här anpassades från etablerade protokoll13,14,15,16,17,18,19,20. Det övergripande förfarandet för immunaffinitetsrening (IP) av MHC-klass I- och II-peptider illustreras i figur 1. Se Materialförteckning för mer information om de cellinjer och antikroppar som används.

1. Pärlor koppling med antikropparna (dag 1): Koppling antikroppar för att sepharose CNBr-aktiverade pärlor

OBS: Förbered nya lösningar för varje nytt experiment. Se tabell över material och tilläggstabell 1 för en förteckning över recept på reagenser och lösningar. Alla steg utförs vid rumstemperatur (RT). Kontrollera bindningseffektiviteten vid användning av en ny antikropp genom att samla in viktiga alikvoter (se indikationen OPTIONAL) och utföra Coomassie blå färgning SDS-PAGE (bild 2).

  1. Aktivering av sepharose CNBr pärlor
    1. Väg 80 mg sefarosa CNBr-aktiverade pärlor per prov och överför dem till ett koniskt rör på 15 ml.
    2. För att underlätta resuspension av torkade pärlor, tillsätt först 5 ml 1 mM HCl och pipetter upp och ner 5 gånger. Fyll sedan koniska röret med ytterligare 8,5 ml 1 mM HCl.
    3. Rotera vid 20 varv/min (varv per minut) i 30 minuter vid RT med hjälp av en rotatorenhet. Centrifugera pärlorna vid 200 x g i 2 min vid RT och ta bort supernatanten genom strävan.
    4. Tillsätt 500 μL kopplingsbuffert till pärlor pelleten och överför till ett nytt 2,0 ml centrifugrör och håll åt sidan för steg 1.2.2.
  2. Koppling av antikroppar mot CNBr-aktiverade pärlor
    1. Förbered den antikropp som valts ut för isolering av MHC-klass I- eller II-peptiderna i ett nytt 2,0 ml mikrocentrifugerör genom att tillsätta 2 mg av antikroppen (enligt den koncentration som anges av tillverkaren). Fyll volymen till 1 ml med kopplingsbuffertlösningen för att få en slutlig koncentration på 2 mg/ml.
    2. Centrifugera pärlorna från steg 1.1.4 vid 200 x g i 2 min vid RT och ta sedan bort supernatanten genom strävan.
    3. Tillsätt antikroppslösningen till 2,0 ml mikrocentrifugerör som innehåller de aktiverade pärlorna.
    4. (VALFRITT) Ta en alikvot på 18 μL (INPUT), tillsätt 6 μL 4x SDS-PAGE-buffert och frys omedelbart.
    5. Rotera mikrocentrifugeröret från steg 1.2.3 vid 20 varv/min i 120 minuter med en rotatorenhet. Centrifugera pärlorna vid 200 x g i 2 min och ta sedan bort supernatanten.
    6. (VALFRITT) Ta en alikvot på 18 μL av supernatanten (obunden antikropp), tillsätt 6 μL 4x SDS-PAGE-buffert och frys omedelbart.
  3. Blockering och tvättning av antikroppskopplade pärlor
    1. Tillsätt 1 ml 0,2 M glycin till mikrocentrifugeröret som innehåller de antikroppskopplade pärlorna från steg 1,2,5. Rotera vid 20 varv/min i 60 minuter vid RT med en rotatorenhet.
    2. Centrifugera pärlorna vid 200 x g i 2 min och ta sedan bort supernatanten. Tillsätt 1 ml PBS (fosfatbuffrad saltlösning).
    3. Centrifugera pärlorna vid 200 x g i 2 min och ta sedan bort supernatanten.
    4. (VALFRITT) Ta en alikvot på 18 μL av supernatanten (obunden antikropp, sista tvätt), tillsätt 6 μL 4x SDS-PAGE-buffert och frys omedelbart.
    5. Tillsätt 1 ml PBS till pärlorna i steg 1.3.3.
    6. (VALFRITT) Ta en alikvot på 18 μL pärlblandning (pärlor i kombination med antikroppar), tillsätt 6 μL 4x SDS-PAGE-buffert och frys omedelbart.
    7. Håll vid 4 °C tills samma dag används i steg 2.5.
      OBS: Pärlor kan beredas dagen före immunkapslingen, men längre lagring har inte testats.

2. Celllys och immunocapture med antikroppskopplade pärlor (dag 1)

OBS: Nivån av MHC-molekyler varierar från en celltyp till en annan, och kvantifieringen av MHC/HLA-molekyler per cell föreslås21 (figur 4A). Vi rekommenderar minst 1 x 108 celler för varje IP. Detta antal celler motsvarar 6-10 mg protein från JY, EL4 och A20 celler solubilized med 0,5% Chaps buffert. För att förbereda cellpellets för IPs bör celler skördas, centrifugeras och tvättas två gånger med 5 ml PBS. Sedan kan cellpellets lagras i ett 1,5 mL mikrocentrifugerör eller ett koniskt rör på 15 ml vid -80 °C fram till tidpunkten för IP. Observera att IPs kan utföras på färskskördad eller fryst cellpellets.

  1. För att isolera MHC-klass I- eller II-peptider, tina en frusen pellet på 1 x 108 celler genom att värma botten av röret med handflatan. Tillsätt 500 μL PBS till pelleten och pipetten upp och ner tills suspensionen är homogen.
    OBS: Beroende på celltyp kan cellpelletvolymen variera avsevärt. Om 500 μL PBS inte räcker för att lösa upp cellpelleten, använd mer PBS tills cellerna lätt delas upp medan de rör sig upp och ner.
  2. Mät den totala volymen av pelleten som återanvänds i PBS och överför till ett nytt rör 2 mL microcentrifugerör. Dela upp i fler rör om det behövs.
  3. Tillsätt en volym celllysbuffert (1% chapsbuffert i PBS som innehåller proteashämmare, 1 pellet/10 ml buffert) motsvarande volymen cellpellets som återanvänds i PBS mätt i föregående steg. Den slutliga koncentrationen av lysbufferten är 0,5% Chaps.
  4. Rotera vid 10 varv/min i 60 min vid 4 °C med en rotatoranordning. Centrifugera cellen lysate vid 18 000 x g i 20 min vid 4 °C med full broms och överför supernatanten (som innehåller MHC-peptider komplex) i ett nytt 2,0 mL microcentrifuge rör.
  5. Återställ de antikroppskopplade pärlorna från steg 1.3.7 genom centrifugering vid 200 x g i 2 min och ta bort supernatanten.
  6. Överför celllynatanten i steg 2.4 till de antikroppskopplade pärlorna och inkubera med rotation (10 rpm) i 14-18 timmar (över natten) vid 4 °C med hjälp av en rotatoranordning.

