Summary
نحن نقدم طريقة لحقن الخلايا عبر تقنية Waterjet الخالية من الإبر إلى جانب تكملة من تحقيقات ما بعد الولادة من حيث الجدوى الخلوية والانتشار وقياسات المرونة.
Abstract
سلس البول (UI) هو حالة منتشرة للغاية تتميز بنقص العضلة العاصرة للإحليل. فروع الطب التجديدي ، وخاصة العلاج الخلوي ، هي أساليب جديدة لتحسين واستعادة وظيفة العضلة العاصرة للإحليل. على الرغم من أن حقن الخلايا الوظيفية النشطة يتم إجراؤه بشكل روتيني في الإعدادات السريرية عن طريق الإبرة والحقنة ، إلا أن هذه الأساليب لها عيوب وقيود كبيرة. في هذا السياق ، تعد تقنية Waterjet الخالية من الإبر (WJ) طريقة مجدية ومبتكرة يمكنها حقن خلايا قابلة للحياة عن طريق تنظير المثانة الموجه بصريا في العضلة العاصرة للإحليل. في هذه الدراسة ، استخدمنا WJ لتوصيل الخلايا اللحمية المشتقة من الأنسجة الدهنية الخنازير (pADSCs) إلى أنسجة مجرى البول الجثة، ثم حققنا في تأثير توصيل WJ على إنتاجية الخلايا وقابليتها للحياة. قمنا أيضا بتقييم السمات الميكانيكية الحيوية (أي المرونة) بواسطة قياسات مجهر القوة الذرية (AFM). لقد أظهرنا أن PADSC التي قدمتها WJ قد انخفضت بشكل كبير في مرونتها الخلوية. كانت الجدوى أقل بكثير مقارنة بالضوابط ولكنها لا تزال أعلى من 80٪.
Introduction
سلس البول (UI) هو اضطراب واسع الانتشار مع انتشار 1.8 - 30.5 ٪ في السكان الأوروبيين1 ويتميز في المقام الأول عن طريق خلل في العضلة العاصرة للإحليل. من منظور سريري ، غالبا ما يتم تقديم العلاج الجراحي للمرضى عندما تفشل العلاجات المحافظة أو العلاج الطبيعي في معالجة الأعراض الناشئة والتخفيف من حدتها.
ظهر العلاج الخلوي للإصلاح التجديدي المحتمل لخلل مجمع العضلة العاصرة كنهج طليعي لعلاج أمراض UI 2,3. أهدافها الرئيسية هي استبدال وإصلاح واستعادة الوظائف البيولوجية للأنسجة التالفة. في النماذج الحيوانية لواجهة المستخدم ، أظهرت زراعة الخلايا الجذعية نتائج واعدة في نتائج ديناميكا البول2،4،5. تنشأ الخلايا الجذعية كمرشحة خلوية مثالية لأنها تتمتع بالقدرة على الخضوع للتجديد الذاتي والتمايز متعدد القدرات ، وبالتالي ، تساعد على تجديد الأنسجة المصابة6. على الرغم من إمكانات التجدد القادمة ، لا يزال الاستخدام العملي للعلاج بالخلايا معوقا لأن توصيل الخلايا بأقل قدر من التدخل الجراحي لا يزال يواجه العديد من التحديات المتعلقة بدقة الحقن وتغطية الهدف. على الرغم من أن النهج الحالي المستخدم لتوصيل الخلايا هو الحقن من خلال نظام حقنة الإبرة7 ، إلا أنه عادة ما يؤدي إلى عجز عام في الخلايا القابلة للحياة ، مع انخفاض الجدوى المبلغ عنها إلى 1٪ - 31٪ بعد الزرع8. بالإضافة إلى ذلك ، فقد ثبت أيضا أن توصيل الخلايا عن طريق حقن الإبرة يؤثر على الوضع ، ومعدل الاحتفاظ ، وكذلك توزيع الخلايا المزروعة في الأنسجة المستهدفة9،10،11. هناك نهج عملي وجديد يتغلب على القيد المذكور أعلاه وهو توصيل الخلايا الخالية من الإبر عبر تقنية المياه النفاثة.
تظهر تقنية Waterjet (WJ) كنهج جديد يتيح توصيل الخلايا عالية الإنتاجية بواسطة منظار المثانة تحت السيطرة البصرية في العضلة العاصرة للإحليل12,13. يتيح WJ توصيل الخلايا عند ضغوط مختلفة (E = تأثيرات في البار) تتراوح من E5 إلى E8013. في المرحلة الأولى ، يتم تطبيق محلول متساوي التوتر (مرحلة اختراق الأنسجة) بضغط عال (أي E60 أو E80) من أجل تخفيف المصفوفة خارج الخلية المحيطة بالأنسجة المستهدفة وفتح ثغرات صغيرة مترابطة صغيرة. في المرحلة الثانية (مرحلة الحقن) ، يتم خفض الضغط في غضون مللي ثانية (أي حتى E10) من أجل توصيل الخلايا بلطف إلى الأنسجة المستهدفة. بعد هذا التطبيق المكون من مرحلتين ، لا تتعرض الخلايا لضغط إضافي ضد الأنسجة عند إخراجها ولكنها تطفو في تيار منخفض الضغط في منطقة كهفية مملوءة بالسائل13. في إعداد نموذج خارج الجسم الحي حيث تم حقن الخلايا الجذعية عبر WJ في أنسجة مجرى البول الجثة، يمكن بعد ذلك شفط الخلايا القابلة للحياة واسترجاعها من الأنسجة وتوسيعها في المختبر13. على الرغم من أن دراسة أجريت عام 2020 من قبل Weber et al. أظهرت جدوى وقابلية تطبيق WJ لتقديم خلايا عضلة القلب الخالية من البصمة في عضلة القلب14 ، إلا أنه يجب أن يؤخذ في الاعتبار أن تقنية WJ لا تزال في مرحلة النموذج الأولي.
يصف البروتوكول التالي كيفية تحضير وتسمية الخلايا اللحمية المشتقة من الأنسجة الدهنية الخنازير (pADSC) وكيفية توصيلها إلى أنسجة سائلة وجثث عبر تقنية WJ وإبر تنظير المثانة من ويليامز (WN). بعد الحقن الخلوي ، يتم تقييم الحيوية الخلوية والمرونة عبر مجهر القوة الذرية (AFM). من خلال تعليمات خطوة بخطوة ، يوفر البروتوكول نهجا واضحا وموجزا للحصول على بيانات موثوقة. يعرض قسم المناقشة ويصف المزايا الرئيسية والقيود والمنظورات المستقبلية لهذه التقنية. إن تسليم WJ للخلايا بالإضافة إلى تحليلات ما بعد ترجمة التتمة المذكورة هنا تحل محل حقن الإبرة القياسي وتوفر إطارا قويا لتوصيل الخلايا للشفاء التجديدي للأنسجة المستهدفة. في دراساتنا الأخيرة قدمنا أدلة على أن WJ سلمت الخلايا بشكل أكثر دقة وعلى الأقل في قابلية مماثلة عند مقارنتها بحقن الإبرة15,16.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
تم الحصول على عينات الأنسجة الدهنية الخنازير من معهد الجراحة التجريبية في جامعة توبنغن. تمت الموافقة على جميع الإجراءات من قبل سلطات رعاية الحيوان المحلية تحت رقم التجربة على الحيوانات CU1/16.
