Summary
Integrativ toolkit til analyse af cellulære signaler (iTACS) automatiserer processen med samtidig at måle en lang række kemiske og mekaniske signaler i klæbende celler. iTACS er designet til at lette samfundsdrevet udvikling og gøre det muligt for forskere at bruge alle platformsfunktioner uanset deres uddannelsesmæssige baggrund.
Abstract
Kvantitativ vurdering af cellulære kræfter og bevægelse avancerede betydeligt i løbet af de sidste fire årtier. Disse fremskridt dannede rammen om at undersøge indsigtsfulde mekaniske signalprocesser i cellekultursystemer. Men feltet står i øjeblikket over for tre problemer: manglende kvalitetsstandardisering af de erhvervede data, tekniske fejl i dataanalyse og visualisering, og måske vigtigst af alt forbliver teknologien stort set uden for rækkevidde for almindelige cellebiologilaboratorier. For at overvinde disse begrænsninger udviklede vi en ny eksperimentel platform - Integrativ Toolkit til analyse af cellulære signaler (iTACS). iTACS består af to komponenter: Anskaffelses- og træningsmodul (AcTrM) og Analyse- og Visualiseringsmodul (AnViM). AcTrM er baseret på μManager - en NIH-ImageJ-baseret mikroskopstyringssoftware - og letter brugerens selvtræning og automatisering af fælles billedopkøbsprotokoller. AnViM er baseret på NIH-ImageJ og letter brugervenlig automatisering af dataanalyse og indsigtsfuld visualisering af resultater. Disse eksperimenter involverer dyrkning af klæbende celler på hydrogeler, billeddannende fiducial markører indlejret i hydrogel, og endelig udvinding fra disse billeder en omfattende mekanisk karakterisering af cellerne. I øjeblikket gør iTACS det muligt for brugeren at analysere og spore en bred vifte af egenskaber, herunder morfologi, bevægelse, cytoskeletale kræfter og fluorescens af individuelle celler og deres naboregion. Problemet med standardisering af høj kvalitet blev behandlet i AcTrM med en referencebilledstyret refokuseringsteknik. De tekniske problemer i dataanalyse blev behandlet i AnViM med en flerstrenget billedsegmenteringsprocedure, en brugervenlig tilgang til at identificere grænseforhold og en ny cellulær ejendomsbaseret datavisualisering. AcTrM er designet til at lette den enkle transformation af grundlæggende fluorescensmikroskoper til eksperimentelle cellemekanikrigge, og AnViM er udstyret til at give brugerne mulighed for at måle cellulære mekaniske signaler uden at kræve en teknisk baggrund. iTACS vil være tilgængelig for forskersamfundet som en open source-pakke med community-drevne udviklingsfunktioner.
Introduction
Almindeligt anvendte optiske billed- og dataanalyseværktøjer anvender hardware- og softwareteknologier, der er næsten forældede. Forsinkelsen i oversættelse og implementering af fremskridt inden for elektroniske enheder, beregningsmæssige tilgange og matematisk analyse til almindelige eksperimentelle cellebiologiværktøjer er en stor begrænsning på væksttempoet i vores viden om cellulær fysiologi. I øjeblikket finder cellebiologiforskere molekylærbiologiske værktøjer inden for rækkevidde, men værktøjer baseret på tekniske principper er uden for rækkevidde. Et sådant teknisk-principper-baseret værktøj er Monolayer Stress Microscopy (MSM)1,2. Mens MSM er blevet tilpasset og undersøgt i forskellige laboratorier over hele verden, er brugen primært begrænset til laboratorier med teknisk ekspertise3,4,5,6,7,8,9.
NIH-ImageJ er et af de mest populære open source-værktøjer blandt cellebiologiforskere10. Bruger samfund bidrag-drevet fremskridt har været centralt for sin popularitet11,12. ImageJ har funktioner, der giver brugerne mulighed for at udvikle programmer med en blanding af et avanceret programmeringssprog og forenklede scripting tilgange. Disse funktioner gør det lettere for brugere med grundlæggende programmeringsviden at implementere, tilpasse og fremme ethvert nyt bidrag til softwaren. Med udgangspunkt i disse kvaliteter af NIH-ImageJ har vi udviklet Integrative Toolkit til at analysere cellulære signaler (iTACS), som muliggør en billig integration af ønskede hardware- og softwareværktøjer for at automatisere målingen af en lang række kemiske og mekaniske signaler på tværs af klæbende celler11,12.
iTACS består af to komponenter: Anskaffelses- og træningsmodul (AcTrM) og Analyse- og Visualiseringsmodul (AnViM). AcTrM er bygget på μManager - en NIH-ImageJ-baseret billedopsamlingsprogram - for at give brugerne mulighed for at oprette time-lapse målinger af traditionelle optiske egenskaber og en række fysiske egenskaber af klæbende celler i flere samples12. AcTrM letter brugertræning gennem kortfattede anvisninger, der er inkluderet i den grafiske grænseflade. Derudover har det et nyt træk ved referencebilledebaseret autofokusering, der er designet til at lette realtidsmålinger af fysiske kræfter og muliggøre kvalitetsstandardisering af de erhvervede data.
AnViM er bygget på ImageJ plugins, fremskyndet software og filhåndtering scripts, der giver brugerne mulighed for kvantitativt at vurdere mere end 50 egenskaber, herunder cellulære form, størrelse, orientering, hastighed og retning af bevægelse, trækkraft udøves på den ekstracellulære matrix (ECM), og på tilstødende celler, sammentrækning og forskydning øjeblikke af både individuelle klæbende celler og deres nærliggende region. AnViM gør det lettere for brugerne at kvantificere de cellulære fysiske egenskaber uden at mestre den underliggende tekniske baggrund11. Desuden muliggør det dataanalyse i en interaktiv eller batchbehandlingstilstand. Det genererer varmekort, der afslører rumlig variation og grafer, der viser den tidsmæssige variation af de enkelte cellers egenskaber.
I et typisk eksperiment, brugeren kulturer celler på en elastisk hydrogel med passende ekstracellulære matrix proteiner på den øverste overflade og to typer af indlejrede fluorescerende markører. Væsentlige, billeder af disse fluorescerende markører før og efter dyrkning af cellerne er tilstrækkelige til at kvantificere kræfterne i og omkring de enkelte celler2,13. AnViM kortlægger disse resultater på individuelle celler i klæbenglyngen og genererer indsigtsfulde billeder og grafer.
Protocol
BEMÆRK: Prøver, der undersøges ved hjælp af iTACS-platformen, er celler, der klæbes til et blødt substrat. Protokollen til vurdering af mekaniske og kemiske signaler er opdelt i to sekventielle dele: Anskaffelses- og træningsmodul (AcTrM) og Analyse- og Visualiseringsmodul (AnViM).
1. Erhvervelse og uddannelse modul (AcTrM)
BEMÆRK: AcTrM automatiserer processen med dataindsamling og bruger selvtræning. Før dataindsamling skal du forberede et blødt substrat, der er i stand til at give de oplysninger, der er nødvendige for at kvantificere de kræfter, som celler udøver på det.
- Hydrogel forberedelse
BEMÆRK: Målet her er at forberede en 1.250 Pa forskydning modulus, ca 100 μm tykkelse, og 22 mm diameter polyacrylamid (PAA) hydrogel.- Forbered polyacrylamidopløsning ved at følge metoden Yeung et al. og støbt hydrogelerne følgende trin beskrevet af Trepat et al.14,15. En undtagelse fra proceduren er, at perlerne indlejret umiddelbart under cellerne er 0,5 μm i diameter og udsender gul fluorescens.
- Spring trinnet med at fastgøre 2 μm perler til dækglasset, hvis visningsområdet forventes at have et stort cellefrit område.
BEMÆRK: Hydrogel forberedelse protokol er nu temmelig etableret i marken16. I hele den efterfølgende beskrivelse omtales de 0,5 μm perler som »topperler«, og de 2 μm perler betegnes som »bundperler«. De nederste perler er dog valgfrie, hvor det afbildede område indeholder et stort cellefrit område. Den øverste perle mønster fra en sådan cellefri region vil tjene formålet med den nederste perle mønster. - Monter hydrogel med indlejrede fluorescerende perler på mikroskopstadiet.
- Tillad 15-20 min for temperaturen på pladen for at opnå en steady-state.