3. Elution av MHC peptider (dag 2)

OBS: Polypropylenkolonnen möjliggör elution av MHC-peptidkomplex samtidigt som pärlorna behålls i kolonnen. För att utvärdera andelen MHC-peptider komplex som begränsas till pärlor före och efter sur elution med 1% TFA (trifluoratisk syra), är det möjligt att utföra en västerländsk fläck med alikvoter som tas vid viktiga steg under protokollet (se indikationen OPTIONAL). Western blotting som visas i figur 3 avslöjar berikning av MHC-peptidkomplex efter sur eleuion med 1% TFA. Frånvaron av signal i denna fraktion skulle indikera att elutionssteget inte lyckades. Observera att andelen obundna MHC-peptider komplex till pärlor också kan utvärderas parallellt genom västra blotting med hjälp av en alikvot som beskrivs i steg 3.1.6.

  1. Elution av MHC-peptidkomplex från antikroppen kopplade pärlor
    1. Ta bort polypropylenkolonnens nedre lock, placera kolonnen på polypropylenkolonnstället och installera en tom behållare under för att samla flödet igenom.
      OBS: En kolumn per exempel krävs.
    2. Skölj polypropylenkolonnen med 10 ml buffert A och låt den rinna av tyngdkraften. Om flödeshastigheten för flytande elution är för långsam, skär ytterligare bottenspetsen på polypropylenkolonnen.
    3. Mät och samla pärlor-lysateblandningen (~ 2 ml) från steg 2.5 och överför den till polypropylenkolonnen.
    4. (VALFRITT) Ta en alikvot på 20 μL (eller 1/100 ur den totala volymen) för western blotting och frys omedelbart. Denna fraktion motsvarar de totala MHC-peptiderna komplex inkuberade med pärlorna.
    5. Låt vätskeblandningen gäckas av gravitationen.
    6. (VALFRITT) Samla och mät genomströmningen och ta en alikvot på 20 μL (eller 1/100 ur den totala volymen) för västra blottning och frysning omedelbart. Denna fraktion representerar de återstående obundna MHC-peptiderna komplex.
    7. För att återställa beads-lysate-blandningen så mycket som möjligt, skölj röret från steg 3.1.3 med 1 ml buffert A och överför den till polypropylenkolonnen.
    8. Tvätta pärlorna som behålls i polypropylenkolonnen genom att tillsätta 10 ml buffert A. Låt tvättbufferten elta av gravitationen.
    9. Upprepa tvättsteget med 10 ml buffert B, 10 ml buffert A och sedan 10 ml buffert C.
    10. Ta bort polypropylenkolonnen från racket och placera den på toppen av ett nytt 2,0 mL microcentrifuge-rör. Håll kolonnen och röret tillsammans med handen.
    11. Tillsätt 300 μL 1% TFA till polypropylenkolonnen och blanda pärlorna genom pipettering upp och ner 5 gånger.
      OBS: Pärlorna kommer att behållas i polypropylenkolonnen, och de MHC-bundna peptiderna kommer att gäcka i 2,0 ml mikrocentrifugerör.
    12. Överför eluatet i ett nytt 2,0 mL microcentrifuge-rör. Upprepa steg 3.1.11 och slå samman de 2 eluaterna (eluaterna som innehåller MHC-peptidkomplexen ska motsvara totalt 600 μL och användas i steg 3.2.4).
    13. (VALFRITT) Samla in en alikvot på 6 μL (eller 1/100 av den totala volymen) för western blotting och frysning omedelbart. Denna fraktion motsvarar MHC-peptider komplex eluted från pärlor.
  2. Avsaltning och elution av MHC-peptider
    OBS: Avsaltning och elution av MHC peptider steg kan göras genom att installera C18 kolonnen på en 2,0 mL microcentrifuge rör. För en bättre passform, installera glödgarna som tillhandahålls av tillverkaren mellan C18-kolonnen och 2,0 mL microcentrifuge-röret. I detta protokoll används en C18-kolumn med en volymkapacitet på 5-200 μL (6-60 μg). Alla steg utförs på RT.
    1. Tillsätt 200 μL metanol ovanpå C18-kolonnen och centrifugera sedan vid 1546 x g i 3 minuter. Kassera genomströmningen.
    2. Tillsätt 200 μL 80%ACN (acetonitril)/0,1%TFA ovanpå C18-kolonnen och centrifugera sedan vid 1546 x g i 3 min. Kassera genomströmningen.
    3. Tillsätt 200 μL 0,1 %TFA ovanpå C18-kolonnen och centrifugera sedan vid 1546 x g i 3 minuter. Kassera genomströmningen.
    4. Ladda 200 μL av MHC-peptidkomplexen från steg 3.1.12 ovanpå C18-kolonnen. Centrifugera vid 1546 x g i 3 minuter och kasta igenom flödet.
    5. Upprepa steg 3.2.4 två gånger tills hela volymen har lästs in. Observera att MHC peptider behålls i C18-kolumnen.
    6. Tillsätt 200 μL 0,1 %TFA till C18-kolonnen och centrifugera sedan vid 1546 x g i 3 min. Kassera genomströmningen.
    7. Överför C18-kolonnen till ett nytt 2,0 mL microcentrifuge-rör. Elute MHC peptider från C18 kolonnen genom att tillsätta 150 μL 28%ACN/0,1%TFA.
    8. Centrifug vid 1546 x g i 3 min.
    9. Överför genomströmningen i ett nytt 1,5 mL mikrocentrifugerör. Var försiktig så att du inte kasserar genomströmningen; Den innehåller de isolerade MHC-klass I- eller II-peptiderna.
    10. Upprepa steg 3.2.7-3.2.9 två gånger för en total volym på 450 μL.
    11. Frys 450 μL eluat (renade MHC-klass I- eller II-peptider) vid -20 °C tills proverna analyseras av LC-MSMS.
    12. Före LC-MS/MS-analys avdunstas de renade MHC-klass I- eller II-peptiderna från steg 3.2.11 till torrhet med en vakuumkoncentrator med förinställningar på 45 °C för 2 timmar, vakuumnivå: 100 mTorr och vakuumramp: 5.
      OBS: Avdunstning av frysta prover är mycket effektiv. Torkade peptider kan frysas tills analys.