1. عزل الخلايا اللحمية المشتقة من الأنسجة الدهنية الخنازير
- استخدم الأنسجة الدهنية الخنازير التي يتم تسليمها من معهد الجراحة التجريبية في أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل إلى المختبر.
- انقل الأنسجة إلى طبق بتري معقم تحت المقعد المعقم وفرمه بمشرطين (رقم 10) إلى شظايا صغيرة وفطر.
ملاحظة: يمكن أيضا استخدام المقص للحصول على شظايا صغيرة. كلما كانت الشظايا أصغر ، كان ذلك أفضل لعملية الهضم التالية.- انقل الشظايا الصغيرة / الهريسة إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل واحتضنها بمحلول مجانس 5 مل لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية على شاكر. الحل المجانس هو PBS مع 1٪ ألبومين مصل البقر (BSA) (محلول الأسهم: 1٪ (ث / v) BSA في PBS) و 0.1٪ كولاجيناز من النوع الأول.
ملاحظة: قم دائما بإعداد محلول مجانس طازجا. يحتوي الخلاط على حركة اهتزاز دائرية بسرعة بطيئة تتراوح بين 25 و 500 دورة في الدقيقة.
- انقل الشظايا الصغيرة / الهريسة إلى أنبوب طرد مركزي سعة 50 مل واحتضنها بمحلول مجانس 5 مل لمدة 30 دقيقة عند 37 درجة مئوية على شاكر. الحل المجانس هو PBS مع 1٪ ألبومين مصل البقر (BSA) (محلول الأسهم: 1٪ (ث / v) BSA في PBS) و 0.1٪ كولاجيناز من النوع الأول.
- لوقف الحضانة ، أضف 10 مل من وسائط النمو [Dulbecco's Modified Eagle's Medium - Low glucose (DMEM-LG) ، و 2.5٪ محلول ملح الصوديوم HEPES (1 M) ، و 10٪ مصل البقر الجنيني (FBS) ، و 1٪ L-Glutamin (200 mM) ، و 1٪ Penicillin-Streptomycin (10000 U / mL Penicillin ؛ 10000 ميكروغرام / مل Streptomycin) و 1٪ Amphotericin B (250 ميكروغرام / مل)].
ملاحظة: يمكن إعداد وسائط النمو مسبقا. المضادات الحيوية والأدوية المضادة للفطريات ضرورية في إعداد وسائط النمو لزراعة الخلايا لحماية الخلايا من التلوث. - احتضان أنابيب الطرد المركزي لمدة 10 دقائق في درجة حرارة الغرفة.
- استنشق الكسر بالخلايا الشحمية ، وهو أخف وزنا وبالتالي يسبح فوق السائل ، باستخدام ماصة 10 مل وتخلص منها.
- قم بتصفية الجزء اللحمي المتبقي من خلال غربال خلية 100 ميكرومتر باستخدام غشاء البولي إيثيلين تيريفثاليت (PET) الخالي من المعادن الثقيلة لحجب شظايا الأنسجة الدهنية واسترداد تعليق الخلية فقط.
- جهاز طرد مركزي لتعليق الخلية المصفى لمدة 7 دقائق عند 630 × جم في درجة حرارة الغرفة.
- أعد تعليق بيليه الخلية في 2 مل من PBS لغسل الخلايا مرة واحدة.
- قم بالطرد المركزي لتعليق الخلية مرة أخرى لمدة 7 دقائق عند 630 × g في درجة حرارة الغرفة.
- بعد الطرد المركزي وإعادة التعليق المتكرر لحبيبات الخلية في 10 مل من وسائط النمو لكل قارورة ، تتكاثر خلايا البذور في قوارير زراعة الخلايا 75 سم2 .
ملاحظة: اعتمادا على حجم بيليه الخلية بعد خطوة الغسيل باستخدام PBS ، فإن خلايا البذور في واحد إلى أربعة قوارير.
2. زراعة الخلايا من الخلايا اللحمية المشتقة من الأنسجة الدهنية الخنازير
- خلايا الحصاد والمرور عندما تصل إلى 70٪ من الالتقاء.
- اغسل الخلايا ب 10 مل من PBS مرتين واستطلع PBS تماما.
ملاحظة: هذه الخطوة ضرورية لإزالة وسائط النمو المتبقية، والتي تكملها 10٪ FBS. يحتوي FBS على العديد من مثبطات الأنزيم البروتيني التي يمكن أن تعيق وظيفة التربسين التالي. - أضف 3 مل من 0.05٪ -Trypsin-EDTA لكل قارورة لفصل الخلايا.
- احتضان القوارير لمدة 3 دقائق عند 37 درجة مئوية.
- تحقق تحت المجهر إذا كانت الخلايا منفصلة.
ملاحظة: في بعض الأحيان يستغرق الأمر بعض الوقت لفصل الخلايا. في هذه الحالة ، احتضان القوارير لمدة أقصاها 5 دقائق عند 37 درجة مئوية. - لوقف عملية الحضانة والانفصال ، أضف 3 مل من وسائط النمو.
ملاحظة: كما هو مذكور أعلاه، يتم استكمال وسائط النمو بنسبة 10٪ FBS التي تحتوي على مثبطات الأنزيم البروتيني. - انقل الخلايا المنفصلة إلى أنبوب طرد مركزي وأجهزة طرد مركزي لمدة 7 دقائق عند 630 × جم في درجة حرارة الغرفة.
- أعد تعليق الخلايا في 10 مل من وسائط النمو وعدها باستخدام مقياس الدم.
- خلايا البذور بكثافة تلقيح 3 × 105 خلايا لكل 75 سم2 قارورة.
3. وضع العلامات على الخلايا مع الكالسيين-AM
ملاحظة: الخلايا التي يتم حقنها في أنسجة الجثث ملطخة ببقعة خلايا حية قابلة للنفاذ إلى الغشاء الأخضر الفلوري ومؤشر جدوى غشاء أحمر فلورسنت غير مقصود للتحقق من أن الخلايا المستخرجة هي نفسها الخلايا المحقونة وليست شظايا الأنسجة في مجرى البول.
- اغسل الخلايا مرتين باستخدام 10 مل من PBS.
- أضف 5 مل من محلول الصبغة لكل قارورة 75 سم2 . يتكون محلول الصبغة من وسائط نمو مع 2 ميكرومتر من صبغة الخلايا الحية ذات الغشاء الأخضر الفلوري النافذ ومؤشر جدوى الغشاء الأحمر الفلوري 4 ميكرومتر.
- احتضان لمدة 30 دقيقة في درجة حرارة الغرفة في الظلام.
- شفط وتجاهل محلول الصبغة.
- اغسل الخلايا مرة أخرى مرتين باستخدام 10 مل من PBS.
- أضف وسائط نمو ووثق إشارة التألق الخضراء والحمراء بواسطة المجهر الفلوري.
- ضع القارورة 75 سم2 على طاولة المجهر ، واستخدم الهدف 10x ، وحدد عدم وجود مرشح تألق وتأكد من أن مسار الضوء المنقول نشط.
ملاحظة: يتم تنفيذ جميع هذه الخطوات يدويا على المجهر. - بالتوازي مع الخطوة 3.6.1، افتح البرنامج.
- اضغط على الزر Live (تم ) أسفل علامة التبويب تحديد الموقع ( تحديد الموقع) للحصول على صورة حية للخلايا الموجودة في القارورة على الطاولة والتركيز عليها باستخدام محركات أقراص الضبط الخشنة والدقيقة.
