Summary
Plattformen Integrative Toolkit to Analyze Cellular Signals (iTACS) automatiserar processen att samtidigt mäta en mängd olika kemiska och mekaniska signaler i vidhäftande celler. iTACS är utformat för att underlätta samhällsdriven utveckling och göra det möjligt för forskare att använda alla plattformsfunktioner oavsett deras utbildningsbakgrund.
Abstract
Kvantitativ bedömning av cellulära krafter och rörelse avancerade avsevärt under de senaste fyra decennierna. Dessa framsteg gav ramverket för att undersöka insiktsfulla mekaniska signalprocesser i cellkultursystem. Men området står för närvarande inför tre problem: brist på kvalitetsstandardisering av de förvärvade data, tekniska fel i dataanalys och visualisering, och kanske viktigast av allt, tekniken förblir till stor del utom räckhåll för vanliga cellbiologiska laboratorier. För att övervinna dessa begränsningar utvecklade vi en ny experimentell plattform - Integrative Toolkit to Analyze Cellular Signals (iTACS). iTACS består av två komponenter: Förvärvs- och utbildningsmodul (AcTrM) och Analys- och visualiseringsmodul (AnViM). AcTrM är baserat på μManager - en NIH-ImageJ-baserad mikroskopkontrollprogramvara - och underlättar användarens självutbildning och automatisering av vanliga bildförvärvsprotokoll. AnViM är baserat på NIH-ImageJ och underlättar användarvänlig automatisering av dataanalys och insiktsfull visualisering av resultat. Dessa experiment innebär odling av vidhäftande celler på hydrogeler, bildframställning fiducial markörer inbäddade i hydrogelen och slutligen extrahera från dessa bilder en omfattande mekanisk karakterisering av cellerna. För närvarande gör iTACS det möjligt för användaren att analysera och spåra ett brett spektrum av egenskaper, inklusive morfologi, rörelse, cytoskeletala krafter och fluorescens av enskilda celler och deras närliggande region. Kvalitetsstandardiseringsproblemet togs upp i AcTrM med, en referensbildstyrd omfokuseringsteknik. De tekniska problemen i dataanalysen togs upp i AnViM med en flerdelad bildsegmenteringsprocedur, ett användarvänligt tillvägagångssätt för att identifiera gränsvillkor och en ny cellulär egenskapsbaserad datavisualisering. AcTrM är utformat för att underlätta enkel omvandling av grundläggande fluorescensmikroskop till experimentella cellmekanikriggar, och AnViM är utrustad för att göra det möjligt för användare att mäta cellulära mekaniska signaler utan att kräva en teknisk bakgrund. iTACS kommer att vara tillgängligt för forskarsamhället som en svit med öppen källkod med samhällsdriven utvecklingskapacitet.
Introduction
Vanliga optiska bild- och dataanalysverktyg använder hårdvaru- och programvaruteknik som är nästan föråldrade. Fördröjningen i översättning och implementering av framsteg inom elektroniska enheter, beräkningsmetoder och matematisk analys av vanliga experimentella cellbiologiska verktyg är ett stort hinder för tillväxttakten i vår kunskap om cellulär fysiologi. För närvarande hittar cellbiologiska forskare molekylärbiologiska verktyg inom räckhåll, men verktyg baserade på tekniska principer är utom räckhåll. Ett sådant teknik-principbaserat verktyg är Monolayer Stress Microscopy (MSM)1,2. Msm har anpassats och studerats i olika laboratorier över hela världen, men användningen är främst begränsad till laboratorier med teknisk expertis3,4,5,6,7,8,9.
NIH-ImageJ är ett av de mest populära verktygen med öppen källkod bland cellbiologiska forskare10. Bidragsdrivna framsteg i användargemenskapen har varit centrala för dess popularitet11,12. ImageJ har funktioner som gör det möjligt för användare att utveckla program med en blandning av ett avancerat programmeringsspråk och förenklade skriptmetoder. Dessa funktioner underlättar för användare med grundläggande programmeringskunskaper att implementera, anpassa och främja alla nya bidrag till programvaran. Med utgångspunkt i dessa egenskaper hos NIH-ImageJ har vi utvecklat Integrative Toolkit to Analyze Cellular Signals (iTACS), som möjliggör en billig integration av önskade hårdvaru- och programvaruverktyg för att automatisera mätningen av en mängd olika kemiska och mekaniska signaler över vidhäftande celler11,12.
iTACS består av två komponenter: Förvärvs- och utbildningsmodul (AcTrM) och Analys- och visualiseringsmodul (AnViM). AcTrM är byggt på μManager - en NIH-ImageJ-baserad bildförvärvsapplikation - för att göra det möjligt för användare att ställa in timelapse-mätningar av traditionella optiska egenskaper och en mängd fysiska egenskaper hos vidhäftande celler i flera prover12. AcTrM underlättar användarutbildning genom kortfattade anvisningar som ingår i det grafiska gränssnittet. Dessutom har den en ny egenskap hos referensbildbaserad autofokusering som är utformad för att underlätta realtidsmätningar av fysiska krafter och möjliggöra kvalitetsstandardisering av de förvärvade uppgifterna.
AnViM bygger på ImageJ-plugins, snabb programvara och filhanteringsskript som gör det möjligt för användare att kvantitativt bedöma mer än 50 egenskaper, inklusive cellulär form, storlek, orientering, hastighet och rörelseriktning, dragkrafter som utövas på den extracellulära matrisen (ECM) och på närliggande celler, kontraktila och skjuvmoment i både enskilda vidhäftande celler och deras närliggande region. AnViM gör det möjligt för användare att kvantifiera de cellulära fysiska egenskaperna utan att behärska den underliggande tekniska bakgrunden11. Dessutom möjliggör det dataanalys i ett interaktivt eller batchbearbetningsläge. Den genererar värmekartor som avslöjar rumslig variation och grafer som visar den tidsmässiga variationen av egenskaperna hos enskilda celler.
I ett typiskt experiment, användaren kulturer celler på en elastisk hydrogel med lämpliga extracellulära matris proteiner på den övre ytan och två typer av inbäddade fluorescerande markörer. I huvudsak är bilder av dessa fluorescerande markörer före och efter odling av cellerna tillräckliga för att kvantifiera krafterna inom och runt enskilda celler2,13. AnViM mappar dessa resultat på enskilda celler i det vidhäftande klustret och genererar insiktsfulla bilder och grafer.
Protocol
OBS: Prover som undersöks med hjälp av iTACS-plattformen är celler som fästs vid ett mjukt substrat. Protokollet för bedömning av mekaniska och kemiska signaler är uppdelat i två sekventiella delar: Förvärvs- och utbildningsmodul (AcTrM) och Analys- och visualiseringsmodul (AnViM).
1. Förvärvs- och utbildningsmodul (AcTrM)
OBS: AcTrM automatiserar processen för datainsamling och självutbildning av användare. Innan du anskaffning av data ska du förbereda ett mjukt substrat som kan tillhandahålla information som är nödvändig för att kvantifiera krafter som celler utövar på den.
- Hydrogel beredning
OBS: Målet här är att förbereda en 1 250 Pa skjuvmodul, cirka 100 μm tjocklek och 22 mm diameter polyakrylamid (PAA) hydrogel.- Förbered polyakrylamidlösning genom att följa metoden med Yeung et al. och gjut hydrogelerna enligt trepat et al.14,15. Ett undantag från förfarandet är att pärlorna som är inbäddade omedelbart under cellerna är 0,5 μm i diameter och avger gul fluorescens.
- Hoppa över steget att fästa 2 μm pärlor på täckglaset om visningsområdet förväntas ha en stor cellfri region.
OBS: Hydrogel förberedelseprotokoll är nu ganska etablerat i fältet16. Under hela den efterföljande beskrivningen kallas 0,5 μmpärlorna "topppärlor", och de 2 μm pärlor kallas "bottenpärlor". De nedre pärlorna är dock valfria där den avbildade regionen innehåller ett stort cellfritt område. Det övre pärlmönstret från en sådan cellfri region kommer att tjäna syftet med det nedre pärlmönstret. - Montera hydrogelen med inbäddade fluorescerande pärlor på mikroskopstadiet.