BEMÆRK: Pladens øverste overflade er funktionaliseret med ekstracellulære matrixproteiner, men cellerne er endnu ikke sået på hydrogelen.
- Erhvervelse af referencebillede
- Del 1: Oprette en stillingsliste
BEMÆRK: Manuel input i dette trin omfatter at følge AcTrM-prompterne om at vælge placeringer med den bedste perlefordeling. Der bruges ingen tidligere oprettede filer i dette trin. De vigtigste nye mapper, der produceres i dette trin, omfatter mapperne 't0imgs', 'tnimgs' og 'textfiles', og den producerede fil indeholder positionlistefilen. Se figur 2 for den visuelle beskrivelse af følgende trin, der styrer oprettelsen af en stillingsliste ved hjælp af AcTrM. Det demonstrerede eksempel indsamler data ved 20x forstørrelse.- Start μManager 2.0 - Beta.
- Kør AcTrM ved at klikke på knappen AcTrM.bsh i vinduet IMBL Resources .
- I vinduet Definer anskaffelsesegenskaber skal du vælge det relevante mål, tolerance for nøjagtigheden af lateral position (dvs. XY) opsving, trinstørrelse af grov og raffineret refokusering (dvs. z) operation og værdien af acceptabel billedkorrelationskoefficient for fokusgendannelse.
BEMÆRK: En finere tolerance for lateral position opsving vil bremse position opsving, men en betydelig tolerance vil kræve position korrektion under dataanalyse og kan forårsage vanskeligheder i fokus opsving. En mindre trinstørrelse vil bremse refokuseringsoperationen, men en meget høj trinstørrelse kan forårsage hurtig bevægelse med muligheder for at gå glip af fokus. - Vælg Frisk anskaffelse i vinduet AcTrM - Trin 0 for at oprette en stillingsliste.
BEMÆRK: Vinduet med titlen AcTrM - Trin 1 viser alle de næste vigtige trin. Disse trin omfatter flytning af scenen, justering af fokus og klik på knapper i μManager. Disse trin er en rettesnor for opbygningen af listen over stillinger, der er egnede til dataindsamling. - Klik på Live in Micromanager for at visualisere prøverne til manuelle justeringer, der er angivet i vinduet AcTrM - Trin 1 .
- Følg trinnene i dette vindue.
- Nu erhverve billedet af perlerne. Vælg den relevante kanal til de øverste perler.
- Sørg for at se på de nederste perler så godt. For at gøre dette skal du vælge kanalerne til de nederste perler. Et sløret billede af bundperler ses.
BEMÆRK: Kanaler kan skiftes fra den forudindstillede rullemenu i hovedvinduet i μManager. Hvis de nederste perler anvendes i eksperimentet, skal du sikre dig, at de er til stede i den valgte position. Disse perler vil virke slørede. - Når du vælger den relevante placering, skal du klikke på Marker i vinduet Placeringsliste for at gemme placeringen.
BEMÆRK: Den bedste position defineres ved en tæt og ensartet fordeling af de øverste perler, der er indlejret umiddelbart under den øverste overflade (dvs. topperler) og mindst to perler fastgjort til dækglasset (dvs. bundperler) (supplerende figur S1). Fokus opsving er hurtigere, hvis de nederste perler vises som store, out-of-fokus ringe. Men hvis eksperimenter udføres i en position uden behov for fokus eller lateral position opsving, ignorere instruktioner relateret til de nederste perler billede. - Følg trin 6-9, der er beskrevet i figur 2 , for at medtage yderligere placeringer på listen.
BEMÆRK: Vælg et par ekstra positioner, så en runde eliminering kan give mulighed for de bedste positioner valgt på pladen.
- Del 2: Erhvervelse af referencebilleder
BEMÆRK: Dette trin omfatter ikke nogen manuel input. Tidligere oprettede nøglefiler, der bruges i dette trin, omfatter 'textfiles/*.pos'. De vigtigste nye filer og mapper, der produceres i dette trin, omfatter dem i mapperne 't0imgs' og 'tnimgs'. Se figur 3 og supplerende figur S2 for den visuelle beskrivelse af følgende trin, der styrer erhvervelsen af referencebilleder ved hjælp af AcTrM. Vinduet AcTrM - Trin 2 viser også alle de vigtigste trin.- Følg de trin, der er angivet i vinduet AcTrM - Trin 2 , skal du foretage valgmulighederne i vinduet Flerdimensional anskaffelse . For eksempel, for at udføre en lang tid bortfalder, angive et antal billeder, der skal tages, skal du vælge den første kanal som fase kanal, og derefter vælge den næste for de øverste perler og den ene efter det er for bund perler. Klik på Luk i vinduet Flerdimensionel anskaffelse , og klik derefter på OK i vinduet ActrM - Trin 2 .
- I vinduet AcTrM - Trin 3 skal du vælge at aktivere den referencebilledebaserede XYZ-positionsgendannelse. Valget er generelt ja. Men hvis billeder erhverves på en position uden plads til fokus eller fase drift, vil valget i AcTrM - Trin 3 vindue være Nej.
- I vinduet AcTrM - XYZ Recovery Options skal du indstille kanalen til grov XYZ-gendannelse, om du vil udføre raffineret XYZ-gendannelse, region og kanal til raffineret XYZ-gendannelse og retningen til at begynde at fokusere igen (supplerende figur S4). Når acTrM er færdig, vil den anskaffe referencebilleder.
BEMÆRK: Typiske valg for kanalen vil være den nederste perler kanal. XYZ opsving fungerer bedst, når de udføres med det fulde billede i den aktuelle implementering. Referencebilleder vil typisk omfatte et transmitteret lysbillede af hydrogel, et fluorescerende billede af topperler og et fluorescerende billede af de nederste perler. Hvert billedsæts indhold kan variere afhængigt af de valg, der er foretaget i vinduet Flerdimensional anskaffelse . Alligevel vil softwaren erhverve referencebilledet, der er indstillet på hver position bestemt i figur 2. I slutningen af dette trin oprettes der tre mapper i den valgte mappe: 't0imgs', 'tnimgs' og 'textfiles'. Mappen 't0imgs' indeholder referencebilleder i det format, der genkendes af μManager og bruges i efterfølgende trin. Mappen 'tnimgs' indeholder separate TIFF-billeder med filnavnene 'c0_p0_t0.tif', 'c1_p0_t0.tif' osv. Her står 'c' for kanalen, 'p' står for positionen, og 't' står for tiden. Efter disse bogstaver følger henholdsvis kanalnummeret, positionnummeret og rammenummeret. Mappen 'textfiles' indeholder placeringslisten i XML-format og brugervalg til billedopsamling og placeringsgenoprettelse.
- Del 1: Oprette en stillingsliste
- Cellesåning og vækst
BEMÆRK: iTACS-platformen har fleksibilitet til at rumme prøveforberedelsesprotokoller, der anvendes til fælles in vitro-vurdering af klæbende cellers mekaniske adfærd, herunder sparsomme celler, fuldt sammenflydende monolag, netværksdannelsesanalyse og monolag med huller eller betydelige huller.- Kultur rotte lungemikrovaskulære endotelceller til sammenløb i en kolbe17,18.
- Tag cellerne af ved hjælp af trypsin. Brug cellerne i et kulturmedium, der indeholder 10 % føtalt kvægserum, til en koncentration på 1 x 106 celler/mL.
- Placer en 5 μL dråbe af de ophængte celler på en delvist tør hydrogel overflade og placere den i cellekultur inkubatoren.
BEMÆRK: Efter 2 dage i kulturmediet, der indeholder 10% fosterkvægsserum, danner cellerne i dråben en overfyldt ø af celler1.
- Automatiseret billedopsamling for det resterende eksperiment
BEMÆRK: Manuel input til dette trin omfatter at følge AcTrM-prompterne for at genoptage afbildningsopsamlingen. De tidligere oprettede filer, der bruges af dette trin, omfatter 'textfiles/*.pos' og bundperlebilledfiler i mappen 't0imgs'. De vigtigste nye filer, der produceres i dette trin, omfatter opdaterede positionlistefiler og billeder 'tnimgs/*_t* .tif'.- Sørg for, at mikroskopets miljøkontrolsystem når stabile vævskulturforhold.
- Monter forsigtigt pladen med dyrkede celler på mikroskopstadiet.
- Tillad 15-20 min for temperatur og fugtighed til at stabilisere.