ملاحظة: على مرمى البصر الصحيح ستظهر الصورة الحية بمجرد تنشيط الزر "بث مباشر ". - في علامة التبويب الفرعية مكونات المجهر، حدد الهدف الصحيح (10x).
- في علامة التبويب الفرعية الكاميرا، قم بتطبيق علامة اختيار للتعريض الضوئي التلقائي.
- اضغط على الزر Snap (محاذاة ) لالتقاط الصورة الأولى باستخدام الضوء المرسل.
- أدخل شريط المقياس باستخدام علامة التبويب رسومات في شريط القوائم وحدد شريط القياس.
- احفظ الصورة باستخدام علامة التبويب ملفات في شريط القوائم وحدد حفظ باسم czi.
- بالنسبة لصور التألق ، قم بتغيير المرشح إلى المرشح المحدد للتألق الأخضر أو الأحمر وحدد مسار الضوء المنعكس.
ملاحظة: يجب إجراء هذه التغييرات يدويا على المجهر. - اضغط مرة أخرى على الزر Live (لاذخ) ضمن علامة التبويب تحديد الموقع للحصول على صورة حية للخلايا.
- اضغط على الزر Snap (محاذاة ) لالتقاط الصورة الثانية باستخدام التألق الأخضر أو الأحمر.
- أدخل شريط المقياس باستخدام علامة التبويب رسومات في شريط القوائم وحدد شريط القياس.
- احفظ الصورة باستخدام علامة التبويب ملفات في شريط القوائم وحدد حفظ باسم czi.
- كرر الخطوات من 3.6.9 إلى 3.6.13 مع قناة التألق الأخرى.
- ضع القارورة 75 سم2 على طاولة المجهر ، واستخدم الهدف 10x ، وحدد عدم وجود مرشح تألق وتأكد من أن مسار الضوء المنقول نشط.
4. إعداد عينات من أنسجة مجرى البول للحقن
- تشريح مجرى البول والمثانة المتصلة من الخنزير.
ملاحظة: تم استخدام عينات أنسجة مجرى البول من عينات الجثث الطازجة من خنازير السلالة البرية البالغة في التجارب. - نقله إلى المختبر في أكياس على الجليد الرطب.
ملاحظة: يجب ترك العينات على الجليد حتى مزيد من المعالجة. لم تتم إضافة أي إضافات إلى العينات. - ضع مجرى البول مع المثانة على إسفنجة ، والتي تحاكي مرونة قاع الحوض السفلي.
- استخدم المثانة لتحديد الاتجاه (القريب والبعيد والظهري والبطني) للإحليل. هذا ممكن بسبب توطين الحالب والأربطة الثلاثة التي تثبت المثانة في تجويف البطن والحوض. الأربطة الثلاثة هي الأربطة الجانبية الحويصلة على جانبي المثانة و vesicae medianum ، والتي تنشأ من السطح البطني للمثانة (الشكل 1).
- اقطع مجرى البول طوليا على الجانب الظهري بمساعدة قسطرة.
- حقن الخلايا في مجرى البول المفتوح كما هو موضح في الفصول التالية.
5. حقن الخلايا عن طريق إبرة ويليامز في عينات السوائل والأنسجة
- حصاد الخلايا كما هو موضح في الخطوة 2.
- على النقيض من الخطوة 2.9 ، اضبط كثافة الخلايا للحقن على 2.4 × 106 خلايا لكل مل.
ملاحظة: بالنسبة للحقن في عينات الأنسجة ، قم بتسمية الخلايا بخلية حية قابلة للنفاذ إلى غشاء الفلورسنت الأخضر. - استنشق تعليق الخلية باستخدام حقنة وقم بتطبيق إبرة الحقن بالمنظار المثانة (WN) من ويليامز عليها.
- إما أن تمسك الإبرة فوق 2 مل من وسائط النمو بقليل في أنبوب طرد مركزي 15 مل أو تدخل الإبرة في أنسجة مجرى البول المفتوحة. في كلتا الحالتين حقن 250 ميكرولتر من الخلايا يدويا.
ملاحظة: الخلايا التي يتم حقنها في مجرى البول الجثوي تشكل قبة حقن. - جمع الخلايا التي يتم حقنها في الوسائط مباشرة عن طريق الطرد المركزي لمدة 7 دقائق عند 630 × g في درجة حرارة الغرفة.
- بالنسبة للخلايا التي يتم حقنها في مجرى البول الجثة، قم بسحبها من قبة الحقن باستخدام إبرة 18G مطبقة على حقنة.
- انقل الخلايا المحقونة والمستنشقة إلى أنبوب طرد مركزي وأجهزة طرد مركزي لمدة 7 دقائق عند 630 × g في درجة حرارة الغرفة مقارنة بالخلايا المحقونة في الوسائط.
- بعد الطرد المركزي ، أعد تعليق الخلايا في 4 مل من وسائط النمو في كلتا الحالتين.
- تحديد إنتاجية الخلايا وقابليتها للحياة بمساعدة استبعاد صبغة تريبان الزرقاء باستخدام مقياس الدم.
- امزج 20 ميكرولتر من تعليق الخلايا جيدا مع 20 ميكرولتر من التربان الأزرق.
- املأ 10 ميكرولتر من هذا الخليط في كل غرفة من مقياس الدم.
ملاحظة: يتم ملء كلا الغرفتين وحسابهما للحصول على التحسين الإحصائي عن طريق مضاعفة أخذ العينات. - تحت المجهر ، عد الخلايا في جميع مربعات الزاوية الأربعة.
ملاحظة: عد الخلايا اللامعة باللون الأبيض (غير الملطخ) كخلايا قابلة للحياة بينما تحسب الخلايا اللامعة باللون الأزرق (الملطخ) كخلايا ميتة. - لحساب رقم الخلية لكل مل ، احسب متوسط الغرفتين ، واقسم هذا الرقم على اثنين واضربه في 104.
6. حقن الخلايا عن طريق Waterjet في عينات السوائل والأنسجة
- حصاد الخلايا كما هو موضح في الخطوة 2.
- على النقيض من الخطوتين 2.9 و 5.2 ، اضبط كثافة الخلايا للحقن على 6 × 106 خلايا لكل مل.
ملاحظة: بالنسبة للحقن في عينات الأنسجة ، استخدم الخلايا الموسومة بخلية حية منفذة بالغشاء الأخضر الفلورسنت. - املأ تعليق الخلية في وحدة الجرعات الخاصة بجهاز WJ.
- إما أن تمسك فوهة الحقن فوق 2 مل من وسائط النمو بقليل في أنبوب طرد مركزي 15 مل أو فوق أنسجة مجرى البول المفتوحة بقليل.
- في كلتا الحالتين حقن 100 ميكرولتر من الخلايا بواسطة الجهاز باستخدام ضغط عال لاختراق الأنسجة تليها مرحلة الضغط المنخفض لحقن الخلايا. استخدم إعدادات الضغط E60-10.
ملاحظة: الخلايا التي يتم حقنها في مجرى البول الجثوي تشكل قبة حقن. - جمع الخلايا التي يتم حقنها في الوسائط مباشرة عن طريق الطرد المركزي لمدة 7 دقائق عند 630 × g في درجة حرارة الغرفة.