- Låt 15-20 min för plattans temperatur uppnå ett stabilt tillstånd.
OBS: Plattans övre yta är funktionaliserad med extracellulära matrisproteiner, men cellerna är ännu inte sådda på hydrogelen.
- Förvärv av referensbild
- Del 1: Skapa en positionslista
Manuell inmatning i det här steget inkluderar att följa AcTrM-uppmaningarna att välja platser med den bästa pärldistributionen. Inga tidigare skapade filer används i det här steget. Viktiga nya mappar som produceras i det här steget inkluderar mapparna "t0imgs", "tnimgs" och "textfiles", och filen som produceras innehåller positionlistfilen. Se bild 2 för den visuella beskrivningen av följande steg som vägleder skapandet av en positionslista med AcTrM. Det demonstrerade exemplet hämtar data vid 20x förstoring.- Start μManager 2.0 - Beta.
- Kör AcTrM genom att klicka på knappen AcTrM.bsh i fönstret IMBL-resurser .
- I fönstret Definiera förvärvsegenskaper väljer du lämpligt mål, tolerans för noggrannheten i lateral position (dvs XY) återhämtning, stegstorlek för den grova och raffinerade omfokuseringen (dvs. z) -operationen och värdet av acceptabel bildkorrelationskoefficient för fokusåterställning.
OBS: En finare tolerans för lateral position återhämtning kommer att bromsa position återhämtning, men en betydande tolerans kommer att behöva position korrigering under data analys och kan orsaka svårigheter i fokus återhämtning. En mindre stegstorlek saktar ner omfokuseringsoperationen, men en mycket hög stegstorlek kan orsaka snabb rörelse med möjligheter att missa fokus. - I fönstret AcTrM - Steg 0 väljer du Nytt förvärv för att skapa en positionslista.
FÖNSTRET med titeln AcTrM - Steg 1 listar alla viktiga nästa steg. Dessa steg innebär att flytta scenen, justera fokus och klicka på knappar i μManager. De här stegen vägleder till att konstruera listan över positioner som är lämpliga för datainsamling. - Klicka på Live in Micromanager för att visualisera exemplen för manuella justeringar som listas i fönstret AcTrM - Steg 1 .
- Följ stegen i det här fönstret.
- Skaffa nu bilden av pärlorna. Välj lämplig kanal för de övre pärlorna.
- Se till att titta på de nedre pärlor också. För att göra det, välj kanalerna för de nedre pärlorna. En suddig bild av bottenpärlor ses.
Kanaler kan växlas från den förinställda rullgardinsmenyn i huvudfönstret i μManager. Om de nedre pärlorna används i experimentet, se till att de finns i den valda positionen. Dessa pärlor kommer att verka suddiga. - När du väljer lämplig position klickar du på Markera i fönstret Scenpositionslista för att spara positionen.
OBS: Den bästa positionen definieras av en tät och enhetlig fördelning av de övre pärlorna som är inbäddade omedelbart under den övre ytan (dvs. topppärlor) och minst två pärlor fästa vid täckglaset (dvs. bottenpärlor) (kompletterande figur S1). Fokusåterställning är snabbare om de nedre pärlorna visas som stora, out-of-focus ringar. Men om experiment görs i en position utan behov av fokus eller lateral position återhämtning, ignorera instruktioner relaterade till bottenpärlor bilden. - Följ steg 6–9 som beskrivs i figur 2 för att inkludera ytterligare positioner i listan.
OBS: Välj några ytterligare positioner så att en elimineringsrunda kan möjliggöra de bästa positionerna som valts på plattan.
- Del 2: Förvärv av referensbilder
OBS: Det här steget innebär ingen manuell inmatning. Tidigare skapade nyckelfiler som användes i det här steget inkluderar "textfiler/*.pos". Viktiga nya filer och mappar som produceras i det här steget inkluderar mapparna "t0imgs" och "tnimgs". Se figur 3 och kompletterande figur S2 för visuell beskrivning av följande steg som vägleder förvärvet av referensbilder med AcTrM. Fönstret AcTrM - Steg 2 listar också alla viktiga steg.- Gör valen i fönstret Flerdimensionellt förvärv efter stegen i fönstret AcTrM - Steg 2. Om du till exempel vill utföra en lång tidsfördröjning, ange ett antal bilder som ska tas, välj den första kanalen som faskanal och välj sedan nästa för de övre pärlorna och den efter det är för bottenpärlor. Klicka på Stäng i fönstret Flerdimensionellt förvärv och klicka sedan på OK i fönstret ActrM - Steg 2.
- I fönstret AcTrM - Steg 3 väljer du att aktivera den referensbildbaserade XYZ-positionsåterställningen. Valet är i allmänhet ja. Men om bilder förvärvas på en position utan utrymme för fokus eller scendrift, kommer valet i AcTrM - Steg 3-fönstret att vara Nej.
- I fönstret AcTrM - XYZ Återställningsalternativ ställer du in kanalen för grov XYZ-återställning, om förfinad XYZ-återställning, region och kanal för förfinad XYZ-återställning och riktningen för att börja fokusera om (kompletterande figur S4). När actrm är klart kommer de att få referensbilder.
Obs: Typiska val för kanalen kommer att vara den nedre pärlor kanalen. XYZ-återställning fungerar bäst när den utförs med den fullständiga bilden i den aktuella implementeringen. Referensbilder innehåller vanligtvis en överförd ljusbild av hydrogelen, en fluorescerande bild av topppärlor och en fluorescerande bild av de nedre pärlor. Varje bilduppsättnings innehåll kan variera beroende på de val som gjorts i fönstret Flerdimensionellt förvärv . Ändå kommer programvaran att förvärva referensbilduppsättningen på varje position som bestäms i figur 2. I slutet av det här steget skapas tre mappar i den valda katalogen: "t0imgs", "tnimgs" och "textfiles". Mappen "t0imgs" innehåller referensbilder i det format som känns igen av μManager och används i efterföljande steg. Mappen "tnimgs" innehåller separata TIFF-bilder med filnamnen "c0_p0_t0.tif", "c1_p0_t0.tif" osv. Här står "c" för kanalen, "p" står för positionen och "t" står för tiden. Följande bokstäver är kanalnumret, positionnumret respektive bildrutenumret. Mappen "textfiler" innehåller positionslistan i XML-format och användarval för bildförvärv och positionsåterställning.
- Del 1: Skapa en positionslista
- Cellsådd och tillväxt
OBS: ITACS-plattformen har flexibiliteten att tillgodose provberedningsprotokoll som används vid vanlig in vitro-bedömning av mekaniskt beteende hos vidhäftande celler, inklusive glesa celler, helt sammanflytande monoskikt, nätverksbildningsanalys och monoskikt med hål eller betydande luckor.- Kultur råtta pulmonell mikrovaskulära endotelceller att sammanflöde i en kolv17,18.
- Lossa cellerna med trypsin. Återsuspend cellerna i ett odlingsmedium som innehåller 10% fetala nötkreatur serum till en koncentration 1 x 106 celler/ml.
- Placera en 5 μL droppe av de återanvända cellerna på en delvis torr hydrogelyta och placera den i cellodlingsinkubatorn.
OBS: Efter 2 dagar i odlingsmediet som innehåller 10% fetala nötkreatur serum, cellerna i den droppen bildar en fullsatt ö av celler1.
- Automatiserat bildförvärv för det återstående experimentet
Manuell inmatning för det här steget inkluderar att följa AcTrM-uppmaningarna att återuppta bildförvärvet. Viktiga tidigare skapade filer som används av detta steg inkluderar "textfiler/*.pos" och nedersta pärla bildfiler i mappen 't0imgs'. Viktiga nya filer som produceras i detta steg inkluderar uppdaterade position listfiler och bilder "tnimgs /*_t *.tif".- Se till att mikroskopets miljökontrollsystem når stabila vävnadsodlingsförhållanden.
- Montera försiktigt plattan som innehåller odlade celler på mikroskopstadiet.
- Låt temperaturen och luftfuktigheten stabiliseras 15-20 minuter.