4. Identifiering av MHC-peptider av klass I och II med LC-MS/MS

OBS: Analysera MHC klass I och II immunopeptidome med hjälp av en högpresterande Orbitrap och högupplösta fyrdubbla tids-of-flight masspektrometrar6. Följande information anges endast som en indikation, med beaktande av att de olika befintliga tandemmasspektrometriinstrumenten fungerar enligt olika operativa standarder. En kort översikt över stegen diskuteras nedan:

  1. Solubilisera de torkade proverna (från steg 3.2.12) i 50 μL 4% myrsyra (FA).
  2. Ladda tre injektioner på 16 μL för varje prov och separera på en hemgjord omvänd faskolonn (150-μm i.d. med 250 mm längd, Jupiter 3 μm C18 300 Å) med en gradient från 5%-30% ACN-0,1% FA och ett flöde på 600 nL/min på ett nanoflöde UHPLC ansluten till en MS.
  3. Skaffa varje fullt MS-spektrum med en upplösning på 120000, en AGC på 4 x 105 med automatiskt läge för injektionstiden och spektra med tandem-MS (MS-MS) på de mest rikliga multiplicera laddade prekursorjoner i högst 3 s.
    OBS: Tandem-MS-experiment utförs med hjälp av kollisions dissociation med högre energi (HCD) vid en kollisionsenergi på 30%, en upplösning på 30 000, en AGC på 1,5 x 105 och en injektionstid på 300 ms.
  4. Bearbeta datafilerna från de tre injektionerna/provet med hjälp av en proteomik LC-MS/MS-analysprogramvara (t.ex. PEAKS X) med hjälp av mus- och mänskliga databaser (UniProtKB/Swiss-Prot (2019_09)).
  5. Välj "Ospecificerad enzymrötning" för enzymparametern och 10 ppm respektive 0,01 Da för masstoleranser mot prekursorer respektive fragmentjoner.
    OBS: Variabla modifieringar är deamidation (NQ) och oxidation (M). Alla andra sökparametrar är standardvärdena. Slutliga peptidlistor filtreras med ALC på 80% och med en falsk upptäcktsfrekvens (FDR) på 1 % med hjälp av proteomikerna LC-MS/MS analysprogramvara.

5. Visualisering av immunopeptidomics data

OBS: Kvaliteten på immunpeptidomics data som genereras av MS kan bedömas på flera sätt, som nyligen beskrivits22,23. För att visualisera data och bedöma deras övergripande kvalitet, sammansättning och MHC-specificitet kan MhcVizPipe (MVP) mjukvaruverktyg användas.

  1. Följ alla instruktioner och relaterad dokumentation för att installera och köra MVP-programvaran som finns tillgänglig på Caron Lab GitHubs webbplats24.
    OBS: MVP ger en snabb och konsoliderad bild av provkvalitet, sammansättning och MHC-specificitet. MVP parallelliserar användningen av väletablerade immunopeptidomics algoritmer (NetMHCpan25, NetMHCIIpan26 och GibbsCluster27) och genererar organiserade och lättförståeliga rapporter i HTML-format (HyperText Markup Language). Rapporterna är helt bärbara och kan ses på vilken dator som helst med en modern webbläsare. Mer information om tillägg 1-4 finns i exempel på HTML-rapporter.

Representative Results

Det allmänna arbetsflödet för att isolera MHC-peptidkomplex för analys av immunpeptidomes av MS illustreras i figur 1. Representativa resultat för verifiering av antikroppens pärlbindande verkningseffektivitet (figur 2) (med Y3 anti-H2Kb-antikroppen) och elutionseffektiviteten hos MHC-peptidkomplexen från pärlorna (figur 3) (med hjälp av anti-HLA-ABC-antikroppen W6/32). Flödescytometribaserade kvantifieringsanalyser21 tillämpades också för att mäta det absoluta antalet MHC-klass I-molekyler per EL4-cell (H2Kb och H2Db) och JY-cell (HLA-ABC), vilket visas i figur 4A.

Den intra- och inter-individuella reproducerbarheten av resultaten med hjälp av det aktuella protokollet visas i figur 4B-E. Representativa resultat visas för MHC klass I peptider identifierade från 1 x 108 EL4 celler och 1 x 108 JY celler. Resultaten genererades från två olika labbmedlemmar (användare 1 och användare 2). För användare 1 var det genomsnittliga antalet MHCI-specifika peptider som detekterades från EL4- och JY-celler 1341 respektive 6361; för användare 2, 1933 respektive 7238 (figur 4B,D). Den genomsnittliga variationskoefficienten (CV) för antalet peptider som detekteras över tre olika biologiska replikat/experiment varierar från 1,9%-11% (figur 4B, D). Även om CV: n för antalet peptider som upptäcktes i de tre olika experimenten var relativt små, varierade peptidernas identitet avsevärt (figur 4C, E). Representativa Venndiagram visar faktiskt att andelen peptider som upptäcktes reproducerbart över tre biologiska replikat varierade från 39% (användare 2, EL4-celler) till 63% (användare 1, JY-celler) (figur 4C, E och kompletterande tabell 2).

Värmekartor som genereras av MVP-programvaran visar förväntad MHC-bindningsstyrka hos de identifierade peptiderna med netmhcpan-svitverktygen25,26,28. Två GibbsCluster rutinalternativ, som kallas "Unsupervised GibbsCluster" och "Allele-Specific GibbsCluster", utförs också av MVP för att extrahera MHC peptidbindande motiv. Observera att MVP har begränsningar. Dess primära mål är inte att extrahera allelspecifika motiv och kommentera peptider på ett mycket exakt sätt utan snarare att ge en fågelperspektiv på provernas övergripande kvalitet, sammansättning och MHC-specificitet.

För MHC-klass I-peptider (H2Db och H2Kb) i EL4-celler (figur 5A; övre paneler och kompletterande data 1) visar en representativ värmekarta att 89% av alla detekterade 8-12-mer peptider förutspås vara starka bindemedel (SB: NetMHCpan %Rank <0,5) eller Weak Binders (WB: NetMHCpan %Rank <2) för H2Db eller H2. Sekvenskluster som genereras från 8-12-mer peptider överensstämmer med rapporterade logotyper för H2Db (asparagin vid P5 och Leucin vid P9) och H2Kb (fenylalanin vid P5 och leucin vid P8) (figur 5)29. Det är värt att nämna att ett tredje dominerande motiv (histidin vid P7 och leucin vid P9) samt ytterligare "artefactual" motiv kan observeras med M1-antikroppen (kompletterande data 1). Faktum är att M1-antikroppen är känd för att korsreagera med den icke-klassiska Qa2-molekylen, och därför detekteras Qa2-associerade peptider också av MS (Supplementary Data 1). Här fokuserar figur 5 för enkelhetens skull på att visa de väletablerade peptidbindningsmotiven för de två klassiska H2b-allelerna (dvs H2Db eller H2Kb) uttryckta i EL4-celler.