- بالنسبة للخلايا التي يتم حقنها في مجرى البول الجثة، قم بسحبها من قبة الحقن باستخدام إبرة 18G مطبقة على حقنة.
- انقل الخلايا المحقونة والمستنشقة إلى أنبوب طرد مركزي وأجهزة طرد مركزي لمدة 7 دقائق عند 630 × g في درجة حرارة الغرفة مقارنة بالخلايا المحقونة في الوسائط.
- بعد الطرد المركزي ، أعد تعليق الخلايا في 4 مل من وسائط النمو في كلتا الحالتين.
- حدد إنتاجية الخلية وقابليتها للحياة بمساعدة استبعاد صبغة تريبان الزرقاء باستخدام مقياس الدم كما هو موضح بالتفصيل في 5.10.
7. التقييم الميكانيكي الحيوي للمرونة الخلوية بواسطة مجهر القوة الذرية (AFM)
- إعداد العينات
ملاحظة: الخلايا المستردة بعد الحقن تخضع الآن لمزيد من التحليلات من قبل AFM. بالإضافة إلى ذلك ، يتم استخدام الخلايا التي لم يتم حقنها كعناصر تحكم.- خلايا البذور في أطباق زراعة الأنسجة بكثافة 5 × 105 خلايا لكل طبق.
ملاحظة: بذر طبق واحد من زراعة الأنسجة لكل حالة. الشروط هي الضوابط ، ADSCs التي يتم حقنها بواسطة WJ أو WN في الوسائط و ADSCs التي يتم حقنها بواسطة WJ أو WN في الأنسجة الجثة. - احتضان الخلايا في أطباق زراعة الأنسجة لمدة 3 ساعات عند 37 درجة مئوية.
ملاحظة: لتجنب الاختلافات بسبب الخلايا في مرحلة G1 وأثناء الانقسام ، أجرينا قياسات AFM بعد 3 ساعات من خطوة بذر الخلية. - مباشرة قبل القياس باستخدام AFM ، استبدل وسائط النمو ب 3 مل من وسائط L-15 من Leibovitz بدون L-glutamine.
- ضع طبق زراعة الأنسجة في حامل العينة الخاص بجهاز AFM وقم بتشغيل سخان الأطباق بتري الذي تم ضبطه على درجة حرارة 37 درجة مئوية.
- خلايا البذور في أطباق زراعة الأنسجة بكثافة 5 × 105 خلايا لكل طبق.
- إعداد AFM ومعايرة الكابولي
- استخدم كتلة زجاجية محددة للقياسات في السوائل واضبطها على حامل AFM.
ملاحظة: يجب أن يكون السطح العلوي للكتلة الزجاجية مستقيما وموازيا لحامل AFM. - ضع الكابولي بعناية على سطح الكتلة الزجاجية. يجب أن يقع الطرف A فوق المستوى البصري المصقول.
ملاحظة: لا تخدش السطح البصري المصقول للكتلة الزجاجية لأن الخدوش قد تؤدي إلى تداخلات في القياسات. يجب أن يبرز الطرف A فوق المستوى البصري المصقول لأنه بخلاف ذلك ، فإن انعكاس ليزر AFM على الكاشف الضوئي غير ممكن. - لتحقيق الاستقرار في الكابولي على الكتلة الزجاجية ، أضف نابضا معدنيا بمساعدة ملاقط.
- عندما يتم تثبيت الكابولي على الكتلة الزجاجية ، ضع الكتلة على رأس AFM وقم بقفل آلية القفل المدمجة.
- قم بتركيب رأس AFM على جهاز AFM.
ملاحظة: يجب أن يواجه الزنبرك الجانب الأيسر ليتم وضعه بشكل صحيح. إذا لم يكن الأمر كذلك ، فقم بتصحيح موضع الكتلة الزجاجية واضبط رأس AFM مرة أخرى. - قم بتهيئة إعداد البرنامج وافتح البرنامج مع نافذة محاذاة الليزر وإعدادات معلمة النهج. بالإضافة إلى ذلك ، قم بتشغيل محرك السائر وضوء الليزر وكاميرا CCD.
- حدد الطرف الكابولي A باستخدام كاميرا CCD.
- اخفض الكابولي حتى يتم غمسه بالكامل في الوسط. استخدم وظيفة محرك السائر للوصول إلى هذا الهدف.
- بمجرد تغطية الكابولي بالكامل بواسطة الوسط ، يتم محاذاة الليزر أعلى الكابولي باستخدام مسامير الضبط. يجب أن يسقط الشعاع المنعكس على مركز الكاشف الضوئي ويجب أن يكون مجموع الإشارات 1 فولت أو أعلى. يجب أن تكون الانحرافات الجانبية والرأسية قريبة من 0.
ملاحظة: إذا تم الوصول إلى المركز يمكن مراقبته في وظيفة محاذاة الليزر وكذلك قيم الإشارة. إذا كانت قيم الإشارة غير صحيحة ، فمن الضروري إجراء مزيد من التعديلات. - قم بتشغيل نهج الماسح الضوئي الآن باستخدام معلمات النهج (الجدول 1).
- اسحب الكابولي بمقدار 100 ميكرومتر بمجرد وصوله إلى القاع عن طريق الضغط على زر التراجع .
ملاحظة: تأكد من عدم إرفاق أي خلية في هذا الحقل إذا تم تنفيذ النهج لأن هذا من شأنه تزوير المعايرة. - قم بإعداد معلمات التشغيل وفقا للمواصفات التالية: Setpoint 1 V ، طول السحب 90 ميكرومتر ، السرعة: 5 ميكرومتر / ثانية ، معدل العينة: 2000 هرتز وكوضع تأخير: قوة ثابتة.
- ابدأ قياس منحنى قوة المسافة للمعايرة بالضغط على الزر تشغيل.
ملاحظة: بالنقر فوق الزر تشغيل في البرنامج ، يتم الحصول على منحنى مسافة القوة. - حدد منطقة الملاءمة الخطية للمنحنى المسحوب في البرنامج على منحنى مسافة قوة المعايرة الذي تم الحصول عليه. حساب قياس ثابت الربيع بواسطة البرنامج.
- معايرة الكابولي باتباع المعلمات والخطوات الدقيقة كما وصفها Danalache et al.17.
- استخدم كتلة زجاجية محددة للقياسات في السوائل واضبطها على حامل AFM.
- قياس مرونة الخلايا الفردية
- تحديد الخلية بصريا والتركيز عليها. ضع ماوس الكمبيوتر في منتصف الخلية. لتحسين دقة القياسات، ضع طرف AFM مباشرة فوق نواة الخلية.
ملاحظة: يتم استخدام ماوس الكمبيوتر كعلامة مرئية لتحديد الموقع المستهدف للمسافة البادئة. - الآن التركيز على الكابولي وتحريكه على ماوس الكمبيوتر.
- ابدأ القياس باستخدام Run باستخدام المعلمات الواردة في الجدول 2.
ملاحظة: يتم استخدام معلمة نقطة الضبط التي تم الحصول عليها عن طريق معايرة الكابولي. علاوة على ذلك ، يتم قياس خلية واحدة ثلاث مرات. قياس ما لا يقل عن 50 خلية.
- تحديد الخلية بصريا والتركيز عليها. ضع ماوس الكمبيوتر في منتصف الخلية. لتحسين دقة القياسات، ضع طرف AFM مباشرة فوق نواة الخلية.