OBS: Se bild 4 för den visuella beskrivningen av följande steg som vägleder förvärvet av bilder för det återstående experimentet med AcTrM. - Start μManager 2.0 - Beta.
- Kör AcTrM genom att klicka på knappen AcTrM.bsh i fönstret IMBL-resurser .
Ignorera de val som gjorts i fönstret Definiera förvärvsegenskaper men använd de val som gjordes i föregående steg. - Välj Fortsätt pausad anskaffning i fönstret AcTrM - Steg 0.
- Välj den förstoring och katalog som identifierades i fönstret Flerdimensionellt förvärv i det tidigare steget där datamappar (t0imags", "tnimgs" och "textfiler") sparades.
Fönstrets rubrik vägleder användaren att välja lämplig katalog. - I fönstret Flytta plattan väljer du alternativ för ompositionering av plattan (tre icke-kollinea positioner) tillsammans med kanalen som används för ompositionering.
Obs: Sparade bilder visas i kameran. Om överlappande bilder visas som en röd, grön och svart färgbild utför du manuell justering. - Klicka på Acceptera för att fortsätta med förvärvet.
OBS: Detta steg övervinner de små förskjutningarna från irreproduktiviteten av plattjusteringen när plattan återmonteras på mikroskopstadiet. Följ AcTrM-uppmaningar för att påskynda justeringen vid var och en av de tre positionerna genom att visa en sammansatt bild av referensbilden som visas i rött (vanligtvis av de nedre pärlorna) och bilden som för närvarande observeras genom det mål som visas i grönt. Att få det gröna tillräckligt nära rött lämnar mindre arbete för programvaran. När överlappningen är perfekt visas den sammansatta bilden gul och svart. Tillräckligt nära är vanligtvis när samma bottenpärlor är synliga i både röda och gröna bilder, och motsvarande röda och gröna out-of-focus ringar berör varandra. När plåtompositionering är klar tar AcTrM scenen till varje vald position och återställer XYZ-positionen genom att matcha referensbilden med vad som för närvarande ses genom kameran. Den första laterala (XY) positionen matchas och sedan matchas fokus (Z). Grov återhämtning följs av förfinad återhämtning av position och fokus. Uppdateringar av experimentets aktuella status visas på skärmen genom ett fönster i fyra delar som visas i kompletterande figur S3. De förvärvade bilderna sparas i mappen "tnimgs" efter "*_t1.tif", "*_t2.tif", vilket anger tidsräkningen för bilduppsättningen. Om XYZ-återställning identifierar en uppdaterad position genereras och sparas den nya positionslistan i mappen "textfiler".
2. Analys- och visualiseringsmodul (AnViM)
- Ställa in automatiserad dataanalys
Obs: Manuell inmatning i det här steget inkluderar identifiering av platsen för mappen "tnimgs". Viktiga tidigare skapade filer som används i det här steget inkluderar 'tnimgs/*.tif'. Viktiga nya filer och mappar som produceras i det här steget inkluderar "analys" -mappen i samma överordnade mapp som "tnimgs" och mappar för varje position "analys /p*". Inom varje "analys/p*" skapar detta steg en ny "*.tif" bildfiler i "phs" och "tny" mappar. Dessa bilder är beskurna och avdriftade bilder av celler och topppärlor. De andra filer som skapas inkluderar "analys/analysChoices.txt" som listar analysval, "analys/p*/skipAnalysis.txt", som listar fall där analysen hoppas över på grund av betydande befintlig drift, och "analys/p*/part_shift_values_pixel_degree.dat" som listar uppskattade driftvärden. AnViM ändrar inte rådata i mappen "tnimgs". Se bild 5 för visuell beskrivning av följande steg som vägleder inrättandet av automatiserad dataanalys med AnViM.- Starta Fiji-programvaran och välj det första alternativet i den rullgardinsmenyn MSM märkt som MSM - förbehandling.
- Med hjälp av dialogrutan för filwebbläsaren väljer du mappen som innehåller mappen "tnimgs", som innehåller analyserade data.
- Definiera kanalen för bilderna. Enligt riktlinjerna från kompletterande figur S5, identifiera kanalnumren på den överförda ljusbilden av cellerna (faskontrastbild av cellerna), bottenpärlor bild och topppärlor bild. Följande tre kryssrutor ("Flytta filer till positionmappen", "Gör ytterligare korrigering för styv rörelse" och "Beskär data och spara i positionsmapp") markeras vanligtvis. Slutligen definierar du tolerans för att avvisa kraftigt drivna data, pixelstorlek och sidor av bilden där cellerna korsar.
- Svara på uppmaningen för att förbättra ljusstyrkan och kontrasten hos de nedre pärlbilderna så att pärlorna visas framträdande. Justera detta med skjutreglaget på menyn och klicka på OK.
- Utför nu positionskorrigering för att bli av med skiften, om några. När du är klar skapas en analysmapp.
Kontrast förbättring behövs vanligtvis inte, men den här bestämmelsen är tillgänglig för experiment där exponeringen för lasrar måste minimeras. Efter det valet kopierar AnViM filerna från mappen "tnimgs" till mappen "analys". Filerna som motsvarar varje position sparas i mapparna "analys/p0, analys/p1", etc. I var och en av dessa positionsmappar gör AnViM mapparna "cels", "defs" och "refs" som innehåller den ursprungliga överförda ljusbilden, bilder av topppärlor respektive bilder av nederkantpärlor (kompletterande figur S6). AnViM analyserar sedan styv rörelse i bilderna av de nedre pärlorna och skapar en "phs" mapp som innehåller en korrigerad överförd ljusbild av cellerna och en "tny" mapp som innehåller uppdaterade topppärlor bilder. Slutligen sparas användarval för kanaler, operationer, tolerans, pixelstorlek och gränsövergång i filen "analysisChoices.txt" (kompletterande figur S6).
- Kvantifiering av deformation av hydrogel och monoskikt
OBS: Det är viktigt att notera att kvantifiering av rörelse från en sekvens av bilder är ett snabbt föränderligt fält19. Tekniken är ständigt optimerad för funktioner, inklusive hastighet, noggrannhet, specifika funktioner i de råa bilderna och specifika deformationsmönster. Därför är det troligt att vissa användare kan använda en annan deformationskvantifieringsmetod än den som presenteras här.-
Del 1: Kvantifiering av hydrogeldeformation
Manuella indata i det här steget inkluderar identifiering av datakatalog och val av rutnätsupplösning. Viktiga tidigare skapade filer som används i det här steget inkluderar "p*/tny/*.tif". Viktiga nya filer som produceras i detta inkluderar "p */displacement/*_disp.dat" som listar deplacementvektorer av hydrogelens övre yta. Se figur 6 för visuell beskrivning av följande steg för att via AnViM engagera partikelbilds velocimetry-analysen på de övre pärlornas bilder20.- Starta Fiji-programvaran och välj MSM - Gel Deformation från rullgardinsmenyn MSM .
- Härifrån väljer du det alternativ som är lämpligt för experimentet.
- Med hjälp av dialogrutan filwebbläsaren väljer du den överordnade katalogen för "analysmappen" som innehåller analyserade data.
- I fönstret Parametrar för beräkning av geldeformation väljer du lämplig fönsterstorlek, ljudnivå och tröskelvärde (kompletterande figur S7)20.
OBS: Resultaten sparas i en nyskapad "förskjutningskatalog" i varje positionmapp "analys/p0, analys/p1", etc. Det är här alla utdatafiler lagras.
-
Del 2: Kvantifiering av monoskiktsdeformation
Manuella indata i det här steget inkluderar identifiering av datakatalogen och val av rutnätsupplösning. Viktiga tidigare skapade filer som används i det här steget inkluderar "p*/tny/*.tif". Viktiga nya filer som produceras i detta inkluderar "p */velocity/*_vel.dat" som listar rörelsevektorer i cellerna. Se figur 7 för den visuella beskrivningen av stegen för att via AnViM engagera partikelbilds velocimetry-analysen på de översta pärlornas bilder20. Proceduren liknar den som följs för kvantifiering av hydrogeldeformation och väljer MSM - Cellular Motion från MSM-rullgardinsmenyn. Resultaten sparas i en nyskapad hastighetskatalog i varje positionsmapp "analys/p0", "analys/p1", etc.