För humana HLA-klass I-peptider (HLA-ABC) i JY-celler (figur 5A; nedre paneler och kompletterande data 2) visar en representativ värmekarta att 97% av alla upptäckta 8-12-mer peptider förutspås vara SB eller WB för HLA-A * 0201, -B * 0702 eller -C * 0702. Peptider grupperades för att visualisera peptidbindningsmotiv för HLA-A *0201 och -B*0702. Bindningsmotiv för HLA-C*0702 visas inte i figur 5A eftersom C*0702-allelen har en relativt låg uttrycksnivå. Därför var för få C* 0702 peptider isolerade och identifierade för att generera ett representativt C * 0702 motiv. Observera att C*0702-motivet kan visualiseras i andra studier30,31,32 eller från NetMHCpan 4.1 Motif Viewer webbplats33.

För humana HLA-klass II-peptider (HLA-DR) i JY-celler (figur 5B; övre paneler och kompletterande data S3) visar en representativ värmekarta att 70% av alla detekterade 9-22-mer peptider förutspås vara SB eller WB för HLA-DRB1*0404 och -DRB1*1301. Peptidbindningsmotiv för dessa två alleler visas (figur 5B). Observera att de peptidbindande motiven som visas här kanske inte är helt överensstämmelse med de nyligen rapporterade logotyperna för HLA-DRB1*0404 och -DRB1*130134. Denna avvikelse belyser den nuvarande oförmågan hos MVP/NetMHCpan att exakt kommentera peptider till HLA klass II-alleler som är mindre karakteriserade, såsom HLA-DRB1 * 0404 och -DRB1 * 1301 uttryckt i JY-celler. Ytterligare information om klass II peptidbindningsmotiv finns i andra studier34,35 och från NetMHCIIpan 4.0 Motif Viewer webbplats36.

Slutligen, för mus MHC klass II (H2-IAd och H2-IEd) peptider i A20 celler (figur 5B; lägre paneler och kompletterande data 4), visar en representativ värmekarta att 87% av alla upptäckta 9-22-mer peptider förutspås vara SB eller WB för H2-IAd eller H2-IEd. Peptidbindningsmotiv för dessa två alleler är i överensstämmelse med rapporterade logotyper37.

Fullständiga HTML-rapporter som genereras av MVP-programvaran för att bedöma provernas övergripande kvalitet och MHC-specificitet finns tillgängliga i kompletterande uppgifter 1-4.

Figure 1
Figur 1: Schematisk av det fullständiga förfarandet för isolering av MHC klass I- och II-peptider. (A-B)100 miljoner celler pelleteras och lyseras med 0,5% Chaps buffert. (C) Celllyteen centrifugeras och supernatanten tillsätts till CNBr-sefarospärlor kopplade till önskad antikropp i förväg och (D) inkuberas 14-18 timmar vid 4 °C. (E) Efter immunocapture överförs pärlorna till en polypropylenkolonn och tvättas, och MHC-peptidkomplexen eluteras med en 1% TFA-lösning. F) Peptiderna avsaltas och elteras med hjälp av en C18-kolumn. (G) Därefter är peptider hastighetsvac torkade och analyseras av tandemmasspektrometri. (H) Kvaliteten på de isolerade MHC-peptiderna klass I och II kan bedömas utifrån HLA-undertyperna med hjälp av den fritt tillgängliga MhcVizPipe-programvaran. Figur skapad med BioRender.com (NT22ZL8QSL). Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 2
Figur 2: Coomassie gelfärgning för att spåra antikroppsbindningseffektivitet för att sepharose CNBr-aktiverade pärlor. Alikvoter med motsvarande volymer lastades på 12% SDS-PAGE gel följt av Coomassie blå färgning: pärlor + antikropp pre-koppling (1), obunden antikropp efter koppling steg (2), supernatant efter sista tvätt efter koppling (3) och pärlor i kombination med antikroppar (4). Bindningens effektivitet illustreras av en betydande minskning av signalfärgningsintensiteten hos de lätta och tunga kedjorna av H2Kb när pärlor är kovalent bundna (Lane 4) till CNBr-pärlor jämfört med antikroppen före koppling (Lane 1). Figuren har tryckts om och anpassats från bioRxiv38. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 3
Figur 3: Western blotting för spårning av MHC-peptidkomplex efter sur elution från antikroppskopplade CNBr-aktiverade pärlor. Alikvoter som tagits från de steg som anges i protokollet (1/100 av den totala uppmätta volymen) lastades på en 12% SDS-PAGE gel och överfördes till nitrocellulosamembranet: Pärlor + lysate efter immunocapture och sista tvätt (A); supernatant av sista tvätt (B) och MHC-peptidkomplex eluted från pärlor (C). Den starka detektionssignalen av MHC-peptidkomplexen i (C) med anti-HLA-ABC tunga kedjeantikroppar (Abcam, #ab 70328, 1:5000) bekräftade isoleringen av MHC-peptidkomplex efter sur eleuion. Observera att det är möjligt att bedöma andelen MHC-peptidkomplex som inte fångades upp av antikroppskopplade pärlor genom att samla in genomströmningen från steg 3.1.6. En alikvot kan läggas till den västra fläcken (visas inte på denna gel). Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 4
Figur 4: Identifiering av MHC klass I peptider från JY- och EL4-celler. (A) Histogram som visar det absoluta antalet cellytanS H2Db- och H2Kb-molekyler per EL4-cell och av HLA-ABC-molekyler per JY-cell. Kvantifiering utfördes av flöde cytometri. Medelvärdet och standardfelet i medelvärdet erhölls från tre biologiska replikat. (B, D) Histogram som visar medelvärdet och standardavvikelsen för medelvärdet av MHC klass I peptider som identifierats av två oberoende användare (USER_1 [U1] och USER_2 [U2]). Medelvärdet och standardavvikelsen för medelvärdet av MHC-klass I-peptider som detekteras från musens EL4-celler (B) och mänskliga JY-celler (D) visas. Variationskoefficienter (CV) över tre oberoende biologiska replikat anges. (C, E) Venndiagram som visar antalet peptider som upptäcktes reproducerbart i EL4 (C) och JY-celler (E) av två oberoende användare (U1 och U2) över tre oberoende biologiska replikat. Figur 4A har tryckts om och anpassats från bioRxiv38. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Figure 5
Bild 5: Visualisering av immunopeptidomics data med hjälp av MVP-programvaruverktyget. Dataanalys av mus- och humana (A) MHC-klass I- och (B) MHC-klass II peptider. Representativa bindningsbiositetsvärmekartor (vänster paneler) och peptidbindningsmotiv (höger paneler) visas. Värmekartors färger representerar den MHC-bindningstillhörighet som förutspås av NetMHCpan 4.1 (%rank). Starka pärmar är röda (%rank <0,5), Weak Binders är blå (%rank <2) och Non-Binders är gula (%Rank >2). Andel (%) av 8-12mer peptider (A) och 9-22mer peptider (B) som är SB eller WB anges i parentes. Peptidbindningsmotiv genererades av MVP med alternativet "Allele-specific Gibbscluster". Dessa representativa resultat erhölls från 1 x 108 celler och genom att använda följande antikroppar och cellinjer: M1 antikropp och EL4 celler för mus MHC klass I peptider; W6/32 antikropps- och JY-celler för humana MHC-klass I-peptider; M5-antikroppar och A20-celler för MHC-klass II-peptider av mus. L243 antikropps- och JY-celler för humana MHC klass II peptider. Se kompletterande data 1-4 för att komma åt de fullständiga HTML-rapporterna som genereras av MVP-programvaran. Klicka här för att se en större version av den här figuren.