BEMÆRK: Se figur 4 for den visuelle beskrivelse af følgende trin, der styrer erhvervelsen af billeder til det resterende eksperiment ved hjælp af AcTrM. - Start μManager 2.0 - Beta.
- Kør AcTrM ved at klikke på knappen AcTrM.bsh i vinduet IMBL Resources .
BEMÆRK: Ignorer de valg, der er foretaget i vinduet Definer egenskaber for anskaffelse, men brug de valg, der blev foretaget i forrige trin. - Vælg Fortsæt midlertidigt afbrudt anskaffelse i vinduet AcTrM - Trin 0.
- Vælg den forstørrelse og mappe, der er identificeret i vinduet Multidimensionel anskaffelse i det tidligere trin, hvor datamapper ('t0imags', 'tnimgs' og 'textfiles' blev gemt.
BEMÆRK: Titlen på vinduet hjælper brugeren med at vælge den relevante mappe. - I vinduet Omplacering af pladen skal du vælge valg til omplacering af pladen (tre ikke-lineære positioner) sammen med den kanal, der bruges til at flytte.
BEMÆRK: Gemte billeder vil blive set i kameraet. Hvis overlappende billeder vises som et rødt, grønt og sort farvebillede, skal du udføre manuel justering. - Klik på Accepter for at fortsætte med købet.
BEMÆRK: Dette trin overvinder de små skift fra uigenkaldeligheden af pladejustering, når pladen monteres igen på mikroskopstadiet. Følg AcTrM beder om at fremskynde justering på hver af de tre positioner ved at vise et sammensat billede af referencebilledet vist med rødt (typisk af de nederste perler) og billedet i øjeblikket observeret gennem målet vist med grønt. Kom den grønne tilstrækkeligt tæt på røde blade mindre arbejde for softwaren. Når overlapningen er perfekt, vises det sammensatte billede gult og sort. Tilstrækkelig tæt er typisk, når de samme bundperler er synlige i både røde og grønne billeder, og de tilsvarende røde og grønne out-of-focus ringe rører hinanden. Når pladens repositionering er færdig, tager AcTrM scenen til hver valgt position og genopretter XYZ-positionen ved at matche referencebilledet med det, der i øjeblikket ses gennem kameraet. Den første laterale (XY) position matches, og derefter er fokus (Z) matchet. Hård genopretning efterfølges af raffineret genopretning af positionen og fokus. Opdateringer af eksperimentets aktuelle status vises på skærmen via et vindue i fire dele, der vises i supplerende figur S3. De erhvervede billeder gemmes i mappen 'tnimgs' efter '*_t1.tif', '*_t2.tif', hvilket angiver tidstallet for billedsættet. Hvis XYZ-gendannelse identificerer en opdateret placering, genereres og gemmes den nye placeringsliste i mappen 'textfiles'.
2. Analyse og Visualisering Modul (AnViM)
- Opsætning af automatiseret dataanalyse
BEMÆRK: Manuel input i dette trin omfatter identifikation af placeringen af mappen 'tnimgs'. De tidligere oprettede filer, der bruges i dette trin, omfatter 'tnimgs/*.tif'. De vigtigste nye filer og mapper, der produceres i dette trin, omfatter mappen 'analyse' i samme overordnede mappe som 'tnimgs' og mapper for hver position 'analyse/p*'. Inden for hver 'analyse /p*' opretter dette trin en ny '* .tif' billedfiler inden for 'phs' og 'tny' mapper. Disse billeder er beskåret og afdriftet billeder af celler og top perler. De andre oprettede filer omfatter 'analyse/analyseValg.txt', som viser analysevalg, 'analyse/p*/skipAnalysis.txt', som viser tilfælde, hvor analysen springes over på grund af betydelig allerede eksisterende drift, og 'analyse/p*/part_shift_values_pixel_degree.dat', som viser anslåede driftsværdier. AnViM ændrer ikke de rå data i mappen 'tnimgs'. Se Figur 5 for at få en visuel beskrivelse af følgende trin, der styrer oprettelsen af automatiseret dataanalyse ved hjælp af AnViM.- Start Fiji-softwaren, og vælg den første mulighed i rullemenuen MSM , der er mærket som MSM - forbehandling.
- Brug filbrowserdialogboksen til at vælge den mappe, der indeholder mappen 'tnimgs', som indeholder de analyserede data.
- Definer kanalen for billederne. I kølvandet på retningslinjerne fra supplerende figur S5 skal du identificere kanalnumrene på cellernes transmitterede lysbillede (cellernes fasekontrastbillede), bundperlers billede og billedet af topperler. Følgende tre afkrydsningsfelter ('Flyt filer til positionsmappen', 'Do additional correction for rigid motion' og 'Crop data and save in position folder') kontrolleres typisk. Endelig definere tolerance for at afvise stærkt drev data, pixel størrelse, og sider af billedet, hvor cellerne krydser.
- Svar på prompten for at øge lysstyrken og kontrasten i de nederste perlebilleder, så perlerne vises fremtrædende. Juster dette ved hjælp af skyderen i menuen, og klik på OK.
- Udfør nu position korrektion for at slippe af med skift, hvis nogen. Når det er gjort, oprettes der en analysemappe.
BEMÆRK: Kontrastforbedring er typisk ikke nødvendig, men denne bestemmelse er tilgængelig for eksperimenter, hvor eksponering for lasere skal minimeres. Efter dette valg kopierer AnViM filerne fra mappen 'tnimgs' til mappen 'analyse'. De filer, der svarer til hver position, gemmes i mapperne 'analyse/p0, analyse/p1' osv. Inden for hver af disse position mapper, AnViM gør 'cels', 'defs', og 'refs' mapper, der indeholder den oprindelige transmitterede lys billede, top perler billeder, og bund perler billeder, henholdsvis (supplerende figur S6). AnViM analyserer derefter stiv bevægelse i billederne af de nederste perler og skaber en 'phs' mappe, der indeholder et korrigeret transmitteret lysbillede af cellerne og en 'tny' mappe, der indeholder opdaterede topperler billeder. Endelig gemmes brugervalg af kanaler, operationer, tolerance, pixelstørrelse og grænsekrydsning i filen 'analysisChoices.txt' (supplerende figur S6).
- Kvantificering af deformation af hydrogel og monolayer
BEMÆRK: Det er vigtigt at bemærke, at kvantificering af bevægelse fra en sekvens af billeder er et hurtigt udviklende felt19. Teknologien er konstant optimeret til funktioner, herunder hastighed, nøjagtighed, specifikke funktioner i de rå billeder og specifikke deformationsmønstre. Derfor er det sandsynligt, at nogle brugere kan bruge en anden deformation kvantificering tilgang end den, der præsenteres her.-
Del 1: Kvantificering af hydrogel deformation
BEMÆRK: Manuelle input i dette trin omfatter identifikation af datamappe og valg af gitteropløsning. De tidligere oprettede filer, der bruges i dette trin, omfatter 'p*/tny/*.tif'. De vigtigste nye filer, der er produceret i dette, omfatter 'p*/displacement/*_disp.dat', der viser forskydningsvektorer på hydrogelens øverste overflade. Se figur 6 for den visuelle beskrivelse af følgende trin til at engagere, via AnViM, partikelbilledet Velocimetry analyse på toppen perler billeder20.- Start Fiji-softwaren, og vælg MSM - Gel Deformation i rullemenuen MSM.
- Herfra skal du vælge den indstilling, der passer til eksperimentet.
- Brug dialogboksen filbrowser til at vælge den overordnede mappe i den 'analyse'-mappe, der indeholder de analyserede data.
- Vælg den relevante vinduesstørrelse, støjniveau og tærskel (supplerende figur S7)20 i vinduet Parametre til beregning af geldeformation.
BEMÆRK: Resultaterne gemmes i en nyoprettet 'forskydningsmappe' i hver positionsmappe 'analyse/p0, analyse/p1' osv. Det er her, alle outputfilerne er gemt.
-
Del 2: Kvantificering af monolagsdeformation
BEMÆRK: Manuelle input i dette trin omfatter identifikation af datamappen og valg af gitteropløsning. De tidligere oprettede filer, der bruges i dette trin, omfatter 'p*/tny/*.tif'. De vigtigste nye filer, der produceres i dette, omfatter 'p*/hastighed/*_vel.dat', der viser cellernes bevægelsesvektorer. Se figur 7 for den visuelle beskrivelse af de trin, der via AnViM skal aktivere partikelbilledanalysen velocimetri på de øverste perler billeder20. Proceduren svarer til den, der følges for kvantificering af hydrogeldeformation og vælger MSM - Cellular Motion fra MSM-rullemenuen . Resultaterne gemmes i en nyoprettet 'hastighed' mappe inden for hver position mappe 'analyse / p0', 'analyse / p1', osv.