-
Del 1: Kvantifiering av hydrogeldeformation
- Kvantifiering av cell-ECM och cell-cell krafter
Manuell inmatning i det här steget inkluderar identifiering av datakatalogen, indikerar hydrogelstelhet och svar på cellulära klustersegmenteringsmeddelanden för att identifiera celler från området utan celler. Viktiga tidigare skapade filer som används i det här steget inkluderar "p*/displacement/*_disp.dat". Viktiga nya filer som produceras i detta steg inkluderar: "p*/traction/*_trac.dat", som listar krafter som utövas av cellerna på hydrogelen; "p*/traction/*_domain.dat", som anger placeringen av rutnätspunkter som innehåller celler. och mata in filer 'p*/traction.in, p*/clusterInput.txt' och 'p*/prestress.in' som registrerar användarval för det här steget. Efter den första kvantitativa bedömningen av cell-ECM och cell-cell krafter, flera variationer till tekniken har utvecklats1,15. Variationerna fokuserar på särskilda fall av substrat, celler, experimentella förhållanden eller numeriska verktyg7,8,21,22. Se figur 8 för den visuella beskrivningen att aktivera via AnViM, Fourier Transform Traction Microscopy och Monolayer Stress Microscopy analys på hydrogel deformation data1,2,15.- Starta Fiji-programvaran och välj MSM - Cell-ECM och Cell-Cell Forces (tredje alternativet i rullgardinsmenyn) på den nedrullningsbara menyn MSM - Cell-ECM och Cell-Cell Forces (tredje alternativet i den nedrullningsbara menyn).
- Med hjälp av dialogrutan filwebbläsaren väljer du den överordnade katalogen för "analysmappen" som innehåller mapparna "tnimgs" och "analys" som innehåller analyserade data. Klicka på Välj.
- I fönstret Parametrar för beräkning av cellulära krafter anger du skjuvmodulen, tjockleken på hydrogelen och den förväntade ljudnivån. Välj OK. Detta gör att den kan utföra dragkraft via MATLAB-funktionen.
Efter dessa indata beräknar AnViM cell-ECM-krafter. - Därefter anger du om monolagret är sammanflöde. Om hela cellbilden är täckt med celler är svaret Ja. I så fall beräknas cellcellskrafterna över hela ramen. Å andra sidan, om en del av bilden inte har celler, är svaret Nej. I så fall följer du AnViM-uppmaningar för att underlätta segmentering av bildområdet som innehåller celler.
- Om svaret är nej ritar du en polygon manuellt runt icke-cellobjektet när programvaran uppmanas att göra det och väljer sedan en lämplig metod för segmentering. Programvaran kommer att be om färgen (svart eller vit) på cellerna.
- Markera alternativet Fyllningsfläckar automatiskt i programvaran och klicka på OK.
OBS: Stegen för segmentering av ett icke-sammanflödesmonolayer kommer att omfattas av den första delen av avsnitt 2.4. Cell-ECM-krafter lagras i "*_trac.dat" filer i en nyskapad katalog "traction" i varje positionsmapp, och indata till cell-ECM-kraftberäkningsprogrammet sparas i filen "traction.in" (kompletterande figur S8). Cellcellskrafter lagras i *_prestress.dat-filer i en nyskapad katalog "prestress" i varje position mapp, och indata till cell-cell kraftberäkningsprogramvaran sparas i filen "prestress.in" (kompletterande figur S9).
- Mappa rutnätspunktvärden på enskilda celler
OBS: Ett av iTACS nuvarande fokus är att införa ett enkelt tillvägagångssätt för att tolka de uppmätta mekaniska signalerna i fältet. Detta tillvägagångssätt är fördelaktigt för att undersöka mekaniska interaktioner mellan närliggande celler i ett kluster18. Sammantaget finns de egenskaper som kvantifierats hittills på regelbundet åtskilda rutnätspunkter över cellklustret. Dessa data identifierar median-, medelvärdes- och standardavvikelse för valda egenskaper inom den morfologiska gränsen för enskilda celler och tilldelar dem som cellulära fysiska egenskaper/signaler. Från dessa används standardavvikelsen för att ange variabilitet, skillnaden mellan medelvärde och median används för att ange fördelningens art och medianvärdet används för att ange cellernas totala tillstånd för de valda egenskaperna.- Del 1: Segmentering av bildområdet som innehåller celler
Manuell inmatning till det här steget inkluderar identifiering av datakatalog och svar på segmenteringsmeddelandena för att identifiera celler från området utan celler. Viktiga tidigare skapade filer som används i det här steget inkluderar "p*/phs/*.tif". Viktiga nya filer som produceras i det här steget inkluderar "p*/phs/bwImages/*.tif" som är binära bilder som skiljer cellområden från celler, "p*/phs/textResults/frameNum_percentHealed.txt", som listar procent bildområde som täcks av celler i varje enskilt fall, och "p*/clusterInput.txt", som registrerar användargränssnitt som anges i AcTRM-gränssnittet. Se bild 9 för den visuella beskrivningen av följande steg för att segmentera bildområdet som innehåller celler. Den här delen måste slutföras innan cellcellskrafterna datorförs. I så fall behöver dessa steg inte upprepas. Om dessa steg utförs före cell-cellkraftberäkningarna begärs de inte i början av kraftberäkningarna.- Starta Fiji-programvaran och välj Segmentering - Cellular Cluster på den nedrullningsbara MSM-menyn.
- Med hjälp av dialogrutan för filwebbläsaren väljer du positionskatalogen "analys/p0", "analys/p1" etc., som innehåller egenskaper som kvantifierats på regelbundet fördelade rutnätspunkter.
- Ange om monolagret är sammanflöde.
STEGEN nedan anropas endast när monolagret inte är sammanflöde. Följ AnViM-uppmaningar om att tillämpa den nya flerdelade metoden för att identifiera de bildregioner som innehåller celler. Processen involverar fyra metoder - var och en närmar sig segmentering på ett annat sätt. En eller flera av dessa metoder som används i kombination täcker en mängd olika bilder av cellerna. Prova därför olika metoder för att hitta vilken kombination som fungerar bäst för deras data. - Justera "Domänanslutningsfaktorn" och "Smear-faktorn" för att uppnå optimal segmentering.
OBS: "Utstryksfaktorn" gör de regioner som innehåller celler större. - Ange om cellerna visas svartvitt i den binära bilden.
- I fönstret Vägbeskrivning för att rensa gränsbilden väljer du om bilden ska rensas automatiskt eller manuellt.
Oönskade funktioner i bilderna är svarta fläckar på pixlarna som upptas av celler och vita fläckar på pixlarna som är frånkopplade från cellklustret som ska analyseras. Analys kan endast göras på de regioner som är anslutna. Så flera frånkopplade regioner måste analyseras separat.
- Del 2: Segmentering av de enskilda cellerna i bilderna
Manuella indata till det här steget inkluderar identifiering av datakatalogen och svar på segmenteringsmeddelandena för att identifiera enskilda celler i bilden. Viktiga tidigare skapade filer som används i det här steget inkluderar "p*/phs/*.tif" och "p*/phs/bwImages/*.tif". Viktiga nya filer som produceras inkluderar "p*/phs/textResults/*.csv", som innehåller cellulära morfologiska egenskaper. Se bild 10 för visuell beskrivning av följande steg för att segmentera enskilda celler i monolagret.- Starta Fiji-programvaran och välj Segmentering - enskilda celler på den nedrullningsbara MSM-menyn.
- Med hjälp av dialogrutan för filwebbläsaren väljer du positionskatalogen "analys/p0", "analys/p1" etc., som innehåller egenskaper som kvantifierats på regelbundet fördelade rutnätspunkter.
- I fönstret Välj indataparametrar anger du det maximala bildförhållandet, framträdandet för hur mycket cellcentret sticker ut jämfört med cellgränsen och två suddiga parametrar för att styra identifieringen av cellerna (kompletterande figur S10).