Kompletterande data 1-4: Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande data 1: HTML-rapport genererad av MVP-programvaran från peptider som isolerades från 1 x 108EL4 celler med M1-antikroppen. Tre biologiska replikat visas. Denna rapport är relaterad till figur 4 och figur 5 och representativa peptider förtecknas i tilläggstabell 2.

Kompletterande data 2: HTML-rapport som genereras av MVP-programvaran från peptider som isolerades från 1 x 108JY-celler med hjälp av W6/32-antikroppen. Tre biologiska repater visas. Denna rapport är relaterad till figur 4 och figur 5, och representativa peptider förtecknas i tilläggstabell 2.

Kompletterande data 3: HTML-rapport som genereras av MVP-programvaran från peptider som isolerades från 1 x 108JY-celler med hjälp av L243-antikroppen. Denna rapport är relaterad till figur 5, och representativa peptider förtecknas i tilläggstabell 2.

Kompletterande data 4: HTML-rapport som genereras av MVP-programvaran från peptider som isolerades från 1 x 108A20-celler med M5-antikroppen. Denna rapport är relaterad till figur 5, och representativa peptider förtecknas i tilläggstabell 2.

Tilläggstabell 1: Lista över buffertar. Recept för alla buffertar som används i protokollet beskrivs. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.

Tilläggstabell 2: Representativa förteckningar över peptider med anknytning till H2Db/Kb, HLA-ABC, HLA-DR och H2-IAd/IEd. Denna tabell innehåller förteckningar över representativa MHC-klass I- och II-peptider som är isolerade från mus-EL4- respektive A20-cellinjer och HLA-klass I och II från mänsklig JY-cellinje. Dessa data har deponerats på ProteomeXchange (PXD028633). Klicka här för att ladda ner den här tabellen.

TILLGÄNGLIGHET FÖR DATA:

Datamängder som används i detta manuskript deponerades på ProteomeXchange (http://proteomecentral.proteomexchange.org/cgi/GetDataset): PXD028633.

Discussion

Två muscelllinjer (EL4 och A20), en mänsklig cellinje (JY) och fem kommersiellt tillgängliga antikroppar [M1 (anti-H2Db/Kb), Y3 (anti-H2Kb), M5 (anti-H2-IAd/IEd), W6/32 (anti-HLA-ABC) och L243 (anti-HLA-DR)] testades och validerades i samband med detta protokoll. Andra anti-HLA-antikroppar finns tillgängliga (t.ex. anti-HLA-A2 BB7.2) men testades inte här. Observera att W6/32-antikroppen används i stor utsträckning och den mest etablerade antikroppen i fältet; Det möjliggör isolering av peptider som presenteras av alla HLA-ABC-molekyler hos människor och har tidigare rapporterats av expertlaboratorier att arbeta från olika biologiska källor såsom färska eller frysta vävnader8,39, perifera blodmonukleära celler och benmärgsmonukleära cell40, biopsier41, xenografts41,42, obduktioner43 och plasmaprover44,45.

Utarbetandet av nya lösningar som används i hela protokollet är avgörande. I synnerhet är användningen av färska sura lösningar i glasflaskor avgörande för att undvika efterföljande kontaminering av de prover som analyseras av MS. När protokollet görs för första gången och/eller med en ny antikropp är det dessutom viktigt att bedöma att antikroppen verkligen är kopplad till CNBr Sepharose-pärlor med en blå Coomassie-gel. Tvättstegen i antikroppskopplade pärlor efter immunocapture av MHC-peptidkomplexen är också avgörande för att undvika kontaminering av icke-MHC peptider. Slutligen krävs särskild försiktighet för att inte kassera eluaterna efter eluering av MHC-peptidkomplexen med 1% TFA och eluering av peptiderna från C18-kolonnen med ACN28%/0,1% FA.

Befintliga protokoll som finns tillgängliga i litteraturen beskriver ytterligare steg för att ytterligare rena peptiderna i slutet av isoleringsproceduren, t.ex. peptidfraktionering med olika metoder14,46 eller ultrafiltrering med 10-30 kDa-filter13,47. Det nuvarande protokollet innehåller inga detaljer om dessa ytterligare steg och är tillräckligt för att tillhandahålla högkvalitativa immunpeptidomics data. Sådana steg kan dock övervägas av icke-experter för att modifiera och felsöka för att ytterligare optimera peptidisoleringsproceduren.

Typen av pärlor och typen av sur elutionsbuffert som används för att elta MHC-komplex från pärlorna kan också ändras för felsökning13,14,15,16,17,18,19. I detta avseende är sepharose CNBr-aktiverade pärlor i allmänhet en bra utgångspunkt eftersom de är relativt billiga förutom att visa flexibilitet när det gäller bindning med olika typer av antikroppar. I det nuvarande protokollet visade sig sepharose CNBr-aktiverade pärlor fungera relativt bra med fem olika kommersiellt tillgängliga antikroppar (dvs. M1, Y3, W6/32, L243 och M5). Förutom sepharose CNBr-aktiverade pärlor, Protein A eller G eller A / G sepharose 4 Fast Flow pärlor är också lätta att hantera, och även om relativt dyrare, kan generera liknande resultat. En annan faktor att tänka på är antikroppens affinitet för protein A eller G. Dessutom är sepharose magnetiska pärlor också mycket lätta att använda men är relativt dyra. Oberoende av den typ av pärlor som valts av icke-experter uppmuntras det att samla alikvoter i kritiska steg i protokollet och utföra blå Coomassie-färgade SDS-PAGE-geler för att spåra antikroppens bindningseffektivitet mot pärlorna, som visas i figur 2.

En annan viktig faktor som påverkar effektiviteten av MHC peptider isolering avser den typ av sura eleuionsbuffert som används för att isolera MHC-peptidkomplexen från pärlorna. Olika buffertar har rapporterats inklusive 0,1%, 1% eller 10% TFA, 0,2% FA och 10% ättiksyra. 1% TFA var elutionbufferten som fungerade för alla testade antikroppar. Detta steg kan också spåras genom western blotting mot MHC-molekylerna som används för att fånga MHC peptider, som visas i figur 3.