-
Del 1: Kvantificering af hydrogel deformation
- Kvantificering af celle-ECM og cellecellekræfter
BEMÆRK: Manuel input i dette trin omfatter identifikation af datamappen, angivelse af hydrogelstivhed og reaktion på cellulære klyngesegmenteringsmeddelelser for at registrere celler fra no-cell-området. De tidligere oprettede filer, der bruges i dette trin, omfatter 'p*/displacement/*_disp.dat'. De vigtigste nye filer, der er udarbejdet i dette trin, omfatter: »p*/traction/*_trac.dat«, som opregner de kræfter, som cellerne udøver på hydrogelen; »p*/traction/*_domain.dat«, som viser placeringen af gitterpunkter, der indeholder celler og inputfiler 'p*/traction.in, p*/clusterInput.txt' og 'p*/prestress.in', der registrerer brugervalg for dette trin. Efter den første kvantitative vurdering af celle-ECM og cellecellekræfter er der udviklet flere variationer af teknikken1,15. Variationerne fokuserer på særlige tilfælde af substrater, celler, eksperimentelle tilstande eller numeriske værktøjer7,8,21,22. Se figur 8 for den visuelle beskrivelse til at engagere via AnViM, Fourier Transform Traction Microscopy, og Monolayer Stress Mikroskopi analyse på hydrogel deformation data1,2,15.- Start Fiji-softwaren, og vælg MSM - Cell-ECM og Cell-Cell Forces (tredje mulighed i rullemenuen) fra rullemenuen MSM .
- Brug filbrowserdialogboksen til at vælge den overordnede mappe i mappen 'analyse', der indeholder mapperne 'tnimgs' og 'analyse', der indeholder analyserede data. Klik på Vælg.
- I vinduet Parametre for Beregning af cellulære kræfter skal du indtaste forskydningsmodulus , tykkelsen af hydrogelen og det forventede støjniveau. Vælg OK. Dette gør det muligt at udføre trækkraft via MATLAB-funktionen.
BEMÆRK: Efter disse input beregner AnViM celle-ECM-kræfter. - Derefter skal du angive, om monolag er sammenflyttet. Hvis hele cellebilledet er dækket af celler, er svaret Ja. I så fald beregnes cellecellekræfterne på tværs af hele rammen. På den anden side, hvis en del af billedet ikke har celler, er svaret nej. I så fald skal du følge AnViM-prompter for at lette segmentering af det billedområde, der indeholder celler.
- Hvis svaret er nej, skal du manuelt tegne en polygon rundt om det ikke-celleobjekt, når softwaren beder om det, og derefter vælge en eller flere metoder til segmentering. Softwaren vil bede om farven (sort eller hvid) af cellerne.
- Markér indstillingen Udfyld pletter automatisk i softwaren, og klik på OK.
BEMÆRK: Trinene til segmentering af et ikke-sammenflydende monolag vil blive dækket i første del af 'afsnit 2.4. Celle-ECM-kræfter gemmes i '*_trac.dat' filer i en nyoprettet mappe 'trækkraft' i hver position mappe, og input til celle-ECM kraft beregning software gemmes i filen 'traction.in' (supplerende figur S8). Cellecellekræfter gemmes i '*_prestress.dat' filer i en nyoprettet mappe 'prestress' i hver positionsmappe, og inputtet til cellecellekraftberegningssoftwaren gemmes i filen 'prestress.in' (supplerende figur S9).
- Tilknytning af gitterpunktværdier på individuelle celler
BEMÆRK: Et af de nuværende fokuspunkter i iTACS er at indføre en enkel tilgang til fortolkning af de målte mekaniske signaler i marken. Denne tilgang er gavnlig for at undersøge mekaniske interaktioner mellem naboceller i en klynge18. Samlet set er de egenskaber, der er kvantificeret indtil nu, på regelmæssigt fordelte gitterpunkter på tværs af celleklyngen. Disse data identificerer median-, middel- og standardafvigelse af udvalgte egenskaber inden for de enkelte cellers morfologiske grænse og tildeler dem som cellulære fysiske egenskaber/signaler. Fra disse bruges standardafvigelsen til at angive variabilitet, forskellen mellem middelværdi og median bruges til at angive fordelingens art, og medianværdien bruges til at angive cellernes overordnede tilstand for de valgte egenskaber.- Del 1: Segmentering af det billedområde, der indeholder celler
BEMÆRK: Manuel input til dette trin omfatter identifikation af datamappe og svar på segmenteringsmeddelelserne for at registrere celler fra området uden celler. De tidligere oprettede filer, der bruges i dette trin, omfatter 'p*/phs/*.tif'. De vigtigste nye filer, der produceres i dette trin, omfatter 'p*/phs/bwImages/*.tif', som er binære billeder, der adskiller celleområder fra områder uden celler, 'p*/phs/textResults/frameNum_percentHealed.txt', som viser procent billedareal, der er dækket af celler i hver forekomst, og 'p*/clusterInput.txt', som registrerer brugervalg, der er angivet i AcTrM-grænsefladen. Se Figur 9 for at få en visuel beskrivelse af følgende trin for at segmentere det billedområde, der indeholder celler. Denne del skal udfyldes, før cellecellekræfterne beregnes. I så fald behøver disse trin ikke at blive gentaget. Hvis disse trin udføres før cellecellekraftberegningerne, anmodes der heller ikke om dem i begyndelsen af kraftberegningerne.- Start Fiji-softwaren, og vælg Segmentering - Cellulær klynge i rullemenuen MSM.
- Ved hjælp af filbrowserdialogen skal du vælge positionsmappen 'analyse/p0', 'analyse/p1' osv., der indeholder egenskaber, der er kvantificeret på regelmæssigt fordelte gitterpunkter.
- Angiv, om monolag er sammenflyttet.
BEMÆRK: Nedenstående trin aktiveres kun, når monolag ikke er sammenflyttet. Følg AnViM beder om at anvende den nye flerstrengede tilgang til at identificere de billedområder, der indeholder celler. Processen involverer fire metoder - hver nærmer segmentering på en anden måde. En eller flere af disse metoder, der anvendes i kombination, dækker en bred vifte af billeder af cellerne. Prøv derfor forskellige tilgange for at finde ud af, hvilken kombination der fungerer bedst for deres data. - Juster 'Domæneforbindelsesfaktoren' og 'Smear-faktoren' for at opnå optimal segmentering.
BEMÆRK: 'Smear-faktoren' gør de områder, der indeholder celler større. - Angiv, om cellerne ser sorte eller hvide ud i det binære billede.
- I vinduet Rutevejledning til rensning af grænsebilledet skal du vælge, om billedet skal renses automatisk eller manuelt.
BEMÆRK: Uønskede funktioner i billederne er sorte pletter på pixels besat af celler og hvide pletter på pixels afbrudt fra celleklyngen, der skal analyseres. Analyse kan kun foretages på de områder, der er tilsluttet. Så flere afbrudte områder skal analyseres separat.
- Del 2: Segmentering af de enkelte celler i billederne
BEMÆRK: Manuelle input til dette trin omfatter identifikation af datamappen og reaktion på segmenteringsmeddelelserne for at registrere individuelle celler i billedet. De tidligere oprettede filer, der bruges i dette trin, omfatter 'p*/phs/*.tif' og 'p*/phs/bwImages/*.tif'. De vigtigste nye filer, der produceres, omfatter 'p*/phs/textResults/*.csv', som indeholder cellulære morfologiske egenskaber. Se figur 10 for at få en visuel beskrivelse af følgende trin for at segmentere monolagens individuelle celler.- Start Fiji-softwaren, og vælg Segmentering - individuelle celler i rullemenuen MSM.
- Ved hjælp af filbrowserdialogen skal du vælge positionsmappen 'analyse/p0', 'analyse/p1' osv., der indeholder egenskaber, der er kvantificeret på regelmæssigt fordelte gitterpunkter.
- Angiv det maksimale højde-bredde-forhold i vinduet Vælg inputparametre , hvor meget cellecentret skiller sig ud i forhold til cellegrænsen, og to sløringsparametre, der styrer påvisning af cellerne (supplerende figur S10).