- Rita en polygon på den minsta normala cellen i bildstacken för varje position. Detta används för att beräkna området. Allt mindre än detta kommer inte att betraktas som en cell av programvaran.
- Rita sedan en polygon runt den största normala cellen och ange om cellcentret eller cellcellsgränssnittet är ljusare.
AnViM skapar sedan filer "phs/textResults/0001.csv", "phs/textResults/0002.csv" , etc., för varje bildruta som innehåller information om celler inom ramen. I detta skede innehåller denna fil morfologisk information om cellerna, inklusive område, centroid, omkrets, orientering, cirkularitet, bildförhållande, avrundadhet, soliditet, avstånd från no-cell-regionen. Längdenheten i dessa egenskaper är pixlar och vinkeln är i grader. Slutligen uppdateras den här filen så att den innehåller cellulär pixelintensitet, rörelse och krafter i de efterföljande stegen.
- Del 3: Kartläggning av pixelintensiteterna på cellerna
Manuella indata i det här steget inkluderar identifiering av datakatalogen och val av mappningsegenskaper och parametrar. Viktiga tidigare skapade filer som används i det här steget inkluderar "p*/phs/*.tif" (eller "p*/fluo/*.tif" och "p*/phs/bwImages/*.tif". Viktiga nya filer som produceras i det här steget inkluderar "p*/phs/textResults/*.csv", som listar cellulära morfologiska egenskaper. Se bild 11 för visuell beskrivning av följande steg för att bedöma pixelintensiteterna i regionen som omfattas av enskilda celler och deras närliggande region och definiera dem som cellers egenskaper.- Starta Fiji-programvaran och välj Karta på celler - intensiteter på den nedrullningsbara MSM-menyn.
- Med hjälp av dialogrutan för filwebbläsaren väljer du positionskatalogen "analys/p0", "analys/p1" etc., som innehåller egenskaper som kvantifierats på regelbundet fördelade rutnätspunkter.
- Välj Identifiera celldelning eller kvantifiera cellulär fluorescens när du uppmanas av programvaran. Definiera storleken på grannregionen. Markera både insamlingsegenskaper för grannregionen och Samla in egenskaper för cellerna. Klicka på OK.
- I fönstret Spela in cellintensiteten anger du vilken typ av bild som ska användas för intensitetsmappning, storleken på grannregionen och om data samlas in för enskilda celler eller båda cellerna och deras angränsande regioner (kompletterande figur S11).
OM du mappar pixelintensiteten i en faskontrastbild kan du identifiera celldelningshändelser. Kartläggning av fluorescerande bildintensiteter gör det möjligt att upptäcka fluktuationer i de fluorescerande taggade cytoplasmiska molekylerna. Utdata för ovanstående steg är medelvärdet, medianvärdet, standardavvikelsen, minimi- och maximivärdena för pixelintensitet för enskilda celler. Dessa siffror anges som nya kolumner i filerna "phs/textResults/0001.csv", "phs/textResults/0002.csv" , etc.
- Del 4: Kartläggning av krafter och rörelse på cellerna
Manuella indata till det här steget inkluderar identifiering av datakatalogen och val av mappningsegenskaper och parametrar. Viktiga tidigare skapade filer som används i det här steget inkluderar "p*/phs/textResults/*.csv", "p*/velocity/*_vel.dat", "p*/displacement/*_disp.dat", "p*/traction/*_trac.dat", "p*/prestress/*_prestress.dat" och "p*/phs/bwImages/*.tif". Inga nya filer skapas under det här steget. I stället läggs den nya informationen (cellulär kraft och rörelseegenskaper) till i filerna "p*/phs/textResults/*.csv". Se figur 12 för visuell beskrivning av stegen för att bedöma krafter och rörelser i regionen som omfattas av enskilda celler och deras närliggande region och definiera dem som cellers egenskaper.- Välj mellan den nedrullningsbare MSM-menyn Karta över celler - rörelse/kraftdata (kompletterande figur S12).
- Följ sedan stegen i steg 2.4.3.
OBS: Nya kolumner läggs till i filerna "phs/textResults/0001.csv", "phs/textResults/0002.csv", etc. och inkluderar medelvärdet, medianen och standardavvikelsen för hastighet, hastighetsorientering, genomsnittlig cytoskeletalspänning, spänningsanisotropi, belastningsenergi i hydrogelen, orienteringen av den högsta spänningen och storleken på cell-ECM-dragkraft (Kompletterande figur S13).
- Del 1: Segmentering av bildområdet som innehåller celler
- Visualisering av resultat
- Del 1: Spårning av de cellulära identiteterna i experimentet
Manuella indata till det här steget inkluderar identifiering av datakatalogen och val av mappade egenskaper för att visualisera. Viktiga tidigare skapade filer som används i det här steget inkluderar "p*/phs/textResults/*.csv". Viktiga nya filer som produceras under detta steg inkluderar "p*/phs/textResults/cellTimeTrace_*.csv", som innehåller en tidsspårning av mobildata. Se bild 13 för visuell beskrivning av följande steg för att spåra egenskaperna hos enskilda celler under hela experimentets varaktighet.- Starta Fiji-programvaran och välj Resultat - Spåra data på den nedrullningsbara MSM-menyn.
- Med hjälp av dialogrutan för filwebbläsaren väljer du positionskatalogen "analys/p0", "analys/p1" osv., som innehåller cellulära egenskaper som ska spåras. När du är klar klickar du på Välj.
- I fönstret Välj startpunkt för spårning väljer du startramen för övervakning och antalet bildrutor som spåras samtidigt (kompletterande figur S14). Börja alltid från bildruta 2 eftersom hastigheten inte kan bestämmas för bildruta nummer 1. När du är klar klickar du på OK.
- I fönstret Markera variablerna för att göra spår väljer du variablerna antingen genom att skriva variabelnamnen eller välja termer i kryssrutorna (Kompletterande figur S15). Klicka sedan på OK.
Observera: Spårning genererar "phs/textResults/cellTimeTrace_*.csv"-filer där varje kolumn innehåller ett unikt cellnummer och varje rad som representerar den på varandra följande tidsinstansen.
- Del 2: Generering av tidsspår av de bedömda cellulära egenskaperna
Manuella indata till det här steget inkluderar identifiering av datakatalogen och val av mappade egenskaper för att visualisera. Viktiga tidigare skapade filer som används i det här steget inkluderar "p*/phs/textResults/cellTimeTrace_*.csv". Viktiga nya filer som produceras under detta steg inkluderar "p*/phs/trackedDataPlots/*.tif", som innehåller tidsspårsdiagram och "p*/phs/trackedDataPlots/*.csv", som innehåller diagramdata. Se bild 14 för visuell beskrivning av följande steg för att generera tidsspår för de bedömda cellulära egenskaperna.- Starta Fiji-programvaran och välj Resultat - plot på den nedrullningsbara MSM-menyn.
- Med hjälp av dialogrutan för filwebbläsaren väljer du positionskatalogen "analys/p0", "analys/p1" etc., som innehåller spårade cellulära egenskaper som ska ritas.
- Välj om du vill begränsa intrigen till celler med obrutna spår genom att klicka på knappen Ja eller Nej .
Det här alternativet ignorerar cellerna, som inte kunde identifieras i en eller flera tidsinstanser. - Välj antalet variabler som ska ritas samtidigt och klicka på OK.
Obs: För närvarande tillåter AnViM att högst tre variabler visas i samma diagram. - Välj enskilda variabler för att rita med en rullgardinsmeny.
Obs: De här stegen skapar en TIFF-fil (Tagged Image File Format) och en kommaavgränsad datafil i mappen 'phs/trackedDataPlots/'. Filnamnet består av variabelnamn avgränsade med ett understreck och slutar med ett cellnummer.