- معالجة البيانات
- قم بمعالجة البيانات باتباع الخطوات والمعلمات الدقيقة كما هو موضح سابقا بواسطة Danalache17.
- حفظ الملف وتصديره.
8. التحليل الإحصائي
- افتح البرنامج الإحصائي.
- اختر تحديد مجموعة بيانات جديدة.
ملاحظة: يتم فتح ملفين. واحد هو "DataSet" والآخر هو ملف "الإخراج". - حدد ملف DataSet وافتح علامة التبويب عرض المتغير .
- أدخل المتغيرات الرقمية لحقن الموقع (التقاط السائل أو الأنسجة الجثة) ، والفئة (التحكم ، حقن WJ ، حقن WN) والمرونة.
- أدخل بيانات المرونة المقاسة مع حقن الموقع المقابل لها ورقم الفئة في علامة التبويب عرض البيانات .
- تحليل البيانات عن طريق تحديد علامة التبويب شريط القوائم تحليل | الإحصاءات الوصفية واختر تحليل البيانات الاستكشافية.
- كمتغير تابع، حدد المرونة وقائمة العوامل حدد الفئة.
ملاحظة: يتم عرض النتائج في ملف "الإخراج" بما في ذلك مخطط مربع يستخدم لقسم النتائج. - لإجراء اختبار إحصائي، حدد العينات المستقلة ضمن الاختبار غير البارامتري ضمن علامة التبويب تحليل شريط القائمة.
- في الملف الجديد المفتوح ، احتفظ بالإعدادات في علامة التبويب الهدف والإعدادات.
- افتح علامة التبويب حقول واختر المرونة كحقول اختبار والفئة كمجموعات.
- اضغط على تشغيل.
ملاحظة: يتم عرض النتائج في ملف "الإخراج". لهذه التحليلات يتم إجراء اختبار Mann-U-Whitney. - قم بتضمين نتيجة الاختبار غير البارامتري في مخطط مربع تحليل البيانات الاستكشافية.
- احفظ الملفات عن طريق تحديد ملف في شريط القوائم واختيار حفظ.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
بعد توصيل الخلايا عبر النهجين ، كانت صلاحية الخلايا التي يتم تسليمها من خلال WN (97.2 ± 2٪ ، n = 10 ، p<0.002) أعلى عند مقارنتها بالحقن بواسطة WJ باستخدام إعدادات E60-10 (85.9 ± 0.16٪ ، n = 12) (الشكل 2). أظهرت نتائج التقييم البيوميكانيكي أن: حقن WN للخلايا في سائل الالتقاط لم تظهر فرقا كبيرا فيما يتعلق بالمعامل المرن (EM ؛ 0.992 kPa) عند مقارنتها بالضوابط (1.176 kPa; الشكل 3A)، في حين أدت حقن WJ إلى انخفاض كبير في EM الخلوي (0.440 kPa، p<0.001، الشكل 3B). لوحظ انخفاض بنسبة 40 - 50 ٪ من EM بعد حقن WJ. على الرغم من أن حقن WN في أنسجة مجرى البول الجثوي لم تسفر عن أي فرق كبير في EM الخلوي (الشكل 4A) ، فقد لوحظ انخفاض كبير في EM بعد حقن WJ في عينات الأنسجة (0.890 kPa إلى 0.429 kPa ؛ p<0.00 ، الشكل 4B). وبالتالي ، تم تخفيض قيم EM المطلقة بعد حقن WJ بنسبة 51٪. بشكل جماعي ، تظهر النتائج أنه في حين أن تسليم خلايا WJ يفي بمتطلبات مطلقة للتنفيذ السريري حيث تتأثر أكثر من 80٪ من الخلايا القابلة للحياة بعد التسليم18 ، بعد تسليم WJ ، تتأثر وحدات مرونة الخلية. قد يسهل EM الخلوي السفلي هجرة ميزات الخلايا بعد تسليم WJ. في مثل هذا التوزيع الأوسع نطاقا ومجموعة من القدرات التجديدية في المنطقة المطلوبة19.
الشكل 1. تشريح المثانة الخنازير والإحليل ومواقع الحقن. أ) يظهر الجانب البطني من المثانة الخنازير والإحليل مع الأربطة الثلاثة التي تثبت المثانة في تجويف البطن والحوض. بالإضافة إلى ذلك ، يتم عرض الحالب الذي ينتهي على الجانب الظهري من المثانة. ب) صورة تمثيلية للإحليل الجثوي المستخدم في حقن WJ و WN. طوليا ، يتم عرض مجرى البول الظهري المفتوح مع قباب الحقن الدائرية باللون الأسود. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 2. حقن تحديد الجدوى الخلوية عبر WN و WJ. تم جمع pADSCs التي تم حقنها عبر WN أو WJ بعد الحقن وتم حسابها عبر استبعاد Trypan لتحديد الجدوى. تم تقليل الجدوى الخلوية بشكل كبير بعد حقن WJ عند مقارنتها بالخلايا التي يتم تسليمها عبر WN. ص<0.001. يتم عرض البيانات بيانيا كمتوسط مع الانحراف المعياري. الاختصارات: WJ - waterjet ، WN - إبرة ويليامز. الشكل مقتبس من Danalache et al. 202119. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3. مقارنة بين معامل يونغ الكمي ل WN على التوالي ، سلمت WJ الخلايا إلى وسائط الالتقاط والضوابط المقابلة لها. لم يلاحظ أي اختلاف ملحوظ في EM في مخططات الصندوق للطبقات الأحادية للخلايا الضابطة (غير المعالجة) والخلايا المسلمة WN (A). على النقيض من ذلك ، يمكن ملاحظة انخفاض كبير في المرونة بين مخططات مربعات خلايا التحكم ومجموعة WJ (B). ns - ليس كبيرا ، p > 0.05 ، ***p<0.001. الاختصارات: WJ - waterjet ، WN - إبرة ويليامز. الشكل مقتبس من Danalache et al. 202119. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4. مقارنة بين وحدات يونغ الكمية من WN على التوالي WJ سلمت الخلايا إلى مجرى البول الجثث والضوابط المقابلة لها. لم يلاحظ أي فرق ملحوظ بين الخلايا التي يتم تسليمها عبر خلايا WN والضوابط المقابلة لها (A). لوحظ انخفاض كبير في المرونة بين الخلايا التي تم تسليمها من WJ والطبقة الأحادية لخلية التحكم (B). ns - ليس كبيرا ، p > 0.05 ، ***p<0.001. الاختصارات: WJ - waterjet ، WN - إبرة ويليامز. الشكل مقتبس من Danalache et al. 202119. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
| معلمة النهج | قيمة |
| نهج آي جين | 3.0 هرتز |
| نهج PGain | 0.0002 |
| اقترب من الارتفاع المستهدف | 10.0 ميكرومتر |
| نقطة تحديد النهج | 3.00 فولت |
| نهج خط الأساس | 0.00 فولت |
الجدول 1. معلمات النهج.