- Tegn en polygon på den mindste normale celle på billedstakken for hver placering. Dette bruges til at beregne området. Noget mindre end dette vil ikke blive betragtet som en celle af softwaren.
- Træk derefter en polygon rundt om den største normale celle og angiv, om cellecentret eller cellecellegrænsefladen er lysere.
BEMÆRK: AnViM opretter derefter filer 'phs/textBehør/0001.csv', 'phs/textResultater/0002.csv' osv., for hver ramme, der indeholder oplysninger om celler inden for den pågældende ramme. På dette stadium indeholder denne fil morfologiske oplysninger om cellerne, herunder område, centroid, perimeter, orientering, cirkularitet, billedformat, afrundethed, soliditet, afstand fra no-cell-regionen. Længdeenheden i disse egenskaber er pixel, og vinklen er i grader. Endelig opdateres denne fil, så den indeholder mobil pixelintensitet, bevægelse og kræfter i de efterfølgende trin.
- Del 3: Kortlægning af pixelintensiteterne på cellerne
BEMÆRK: Manuelle input i dette trin omfatter identifikation af datamappen og valg af tilknytningsegenskaber og -parametre. De tidligere oprettede filer, der bruges i dette trin, omfatter 'p*/phs/*.tif' (eller 'p*/fluo/*.tif') og 'p*/phs/bwImages/*.tif'. De vigtigste nye filer, der produceres i dette trin, omfatter 'p*/phs/textResults/*.csv', som viser cellulære morfologiske egenskaber. Se figur 11 for den visuelle beskrivelse af følgende trin til vurdering af pixelintensiteterne i området, der er omfattet af individuelle celler og deres naboområde, og definere dem som egenskaber for cellerne.- Start Fiji-softwaren, og vælg Kort på Celler - intensiteter i rullemenuen MSM.
- Ved hjælp af filbrowserdialogen skal du vælge positionsmappen 'analyse/p0', 'analyse/p1' osv., der indeholder egenskaber, der er kvantificeret på regelmæssigt fordelte gitterpunkter.
- Vælg Find celledeling eller Kvantificer cellulær fluorescens, når du bliver bedt om det af softwaren. Definer størrelsen på det nærliggende område. Markér både indsamleegenskaberne for naboområdet og indsamle egenskaber for cellerne. Klik på OK.
- I vinduet Formål at registrere vinduet Cellulær intensitet skal du angive, hvilken type billede der skal bruges til intensitetstilknytning, størrelsen af det nærliggende område, og om der indsamles data for individuelle celler eller begge celler og deres tilstødende områder (supplerende figur S11).
BEMÆRK: Kortlægning af pixelintensiteterne i et fasekontrastbillede gør det muligt at registrere celledelingshændelser. Kortlægning af fluorescerende billedintensiteter vil gøre det muligt at påvise udsving i de fluorescerende mærkede cytoplasmaiske molekyler. Outputtet af ovenstående trin er middel-, median-, standardafvigelses-, minimum- og maksimumpixets intensitetsværdier for de enkelte celler. Disse tal indtastes som nye kolonner i filerne 'phs/textResults/0001.csv', 'phs/textResults/0002.csv' osv.
- Del 4: Kortlægning af kræfter og bevægelse på cellerne
BEMÆRK: Manuelle input til dette trin omfatter identifikation af datamappen og valg af tilknytningsegenskaber og -parametre. De tidligere oprettede filer, der bruges i dette trin, omfatter 'p*/phs/textResults/*.csv', 'p*/velocity/*_vel.dat', 'p*/displacement/*_disp.dat', 'p*/traction/*_trac.dat', 'p*/prestress/*_prestress.dat' og 'p*/phs/bwImages/*.tif'. Der oprettes ingen nye filer i dette trin. I stedet føjes de nye oplysninger (cellulære kraft- og bevægelsesegenskaber) til filerne 'p*/phs/textResults/*.csv '. Se figur 12 for den visuelle beskrivelse af de trin til vurdering af de kræfter og bevægelser i området, der er omfattet af de enkelte celler og deres naboområde, og definere dem som cellers egenskaber.- Vælg mellem rullemenuen MSM Kort over celler - Bevægelses-/kraftdata (supplerende figur S12).
- Følg derefter trinnene i trin 2.4.3.
BEMÆRK: Der tilføjes nye kolonner til filerne »phs/textResults/0001.csv«, »phs/textResults/0002.csv« osv. og omfatter middel-, median- og standardafvigelsen af hastighed, hastighedsretningen, den gennemsnitlige cytoskeletale spænding, spændingsangisotropi, stammeenergi i hydrogelen, retningen af højeste spænding og størrelsen af celle-ECM-trækkraften (supplerende figur S13).
- Del 1: Segmentering af det billedområde, der indeholder celler
- Visualisering af resultater
- Del 1: Sporing af de cellulære identiteter på tværs af eksperimentet
BEMÆRK: Manuelle input til dette trin omfatter identifikation af datamappen og valg af tilknyttede egenskaber, der skal visualiseres. De tidligere oprettede filer, der bruges i dette trin, omfatter 'p*/phs/textResults/*.csv'. De vigtigste nye filer, der produceres i løbet af dette trin, omfatter 'p*/phs/textResults/cellTimeTrace_*.csv', som indeholder et tidsspor af mobildataene. Se figur 13 for den visuelle beskrivelse af følgende trin for at spore de enkelte cellers egenskaber i hele eksperimentets varighed.- Start Fiji-softwaren, og vælg Resultater - Spor data i rullemenuen MSM.
- Ved hjælp af filbrowserdialogboksen skal du vælge positionsmappen 'analyse/p0', 'analyse/p1' osv., der indeholder cellulære egenskaber, der skal spores. Når du er færdig, skal du klikke på Vælg.
- Vælg startrammen til overvågning i vinduet Vælg udgangspunkt for sporing , og antallet af rammer spores samtidigt (supplerende figur S14). Start altid fra ramme nummer 2, da hastigheden ikke kan bestemmes for ramme nummer 1. Når du er færdig, skal du klikke på OK.
- I vinduet Kontroller variablerne for at oprette spor skal du vælge variablerne enten ved at skrive variabelnavnene eller markere betingelserne i afkrydsningsfelterne (supplerende figur S15). Klik derefter på OK.
BEMÆRK: Sporing genererer filer med 'phs/textResultater/cellTimeTrace_*.csv' med hver kolonne, der indeholder et entydigt cellenummer, og hver efterfølgende række, der repræsenterer den fortløbende tidsforekomst.
- Del 2: Generering af tidsspor af de vurderede cellulære egenskaber
BEMÆRK: Manuelle input til dette trin omfatter identifikation af datamappen og valg af tilknyttede egenskaber, der skal visualiseres. De tidligere oprettede nøglefiler, der bruges i dette trin, omfatter 'p*/phs/textResultater/cellTimeTrace_*.csv'. De vigtigste nye filer, der produceres i løbet af dette trin, omfatter 'p*/phs/trackedDataPlots/*.tif', som indeholder time track plots og 'p*/phs/trackedDataPlots/*.csv', som indeholder plotdata. Se figur 14 for den visuelle beskrivelse af følgende trin til generering af tidsspor af de vurderede cellulære egenskaber.- Start Fiji-softwaren, og vælg Resultater - plot i rullemenuen MSM.
- Ved hjælp af filbrowserdialogboksen skal du vælge positionsmappen 'analyse/p0', 'analyse/p1' osv., der indeholder sporede cellulære egenskaber, der skal afbildes.
- Vælg, om du vil begrænse plottet til celler med ubrudte spor ved at klikke på knappen Ja eller Nej .
BEMÆRK: Denne indstilling ignorerer cellerne, som ikke kunne registreres i en eller flere tidsforekomster. - Vælg det antal variabler, der skal afbildes samtidigt, og klik på OK.
BEMÆRK: AnViM tillader i øjeblikket maksimalt tre variabler i det samme plot. - Vælg individuelle variabler til plotning ved hjælp af en rullemenu.
BEMÆRK: Disse trin opretter en TIFF-fil (Tagged Image File Format) og en kommasepareret datafil i mappen 'phs/trackedDataPlots/'. Filnavnet består af variabelnavne adskilt af et understregningstegn og slutter med et cellenummer.
- Del 3: Generering af varmekort over de vurderede cellulære egenskaber
BEMÆRK: Manuelle input i dette trin omfatter identifikation af datamappen og valg af tilknyttede egenskaber, der skal visualiseres. De tidligere oprettede nøglefiler, der bruges i dette trin, omfatter 'p*/phs/textResultater/cellTimeTrace_*.csv'. De vigtigste nye filer, der genereres i dette trin, omfatter 'p*/phs/segmentedImages/cellPropMaps/*.tif', som er heatmaps for cellulære egenskaber. Se figur 15 for den visuelle beskrivelse af trinene til generering af varmekort over de vurderede cellulære egenskaber.- Vælg mellem rullemenuen MSM - Billede.
- Følg de trin, der er beskrevet i trin 2.5.2.
BEMÆRK: Outputtet gemmes som TIFF-filfiler i mappen 'phs/segmentedImages/cellPropMaps/'. Filnavnene er tidsforekomstnummeret og variabelnavnet adskilt af et understregningstegn.
- Del 1: Sporing af de cellulære identiteter på tværs af eksperimentet
Representative Results
Vi præsenterer her to af de vigtigste output for det demonstrerede eksempel. Den første udgang er tidssporet af cellulær hastighed og cytoskeletal spænding for celle nummer 1 (Figur 16). Egenskaberne vises på en delt lodret akse for at lette den visuelle tilknytning mellem egenskaberne, og den vandrette akse angiver tidsforekomstnummeret. I dette eksperiment blev der erhvervet successive rammer med 15 minutters interval. Den anden udgang er en række varmekort 1 time inde i eksperimentet (figur 17). De egenskaber, der vises her omfatter spredning område, orientering, cirkularitet, hastighed, retning af bevægelse, maksimal spænding orientering, cytoskeletal spænding, substrat trækkraft, og spænding anisotropi af de enkelte celler.
Figur 1: Struktur af integrativ værktøjskasse til analyse af cellulære signaler (iTACS). To nøglekomponenter i iTACS er Anskaffelses- og træningsmodul (AcTrM) og Analyse- og Visualiseringsmodul (AnViM). AcTrM kan bruge forskellige hydrogel forberedelse teknikker, der i øjeblikket findes til fremstilling af hydrogels, der kan holdes fast på et mikroskop fase, enhver celle såning, og en vækst protokol, der bevarer celler i et fokusplan. AnViM kan bruge forskellige teknikker til at kvantificere hydrogel og monolayer deformation, celle-ECM kræfter, og celle-celle kræfter. Alle disse bruger-foretrukne komponenter i kraftmålingsprotokollen kan rummes i iTACS, og de er blevet identificeret med stiplede bokse. De komponenter, der er identificeret med solide bokse, er nye bidrag til cellulær kraftmålingsteknologi. Visualisering i AnViM fokuserer på medianværdien og variationen af egenskaberne på tværs af individuelle celler. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2: Erhvervelse af referencebilleder - del 1. Trin til oprettelse af en stillingsliste ved hjælp af AcTrM. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 3: Erhvervelse af referencebilleder - del 2. Trin til anskaffelse af referencebilleder ved hjælp af AcTrM. Detaljerede visninger af trin 2, 4 og 6 findes i henholdsvis tillægsspørgsmål S2, S3 og S4. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 4: Automatiseret billedopsamling for det resterende eksperiment. Trin til genoptagelse af billedoprekøb for at vurdere cellulær adfærd ved hjælp af AcTrM. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 5: Opsætning af automatiseret dataanalyse. Trin til at starte automatiseret billedanalyse ved hjælp af AnViM. Softwaren genkender det billedformat, der bruges af AcTrM. Et detaljeret billede af panelerne i trin 3 og 5 findes i henholdsvis supplerende figur S5 og supplerende figur S6. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 6: Kvantificering af deformation af hydrogel og monolag - del 1. Skridt til at engagere, via AnViM, partikelbilledet Velocimetry gennemførelse af Tseng, Q. et al., PNAS (2012)20 at kvantificere deformation af den øverste overflade af hydrogel. Brugere kan også implementere inden for AnViM andre tilgange til at kvantificere hydrogel deformation. En detaljeret oversigt over trin 3 findes i supplerende figur S7. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 7: Kvantificering af deformation af hydrogel og monolag - del 2. Skridt til at engagere, via AnViM, partikelbilledet Velocimetry gennemførelse af Tseng, Q. et al., PNAS (2012)20 at kvantificere den lokale bevægelse af de enkelte celler. Brugere kan også implementere inden for AnViM andre tilgange til at kvantificere cellulære bevægelse. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 8: Kvantificering af celle-ECM og cellecellekræfter. Skridt til at udføre billedanalyse til at engagere, via AnViM, Fourier Transform Traction Microscopy gennemførelse af Trepat et al., Nature Physics (2009)15 at kvantificere kræfter udøves af cellerne på hydrogel, og Monolayer Stress Mikroskopi gennemførelse af Tambe et al., Nature Materials (2011)1 at kvantificere kræfter inden for de enkelte celler og mellem tilstødende celler. Brugere kan også implementere inden for AnViM andre tilgange til at kvantificere celle-ECM og celle-celle kræfter. En detaljeret oversigt over trin 6 findes i supplerende figur S8 og supplerende figur S9. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 9: Kortlægning af gitterpunktværdier på individuelle celler - del 1. Trin til segmentering af de billedområder, der indeholder celler, ved hjælp af en ny flerstrenget tilgang. Denne fremgangsmåde kan bruges til at segmentere fasekontrast-, lysefelter eller fluorescensbilleder af cellerne. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 10: Kortlægning af gitterpunktværdier på individuelle celler - del 2. Trin til at segmentere individuelle celler i en monolag ved hjælp af en ny flerstrenget tilgang udviklet i AnViM. Denne fremgangsmåde kan bruges til at segmentere fasekontrast-, lysefelter eller fluorescensbilleder af cellerne. En detaljeret oversigt over trin 2 findes i supplerende figur S10. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 11: Kortlægning af gitterpunktværdier for individuelle celler - del 3. Trin til vurdering af pixelintensiteter i området i de enkelte celler og inden for det nærliggende område af individuelle celler ved hjælp af AnViM. De vurderede intensiteter omfatter overført lysintensitet og fluorescensintensitet. Denne del kortlægger medianværdien og standardafvigelsen af pixelintensiteterne i de enkelte celler og inden for et nærliggende område af individuelle celler. En detaljeret oversigt over trin 2 findes i supplerende figur S11. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 12: Kortlægning af gitterpunktværdier på individuelle celler - del 4. Trin til vurdering af styrker og bevægelsesegenskaber for gitterpunkterne i de enkelte celler og inden for det nærliggende område af individuelle celler ved hjælp af AnViM. Denne del kortlægger medianværdien og standardafvigelsen af egenskaberne i de enkelte celler og inden for et nærliggende område af individuelle celler. En detaljeret oversigt over trin 2 og 3 findes i supplerende figur S12 og supplerende figur S13. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 13: Visualisering af resultater - del 1. Trin til at spore egenskaber for individuelle celler i hele eksperimentets varighed ved hjælp af AnViM. En detaljeret oversigt over trin 2 og 3 findes i supplerende figur S14 og supplerende figur S15. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 14: Visualisering af resultater - del 2. Trin til at generere tidsspor af de vurderede egenskaber ved hjælp af AnViM. Brugeren har mulighed for at afbilde op til tre egenskaber i én graf. Tidsspor genereres for enten alle celler eller kun de celler, for hvilke sporing var vellykket på tværs af hele eksperimentet. En detaljeret oversigt over trin 5 findes i supplerende figur S16 og supplerende figur S17. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 15: Visualisering af resultater - del 3. Trin til at generere varmekort over de vurderede egenskaber ved hjælp af AnViM. Varmekort genereres for alle rammer, der følger startrammen og alle de valgte egenskaber. En detaljeret oversigt over trin 3 er præsenteret i supplerende figur S18. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 16: Tidsspor for celle-id 1. To viste egenskaber er den cellulære cytoskeletal spænding ("avgtenMedian") og cellulære hastighed ("speedMedian"). Både cellulær cytoskeletal spænding og cellulær hastighed kvantificeres som medianen værdi på tværs af gitteret peger i cellerne. De to egenskaber afbildes på samme akse med vilkårlige enheder for at visualisere relationer mellem de vurderede egenskaber. Yderligere variabelnavne er angivet i supplerende tabel S1. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 17: Varmekort over de enkelte cellers egenskaber på tværs af den analyserede monolag. Hver celle er farvet med medianværdien af den egenskab, der er angivet i panelet. Dyb rød angiver således den maksimale cellulære værdi i farvespektret, og dybblå angiver den minimale cellulære værdi på tværs af den analyserede monolag. Som beskrevet i Tambe et al., PLoS One (2013)2, har cellerne, der ligger tættere på grænsen, mekaniske kræfter påvirket af ukendte egenskaber af cellerne uden for billedet. Derfor genereres varmekortet for celler langt fra grænsen. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur S1: Eksempel på billeder af den øverste og nederste fluorescerende perle. Klik her for at downloade denne fil.