- Del 3: Generering av värmekartor över de bedömda cellulära egenskaperna
Manuella indata i det här steget inkluderar identifiering av datakatalogen och val av mappade egenskaper för att visualisera. Viktiga tidigare skapade filer som används i det här steget inkluderar "p*/phs/textResults/cellTimeTrace_*.csv". Viktiga nya filer som genereras i det här steget inkluderar 'p*/phs/segmentedImages/cellPropMaps/*.tif', som är värmekartor för cellulära egenskaper. Se figur 15 för visuell beskrivning av stegen för att generera värmekartor över de bedömda cellulära egenskaperna.- Välj på den nedrullningsbare MSM-menyn Resultat - Bild.
- Följ stegen i steg 2.5.2.
Utdata lagras som TIFF-filfiler i mappen 'phs/segmentedImages/cellPropMaps/'. Filnamnen är tidsinstansnumret och variabelnamnet avgränsade med ett understreck.
- Del 1: Spårning av de cellulära identiteterna i experimentet
Representative Results
Vi presenterar här två av de viktigaste resultaten för det demonstrerade exemplet. Den första utmatningen är tidsspåret av cellulär hastighet och cytoskeletal spänning för cell nummer 1 (figur 16). Egenskaperna visas på en delad lodrät axel för att underlätta den visuella associationen mellan egenskaperna och den vågräta axeln anger tidsinstansnummer. I detta experiment förvärvades successiva ramar med ett intervall på 15 minuter. Den andra utgången är en rad värmekartor 1 h in i experimentet (figur 17). De egenskaper som visas här inkluderar spridningsområde, orientering, cirkularitet, hastighet, rörelseriktning, maximal spänningsorientering, cytoskeletal spänning, substrat dragkrafter och spännings anisotropi av enskilda celler.
Bild 1: Struktur av integrativ verktygslåda för att analysera cellulära signaler (iTACS). Två viktiga komponenter i iTACS är förvärvs- och utbildningsmodul (AcTrM) och analys- och visualiseringsmodul (AnViM). AcTrM kan använda olika hydrogelberedningstekniker som för närvarande finns för att förbereda hydrogeler som kan hållas fast på ett mikroskopstadium, eventuell cellsådd och ett tillväxtprotokoll som behåller celler i ett fokalplan. AnViM kan använda olika tekniker för att kvantifiera hydrogel- och monolagerdeformation, cell-ECM-krafter och cellcellskrafter. Alla dessa användarförsedda komponenter i kraftmätningsprotokollet kan rymmas i iTACS, och de har identifierats med streckade lådor. De komponenter som identifieras med fasta lådor är nya bidrag till cellulär kraftmätningsteknik. Visualisering i AnViM fokuserar på medianvärdet och variabiliteten för egenskaperna mellan enskilda celler. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 2: Referensbildförvärv - del 1. Steg för att skapa en positionslista med AcTrM. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 3: Referensbildförvärv - del 2. Steg för att hämta referens avbildningar med AcTrM. Detaljerade vyer av steg 2, 4 och 6 presenteras i tilläggssiffrorna S2, S3 respektive S4. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 4: Automatiserat bildförvärv för det återstående experimentet. Steg för att återuppta bildförvärv för att bedöma cellulärt beteende med AcTrM. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 5: Ställa in automatiserad dataanalys. Steg för att påbörja automatiserad avbildningsanalys med AnViM. Programvaran känner igen bildformatet som används av AcTrM. En detaljerad översikt över panelerna i steg 3 och 5 presenteras i kompletterande figur S5 respektive kompletterande figur S6. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 6: Kvantifiering av deformation av hydrogel och monoskikt - del 1. Steg för att via AnViM engagera partikelbildsvelocimetryimplementering av Tseng, Q. et al., PNAS (2012)20 för att kvantifiera deformationen av hydrogelens övre yta. Användare kan också implementera inom AnViM andra metoder för att kvantifiera hydrogeldeformation. En detaljerad bild av steg 3 presenteras i kompletterande figur S7. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 7: Kvantifiering av deformation av hydrogel och monoskikt - del 2. Åtgärder för att via AnViM engagera partikelbildsvelocimetryimplementering av Tseng, Q. et al., PNAS (2012)20 för att kvantifiera den lokala rörelsen hos enskilda celler. Användare kan också implementera inom AnViM andra metoder för att kvantifiera cellulär rörelse. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Figur 8: Kvantifiering av cell-ECM och cellcellskrafter. Steg för att utföra bildanalys för att via AnViM engagera Fourier Transform Traction Microscopy-implementeringen av Trepat et al., Nature Physics (2009)15 för att kvantifiera krafter som utövas av cellerna på hydrogelen och Monolayer Stress Microscopy-implementeringen av Tambe et al., Nature Materials (2011)1 för att kvantifiera krafter inom enskilda celler och mellan närliggande celler. Användare kan också implementera inom AnViM andra metoder för att kvantifiera cell-ECM och cell-cell krafter. En detaljerad översikt över steg 6 presenteras i kompletterande figur S8 och kompletterande figur S9. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 9: Mappa rutnätspunktvärden på enskilda celler - del 1. Steg för att segmentera bildregionerna som innehåller celler med en ny flerdelad metod. Den här metoden kan användas för att segmentera faskontrast-, ljusfälts- eller fluorescensbilder av cellerna. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 10: Mappa rutnätspunktvärden på enskilda celler - del 2. Steg för att segmentera enskilda celler i ett monolager med hjälp av en ny multipronged metod som utvecklats i AnViM. Den här metoden kan användas för att segmentera faskontrast-, ljusfälts- eller fluorescensbilder av cellerna. En detaljerad översikt över steg 2 presenteras i kompletterande figur S10. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 11: Mappa rutnätspunktvärden på enskilda celler - del 3. Steg för att bedöma pixelintensiteter i regionen i enskilda celler och inom den närliggande regionen för enskilda celler med anvim. De bedömda intensiteterna inkluderar överförd ljusintensitet och fluorescensintensitet. Den här delen mappar medianvärdet och standardavvikelsen för pixelintensiteterna i enskilda celler och inom ett närliggande område av enskilda celler. En detaljerad översikt över steg 2 presenteras i kompletterande figur S11. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 12: Mappa rutnätspunktvärden på enskilda celler - del 4. Steg för att bedöma rutnätspunkternas krafter och rörelseegenskaper i enskilda celler och inom den närliggande regionen för enskilda celler med anvim. Den här delen kartlägger medianvärdet och standardavvikelsen för egenskaperna i enskilda celler och inom en angränsande region av enskilda celler. En detaljerad översikt över steg 2 och 3 presenteras i kompletterande figur S12 och kompletterande figur S13. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 13: Visualisering av resultat - del 1. Steg för att spåra egenskaper för enskilda celler under hela experimentets varaktighet med AnViM. En detaljerad översikt över steg 2 och 3 presenteras i kompletterande figur S14 och kompletterande figur S15. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 14: Visualisering av resultat - del 2. Steg för att generera tidsspårningar av de bedömda egenskaperna med AnViM. Användaren har möjlighet att rita upp till tre egenskaper i ett diagram. Tidsspårningar genereras för antingen alla celler eller endast de celler för vilka spårningen lyckades i hela experimentet. En detaljerad bild av steg 5 presenteras i kompletterande figur S16 och kompletterande figur S17. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 15: Visualisering av resultat - del 3. Steg för att generera värmekartor över de bedömda egenskaperna med AnViM. Värmekartor genereras för alla bildrutor som följer startramen och alla valda egenskaper. En detaljerad översikt över steg 3 presenteras i kompletterande figur S18. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 16: Tidsspår för cell-ID 1. Två egenskaper som visas är den cellulära cytoskeletala spänningen ("avgtenMedian") och cellulär hastighet ("speedMedian"). Både cellulär cytoskeletal spänning och cellulär hastighet kvantifieras som medianvärdet över rutnätspunkterna i cellerna. De två egenskaperna ritas på samma axel med godtyckliga enheter för att visualisera relationer mellan de bedömda egenskaperna. Ytterligare variabelnamn visas i tilläggstabell S1. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild 17: Värmekartor över enskilda cellers egenskaper i det analyserade monolagret. Varje cell färgas med medianvärdet för den egenskap som anges på panelen. Således indikerar djuprött det maximala cellvärdet i färgspektrumet, och djupblå indikerar det minsta cellvärdet över det analyserade monolagret. Som beskrivs i Tambe et al., PLoS One (2013)2, har cellerna som ligger närmare gränsen mekaniska krafter som påverkas av okända egenskaper hos cellerna utanför bilden. Därför genereras värmekartan för celler långt från gränsen. Klicka här för att se en större version av den här figuren.