| تشغيل المعلمة | قيمة |
| تعيين نقطة | 10 نانومتر |
| Z الحركة/سرعة التمديد | سرعة ثابتة/ |
| 5.0 ميكرومتر/ثانية | |
| وقت الاتصال | 0.0 ثانية |
| طول السحب | 90 ميكرومتر |
| وضع التأخير | قوة ثابتة |
| معدل العينة | ٢٠٠٠ هرتز |
الجدول 2. تشغيل المعلمات.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
في هذه الدراسة ، أظهرنا وقدمنا نهجا خطوة بخطوة لإجراء توصيل خلايا WJ واستخدمنا تكملة من التحقيقات الكمية لتقييم تأثير تسليم WJ على الخصائص الخلوية: الجدوى الخلوية والميزات الميكانيكية الحيوية (أي EM). بعد حقن WJ ، كانت 85.9٪ من الخلايا التي تم حصادها قابلة للحياة. من حيث حقن WN ، احتفظت 97.2٪ من الخلايا بقدرتها على البقاء بعد الحقن. وبالتالي ، فإن نهج WJ يفي بمتطلبات مطلقة للتنفيذ السريري: أكثر من 80٪ من الخلايا القابلة للحياة بعد التسليم18. في حين يتم تحقيق بروتوكول موحد وقابل للتكرار مع نهج WJ ، فإن نتائج تسليم حقن الإبرة تعتمد بشكل كبير على حجم وفوهة المحقنة والإبرة والضغط ومعدل التدفق والطبيب الذي يقوم بالحقن بأنفسهم19.
أظهرت الدراسات التي استخدمت توصيل خلايا WJ في النماذج الحيوانية الحية أنه من خلال ضغط الطرد المتغير ، يمكن تكييف عمق الاختراق مع الأنسجة المستهدفة وعلى هذا النحو ، مع التطبيق السريري المطلوب13,16. أبلغت حقن الخلايا عبر الإحليل في الحيوانات الحية الخاضعة للسيطرة البصرية عن عدم وجود أو فقدان للخلايا في حوالي 50٪ من الحيوانات المعالجة 20 ، في حين أبلغت حقن WJ عن معدلات حقن دقيقة للخلايا أعلى من90٪ (Linzenbold et al.16 وملاحظة غير منشورة). يتطلب المعيار الذهبي الحالي لتوصيل الخلايا (حقن الإبرة) اختراق القنية في الأنسجة المستهدفة. لذلك ، تسبب ترجمة الخلايا الإبرة الإصابة والصدمة في جميع الحالات. في مجرى البول ، قد يسبب هذا في الواقع تسمما للالتهابات بسبب الجراثيم والسموم الموجودة حتى في البول الصحي. بالإضافة إلى ذلك ، فإن وقت تشغيل المستخدم في حقن WJ أقصر بكثير عند مقارنته بحقن الإبرة: يتم وضع الخلايا في غضون مللي ثانية في طبقة الأنسجة المقصودة عن طريق ضبط مستويات الضغط مسبقا. في المقابل ، يعتمد عمق الاختراق على حقن الإبرة في المناطق النائية عن طريق التنظير الداخلي على مهارات وخبرات الجراح. من المتوقع أيضا أن تكون قابلية تكرار حقن WJ متفوقة ، ولكن في الوقت الحالي لا يوجد سوى بيانات ما قبل السريرية15،16،20 وتم التحقيق في أقل من 200 حيوان. في دراستنا الأخيرة لاحظنا أن المرونة الخلوية تقل عن طريق تطبيق WJ بالمقارنة مع حقن الإبرة21. يمكن أن يعزى ذلك إلى إجهاد القص للخلايا بسرعة أعلى أثناء تسليم WJ. علاوة على ذلك ، يمكن تعويض فقدان الخلايا في نهاية المطاف من خلال دقة أعلى لوضع الخلايا وإخراجها داخل المنطقة ذات الاهتمام كما هو محقق مع التسليم الموجه من WJ بواسطة تنظير المثانة الموجه بصريا22.
من المعروف جيدا أن القوى الميكانيكية توجه سلوك الخلايا الجذعية ، وإمكانات التجديد ، فضلا عن جدواها اللاحقة ووظائفها بعد الزرع 10,23. وفر ظهور AFM الذري أداة قوية لقياس الخواص الميكانيكية للخلايا الحية المفردة بدقة نانوية في الظروف المائية 24،25،26،27. AFM هي طريقة موثوقة وحساسة للغاية يمكنها اكتشاف وتسجيل الصلابة التي تتراوح من أقل من 100 باسكال إلى 106 باسكال ، وبالتالي تغطي مجموعة واسعة لغالبية الأنسجة والخلايا28. في الواقع ، تظهر ميكانيكا الخلايا كعلامة حيوية خالية من الملصقات لتقييم حالة الخلية وفي كل من الحالة الفسيولوجية والمرضية29 ومرونة الخلية هي الاستجابة التآزرية والتراكمية للنواة - الهيكل الخلوي المتقاطع. من الثابت أنه عندما تتعرض خلية لقوى خارجية ، تنتقل هذه القوى من الغشاء البلازمي عبر الهيكل الخلوي إلى النواة ، مما يؤدي إلى تشوهات داخل النواة وإعادة التنظيم30،31،32. لذلك فإن النواة ، التي ينظر إليها منذ فترة طويلة على أنها المادة الجينومية وجهاز النسخ ، هي لاعب رئيسي في النقل الميكانيكي الخلوي وكذلك32. في الواقع ، فإن أهمية الميكانيكا النووية والروابط الخلوية الهيكلية ، في جميع الوظائف والطفرات الخلوية ، في الصفيحات والروابط من الهيكل العظمي النووي إلى مجمع الهيكل الخلوي (LINC) - هي في بداية الأساس للعديد من الأمراض 33,34. يمكن أن تشير هذه القوى أيضا إلى القطع الأثرية الخلوية. وعلى وجه التحديد، تنتشر القوى الخارجية المتولدة بالفعل على طول خيوط الهيكل الخلوي وتنتقل كذلك إلى الصفيحة النووية عبر مجمع LINC؛ استجابة لهذه القوى ، تصبح النواة ، في الواقع ، أكثر صلابة35,36 ، وبالتالي دمج العمليتين المتشابكتين والمترابطتين بشكل وثيق. وهذا هو أيضا الأساس المنطقي لنهجنا وقياساتنا للميكانيكا النووية. وعلاوة على ذلك، فإن وضع الكابولي بدقة فوق السطح النووي يضمن أيضا درجة عالية من القابلية للتكرار ويقلل من الاختلافات بسبب عدم تجانس الخلايا وارتباطها بالركيزة.
على الرغم من أن مرونة الخلية تظهر كعلامة حيوية خالية من الملصقات لتقييم حالة الخلية وفي كل من الحالات الفسيولوجية والمرضية29 ، فإن المعيارية المرنة المقاسة تتميز باختلافات كبيرة حتى في نفس نوع الخلية37. تتمثل إحدى الطرق لمواجهة هذه الاختلافات على النحو الذي اقترحه شيلرز وآخرون في تنفيذ إجراءات AFM الميكانيكية النانوية الموحدة (SNAP) التي تضمن قابلية عالية للتكرار وتطبيق قياسات المرونة كعلامة كمية موثوقة على الخلايا في مختلف الحالات38. أيضا ، على الرغم من أن المعلمات التجريبية المستخدمة في تحليلات AFM ، مثل سرعة المسافة البادئة ، وشكل وحجم indenter بالإضافة إلى التمثيل الدقيق لهندسة الطرف في النموذج المناسب 39 ، تؤثر على القيم المقاسة المطلقة40,41 ، يجب ألا تؤثر هذه المعلمات على النتائج في دراسة واحدة أو ميل مقاس.