Alla buffertar som innehåller acetonitril (ACN) och/eller trifluoretsyra (TFA) är aggressiva och kan leda till förorening av provet med små molekylära och polymera ämnen såsom mjukgörare vid kontakt med plast. För att undvika sådana problem bereds alla lösningar som innehåller ett organiskt lösningsmedel och/eller TFA dagligen färska och förvaras i en glasflaska fram till användning. Majoriteten av stegen utförs i Protein LoBind plaströr. Dessa rör är speciellt utformade för proteomik och är tillverkade av högsta kvalitet, jungfrulig polypropylen fri från biocider, mjukgörare och latex. De tillverkas också med optimerade, mycket polerade formar utan användning av halkmedel. Dessa försiktighetsåtgärder är viktiga att överväga för att möjliggöra generering av högkvalitativa immunpeptidomics data.

Antikroppen är en viktig begränsning för isolering av MHC-bundna peptider. W6/32-antikroppen möjliggör isolering av peptider som presenteras av alla HLA-ABC klass I-molekyler hos människor och är den mest använda och etablerade antikroppen i fältet. Högupplöst HLA-skrivning av okarakteriserade mänskliga cellinjer eller biospecimens är inte en nödvändighet vid tillämpning av W6/32-antikroppen, men rekommenderas ändå för vissa tillämpningar för att underlätta datatolkning48. HLA/MHC-skrivinformation finns också i offentliga resurser för flera cellinjer och musmodeller49. Förutom W6/32-antikroppen är de fyra andra antikropparna (M1, M5, Y3 och L243) som testades och validerades inom ramen för detta protokoll alla kommersiellt tillgängliga. Å andra sidan har många andra antikroppar som rapporterades i tidigare immunopeptidomics studier inte antagits i stor utsträckning av samhället och är inte kommersiellt tillgängliga eller är tillgängliga genom kulturen av hybridoma cellinjer, vilket är relativt dyrt.

En annan viktig begränsning för isolering av MHC-bundna peptider är mängden startmaterial som krävs. Den mängd som krävs är omvänt proportionell mot uttrycksnivån hos MHC-molekyler på cellytan, som kan kvantifieras med flödescytometri (figur 4A). Celler som uppvisar höga uttrycksnivåer av MHC-molekyler (t.ex. dendritiska celler och hematopoetiska celler i allmänhet) ger i allmänhet högkvalitativa immunpeptidomics data. Expertlaboratorier använder från så låga som 50 miljoner celler50, men 100 miljoner till 1 miljard celler rekommenderas för icke-experter. Användning av vävnad biopsi (<13 mg)41, xenograft42,43, obduktion44 och plasma45,46 prover rapporterades också men är fortfarande utmanande för icke-expert laboratorier. Det totala antalet MHC-associerade peptider som förväntas är också väl dokumenterat för etablerade cellinjer (här mellan ~ 2000 och ~ 10000 peptider beroende på vilken cellinje och antikropp som används), men de absoluta mängderna naturligt presenterade peptider som effektivt dras ner av tekniken förblir omdiskuterade. Tidigare studier uppskattade faktiskt att effektiviteten i isoleringsförfarandet är peptidberoende och kan vara från så lågt som 0,5%-2%51. Andra begränsningar i immunopeptidomics är reproducerbarheten av metoderna och oförmågan hos NetMHCpan svit verktyg att korrekt kommentera peptider till MHC alleler som är mindre karakteriserade. I detta avseende, vidareutveckling och tillämpning av relativt nya dataoberoende förvärv MS-metoder7,32,52, samt nya peptidkluster och MHC peptidbindningsprediktionsalgoritmer31,34,53,54 förväntas förbättra reproducerbarheten och noggrannheten hos peptidanotering i immunpeptidomics. Immunopeptidomics står inför andra begränsningar avseende MS-förvärv och beräkningsanalys av MHC-associerade peptider och täcks någon annanstans1,6,55.

While isoleringen av HLA-ABC-associerade peptider från mänskliga prover med W6/32-antikroppen är väl etablerad och tillämpas i stor utsträckning av många forskargrupper, isoleringen av mus MHC klass I- och II-associerade peptider är relativt mindre etablerad. Därför behövs robusta protokoll för isolering av mus MHC ligands. Här tillhandahåller vi ett protokoll optimerat för isolering av MHC klass I peptider och MHC klass II peptider från två mus cellinjer av C57BL/6 respektive BALB/c ursprung. Specifikt möjliggör protokollet isolering av klass I H2Kb- och H2Db-associerade peptider med M1-antikroppen, liksom klass II H2-IAd och H2-IEd-associerade peptider med M5-antikroppen. Spridning och tillämpning av det nuvarande protokollet bör således underlätta grundläggande och translationell immunopeptidomics forskning i olika musmodeller.

Protokollet kan användas för att upprätta och standardisera ett immunopeptidomics arbetsflöde, samt för att jämföra nya protokoll. Det kan till exempel anpassas och optimeras ytterligare för att utföra immunopeptidomics screening i olika biologiska matriser som sträcker sig från blod / plasma till färsk eller frusen vävnad till FFPE (Formalin-Fixed Paraffin-Embedded). Dessutom kommer protokollet att främja reproducerbarheten inom och mellan laboratorier av provberedningsförfarandet inom immunopeptidomics och förväntas därför finna bred tillämpning i grundforskning och klinisk forskning.

Disclosures

Författarna förklarar att de inte har några konkurrerande ekonomiska intressen.

Acknowledgments

Vi tackar Pierre Thibault, Eric Bonneil, Joël Lanoix, Caroline Côté (Institutet för forskning inom immunologi och cancer, Université de Montréal) och Anthony Purcell (Monash University) för deras insiktsfulla kommentarer. Detta arbete stöddes av finansiering från Fonds de recherche du Québec - Santé (FRQS), Cole Foundation, CHU Sainte-Justine och Charles-Bruneau Foundations, Canada Foundation for Innovation, National Sciences and Engineering Research Council (NSERC) (#RGPIN-2020-05232) och Canadian Institutes of Health Research (CIHR) (#174924).