Bild S1: Exempelbilder av den övre och nedre fluorescerande pärlan. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Figur S2: En detaljerad vy över steg 2 från figur 3. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Figur S3: En detaljerad vy över steg 4 från figur 3. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Figur S4 A: Detaljerad vy över steg 6 från figur 3. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Figur S5: En detaljerad vy över steg 3 från figur 5. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Figur S6: En detaljerad vy över steg 5 från figur 5. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Figur S7: En detaljerad vy över steg 3 från figur 6. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Figur S8: En detaljerad vy över cell-ECM-kraftutgången i steg 6 från figur 8. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Figur S9: En detaljerad vy över cellcellskraftutgången för steg 6 från figur 8. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Figur S10: En detaljerad vy över steg 2 från figur 10. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Figur S11: En detaljerad vy över steg 2 från figur 11. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Figur S12: En detaljerad vy över steg 2 från figur 12. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Figur S13: En detaljerad vy över utgången av steg 3 från figur 12. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Figur S14: En detaljerad vy över steg 2 i figur 13. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Figur S15: En detaljerad vy över steg 3 från figur 13. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Figur S16: En detaljerad vy över datafiler som genereras i steg 5 från figur 14. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Figur S17: En detaljerad vy över en tomt som genereras i steg 5 från figur 14. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Figur S18: En detaljerad vy över en värmekarta och filen som innehåller färgspektrumets räckvidd som genereras i steg 4 från figur 15. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Tabell S1: En lista över valda egenskaper som kvantifierats av iTACS. Klicka här för att ladda ner den här tabellen.
Discussion
Vidhäftande celler använder både mekaniska och kemiska signaler för att överleva, växa och fungera. Ett brett utbud av mikroskopiprogramvara optimerar användarupplevelsen vid bedömning av de kemiska signalerna genom fluorescensbaserad avbildning. Bedömning av de mekaniska signalerna innebär dock funktioner som inte är tillgängliga i standardmikroskopiprogramvaran. Dessutom är bedömningen av mekaniska signaler mest effektiv när datainsamling integreras med dataanalys. Bristen på en enhetlig plattform som uppfyller de unika behoven av mekanisk signalbedömning har varit en stor teknisk lucka inom experimentell cellbiologi. Den integrativa verktygslådan för att analysera cellulära signaler (iTACS) är utformad för att möta detta gap. De två komponenterna i iTACS, AnViM och AcTrM, utrustar användarna med de nödvändiga funktionerna för att kvantifiera cellulära egenskaper hos fyra breda kategorier: krafter, rörelse, morfologi och fluorescens / ljusstyrka. I dessa kategorier kan iTACS för närvarande avslöja mer än 50 unika aspekter av enskilda vidhäftande celler. Dessa aspekter omfattar specifika egenskaper hos varje bred kategori, inklusive deras representativa värde och variabilitet i hela cellen (kompletterande tabell S1). Till exempel, inom krafterna finns det dragkrafter över cytoskeletonen, anisotropi av denna spänning, orienteringen av maximal spänning och skjuvningsstress över cell-ECM-gränssnittet som har en djupgående inverkan på beteendet hos vidhäftande celler1,3,6.
Ett nytt tillvägagångssätt för att undersöka det mekaniska beteendet hos enskilda celler i ett monoskikt
Enskilda celler i ett monoskikt är engagerade i ett utbyte av signaler av kemisk och mekanisk natur3. Dessa två typer av signaler överförs över det cellulära monolagret på ett annat sätt23. Den mekaniska signalöverföringskunskapen släpar dock efter den för kemisk signalöverföring. Detta kunskapsgap sammanfaller med en ihållande brist på enkla och intuitiva metoder för att bedöma cellulära mekaniska signaler. Den nya datamappningsmetoden som beskrivs här är utrustad för att fylla detta tomrum. Sådan mappning visar att fluktuationer i inneboende cytoskeletal spänningar i den närliggande regionen av en cell fungerar som avslappning, fluidisering och förankring signaler som reglerar förändringar i cellulära form, storlek och hastighet av cellen18. Kartor över angränsande regioners egenskaper uppvisar "multicellulära indelningsmönster" där celler inom underindelningen utsätts för en relativt enhetlig mikromiljö och cellerna vid indelningens gräns utsätts för en anmärkningsvärt icke-enhetlig mikromiljö18.
Framt2s för kraftmätningstekniken
Det finns en mängd olika protokoll för att göra PAA-hydrogeler, analysera hydrogeldeformation och cellulär rörelse och kvantifiera cell-ECM- och cellcellskrafter1,2,7,8,9,13,14,15,18,20,21,24,25,26,27 28,29,30,31,32. Denna utveckling är dock utom räckhåll för vanliga cellbiologiska laboratorier och begränsad till laboratorier med teknisk expertis. Genom att automatisera de tekniska aspekterna av dessa tillvägagångssätt och integrera dem under en enhetlig och användarvänlig plattform är målet med iTACS att göra bedömningen av mekaniska signaler till en rutinaktivitet inom experimentell cellbiologisk forskning och utbildning.
ImageJ tillåter användare att utveckla program med metoder som skulle kräva liten eller ingen utbildning11. iTACS är till stor del byggt med enkla skriptmetoder för att underlätta samhällsdriven fortsatt utveckling. En stor del av AcTrM programmeras med BeanShell-skript, och huvuddelen av AnViM programmeras med ImageJ Macros. Dessa skript och vägledning för att implementera dessa funktioner i användarens mikroskop är tillgängliga via GitHub (https://github.com/IntegrativeMechanobiologyLaboratory/iTACS).
Kvalitetsstandardisering av de förvärvade bilderna
Även om de elastiska substratbaserade teknikerna för att kvantifiera fysiska krafter i vidhäftande celler har utvecklats och implementerats i olika laboratorier, saknar protokollet fortfarande standardisering. Ett område som behöver standardiseras mest är kvaliteten på de förvärvade topppärlornas bilder (kompletterande figur S1). Betydande problem uppstår från drift i fokus under hela experimentet. Vår nya referensbildsbaserade omfokuseringsmetod gör en sådan fokusering till en objektiv process. De parametrar som definieras i actrm:s allra första steg inför nödvändiga objektiva kvalitetsgränser. Andra standardiseringsåtgärder kan programmeras i framtida versioner av AcTrM.
Den breda tillämpligheten av iTACS
Förutom att kvantifiera många aspekter av vidhäftande celler underlättar iTACS-strukturen dess användning för olika experimentella protokoll och behov. AcTrM möjliggör programvarustyrd användarutbildning. Höghastighetsavbildning som krävs för till exempel samtidig bedömning av cytoplasmiska kalciumfluktuationer begränsas för närvarande av hastigheten för ompositionering och omfokusering av hårdvara och görs bäst på en plats i taget. Den nuvarande implementeringen är dock väl utrustad för långsiktig avbildning, avbruten avbildning, där provet inte kan behållas på mikroskopstadiet under hela experimentets varaktighet. Eftersom referensbilderna förvärvas i början av experimentet möjliggör iTACS realtidsavbildning av mekaniska signaler, vilket öppnar nya vägar i ansökningar om läkemedelsscreening. AnViM gör det möjligt för användare att tillhandahålla mycket teknisk information i lekmannatermer. Förmågan att kvantifiera ett brett spektrum av cellulära egenskaper och spåra dem under hela experimentet utgör kritiska förmågor som behövs för att upptäcka nya intercellulära kommunikationsmekanismer.
För den framtida utvecklingen av iTACS har vi identifierat fyra fokusområden: (1) förbättring av datainsamling och dataanalyshastighet, (2) implementering av metoder för att bedöma nya cellulära signaler13, (3) utveckling av workshops och utbildningsmoduler om iTACS-baserad cellulär signalbedömning, (4) utveckling av billiga automatiseringslösningar.
Disclosures
Författarna förklarar inga intressekonflikter.