ومع ذلك ، ضع في اعتبارك أن المسافات البادئة AFM تقتصر على تحليل السطح الخارجي للخلايا ، وبالتالي فهي غير قادرة على مسح داخل غشاء الخلية أو هياكل معينة داخل الخلايا. اقترح Usukura et al. طريقة "غير مسقوفة" تكسر الغشاء الخلوي وتزيل المكونات القابلة للذوبان في السيتوبلازم42 ، مما يسمح بإجراء تحقيقات AFM داخل الخلايا. ومع ذلك ، في دراستنا ، تم التركيز على تقييم متوسط المعدلات المرنة بدلا من فحص المكونات المميزة والانتقائية داخل الخلايا.
وبشكل جماعي، يعتمد اتساق وموثوقية بيانات AFM الناتجة بشدة على الخبرة التقنية للمشغل المعني ويمكن أن تكون متحيزة بسبب التباين البيولوجي38. بحساب جميع المتغيرات الحساسة التي قد تؤثر على نتائج AFM الفعلية ، لا يمكن تعميم القيم المرنة المطلقة المبلغ عنها في هذه الدراسة وهي محددة إلى حد ما لإعدادنا التجريبي.
بشكل عام ، توفر دراستنا دليلا21 بالإضافة إلى بروتوكول خطوة بخطوة لتفوق حقن WJ على حقن الإبرة لنظام العلاج بالخلايا التجديدية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
أصحاب البلاغ J.K., M.D, T.A., A.S., W.K. A. ليس لديهم ما يكشفون عنه. المؤلفان W.L. و M.D.E. موظفان في ERBE Medizintechnik Lt. Tübingen ، منتج ERBEJet2 والنموذج الأولي WJ المستخدم في هذه الدراسة.
Acknowledgments
نشكر المؤلفين المشاركين من المنشورات الأصلية على مساعدتهم ودعمهم.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 50 mL centrifuge tube | Greiner BioOne | 227261 | |
| 1 mL BD Luer-LokTM Syringe | BD Plastik Inc | n.a. | |
| 100 µm cell sieve | Greiner BioOne | 542000 | |
| 15 mL centrifuge tube | Greiner BioOne | 188271 | |
| 75 cm2 tissue culture flask | Corning Incorporated | 353136 | |
| AFM head | (CellHesion 200) JPK | JPK00518 | |
| AFM processing software | Bruker | JPK00518 | |
| AFM software | Bruker | JPK00518 | |
| AFM system Cell Hesion 200 | Bruker | JPK00518 | |
| All-In-One-Al cantilever | Budget Sensors | AIO-10 | tip A, Conatct Mode, Shape: Beam Force Constant: 0.2 N/m (0.04 - 0.7 N/m) Resonance Frequency: 15 kHz (10 - 20 kHz) Length: 500 µm (490 - 510 µm) Width: 30 µm (35 - 45 µm) Thickness: 2.7 µm (1.7 - 3.7 µm) |
| Amphotericin B solution | Sigma | A2942 | 250 µg/ml |
| Atomic Force Microscope (AFM) | CellHesion 200, JPK Instruments, Berlin, Germany | JPK00518 | |
| BD Microlance 3 18G | BD | 304622 | |
| bovine serum albumin | Gibco | A10008-01 | |
| Cantilever | All-In-One-AleTl, Budget Sensors, Sofia, Bulgaria | AIO-TL-10 | tip A, k ¼ 0.2 N/m |
| C-chip disposable hemocytometer | NanoEnTek | 631-1098 | |
| centrifuge: Rotina 420R | Hettich Zentrifugen | ||
| Collagenase, Type I, powder | Gibco | 17100-017 | |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium - low glucose | Sigma | D5546 | |
| Feather disposable scalpel (No. 10) | Feather | 02.001.30.010 | |
| fetal bovine serum (FBS) | Sigma | F7524 | |
| HEPES sodium salt solution (1 M) | Sigma | H3662 | |
| Inverted phase contrast microscope (Integrated with AFM) | AxioObserver D1, Carl Zeiss Microscopy, Jena, Germany | L201306_03 | |
| laboratory bags | Brand | 759705 | |
| Leibovitz's L-15 medium without l-glutamine | Merck | F1315 | |
| Leibovitz's L-15 medium without L-glutamine | (Merck KGaA, Darmstadt, Germany) | F1315 | |
| L-glutamine | Lonza | BE 17-605C1 | 200 mM |
| LIVE/DEADTM Viability/Cytotoxicity Kit | Invitrogen by Thermo Fisher Scientific | L3224 | Calcein AM and EthD-1 are used from this kit. |
| Microscope software: Zen 2.6 | Zeiss | ||
| Microscope: AxioVertA.1 | Zeiss | ||
| Nelaton-Catheter female | Bicakcilar | 19512051 | |
| Penicillin-Streptomycin | Gibco | 15140-122 | 10000 U/ml Penicillin 10000 µg/ml Streptomycin |
| Petri dish heater associated with AFM | Bruker | T-05-0117 | |
| Petri dish heater associated with AFM | JPK Instruments AG, Berlin, Germany | T-05-0117 | |
| Phosphate buffered saline (PBS) | Gibco | 10010-015 | |
| Statistical Software: SPSS Statistics 22 | IBM | ||
| Sterile Petri dish - CellStar | Greiner BioOne | 664160 | |
| Tissue culture dishes | TPP AG | TPP93040 | |
| Tissue culture dishes | TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen, Switzerland | TPP93040 | |
| Trypan Blue 0.4% 0.85% NaCl |
Lonza | 17-942E | |
| Trypsin-EDTA solution | Sigma | T3924 | |
| Waterjet: ERBEJET2 device | Erbe Elektromedizin GmbH | ||
| Williams Cystoscopic Injection Needle | Cook Medical | G14220 | 23G, 5.0 Fr, 35 cm |
References
- Milsom, I., et al. Global prevalence and economic burden of urgency urinary incontinence: a systematic review. European Urology. 65 (1), 79-95 (2014).
- Lee, J. Y., et al. The effects of periurethral muscle-derived stem cell injection on leak point pressure in a rat model of stress urinary incontinence. International Urogynecology Journal and Pelvic Floor Dysfunction. 14 (1), 31-37 (2003).
- Tran, C., Damaser, M. S. The potential role of stem cells in the treatment of urinary incontinence. Therapeutic Advances in Urology. 7 (1), 22-40 (2015).
- Fu, Q., Song, X. F., Liao, G. L., Deng, C. L., Cui, L. Myoblasts differentiated from adipose-derived stem cells to treat stress urinary incontinence. Urology. 75 (3), 718-723 (2010).
- Corcos, J., et al. marrow mesenchymal stromal cell therapy for external urethral sphincter restoration in a rat model of stress urinary incontinence. Neurourology and Urodynamics. 30 (3), 447-455 (2011).
- Smaldone, M. C., Chen, M. L., Chancellor, M. B. Stem cell therapy for urethral sphincter regeneration. Minerva Urologica e Nefrologica. 61 (1), 27-40 (2009).
- Perin, E. C., López, J. Methods of stem cell delivery in cardiac diseases. Nature Clinical Practice Cardiovascular Medicine. 3, Suppl 1 110-113 (2006).
- Zhang, M., et al. Cardiomyocyte grafting for cardiac repair: graft cell death and anti-death strategies. Journal of Molecular and Cellular Cardiology. 33 (5), 907-921 (2001).
- Amer, M. H., White, L. J., Shakesheff, K. M. The effect of injection using narrow-bore needles on mammalian cells: administration and formulation considerations for cell therapies. Journal of Pharmacy and Pharmacology. 67 (5), 640-650 (2015).
- Amer, M. H., Rose, F. R. A. J., Shakesheff, K. M., Modo, M., White, L. J. Translational considerations in injectable cell-based therapeutics for neurological applications: concepts, progress and challenges. NPJ Regenerative Medicine. 2, 23-23 (2017).
- Linzenbold, W., Fech, A., Hofmann, M., Aicher, W. K., Enderle, M. D. Novel Techniques to Improve Precise Cell Injection. International Journal of Molecular Sciences. 22 (12), 6367 (2021).
- Adamo, A., Roushdy, O., Dokov, R., Sharei, A., Jensen, K. F. Microfluidic jet injection for delivering macromolecules into cells. Journal of Micromechanics and Microengineering: Structures, Devices, and Systems. 23, 035026 (2013).
- Jäger, L., et al. A novel waterjet technology for transurethral cystoscopic injection of viable cells in the urethral sphincter complex. Neurourology and Urodynamics. 39 (2), 594-602 (2020).
- Weber, M., et al. Hydrojet-based delivery of footprint-free iPSC-derived cardiomyocytes into porcine myocardium. Scientific Reports. 10 (1), 16787 (2020).
- Jäger, L., et al. A novel waterjet technology for transurethral cystoscopic injection of viable cells in the urethral sphincter complex. Neurourology and Urodynamics. 39 (2), 594-602 (2020).
- Linzenbold, W., et al. Rapid and precise delivery of cells in the urethral sphincter complex by a novel needle-free waterjet technology. BJU International. 127 (4), 463-472 (2021).
- Danalache, M., Tiwari, A., Sigwart, V., Hofmann, U. K. Application of Atomic Force Microscopy to Detect Early Osteoarthritis. Journal of Visualized Experiments. (159), e61041 (2020).
- Gálvez-Martín, P., Hmadcha, A., Soria, B., Calpena-Campmany, A. C., Clares-Naveros, B. Study of the stability of packaging and storage conditions of human mesenchymal stem cell for intra-arterial clinical application in patient with critical limb ischemia. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics. 86 (3), 459-468 (2014).
- Danalache, M., et al. Injection of Porcine Adipose Tissue-Derived Stromal Cells by a Novel Waterjet Technology. International Journal of Molecular Sciences. 22 (8), (2021).
- Amend, B., et al. Precise injection of human mesenchymal stromal cells in the urethral sphincter complex of Göttingen minipigs without unspecific bulking effects. Neurourology and Urodynamics. 36 (7), 1723-1733 (2017).
- Danalache, M., et al. Injection of Porcine Adipose Tissue-Derived Stromal Cells by a Novel Waterjet Technology. International Journal of Molecular Sciences. 22 (8), 3958 (2021).
- Strasser, H., et al. 328: Transurethral Ultrasound Guided Stem Cell Therapy of Urinary Incontinence. Journal of Urology. 175 (4), 107 (2006).
- Vining, K. H., Mooney, D. J. Mechanical forces direct stem cell behaviour in development and regeneration. Nature reviews. Molecular Cell Biology. 18 (12), 728-742 (2017).
- Ding, Y., Xu, G. -K., Wang, G. -F. On the determination of elastic moduli of cells by AFM based indentation. Scientific Reports. 7 (1), 45575 (2017).
- Charras, G. T., Horton, M. A. Single cell mechanotransduction and its modulation analyzed by atomic force microscope indentation. Biophysical Journal. 82 (6), 2970-2981 (2002).
- Carl, P., Schillers, H. Elasticity measurement of living cells with an atomic force microscope: data acquisition and processing. Pflügers Archiv: European Journal of Physiology. 457 (2), 551-559 (2008).
- Darling, E. M., Topel, M., Zauscher, S., Vail, T. P., Guilak, F. Viscoelastic properties of human mesenchymally-derived stem cells and primary osteoblasts, chondrocytes, and adipocytes. Journal of Biomechanics. 41 (2), 454-464 (2008).
- Thomas, G., Burnham, N. A., Camesano, T. A., Wen, Q. Measuring the mechanical properties of living cells using atomic force microscopy. Journal of Visualized Experiments. (76), e50497 (2013).
- Li, M., Dang, D., Liu, L., Xi, N., Wang, Y. Atomic Force Microscopy in Characterizing Cell Mechanics for Biomedical Applications: A Review. IEEE Trans Nanobioscience. 16 (6), 523-540 (2017).
- Morimoto, A., et al. A conserved KASH domain protein associates with telomeres, SUN1, and dynactin during mammalian meiosis. The Journal of Cell Biology. 198 (2), 165 (2012).
- Lombardi, M. L., et al. The interaction between nesprins and sun proteins at the nuclear envelope is critical for force transmission between the nucleus and cytoskeleton. Journal of Biological Chemistry. 286 (30), 26743-26753 (2011).
- Isermann, P., Lammerding, J. Nuclear Mechanics and Mechanotransduction in Health and Disease. Current Biology. 23 (24), 1113-1121 (2013).
- Méjat, A. LINC complexes in health and disease. Nucleus. 1 (1), 40-52 (2010).
- Folker, E. S., Östlund, C., Luxton, G. G., Worman, H. J., Gundersen, G. G. Lamin A variants that cause striated muscle disease are defective in anchoring transmembrane actin-associated nuclear lines for nuclear movement. Proceedings of the National Academy of Sciences. 108 (1), 131-136 (2011).
- Guilluy, C., et al. Isolated nuclei adapt to force and reveal a mechanotransduction pathway in the nucleus. Nature cell biology. 16 (4), 376-381 (2014).
- Fischer, T., Hayn, A., Mierke, C. T. Effect of Nuclear Stiffness on Cell Mechanics and Migration of Human Breast Cancer Cells. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 8, 393 (2020).
- Kuznetsova, T. G., Starodubtseva, M. N., Yegorenkov, N. I., Chizhik, S. A., Zhdanov, R. I. Atomic force microscopy probing of cell elasticity. Micron. 38 (8), 824-833 (2007).
- Schillers, H., et al. Standardized Nanomechanical Atomic Force Microscopy Procedure (SNAP) for Measuring Soft and Biological Samples. Scientific Reports. 7 (1), 5117 (2017).
- Costa, K. D., Yin, F. C. Analysis of indentation: implications for measuring mechanical properties with atomic force microscopy. Journal of Biomechanical Engineering. 121 (5), 462-471 (1999).
- Stolz, M., et al. Dynamic elastic modulus of porcine articular cartilage determined at two different levels of tissue organization by indentation-type atomic force microscopy. Biophysical Journal. 86 (5), (2004).
- Park, S., Costa, K. D., Ateshian, G. A., Hong, K. S. Mechanical properties of bovine articular cartilage under microscale indentation loading from atomic force microscopy. Proceedings of the Institution of Mechanical Engineers, Part H. 223 (3), 339-347 (2009).
- Usukura, E., Narita, A., Yagi, A., Ito, S., Usukura, J. An Unroofing Method to Observe the Cytoskeleton Directly at Molecular Resolution Using Atomic Force Microscopy. Scientific Reports. 6 (1), 27472 (2016).