Figur S2: En detaljeret oversigt over trin 2 fra figur 3. Klik her for at downloade denne fil.
Figur S3: En detaljeret oversigt over trin 4 fra figur 3. Klik her for at downloade denne fil.
Figur S4 A: detaljeret oversigt over trin 6 fra figur 3. Klik her for at downloade denne fil.
Figur S5: En detaljeret oversigt over trin 3 fra figur 5. Klik her for at downloade denne fil.
Figur S6: En detaljeret oversigt over trin 5 fra figur 5. Klik her for at downloade denne fil.
Figur S7: En detaljeret oversigt over trin 3 fra figur 6. Klik her for at downloade denne fil.
Figur S8: En detaljeret oversigt over celle-ECM-kraftudgangen af trin 6 fra figur 8. Klik her for at downloade denne fil.
Figur S9: En detaljeret visning af cellecellekraftudgangen af trin 6 fra figur 8. Klik her for at downloade denne fil.
Figur S10: En detaljeret oversigt over trin 2 fra figur 10. Klik her for at downloade denne fil.
Figur S11: En detaljeret oversigt over trin 2 fra figur 11. Klik her for at downloade denne fil.
Figur S12: En detaljeret oversigt over trin 2 fra figur 12. Klik her for at downloade denne fil.
Figur S13: En detaljeret oversigt over resultatet af trin 3 fra figur 12. Klik her for at downloade denne fil.
Figur S14: En detaljeret oversigt over trin 2 i figur 13. Klik her for at downloade denne fil.
Figur S15: En detaljeret oversigt over trin 3 fra figur 13. Klik her for at downloade denne fil.
Figur S16: En detaljeret visning af datafiler, der blev genereret i trin 5 fra figur 14. Klik her for at downloade denne fil.
Figur S17: En detaljeret oversigt over et plot, der er genereret i trin 5 fra figur 14. Klik her for at downloade denne fil.
Figur S18: En detaljeret visning af et varmekort og den fil, der indeholder farvespektrets rækkevidde, genereret i trin 4 fra figur 15. Klik her for at downloade denne fil.
Tabel S1: En liste over udvalgte egenskaber kvantificeret ved iTACS. Klik her for at downloade denne tabel.
Discussion
Klæbende celler bruger både mekaniske og kemiske signaler til at overleve, vokse og fungere. En bred vifte af mikroskopi software optimerer brugeroplevelsen i vurderingen af de kemiske signaler gennem fluorescens-baseret billeddannelse. Men vurderingen af de mekaniske signaler indebærer kapaciteter, der ikke er tilgængelige i standard mikroskopi software. Desuden er vurderingen af mekaniske signaler mest effektiv, når dataindsamling er integreret med dataanalyse. Manglen på en samlet platform, der opfylder de unikke behov for mekanisk signalvurdering, har været et stort teknologisk hul i eksperimentel cellebiologi. Integrativ toolkit til analyse af cellulære signaler (iTACS) er designet til at opfylde dette hul. De to komponenter i iTACS, AnViM og AcTrM, udstyre brugerne med de nødvendige muligheder for at kvantificere cellulære egenskaber af fire brede kategorier: kræfter, bevægelse, morfologi, og fluorescens / lysstyrke. På tværs af disse kategorier er iTACS i øjeblikket i stand til at afsløre mere end 50 unikke aspekter af individuelle klæbende celler. Disse aspekter omfatter specifikke egenskaber for hver bred kategori, herunder deres repræsentative værdi og variation på tværs af cellen (supplerende tabel S1). For eksempel er der inden for kræfterne trækkræfter på tværs af cytoskeleton, anisotropi af denne spænding, orienteringen af maksimal spænding og forskydningsbelastning på tværs af celle-ECM-grænsefladen, der har en dybtgående indflydelse på klæbende cellers adfærd1,3,6.
En ny tilgang til at undersøge den mekaniske adfærd af individuelle celler i en monolayer
Individuelle celler af en monolag er involveret i en udveksling af signaler af kemisk og mekanisk karakter3. Disse to typer af signaler overføres på tværs af cellulære monolayer på en anden måde23. Den mekaniske signaltransmissionsviden halter imidlertid bagefter viden om kemisk signaltransmission. Denne videnskløft falder sammen med en vedvarende mangel på enkle og intuitive tilgange til vurdering af cellulære mekaniske signaler. Den nye data kortlægning tilgang beskrevet her er udstyret til at udfylde dette hul. En sådan kortlægning viser, at udsving i iboende cytoskeletal spænding i den nærliggende region af en celle tjener som afslapning, fluidisering, og forankring signaler, der regulerer ændringer i cellulære form, størrelse og hastighed af cellen18. Kort over de omkringliggende regioners egenskaber udviser "flercellede underinddelingsmønstre", hvor celler i underopdelingen udsættes for et relativt ensartet mikromiljø, og cellerne ved underopdelingens grænse udsættes for et bemærkelsesværdigt ikke-ensartet mikromiljø18.
Tilgængelighed af kraftmålingsteknologien
Der findes en række protokoller til at fremstille PAA hydrogeler, analysere hydrogeldeformation og cellulær bevægelse og kvantificere celle-ECM- og cellecellekræfter1,2,7,8,9,13,14,15,18,20,21,24,25,26,27 28,29,30,31,32. Denne udvikling er imidlertid fortsat uden for rækkevidde af fælles cellebiologilaboratorier og begrænset til laboratorier med teknisk ekspertise. Ved at automatisere de tekniske aspekter af disse tilgange og integrere dem under en samlet og brugervenlig platform er målet med iTACS at gøre vurderingen af mekaniske signaler til en rutinemæssig aktivitet inden for eksperimentel cellebiologiforskning og -uddannelse.
ImageJ giver brugerne mulighed for at udvikle applikationer ved hjælp af tilgange, der ville kræve ringe eller ingen uddannelse11. iTACS er i vid udstrækning bygget ved hjælp af enkle scripting tilgange til at lette community-drevet fortsat udvikling. En stor del af AcTrM programmeres ved hjælp af BeanShell-scripts, og hovedparten af AnViM programmeres ved hjælp af ImageJ Macros. Disse scripts og vejledning til implementering af disse funktioner på brugerens mikroskop er tilgængelige via GitHub (https://github.com/IntegrativeMechanobiologyLaboratory/iTACS).
Kvalitetsstandardisering af de erhvervede billeder
Selv om de elastiske substratbaserede teknikker til at kvantificere fysiske kræfter i klæbende celler er blevet udviklet og implementeret i forskellige laboratorier, mangler protokollen stadig standardisering. Et område, der har brug for standardisering mest, er kvaliteten af de erhvervede topperler billeder (supplerende figur S1). Væsentlige spørgsmål opstår som følge af afdrift i fokus i hele eksperimentet. Vores nye reference-image-baserede refokusering tilgang gør en sådan fokusering en objektiv proces. De parametre, der er defineret i acTrM's allerførste trin, fastsætter de nødvendige objektive kvalitetsgrænser. Andre standardiseringsforanstaltninger kan programmeres i fremtidige versioner af ACTrM.
Den brede anvendelighed af iTACS
Ud over at kvantificere mange aspekter af klæbende celler letter iTACS-strukturen dens anvendelse til forskellige eksperimentelle protokoller og behov. AcTrM giver mulighed for softwarestyret bruger selvtræning. Højhastighedsbilleddannelse, der kræves af f.eks. samtidig vurdering af cytoplasmaiske calciumudsving, er i øjeblikket begrænset af hastigheden af repositionering og refokusering af hardware og udføres bedst på ét sted ad gangen. Den nuværende implementering er imidlertid veludstyret til langvarig billeddannelse, afbrudt billeddannelse, hvor prøven ikke kan opbevares på mikroskopstadiet i hele eksperimentets varighed. Da referencebillederne er erhvervet i begyndelsen af eksperimentet, iTACS muliggør real-time billeddannelse af mekaniske signaler, åbne nye veje i narkotika-screening applikationer. AnViM giver brugerne mulighed for at give meget tekniske oplysninger i lægmandssprog. Evnen til at kvantificere et bredt spektrum af cellulære egenskaber og spore dem gennem hele eksperimentet udgør kritiske kapaciteter, der er nødvendige for at opdage nye intercellulære kommunikationsmekanismer.
Til den fremtidige udvikling af iTACS har vi identificeret fire fokusområder: (1) forbedring af dataindsamlings- og dataanalysehastighed, (2) implementering af tilgange til vurdering af nye cellulære signaler13, (3) udvikling af workshops og uddannelsesmoduler om iTACS-baseret cellulær signalvurdering, (4) udvikling af billige automatiseringsløsninger.
Disclosures
Forfatterne erklærer ingen interessekonflikter.
Acknowledgments
D.T.T. takker personale tilknyttet Center for Lungebiologi ved University of South Alabama for at stimulere diskussioner om de eksperimentelle cellebiologi forskningsbehov. Disse drøftelser var afgørende for at sætte gang i udviklingen af iTACS.
Dette arbejde blev delvist støttet af tilskud fra National Institute of Health / National Heart Lung Blood Institute, P01 HL66299 og R37 HL60024 (Stevens), R01-HL118334 (Alvarez), F32-HL144040-01 (Xu), og fra University of South Alabama gennem Abraham Mitchell Cancer Research Fund (Singh, Palanki, Tambe), Research and Scholarly Development Grant (Tambe), Honors College og Summer Undergraduate Research Fellow (Nguyen).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents and components used in prepare glass surface for hydrogel coating | |||
| (3-Aminopropyl)trimethoxysilane, 97% | Aldrich chemistry | 13822565 | |
| 2% Bis Solution | Bio-rad | 1610142 | |
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate,98% | Acros organics | 2530850 | |
| 40% Acrylamide Solution | Bio-rad | 1610140 | |
| Glass bottom 35 mm dish/ 6 or 12 or 24 well plates | MatTek or CellVis | ||
| Glutaraldehyde, EM Grade, 25% | Polysciences | 1909100 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-aldrich | 1002074706 | |
| Reagents and components used in preparing suitable hydrogel | |||
| 2% Bis Solution | Bio-rad | 1610142 | |
| 40% Acrylamide Solution | Bio-rad | 1610140 | |
| Ammonium Persulfate | Bio-rad | 1610700 | |
| Cover Slips | Electron Microscopy Sciences | 7222301 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (1M) | Gibco | 14190136 | |
| FluoSpheres carboxylate 0.2 um, yellow-green(505/515) | Invitrogen | F8811 | |
| FluoSpheres carboxylate 0.5 um, red(580/605) | Invitrogen | F8812 | |
| FluoSpheres carboxylate 2.0 um, red(580/605) | Invitrogen | F8826 | |
| Rain-X | |||
| TEMED | Bio-rad | 1610801 | |
| Reagents used in coating extracellular matrix on the hydrogel | |||
| Collagen Type I Rat Tail | Corning | 354236 | |
| HEPES(1M) | Gibco | 15630080 | |
| Phosphate Buffered Saline (1M) | Gibco | 10010023 | |
| Sulfo-SANPAH | CovaChem | 102568434 | |
| Microscope hardware used in the current study | |||
| Camera | Hamamatsu Flash 4.0 LT sCMOS Camera | C11440-42U | |
| H117 ProScanTM Stages | Prior Scientific | ||
| Light source- Lambda DG4 and Lambda DG5 | Sutter instrument company | ||
| Microscope | Nikon eclipse TE2000-S | 550372 | |
| ProScan III Universal Microscope Automation Controller | Prior Scientific | ||
| Stagetop incubator | ibidi | 11922 | |
| Stepper Motor Focus Drive | Prior Scientific |
References
- Tambe, D. T., et al. Collective cell guidance by cooperative intercellular forces. Nature Materials. 10 (6), 469-475 (2011).
- Tambe, D. T., et al. Monolayer stress microscopy: limitations, artifacts, and accuracy of recovered intercellular stresses. PloS One. 8 (2), 55172 (2013).
- Das, T., et al. A molecular mechanotransduction pathway regulates collective migration of epithelial cells. Nature Cell Biology. 17 (3), 276-287 (2015).
- Vedula, S. R., et al. Mechanics of epithelial closure over non-adherent environments. Nature Communications. 6, 6111 (2015).
- Lamason, R. L., et al. Rickettsia Sca4 reduces vinculin-mediated intercellular tension to promote spread. Cell. 167 (3), 670-683 (2016).
- Sunyer, R., et al. Collective cell durotaxis emerges from long-range intercellular force transmission. Science. 353 (6304), 1157-1161 (2016).
- Dong, L., Oberai, A. A. Recovery of cellular traction in three-dimensional nonlinear hyperelastic matrices. Computer Methods in Applied Mechanics and Engineering. 314, 296-313 (2017).
- Nier, V., et al.
- Serrano, R., et al.
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of Image Analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji - an Open Source platform for biological image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. Computer control of microscopes using microManager. Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 14, Unit14 20 (2010).
- Patel, N. G., et al. Unleashing shear: Role of intercellular traction and cellular moments in collective cell migration. Biochemical and Biophysical Research Communications. 522 (2), 279-285 (2020).
- Yeung, T., et al. Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion. Cell Motility and the Cytoskeleton. 60 (1), 24-34 (2005).
- Trepat, X., et al. Physical forces during collective cell migration. Nature Physics. 5, 426-430 (2009).
- Aratyn-Schaus, Y., Oakes, P. W., Stricker, J., Winter, S. P., Gardel, M. L. Preparation of complaint matrices for quantifying cellular contraction. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (46), (2010).
- King, J., et al. Structural and functional characteristics of lung macro- and microvascular endothelial cell phenotypes. Microvascular Research. 67 (2), 139-151 (2004).
- Patel, G., et al. Mechanical signaling in a pulmonary microvascular endothelial cell monolayer. Biochemical and Biophysical Research Communications. 519 (2), 337-343 (2019).
- Kähler, C. J., et al. Main results of the 4th International PIV Challenge. Experiments in Fluids. 57 (6), 97 (2016).
- Tseng, Q., et al. Spatial organization of the extracellular matrix regulates cell-cell junction positioning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (5), 1506-1511 (2012).
- Alvarez-Gonzalez, B., et al. Two-layer elastographic 3-D traction force microscopy. Scientific Reports. 7, 39315 (2017).
- Makarchuk, S., Beyer, N., Gaiddon, C., Grange, W., Hebraud, P.
- Janmey, P. A., Miller, R. T. Mechanisms of mechanical signaling in development and disease. Journal of Cell Science. 124 (1), 9-18 (2011).
- Dembo, M., Oliver, T., Ishihara, A., Jacobson, K. Imaging the traction stresses exerted by locomoting cells with the elastic substratum method. Biophysical Journal. 70 (4), 2008-2022 (1996).
- Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).
- Butler, J. P., Tolic-Norrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology: Cell Physiology. 282 (3), 595-605 (2002).
- Saez, A., et al. Traction forces exerted by epithelial cell sheets. Journal of Physics. Condensed Matter. 22 (19), 194119 (2010).
- Deforet, M., et al. Automated velocity mapping of migrating cell populations (AVeMap). Nature Methods. 9 (11), 1081-1083 (2012).
- Polio, S. R., Smith, M. L. Patterned hydrogels for simplified measurement of cell traction forces. Methods in Cell Biology. 121, 17-31 (2014).
- Toyjanova, J., et al. 3D Viscoelastic traction force microscopy. Soft Matter. 10 (40), 8095-8106 (2014).
- Serra-Picamal, X., Conte, V., Sunyer, R., Munoz, J. J., Trepat, X. Mapping forces and kinematics during collective cell migration. Methods in Cell Biology. 125, 309-330 (2015).
- Charrier, E. E., et al. A novel method to make viscoelastic polyacrylamide gels for cell culture and traction force microscopy. APL Bioengineering. 4 (3), 036104 (2020).