Acknowledgments
D.T.T. tackar personal ansluten till Center for Lung Biology vid University of South Alabama för att stimulera diskussioner om de experimentella cellbiologiska forskningsbehoven. Dessa diskussioner var avgörande för att inleda utvecklingen av iTACS.
Detta arbete stöddes delvis av bidrag från National Institute of Health/National Heart Lung Blood Institute, P01 HL66299 och R37 HL60024 (Stevens), R01-HL118334 (Alvarez), F32-HL144040-01 (Xu), och från University of South Alabama genom Abraham Mitchell Cancer Research Fund (Singh, Palanki, Tambe), Research and Scholarly Development Grant (Singh, Palanki, Tambe).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents and components used in prepare glass surface for hydrogel coating | |||
| (3-Aminopropyl)trimethoxysilane, 97% | Aldrich chemistry | 13822565 | |
| 2% Bis Solution | Bio-rad | 1610142 | |
| 3-(Trimethoxysilyl)propyl methacrylate,98% | Acros organics | 2530850 | |
| 40% Acrylamide Solution | Bio-rad | 1610140 | |
| Glass bottom 35 mm dish/ 6 or 12 or 24 well plates | MatTek or CellVis | ||
| Glutaraldehyde, EM Grade, 25% | Polysciences | 1909100 | |
| Sodium Hydroxide | Sigma-aldrich | 1002074706 | |
| Reagents and components used in preparing suitable hydrogel | |||
| 2% Bis Solution | Bio-rad | 1610142 | |
| 40% Acrylamide Solution | Bio-rad | 1610140 | |
| Ammonium Persulfate | Bio-rad | 1610700 | |
| Cover Slips | Electron Microscopy Sciences | 7222301 | |
| Dulbecco's Phosphate Buffered Saline (1M) | Gibco | 14190136 | |
| FluoSpheres carboxylate 0.2 um, yellow-green(505/515) | Invitrogen | F8811 | |
| FluoSpheres carboxylate 0.5 um, red(580/605) | Invitrogen | F8812 | |
| FluoSpheres carboxylate 2.0 um, red(580/605) | Invitrogen | F8826 | |
| Rain-X | |||
| TEMED | Bio-rad | 1610801 | |
| Reagents used in coating extracellular matrix on the hydrogel | |||
| Collagen Type I Rat Tail | Corning | 354236 | |
| HEPES(1M) | Gibco | 15630080 | |
| Phosphate Buffered Saline (1M) | Gibco | 10010023 | |
| Sulfo-SANPAH | CovaChem | 102568434 | |
| Microscope hardware used in the current study | |||
| Camera | Hamamatsu Flash 4.0 LT sCMOS Camera | C11440-42U | |
| H117 ProScanTM Stages | Prior Scientific | ||
| Light source- Lambda DG4 and Lambda DG5 | Sutter instrument company | ||
| Microscope | Nikon eclipse TE2000-S | 550372 | |
| ProScan III Universal Microscope Automation Controller | Prior Scientific | ||
| Stagetop incubator | ibidi | 11922 | |
| Stepper Motor Focus Drive | Prior Scientific |
References
- Tambe, D. T., et al. Collective cell guidance by cooperative intercellular forces. Nature Materials. 10 (6), 469-475 (2011).
- Tambe, D. T., et al. Monolayer stress microscopy: limitations, artifacts, and accuracy of recovered intercellular stresses. PloS One. 8 (2), 55172 (2013).
- Das, T., et al. A molecular mechanotransduction pathway regulates collective migration of epithelial cells. Nature Cell Biology. 17 (3), 276-287 (2015).
- Vedula, S. R., et al. Mechanics of epithelial closure over non-adherent environments. Nature Communications. 6, 6111 (2015).
- Lamason, R. L., et al. Rickettsia Sca4 reduces vinculin-mediated intercellular tension to promote spread. Cell. 167 (3), 670-683 (2016).
- Sunyer, R., et al. Collective cell durotaxis emerges from long-range intercellular force transmission. Science. 353 (6304), 1157-1161 (2016).
- Dong, L., Oberai, A. A. Recovery of cellular traction in three-dimensional nonlinear hyperelastic matrices. Computer Methods in Applied Mechanics and Engineering. 314, 296-313 (2017).
- Nier, V., et al.
- Serrano, R., et al.
- Schneider, C. A., Rasband, W. S., Eliceiri, K. W. NIH Image to ImageJ: 25 years of Image Analysis. Nature Methods. 9 (7), 671-675 (2012).
- Schindelin, J., et al. Fiji - an Open Source platform for biological image analysis. Nature Methods. 9 (7), 676-682 (2012).
- Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. Computer control of microscopes using microManager. Current Protocols in Molecular Biology. , Chapter 14, Unit14 20 (2010).
- Patel, N. G., et al. Unleashing shear: Role of intercellular traction and cellular moments in collective cell migration. Biochemical and Biophysical Research Communications. 522 (2), 279-285 (2020).
- Yeung, T., et al. Effects of substrate stiffness on cell morphology, cytoskeletal structure, and adhesion. Cell Motility and the Cytoskeleton. 60 (1), 24-34 (2005).
- Trepat, X., et al. Physical forces during collective cell migration. Nature Physics. 5, 426-430 (2009).
- Aratyn-Schaus, Y., Oakes, P. W., Stricker, J., Winter, S. P., Gardel, M. L. Preparation of complaint matrices for quantifying cellular contraction. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (46), (2010).
- King, J., et al. Structural and functional characteristics of lung macro- and microvascular endothelial cell phenotypes. Microvascular Research. 67 (2), 139-151 (2004).
- Patel, G., et al. Mechanical signaling in a pulmonary microvascular endothelial cell monolayer. Biochemical and Biophysical Research Communications. 519 (2), 337-343 (2019).
- Kähler, C. J., et al. Main results of the 4th International PIV Challenge. Experiments in Fluids. 57 (6), 97 (2016).
- Tseng, Q., et al. Spatial organization of the extracellular matrix regulates cell-cell junction positioning. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (5), 1506-1511 (2012).
- Alvarez-Gonzalez, B., et al. Two-layer elastographic 3-D traction force microscopy. Scientific Reports. 7, 39315 (2017).
- Makarchuk, S., Beyer, N., Gaiddon, C., Grange, W., Hebraud, P.
- Janmey, P. A., Miller, R. T. Mechanisms of mechanical signaling in development and disease. Journal of Cell Science. 124 (1), 9-18 (2011).
- Dembo, M., Oliver, T., Ishihara, A., Jacobson, K. Imaging the traction stresses exerted by locomoting cells with the elastic substratum method. Biophysical Journal. 70 (4), 2008-2022 (1996).
- Dembo, M., Wang, Y. L. Stresses at the cell-to-substrate interface during locomotion of fibroblasts. Biophysical Journal. 76 (4), 2307-2316 (1999).
- Butler, J. P., Tolic-Norrelykke, I. M., Fabry, B., Fredberg, J. J. Traction fields, moments, and strain energy that cells exert on their surroundings. American Journal of Physiology: Cell Physiology. 282 (3), 595-605 (2002).
- Saez, A., et al. Traction forces exerted by epithelial cell sheets. Journal of Physics. Condensed Matter. 22 (19), 194119 (2010).
- Deforet, M., et al. Automated velocity mapping of migrating cell populations (AVeMap). Nature Methods. 9 (11), 1081-1083 (2012).
- Polio, S. R., Smith, M. L. Patterned hydrogels for simplified measurement of cell traction forces. Methods in Cell Biology. 121, 17-31 (2014).
- Toyjanova, J., et al. 3D Viscoelastic traction force microscopy. Soft Matter. 10 (40), 8095-8106 (2014).
- Serra-Picamal, X., Conte, V., Sunyer, R., Munoz, J. J., Trepat, X. Mapping forces and kinematics during collective cell migration. Methods in Cell Biology. 125, 309-330 (2015).
- Charrier, E. E., et al. A novel method to make viscoelastic polyacrylamide gels for cell culture and traction force microscopy. APL Bioengineering. 4 (3), 036104 (2020).