Materials

Name Company Catalog Number Comments
A20 cell line ATCC TIB-208 mouse B lymphoblast
Acetonitrile, LC/MS Grade FisherScientific A955-4
anti-Human HLA A, B, C (W6/32) - MHC class I BioXcell BE0079
anti-Human/Monkey HLA-DR (L243) - MHC class II BioXcell BE0308
anti-Mouse H2 (M1/42.3.9.8) - MHC class I BioXcell BE0077
anti-Mouse H2-IAd/IEd (M5/114) - MHC class II BioXcell BE00108
anti-Mouse H2Kb (Y3) - MHC class I BioXcell BE0172
BupH Phosphate Buffered Saline Packs (PBS) ThermoFisher 28372 Pouch contents dissolved in a final volume of 500 mL deionized water (FisherScientific, W64)
CHAPS (3-[(3-cholamidopropyl)dimethylammonio]-1-propanesulfonate) EMDMilipore 220201-10MG
CNBr-activated Sepharose Cytivia # 17-0430-01
EL4 cell line ATCC TIB-39 mouse T lymphoblast
epTIPS LoRetention Tips, 1000 µL/Eppendorf FisherScientific 02-717-352 Better results with low retention material
epTIPS LoRetention Tips, 200 µL/Eppendorf FisherScientific 02-717-351 Better results with low retention material
Formic Acid, LC/MS Grade FisherScientific A117-50
Glycine FisherScientific RDCG0250500
Hydrochloric acid solution FisherScientific 60-007-11
JY cell line Sigma Aldrich 94022533-1VL EBV-immortalised B cell lymphoblastoid line
Methanol, LC/MS Grade FisherScientific A456-4
Poly prep chromatography columns (polypropylene column) Bio-Rad 731-1550 referred as polypropylene column in the protocol
Proteases inhibitor ThermoFisher A32963 1 pellet per 10 mL of cell lysis buffer
Qifikit Dako K007811-8
Sodium Bicarbonate Amresco # 0865-1kg
Sodium Chloride FisherScientific MSX04201
Solid phase extraction disk, ultramicrospin column C18 The nest group SEMSS18V capacity of 6–60 µg, max volume of 200 µL
Trifluoroacetic Acid (TFA), LC-MS Grade FisherScientific PI85183
Tris FisherScientific T395-500
Tris-HCl FisherScientific #10812846001
Tube LoBind 1.5 mL/Eppendorf FisherScientific E925000090 Better results with low retention material
Tube LoBind 2 mL/Eppendorf FisherScientific 13-698-795 Better results with low retention material
Water, LC/MS Grade FisherScientific W64

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Vizcaíno, J. A., et al. The human immunopeptidome project: A roadmap to predict and treat immune diseases. Molecular & Cellular Proteomics. 19 (1), 31-49 (2019).
  2. Caron, E., Aebersold, R., Banaei-Esfahani, A., Chong, C., Bassani-Sternberg, M. A case for a human immuno-peptidome project consortium. Immunity. 47 (2), 203-208 (2017).
  3. Arnaud, M., Duchamp, M., Bobisse, S., Renaud, P., Coukos, G., Harari, A. Biotechnologies to tackle the challenge of neoantigen identification. Current Opinion in Biotechnology. 65, 52-59 (2020).
  4. Caron, E., et al. The MHC I immunopeptidome conveys to the cell surface an integrative view of cellular regulation. Molecular Systems Biology. 7 (1), 533 (2011).
  5. Istrail, S., et al. Comparative immunopeptidomics of humans and their pathogens. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (36), 13268-13272 (2004).
  6. Caron, E., Kowalewski, D. J., Koh, C. C., Sturm, T., Schuster, H., Aebersold, R. Analysis of major histocompatibility complex (MHC) immunopeptidomes using mass spectrometry. Molecular & Cellular Proteomics. 14 (12), 3105-3117 (2015).
  7. Caron, E., et al. An open-source computational and data resource to analyze digital maps of immunopeptidomes. eLife. 4, 07661 (2015).
  8. Bassani-Sternberg, M., et al. Direct identification of clinically relevant neoepitopes presented on native human melanoma tissue by mass spectrometry. Nature Communications. 7 (1), 13404 (2016).
  9. Gubin, M. M., et al. Checkpoint blockade cancer immunotherapy targets tumour-specific mutant antigens. Nature. 515 (7528), 577 (2014).
  10. Yadav, M., et al. Predicting immunogenic tumour mutations by combining mass spectrometry and exome sequencing. Nature. 515 (7528), 572-576 (2015).
  11. Laumont, C. M., et al. Noncoding regions are the main source of targetable tumor-specific antigens. Science Translational Medicine. 10 (470), 5516 (2018).
  12. Lill, J. R., et al. Minimal information about an immuno-peptidomics experiment (MIAIPE). Proteomics. 18 (12), 1800110 (2018).
  13. Nelde, A., Kowalewski, D. J., Stevanović, S. Antigen processing, methods and protocols. Methods in molecular biology. 1988, Clifton, N.J. 123-136 (2019).
  14. Purcell, A. W., Ramarathinam, S. H., Ternette, N. Mass spectrometry-based identification of MHC-bound peptides for immunopeptidomics. Nature Protocols. 14 (6), 1687-1707 (2019).
  15. Ebrahimi-Nik, H., et al. Mass spectrometry driven exploration reveals nuances of neoepitope-driven tumor rejection. JCI Insight. 5 (14), 129152 (2019).
  16. Schuster, H., et al. A tissue-based draft map of the murine MHC class I immunopeptidome. Scientific Data. 5, 180157 (2018).
  17. Ritz, D., Gloger, A., Weide, B., Garbe, C., Neri, D., Fugmann, T. High-sensitivity HLA class I peptidome analysis enables a precise definition of peptide motifs and the identification of peptides from cell lines and patients sera. PROTEOMICS. 16 (10), 1570-1580 (2016).
  18. Bassani-Sternberg, M. Mass spectrometry based immunopeptidomics for the discovery of cancer neoantigens. Methods Mol Biol. 1719, 209-221 (2018).
  19. Lanoix, J., et al. Comparison of the MHC I Immunopeptidome Repertoire of B-Cell Lymphoblasts Using Two Isolation Methods. Proteomics. 18 (12), 1700251 (2018).
  20. Kuznetsov, A., Voronina, A., Govorun, V., Arapidi, G. Critical review of existing MHC I immunopeptidome isolation methods. Molecules. 25 (22), 5409 (2020).
  21. Urlaub, D., Watzl, C. Coated latex beads as artificial cells for quantitative investigations of receptor/ligand interactions. Current Protocols in Immunology. 131 (1), 111 (2020).
  22. Ghosh, M., et al. Guidance document: Validation of a high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry immunopeptidomics assay for the identification of HLA class I ligands suitable for pharmaceutical therapies*. Molecular & Cellular Proteomics. 19 (3), 432-443 (2020).
  23. Fritsche, J., et al. Pitfalls in HLA ligandomics - How to catch a li(e)gand. Molecular & Cellular Proteomics. 20, 100110 (2021).
  24. Caron Lab. GitHub. , Available from: https://github.com/CaronLab/MhcVizPipe (2021).
  25. Jurtz, V., Paul, S., Andreatta, M., Marcatili, P., Peters, B., Nielsen, M. NetMHCpan-4.0: Improved peptide-MHC Class I interaction predictions integrating eluted ligand and peptide binding affinity data. The Journal of Immunology. 199 (9), 3360-3368 (2017).
  26. Reynisson, B., Alvarez, B., Paul, S., Peters, B., Nielsen, M. NetMHCpan-4.1 and NetMHCIIpan-4.0: improved predictions of MHC antigen presentation by concurrent motif deconvolution and integration of MS MHC eluted ligand data. Nucleic Acids Research. 48, 449-454 (2020).
  27. Andreatta, M., Alvarez, B., Nielsen, M. GibbsCluster: unsupervised clustering and alignment of peptide sequences. Nucleic Acids Research. 45 (1), 458-463 (2017).
  28. Nielsen, M., et al. NetMHCpan, a method for quantitative predictions of peptide binding to any HLA-A and -B Locus protein of known sequence. PLoS ONE. 2 (8), 796 (2007).
  29. Fortier, M. -H., et al. The MHC class I peptide repertoire is molded by the transcriptome. The Journal of Experimental Medicine. 205 (3), 595-610 (2008).
  30. Marco, M. D., Schuster, H., Backert, L., Ghosh, M., Rammensee, H. -G., Stevanovic, S. Unveiling the peptide motifs of HLA-C and HLA-G from naturally presented peptides and generation of binding prediction matrices. The Journal of Immunology. 199 (8), 2639-2651 (2017).
  31. Sarkizova, S., et al. A large peptidome dataset improves HLA class I epitope prediction across most of the human population. Nature Biotechnology. 38 (2), 199-209 (2019).
  32. Pak, H., et al. Sensitive immunopeptidomics by leveraging available large-scale multi-HLA spectral libraries, data-independent acquisition and MS/MS prediction. 20, 100080 (2021).
  33. Nielson, M. NetMHNetMHCpan 4.1 Motif Viewer. , Available from: http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCpan/logos_ps.php (2021).
  34. Racle, J., et al. Robust prediction of HLA class II epitopes by deep motif deconvolution of immunopeptidomes. Nature Biotechnology. 37 (11), 1283-1286 (2019).
  35. Abelin, J. G., et al. Defining HLA-II ligand processing and binding rules with mass spectrometry enhances cancer epitope prediction. Immunity. 51 (4), 766-779 (2019).
  36. Nielson, M. NetMHCIIpan 4.0 Motif Viewer. , Available from: http://www.cbs.dtu.dk/services/NetMHCIIpan/logos.php (2021).
  37. Sofron, A., Ritz, D., Neri, D., Fugmann, T. High-resolution analysis of the murine MHC class II immunopeptidome. European Journal of Immunology. 46 (2), 319-328 (2015).
  38. Kovalchik, K. A., et al. Immunopeptidomics for Dummies: Detailed Experimental Protocols and Rapid, User-Friendly Visualization of MHC I and II Ligand Datasets with MhcVizPipe. bioRxiv. , (2020).
  39. Schuster, H., et al. The immunopeptidomic landscape of ovarian carcinomas. Proceedings of the National Academy of Sciences. 114 (46), 9942-9951 (2017).
  40. Berlin, C., et al. Mapping the HLA ligandome landscape of acute myeloid leukemia: a targeted approach toward peptide-based immunotherapy. Leukemia. 29 (3), 1-13 (2014).
  41. Rijensky, N. M., et al. Identification of tumor antigens in the HLA peptidome of patient-derived xenograft tumors in mouse. Molecular & Cellular Proteomics. 19 (8), 1360-1374 (2020).
  42. Heather, J. M., et al. Murine xenograft bioreactors for human immunopeptidome discovery. Scientific Reports. 9 (1), 18558 (2019).
  43. Marcu, A., et al. HLA ligand atlas: A benign reference of HLA-presented peptides to improve T-cell-based cancer immunotherapy. Journal for Immunotherapy of Cancer. 9 (4), 002071 (2021).
  44. Shraibman, B., et al. Identification of tumor antigens among the HLA peptidomes of glioblastoma tumors and plasma. Molecular & Cellular Proteomics. 18 (6), 1255-1268 (2019).
  45. Bassani-Sternberg, M., Barnea, E., Beer, I., Avivi, I., Katz, T., Admon, A. Soluble plasma HLA peptidome as a potential source for cancer biomarkers. Proceedings of the National Academy of Sciences. 107 (44), 18769-18776 (2010).
  46. Demmers, L. C., Heck, A. J. R., Wu, W. Pre-fractionation extends, but also creates a bias in the detectable HLA class Ι ligandome. Journal of Proteome Research. 18 (4), 1634-1643 (2019).
  47. Kowalewski, D. J., Stevanović, S. Antigen processing,. Methods and Protocols. 960, 145-157 (2013).
  48. Bentley, G., et al. High-resolution, high-throughput HLA genotyping by next-generation sequencing. Tissue Antigens. 74 (5), 393-403 (2009).
  49. Boegel, S., Löwer, M., Bukur, T., Sahin, U., Castle, J. C. A catalog of HLA type, HLA expression, and neo-epitope candidates in human cancer cell lines. OncoImmunology. 3 (8), 954893 (2014).
  50. Klaeger, S., et al. Optimized liquid and gas phase fractionation increases HLA-peptidome coverage for primary cell and tissue samples. Molecular & Cellular Proteomics. 20, 100133 (2021).
  51. Hassan, C., et al. Accurate quantitation of MHC-bound peptides by application of isotopically labeled peptide MHC complexes. Journal of Proteomics. 109, 240-244 (2014).
  52. Ritz, D., Kinzi, J., Neri, D., Fugmann, T. Data-independent acquisition of HLA Class I peptidomes on the Q exactive mass spectrometer platform. Proteomics. 17 (19), (2017).
  53. O'Donnell, T. J., Rubinsteyn, A., Laserson, U. MHCflurry 2.0: Improved pan-allele prediction of MHC Class I-presented peptides by incorporating antigen processing. Cell Systems. 11 (1), 42-48 (2020).
  54. O'Donnell, T. J., Rubinsteyn, A., Bonsack, M., Riemer, A. B., Laserson, U., Hammerbacher, J. MHCflurry: Open-source Class I MHC binding affinity prediction. Cell Systems. 7 (1), 129-132 (2018).
  55. Faridi, P., Purcell, A. W., Croft, N. P. In immunopeptidomics we need a sniper instead of a shotgun. Proteomics. 18 (12), 1700464 (2018).

Tags

Biokemi nummer 176
Immunopeptidomics: Isolering av mus och mänskliga MHC klass I- och II-associerade peptider för massspektrometrianalys
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Sirois, I., Isabelle, M., Duquette,… More

Sirois, I., Isabelle, M., Duquette, J. D., Saab, F., Caron, E. Immunopeptidomics: Isolation of Mouse and Human MHC Class I- and II-Associated Peptides for Mass Spectrometry Analysis. J. Vis. Exp. (176), e63052, doi:10.3791/63052 (2021).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter