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Cancer Research

मेलेनोमा मेटास्टेसिस के उपन्यास मध्यस्थों की पहचान के लिए एक मजबूत डिस्कवरी प्लेटफ़ॉर्म

Published: March 8, 2022 doi: 10.3791/63186
Automatic Translation
1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 1,2, 3,4, 2,5, 3,4, 1,2
1Department of Pathology, NYU Grossman School of Medicine, 2Interdisciplinary Melanoma Cooperative Group, Perlmutter Cancer Center, 3Department of Radiology, NYU Grossman School of Medicine, 4Preclinical Imaging Core, NYU Grossman School of Medicine, 5Ronald Perelman Department of Dermatology, NYU Grossman School of Medicine

Summary

यह आलेख मेलेनोमा मेटास्टेसिस के उपन्यास उम्मीदवार मध्यस्थों और कार्रवाई के उनके तंत्र (ओं) के परीक्षण के लिए नियोजित तकनीकों के एक वर्कफ़्लो का वर्णन करता है।

Abstract

मेटास्टेसिस एक जटिल प्रक्रिया है, जिसमें कोशिकाओं को उन बाधाओं को दूर करने की आवश्यकता होती है जो केवल इन विट्रो एसेस द्वारा अपूर्ण रूप से मॉडलिंग की जाती हैं। मेलेनोमा मेटास्टेसिस में उपन्यास खिलाड़ियों की पहचान करने के लिए विवो मॉडल और मानकीकृत तरीकों में मजबूत, पुन: प्रस्तुत करने योग्य का उपयोग करके एक व्यवस्थित वर्कफ़्लो स्थापित किया गया था। यह दृष्टिकोण मेटास्टेसिस में जीन की भूमिका को ठीक से चिह्नित करने के लिए विशिष्ट प्रयोगात्मक चरणों में डेटा अनुमान की अनुमति देता है। मॉडल चूहों में इंट्राकार्डियक, इंट्राडर्मल, या चमड़े के नीचे इंजेक्शन के माध्यम से आनुवंशिक रूप से संशोधित मेलेनोमा कोशिकाओं को पेश करके स्थापित किए जाते हैं, इसके बाद विवो इमेजिंग में सीरियल के साथ निगरानी की जाती है। एक बार जब पूर्वस्थापित समापन बिंदु तक पहुंच जाते हैं, तो प्राथमिक ट्यूमर और / या मेटास्टेसिस-असर अंगों को काटा जाता है और विभिन्न विश्लेषणों के लिए संसाधित किया जाता है। ट्यूमर कोशिकाओं को क्रमबद्ध किया जा सकता है और एकल-सेल आरएनए अनुक्रमण सहित कई 'ओमिक्स' प्लेटफार्मों में से किसी के अधीन किया जा सकता है। अंगों को मेटास्टेसिस के समग्र बोझ को मापने और उनके विशिष्ट शारीरिक स्थान को मैप करने के लिए इमेजिंग और इम्यूनोहिस्टोपैथोलॉजिकल विश्लेषण से गुजरना पड़ता है। इस अनुकूलित पाइपलाइन, engraftment, निगरानी, ऊतक कटाई, प्रसंस्करण, और विश्लेषण के लिए मानकीकृत प्रोटोकॉल सहित, रोगी व्युत्पन्न, अल्पकालिक संस्कृतियों और विभिन्न ठोस कैंसर प्रकारों की स्थापित मानव और murine सेल लाइनों के लिए अपनाया जा सकता है।

Introduction

मेटास्टैटिक मेलेनोमा से जुड़ी उच्च मृत्यु दर दुनिया भर में मेलेनोमा की बढ़ती घटनाओं के साथ संयुक्तहै 1 (2025 तक अनुमानित 7.86% वृद्धि) नए उपचार दृष्टिकोणों के लिए कॉल करती है। लक्ष्य खोज में प्रगति मेटास्टेसिस के पुनरुत्पादक मॉडल पर टिकी हुई है, जो एक अत्यधिक जटिल प्रक्रिया है। मेटास्टैटिक कैस्केड के चरणों के दौरान, मेलेनोमा कोशिकाओं को प्रतिरक्षा प्रणाली की चोरी औरदूर के ऊतकों के उपनिवेशीकरण को प्राप्त करने के लिए अनगिनत बाधाओं को दूर करना चाहिए। मेलेनोमा कोशिकाओं की लचीलापन और अनुकूलन क्षमता कारकों की एक भीड़ से उत्पन्न होती है, जिसमें उनके उच्च आनुवंशिक उत्परिवर्तनीय बोझ3 और उनके तंत्रिका शिखा मूल शामिल हैं, जो महत्वपूर्ण फेनोटाइपिक प्लास्टिसिटी 3,4,5 प्रदान करते हैं। प्रत्येक चरण में, ट्रांसक्रिप्शनल कार्यक्रम मेटास्टेसाइज़िंग मेलेनोमा कोशिकाओं को माइक्रोएन्वायरमेंट के साथ क्रॉसस्टॉक से संकेतों के आधार पर एक राज्य से दूसरे राज्य में स्विच करने की अनुमति देते हैं, जिसमें प्रतिरक्षा प्रणाली6, एक्स्ट्रासेल्युलर परिवेश 7,8 और भौतिक बाधाओं की सेलुलर वास्तुकलाशामिल है जिसके साथ वे संपर्क में आते हैं। उदाहरण के लिए, मेलेनोमा कोशिकाएं महत्वपूर्ण प्रतिरक्षा-प्राइमिंग ट्यूमर-स्रावित कारकों की अभिव्यक्ति को कम करके प्रतिरक्षा निगरानी से बच जातीहैं।

अध्ययन एक "प्रीमेटास्टेटिक आला" का वर्णन करते हैं, जिसमें मेलेनोमा कोशिकाएं मेटास्टेसिस10 के लिए दूर के "लक्ष्य" अंग को प्राइम करने के लिए केमोकाइन्स और साइटोकिन्स को स्रावित करती हैं। ये निष्कर्ष मेटास्टैटिक मेलेनोमा कोशिकाओं के अंग ट्रोपिज़्म और शारीरिक मार्ग के बारे में महत्वपूर्ण सवाल उठाते हैं जो वे दूर के ऊतकों तक पहुंचने के लिए लेते हैं। इंट्रावेसेशन के बाद, मेलेनोमा कोशिकाओं को लसीका (लसीका प्रसार) और रक्त वाहिकाओं (हेमटोजेनस स्प्रेड) 2,11 के माध्यम से मेटास्टेसाइज़ करने के लिए जाना जाता है। जबकि अधिकांश रोगी स्थानीयकृत बीमारी के साथ मौजूद होते हैं, मामलों का एक छोटा सबसेट दूर के मेटास्टैटिक रोग और कोई लसीका प्रसार (नकारात्मक लिम्फ नोड भागीदारी) 11 के साथ प्रस्तुत करता है, जो मेलेनोमा के लिए वैकल्पिक मेटास्टैटिक मार्गों के अस्तित्व का सुझाव देता है।

जब वे एक मेटास्टैटिक साइट का उपनिवेश करते हैं, तो मेलेनोमा कोशिकाएं एपिजेनेटिक और चयापचय अनुकूलन12,13 से गुजरती हैं। नए डिब्बों तक पहुंचने और आक्रमण करने के लिए, मेलेनोमा कोशिकाएं प्रोटीज14 और साइटोस्केलेटल संशोधनोंको 11,15 को नियोजित करती हैं, जो उन्हें अपने नए स्थान पर जाने और बढ़ने में सक्षम बनाती हैं। मेलेनोमा कोशिकाओं को लक्षित करने में कठिनाई इस तरह के अनुकूलन की जटिलता और संख्या में रहती है; इस प्रकार, क्षेत्र को प्रयोगात्मक रूप से कई चरणों और अनुकूलनों को यथासंभव फिर से बनाने के प्रयास करने चाहिए। इन विट्रो assays जैसे organoids और 3 डी संस्कृतियों16,17 में कई प्रगति के बावजूद, इन मॉडलों को केवल अपूर्ण रूप से vivo मेटास्टैटिक कैस्केड में recapitulate.

मुरीन मॉडल ने पुनरुत्पादन, तकनीकी व्यवहार्यता और मानव रोग के सिमुलेशन के बीच संतुलन बनाकर मूल्य दिखाया है। Intravascularly, orthotopically और heterotopically प्रत्यारोपित मेलेनोमा कोशिकाओं रोगी व्युत्पन्न या अल्पकालिक संस्कृतियों से प्रतिरक्षा-समझौता या मानवीकृत चूहों में मेटास्टैटिक मेलेनोमा में लक्ष्य खोज की रीढ़ का प्रतिनिधित्व करते हैं। हालांकि, इन प्रणालियों में अक्सर मेटास्टेसिस पर एक महत्वपूर्ण जैविक बाधा की कमी होती है: प्रतिरक्षा प्रणाली। Syngeneic मेलेनोमा मेटास्टेसिस मॉडल जो इस बाधा के अधिकारी हैं, क्षेत्र में अपेक्षाकृत दुर्लभ हैं। इन प्रणालियों, B16-F1018, सेल लाइनों19, SM1 20, D4M3 21, RIM3 22या अधिक हाल ही में, RMS 23 और M1 (Mel114433),M3 (HCmel1274), M4 (B2905)24 मेलेनोमा सेल लाइनों के YUMM परिवार सहित immunocompetent चूहों में विकसित, मेलेनोमा प्रगति में मेजबान प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया की जटिल भूमिका की जांच की सुविधा प्रदान करते हैं।

यहां, मेलेनोमा मेटास्टेसिस लक्ष्य पहचान के लिए एक पाइपलाइन प्रस्तुत की गई है। मेलेनोमा रोगी साथियों से उत्पन्न होने वाले बढ़ते और बड़े 'ओमिक्स' डेटासेट के साथ, हम मानते हैं कि सबसे अधिक नैदानिक वादा करने वाले अध्ययन वे हैं जो बड़े डेटा एकीकरण से स्टेम करते हैं, जिससे सावधानीपूर्वक कार्यात्मक और यंत्रवत पूछताछहोती है 25,26,27,28। मेटास्टैटिक प्रक्रिया में संभावित लक्ष्यों का अध्ययन करने के लिए माउस मॉडल का उपयोग करके, कोई भी विवो-विशिष्ट घटनाओं और ऊतक इंटरैक्शन में खाता कर सकता है, इस प्रकार नैदानिक अनुवाद की संभावना बढ़ जाती है। मेटास्टैटिक बोझ को मापने के लिए कई तरीकों को रेखांकित किया गया है, जो किसी भी दिए गए प्रयोग के परिणामों पर पूरक डेटा प्रदान करता है। विभिन्न अंगों में ट्यूमर से एकल-सेल अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल को मेटास्टैटिक कोशिकाओं में जीन अभिव्यक्ति के निष्पक्ष लक्षण वर्णन की सहायता के लिए वर्णित किया गया है, जो एकल-सेल या थोक आरएनए अनुक्रमण से पहले हो सकता है।

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Protocol

नोट: निम्नलिखित प्रोटोकॉल में शामिल पशु प्रक्रियाओं को न्यूयॉर्क विश्वविद्यालय संस्थागत पशु देखभाल और उपयोग समिति (आईएसीयूसी) द्वारा अनुमोदित किया गया था। सभी प्रक्रियाओं को प्रयोगशाला पशु देखभाल अंतर्राष्ट्रीय (एएएएलएसी) के मूल्यांकन और प्रत्यायन के लिए एसोसिएशन द्वारा अनुमोदित सुविधाओं में आयोजित किया जाता है। चित्र 1 सामान्य प्रयोगात्मक दृष्टिकोण को दर्शाता है।

1. रोगी व्युत्पन्न मेलेनोमा अल्पकालिक संस्कृतियों (एसटीसी)

  1. पूर्ण RPMI के 1 mL के साथ एक 60 मिमी पेट्री डिश में ऊतक रखें (RPMI 1640 10% भ्रूण गोजातीय सीरम (FBS), 2 mM L-glutamine, 1 mM सोडियम पाइरूवेट, 1x MEM गैर-आवश्यक अमीनो एसिड समाधान, और पेनिसिलिन (100 IU / mL)/ स्ट्रेप्टोमाइसिन (100 μg / mL)) के साथ पूरक)।
    नोट: ट्यूमर कोशिकाओं के अनुपात को बढ़ाने के लिए, यदि आवश्यक हो, तो पेट्री डिश में ट्यूमर के आसपास के ऊतकों को विच्छेदन और हटा दें, माइक्रोस्कोप के तहत, बाँझ सर्जिकल उपकरणों का उपयोग करके।
  2. 1-2 मिमी क्यूब्स में निष्फल रेजर ब्लेड का उपयोग करके ताजा ऊतक को बारीक काट लें। पूर्ण RPMI के 4 mL जोड़ें और एक 10 mL सीरोलॉजिकल पिपेट के साथ 5-10 बार ऊपर और नीचे प्लेट की सामग्री pipette.
  3. सेल निलंबन को 15 मिलीलीटर पॉलीप्रोपाइलीन शंक्वाकार ट्यूब में स्थानांतरित करें और कोशिकाओं को नीचे स्पिन करें (4 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट के लिए 180 × जी )। supernatant aspirate, ताजा माध्यम के 1 मिलीलीटर में सेल गोली resuspend, और एक 25 सेमी2 ऊतक संस्कृति फ्लास्क के लिए निलंबन हस्तांतरण.
  4. ऊतक के टुकड़ों को नीचे से जोड़ने में मदद करने के लिए, फ्लास्क को 37 डिग्री सेल्सियस पर एक ऊतक संस्कृति इनक्यूबेटर में 20 डिग्री -30 डिग्री के कोण पर झुका हुआ सेट करें,20 मिनट के लिए 5% सीओ 2।
  5. माध्यम को ऊतक को कवर करने की अनुमति देने के लिए फ्लास्क को फ्लैट के नीचे रखें, और दैनिक संस्कृति की स्थिति की जांच करें। कोशिकाओं को विभाजित करें जब वे 90-100% confluency तक पहुंचते हैं। एक "कम" मार्ग संख्या पर अल्पकालिक संस्कृतियों को बनाए रखें।
    नोट: एसटीसी लगभग 2 महीने बाद सेल अलगाव और संस्कृति स्थापित किया जाएगा, हालांकि वास्तविक समयरेखा नमूनों और ट्यूमर प्रकारों के बीच भिन्न होती है। 10 से 14 मार्गों के बाद, सेल लाइनें 100% शुद्धता तक पहुंचती हैं, जिसमें केवल मेलेनोमा कोशिकाएंहोती हैं। मार्ग संख्या थ्रेशोल्ड को सेल आकृति विज्ञान में परिवर्तन, दोहरीकरण समय और विवो में व्यवहार को देखकर अनुभवजन्य रूप से निर्धारित किया जाता है। माता-पिता के ट्यूमर की विषमता और अन्य विशेषताओं को संरक्षित करने के लिए, कोशिकाओं को 1: 5 से अधिक विभाजित न करें।
  6. एक एसटीसी की स्थापना पर और किसी भी सेल लाइन मॉडल के साथ जानवरों में इंजेक्ट किया जाना चाहिए जैसा कि बाद के चरणों में वर्णित है, एक रिपोर्टर के साथ कोशिकाओं को ट्रांसड्यूस करें।
    नोट: एक फ्लोरोसेंट टैग (उदाहरण के लिए, लाल फ्लोरोसेंट प्रोटीन (आरएफपी), हरे फ्लोरोसेंट प्रोटीन (जीएफपी)), उदाहरण के लिए, पूर्व-विवो इम्यूनोफ्लोरेसेंस इमेजिंग और प्रतिदीप्ति-सक्रिय सेल सॉर्टिंग (एफएसीएस) द्वारा ट्यूमर कोशिकाओं की छंटाई के लिए अनुमति देता है। लूसिफेरस विवो बायोल्यूमिनेसेंस इमेजिंग में सक्षम बनाता है, जो प्रयोगात्मक प्रगति की निगरानी के लिए एक उपयोगी उपकरण है (खंड 4)।

Figure 1
चित्रा 1: रोगी डेटा एकीकरण से लेकर चूहों से विवो डेटा में उत्पादन और विश्लेषण तक, वर्णित वर्कफ़्लो को चित्रित करने वाली योजनाबद्ध। संक्षेप: LOF = समारोह का नुकसान; GOF = फ़ंक्शन का लाभ। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

2. आरोपण

नोट: यहां वर्णित प्रयोगात्मक प्रक्रियाओं को चूहों में आयोजित किया जाता है जिसमें बिगड़ा हुआ अनुकूली और जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली होती है, NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl / SzJ (एनएसजी) चूहों; या उन चूहों में जिनमें केवल अनुकूली प्रतिरक्षा की कमी होती है, जैसे कि टी सेल की कमी वाले एथाइमिक / न्यूड (एनयू / जे) चूहों। जानवर पुरुष सेक्स के होते हैं, जिनकी उम्र 8 से 10 सप्ताह होती है। मादाएं अक्सर ट्यूमर कोशिकाओं के इंट्राकार्डियक इंजेक्शन पर गोनाडल मेटास्टेसिस की एक उच्च घटना का प्रदर्शन करती हैं, जो उनके अस्तित्व को कम करती है।

  1. चमड़े के नीचे और इंट्राडर्मल इंजेक्शन के लिए, 1x Dulbecco के फॉस्फेट-बफ़र्ड सेलाइन (DPBS) में निलंबित कोशिकाओं के एक हिस्से को एक भाग के साथ एक भाग पिघला हुआ एक्स्ट्रासेल्युलर मैट्रिक्स सब्सट्रेट (ईएमएस) के साथ मिलाकर 1: 1 सेल निलंबन तैयार करें, और 4 डिग्री सेल्सियस पर बर्फ पर रखें। इंट्रावैस्कुलर (इंट्राकार्डियक, इंट्राकैरोटिड, रेट्रो-ऑर्बिटल, टेल वेन, या प्लीहा) इंजेक्शन के लिए, केवल डीपीबीएस में कोशिकाओं को निलंबित करें।
    नोट: इंट्राडर्मल इंजेक्शन के लिए उपयुक्त मात्रा को जितना संभव हो उतना कम रखा जाना चाहिए (30 μL)। चमड़े के नीचे इंजेक्शन के लिए, इंजेक्ट की गई मात्रा 150 μL तक जा सकती है, और इंट्रावैस्कुलर इंजेक्शन के लिए, 250 μL (जानवर के वजन के आधार पर) तक। इंजेक्टेट की अंतिम सेल सस्पेंशन में 10-30% अतिरिक्त मात्रा में जोड़ें, इंजेक्ट की गई राशि और सिरिंज के आधार पर स्लिप टिप के अंदर मृत मात्रा और सुई के लिए खाते में उपयोग की जाने वाली सिरिंज (उदाहरण के लिए, 30 जी के साथ एक 1 एमएल ट्यूबरकुलिन सिरिंज, 25 मिमी सुई में 100 μL की मृत मात्रा होती है)।
  2. उपयोग में सेल लाइनों के व्यवहार और विवो में ट्यूमर की प्रगति की समयरेखा को चिह्नित करने के लिए एक पायलट का संचालन करें। इंट्राडर्मल इंजेक्शन के लिए, 1,000 को 50,000 कोशिकाओं / 30 μL तक इंजेक्ट करके शुरू करें। चमड़े के नीचे इंजेक्शन के लिए, 10,000 को 2 × 106 कोशिकाओं / 150 μL तक इंजेक्ट करके शुरू करें। इंट्रावैस्कुलर (इंट्राकार्डियक, इंट्राकैरोटिड, रेट्रो-ऑर्बिटल और प्लीहा) इंजेक्शन के लिए, 50,000 कोशिकाओं / 150 μL को इंजेक्ट करके शुरू करें।
    नोट: इंट्रावैस्कुलर इंजेक्शन जानवरों को एम्बोलिक घटनाओं के लिए पूर्वनिर्धारित करते हैं, या तो संचार प्रणाली में हवा को पेश करके या कोशिकाओं की अत्यधिक संख्या का उपयोग करके जो छोटे जहाजों को रोकते हैं। clumping से बचने के लिए सेल निलंबन अच्छी तरह से मिश्रण. सेल निलंबन लोड करने से पहले सिरिंज प्राइम करें। सिरिंज के अंदर किसी भी हवा के बुलबुले को हटा दें। लोडिंग और इंजेक्शन के समय तक सेल निलंबन / सिरिंज को बर्फ पर रखें।
  3. साँस लेने के द्वारा संज्ञाहरण प्रशासित करें। ऑक्सीजन स्तर नियामक को 1-2 एल / मिनट के बीच सेट करें। प्रेरण के लिए 2.5-5% और रखरखाव के लिए 1.5-3% पर सेट isoflurane vaporizer के साथ प्रेरण कक्ष में जानवर जगह।
    नोट: संज्ञाहरण प्रेरण चरण में रहते हुए जानवर की श्वास और हृदय गति की निगरानी करें। जानवर को अनदेखा न छोड़ें। एक साथ एक से अधिक जानवरों की निगरानी न करें । जानवर के वजन के लिए संज्ञाहरण की मात्रा टिटर ।
  4. प्रेरण कक्ष से नाक शंकु में जानवर को स्थानांतरित करें। प्रक्रिया के दौरान कॉर्नियल सूखापन को रोकने के लिए जानवर की आंखों पर बाँझ पेट्रोलेटम ऑप्थेल्मिक मरहम लागू करें।
  5. एक 30 ° कोण पर झुका हुआ एक सीधे रेजर ब्लेड के साथ प्रक्रिया स्थल शेव करें। 70% आइसोप्रोपिल अल्कोहल स्वैब के साथ प्रक्रिया क्षेत्र की त्वचा को साफ करें। किसी भी आगे के चरणों से पहले, पेडल रिफ्लेक्स द्वारा संज्ञाहरण के पर्याप्त स्तर के लिए आकलन करें।
  6. इंट्राडर्मल इंजेक्शन के लिए, एसेप्टिक स्थितियों को बनाए रखने के लिए एक जैव सुरक्षा कैबिनेट के अंदर पूरी प्रक्रिया करें।
    1. एनेस्थेटाइज़ करें और चरण 2.3-2.5 में वर्णित के रूप में जानवर को शेव करें।
    2. सुई छुरा घोंपने के प्रक्षेपवक्र के खिलाफ त्वचा को पीछे की ओर खींचें और वापस लें। एक 31 जी इंसुलिन सिरिंज सुई का उपयोग करना, 6 मिमी लंबी, एक तीव्र कोण पर आयोजित, धीरे से ऊपर की ओर सामना करने वाले बेवल के साथ त्वचा को पंचर करती है।
    3. सुई की नोक पर दबाव रिलीज महसूस करें। इंट्राडर्मल डिब्बे के अंदर रहने के लिए धीरे से अग्रिम करें और पूरी त्वचा की गहराई से सबक्यूटिस में पारित न करें। महत्वपूर्ण: यदि कोई चमड़े के नीचे की जगह में फिसल जाता है, तो सुई को हटा दें, इंजेक्शन क्षेत्र को बदलें और सुई को फिर से डालें। सेल निलंबन की पूरी मात्रा (30 μL) को धीरे-धीरे इंजेक्ट करें जब तक कि गुंबद के आकार का wheal मनाया न जाए।
      नोट: कम इंजेक्शन वॉल्यूम त्वचा की परतों के कम विच्छेदन और कम वास्तुशिल्प विरूपण को प्रेरित करेगा।
    4. सुई में रखें और 5 तक गिनें।
      नोट: ईएमएस शरीर के तापमान पर चिपचिपा हो जाता है, सुई पंचर घाव के माध्यम से बैकफ्लो से बचने में मदद करता है।
    5. सुई निकालें और एक गर्म पैड पर एक पिंजरे में जानवर को ठीक करने के लिए एकल-घर। चेतना को पुनः प्राप्त करने के बाद जानवर को विवेरियम पिंजरे में वापस कर दें, जब स्टर्नल और एम्बुलेटरी।
      नोट:: इस प्रोटोकॉल में वर्णित सभी प्रक्रियाओं के दौरान लगातार जानवर की निगरानी करें। जानवर को अनदेखा न छोड़ें या एक साथ एक से अधिक जानवरों की निगरानी न करें।
    6. प्रारंभिक विकास चरण में दैनिक पशु चिकित्सा कर्मचारियों के साथ संयोजन के रूप में ट्यूमर की वृद्धि, वजन घटाने और समग्र स्वास्थ्य स्थिति की प्रगति की निगरानी करें और यदि आवश्यक हो, तो जानवरों के वजन कम करना शुरू करने के बाद अधिक तीव्रता से। इन निगरानी सत्रों के दौरान: जानवरों का वजन करें और वजन घटाने की निगरानी के लिए एक चार्ट प्लॉट करें, और ट्यूमर अल्सरेशन, न्यूरोलॉजिकल, लोकोमोटर, और / या व्यवहार संकेतों (सुस्ती, सौंदर्य की कमी, कम भोजन या पानी का सेवन) के संकेतों की जांच करें।
      नोट: उन्नत बीमारी के लक्षणों को देखने के तुरंत बाद जानवरों को euthanize (20% से अधिक वजन घटाने, <2 के शरीर की स्थिति स्कोर, बेहद कम गतिविधि के स्तर, पक्षाघात, या दौरे)। संस्था के IACUC द्वारा अनुमोदित इच्छामृत्यु विधि का उपयोग करें (उदाहरण के लिए, एक स्वचालित टेबलटॉप सीओ2 कक्ष का उपयोग जानवरों को 15 मिनट के लिए सीओ2 को उजागर करने के लिए किया जाता है, जिसके बाद इच्छामृत्यु की एक माध्यमिक विधि होती है, या तो ग्रीवा विस्थापन, विच्छेदन, या न्यूमोथोरैक्स रिबकेज को भड़काकर द्विपक्षीय रूप से प्रेरित होता है)।
    7. कैलिपर्स के साथ माप लें और सूत्र के साथ मात्रा (वी) की गणना करने के लिए ट्यूमर की लंबाई (एल) और चौड़ाई (डब्ल्यू) आयामों का उपयोग करें:
      Equation 1
  7. चमड़े के नीचे इंजेक्शन के लिए:
    1. एसेप्टिक स्थितियों को बनाए रखने के लिए एक जैव सुरक्षा कैबिनेट के अंदर पूरी प्रक्रिया करें 26,27।
    2. एनेस्थेटाइज़ करें और चरण 2.3-2.5 में वर्णित के रूप में जानवर को शेव करें।
    3. एक 28 जी से 31 जी इंसुलिन सिरिंज सुई का उपयोग करना, लंबाई में 6 मिमी, एक तीव्र कोण पर आयोजित, धीरे से ऊपर की ओर सामना करने वाले बेवल के साथ त्वचा को पंचर करें। एपिडर्मिस, डर्मिस और हाइपोडर्मिस से गुजरते समय सुई की नोक पर दो बार दबाव रिलीज महसूस करें।
      नोट: दूसरी बार सुई की नोक पर एक दबाव रिलीज महसूस किया जाता है इंगित करता है कि चमड़े के नीचे के डिब्बे तक पहुंच गया है।
    4. सेल निलंबन की पूरी मात्रा (30-150 μL) को धीरे-धीरे इंजेक्ट करें जब तक कि एक लम्बी दीर्घवृत्त के आकार का wheal नहीं मनाया जाता है। सुई में रखें और 5 तक गिनें। बड़े वॉल्यूम (50 μL से अधिक) के लिए 10 तक गिनें।
      नोट: ईएमएस शरीर के तापमान पर चिपचिपा हो जाता है, सुई पंचर घाव के माध्यम से बैकफ्लो से बचने में मदद करता है।
    5. सुई निकालें और एक गर्म पैड पर एक पिंजरे में जानवर को ठीक करने के लिए एकल-घर। चेतना को पुनः प्राप्त करने के बाद जानवर को उसके विवेरियम पिंजरे में वापस कर दें, जब स्टर्नल और एम्बुलेटरी।
      नोट: postprocedural निगरानी के दौरान, जटिलताओं (कम श्वसन दर, रक्तस्राव, धीमी वसूली) के किसी भी संकेत के लिए निरीक्षण करें और उन्हें उचित रूप से संबोधित करें। यदि कोई सुधार नहीं देखा जाता है, तो चरण 2.6.6 के नोट में वर्णित मानवीय इच्छामृत्यु प्रक्रियाओं के लिए आगे बढ़ें।
    6. ट्यूमर वृद्धि, वजन घटाने, और समग्र स्वास्थ्य स्थिति के लिए जानवर की निगरानी के रूप में चरण 2.6.6-2.6.7 में वर्णित है।
  8. इंट्राकार्डियक इंजेक्शन के लिए:
    1. 26,30 एसेप्टिक स्थितियों को बनाए रखने के लिए एक जैव सुरक्षा कैबिनेट के अंदर पूरी प्रक्रिया का प्रदर्शन करें।
    2. चरण 2.3-2.4 में वर्णित के रूप में जानवर को एनेस्थेटिक करें।
    3. अल्ट्रासाउंड मशीन के गर्म मंच पर जानवर को स्थानांतरित करें और इसे नाक शंकु में हाइपोएलर्जेनिक टेप के साथ सुरक्षित करें।
    4. एक 30 ° कोण पर झुका हुआ एक सीधे रेजर ब्लेड के साथ वक्ष को शेव करें। Isopropyl अल्कोहल के 3 अनुप्रयोगों के साथ बारी बारी से 10% povidone-आयोडीन के 3 अनुप्रयोगों के साथ प्रक्रिया क्षेत्र की त्वचा को साफ करें।
    5. किसी भी आगे के चरणों से पहले, पेडल रिफ्लेक्स द्वारा संज्ञाहरण के पर्याप्त स्तर के लिए आकलन करें। प्रक्रिया स्थल पर अल्ट्रासाउंड जेल लागू करें।
    6. अल्ट्रासाउंड जांच के साथ कार्डियक विंडो पर कब्जा। बाएं वेंट्रिकल के क्रॉस-सेक्शनल दृश्य (लघु अक्ष) प्राप्त करने के लिए उन्मुख एक क्षैतिज खिड़की पर कब्जा करने के लिए जानवर के बाईं ओर वक्ष के बीच में अल्ट्रासाउंड जांच की स्थिति। यह सुनिश्चित करना कि जांच की लंबी धुरी ऊपर की ओर होती है, जांच को 50 डिग्री के कोण पर और गर्म मंच को 20 डिग्री के कोण पर ठीक करें। जांच और समर्थन फ़्रेम को स्थिति में लॉक करें.
    7. एक 30 जी, 25 मिमी सुई के साथ एक tuberculin 1 mL सिरिंज में biosafety कैबिनेट के अंदर काम करते समय सेल निलंबन ड्रा. सिरिंज में किसी भी हवा के बुलबुले को हटा दें।
      नोट:: यह बनाने के लिए और एक एकल-सेल निलंबन बनाए रखने के लिए महत्वपूर्ण है, जबकि कोशिकाओं को संसाधित और इंजेक्ट किया जाता है। हवा के बुलबुले को हटाना हवा एम्बोलिज्म से बचने के लिए एक महत्वपूर्ण कदम है। एक अच्छी तरह से प्राइम्ड सिरिंज-सुई प्रणाली प्रयोगात्मक समूह में परिहार्य मौतों को रोक देगी। हमेशा सिरिंज में अधिक मात्रा आकर्षित की तुलना में इंजेक्शन दिया जाएगा. अतिरिक्त मात्रा सेल निलंबन के कुछ वापस एक 1.5 मिलीलीटर ट्यूब में इंजेक्शन द्वारा हवा को हटाने में मदद मिलेगी।
    8. स्टीरियोटैक्टिक इंजेक्टर में सिरिंज को लॉक करें। अल्ट्रासाउंड मार्गदर्शन के तहत, छाती की दीवार के माध्यम से सुई को हृदय के बाएं वेंट्रिकल में आगे बढ़ाएं। सेल निलंबन की पूरी मात्रा (100-250 μL) को धीरे-धीरे इंजेक्ट करें।
    9. सुई निकालें और एक गर्म पैड पर एक पिंजरे में जानवर को ठीक करने के लिए एकल-घर। चेतना को पुनः प्राप्त करने के बाद जानवर को उसके विवेरियम पिंजरे में वापस कर दें, जब स्टर्नल और एम्बुलेटरी। ट्यूमर के विकास, वजन घटाने, और समग्र स्वास्थ्य स्थिति के लिए जानवर की निगरानी के रूप में चरण 2.6.6 में वर्णित है।
  9. इंट्राकैरोटिड इंजेक्शन के लिए:
    1. एसेप्टिक स्थितियों को बनाए रखने में मदद करने के लिए एक ठीक से कीटाणुरहित सतह पर पूरी प्रक्रिया करें30।
    2. एक केटामाइन (100 मिलीग्राम / किग्रा) और xylazine (10 मिलीग्राम / किग्रा) कॉकटेल के साथ एक इंसुलिन सिरिंज, 28 जी सुई के साथ इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा जानवर को एनेस्थेटिक करें। प्रक्रिया के दौरान कॉर्नियल सूखापन को रोकने के लिए जानवर की आंखों पर बाँझ पेट्रोलेटम ऑप्थेल्मिक मरहम लागू करें।
    3. एक सीधे रेजर ब्लेड के साथ प्रक्रिया क्षेत्र को शेव करें जो 30 ° कोण पर झुका हुआ है। किसी भी आगे के चरणों से पहले, पेडल रिफ्लेक्स द्वारा संज्ञाहरण के पर्याप्त स्तर के लिए आकलन करें।
    4. एक वार्मिंग पैड पर एक स्टीरियो माइक्रोस्कोप के नीचे जानवर जगह. Isopropyl अल्कोहल के 3 अनुप्रयोगों के साथ बारी बारी से 10% povidone-आयोडीन के 3 अनुप्रयोगों के साथ प्रक्रिया क्षेत्र की त्वचा को साफ करें।
    5. डॉन बाँझ व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई) और बाँझ दस्ताने. जानवर के शरीर पर एक बाँझ ड्रेप बिछाकर बाँझ क्षेत्र तैयार करें।
      नोट: यदि बाँझ ड्रेप के आकार और चीरा के स्थान के लिए उपयुक्त छेद नहीं है, तो आधे में ड्रेप को मोड़ें और बाँझ ड्रेप के बीच में उचित आकार के छेद को काटने के लिए मेटज़ेनबाम कैंची का उपयोग करें।
    6. एक scalpel या आईरिस कैंची का उपयोग करने के लिए त्वचा को आधे गर्दन से नीचे उरोस्थि तक incise. दो microsurgery संदंश के साथ, स्पष्ट रूप से मध्यरेखा विमान में 2 submandibular लार ग्रंथियों के अलावा विच्छेदन. यदि आवश्यक हो, तो हेमोस्टेसिस के लिए एक इलेक्ट्रिक कैटरी का उपयोग करें।
    7. विभाजन की ओर manubrium से आम कैरोटिड धमनी (सीसीए) के आसपास प्रावरणी विच्छेदन और बाहरी कैरोटिड के पीछे की दीवार को मुक्त करने के लिए औसत दर्जे का जारी रखें। इंजेक्ट करने से पहले बाहरी कैरोटिड धमनी (ईसीए) को अस्थायी रूप से क्लिप करें।
      नोट: सीसीए की परिधि के चारों ओर विच्छेदन करते समय, ध्यान रखा जाना चाहिए कि वेगस तंत्रिका को नुकसान न पहुंचे (धमनी के लिए पार्श्व में स्थित है)।
    8. एक 33 जी, 15 मिमी सुई के साथ एक 1 मिलीलीटर सिरिंज में सेल निलंबन लोड करें।
    9. सीसीए के तहत दो 7-0 लिगचर पास करें, और दो लिगेटर में से प्रत्येक के लिए एक ढीला उपकरण गाँठ करें। एक 5 मिमी, 10 जी दबाव पोत क्लिप का उपयोग करें और अस्थायी रूप से ईसीए क्लिप। समीपस्थ स्नायुबंधन को बांधें; फिर, डिस्टल लिगचर को शिथिल रूप से बांधें (सीसीए के विभाजन के बगल में)। इंजेक्शन के बाद रक्तस्राव को नियंत्रित करने के लिए बाद में डिस्टल लूप का उपयोग करें।
    10. एक 33 जी, 15 मिमी सुई के साथ सिरिंज का उपयोग करते हुए, धीरे से सीसीए को ऊपर की ओर और एक तीव्र कोण पर सुई के बेवल के साथ पंचर करें। सेल निलंबन की पूरी मात्रा (50-150 μL) को धीरे-धीरे इंजेक्ट करें।
    11. संदंश के साथ डिस्टल लूप को पकड़ें और सीसीए के लुमेन को रोकने और रक्तस्राव को रोकने के लिए सुई को हटाते समय इसे उठाएं। एक # 7 ज्वेलर्स संदंश के साथ सिरिंज का आदान-प्रदान करें और डिस्टल लूप को बांधें।
    12. डिस्टल लिगचर पर एक और उपकरण गाँठ फेंक दें और ईसीए से पोत क्लिप को हटा दें। रक्तस्राव के लिए सर्जिकल क्षेत्र को नियंत्रित करें और बंद होने से पहले किसी भी रक्तस्राव वाहिकाओं को cauterize करें। जानवर की त्वचा को बंद करने के लिए 9 मिमी स्टैपलिंग डिवाइस का उपयोग करें और जानवर को ठीक करने के लिए एक गर्म पैड पर रखें।
      नोट: स्टेपल को 7-10 दिनों के बाद सर्जरी के बाद निकालें।
    13. एनाल्जेसिक दवा चमड़े के नीचे-Buprenorphine (0.3 मिलीग्राम / एमएल) 0.1 मिलीग्राम / किग्रा की एकाग्रता पर 72 घंटे के बाद सर्जरी के लिए हर 12 घंटे का प्रशासन करें।
      नोट: वैकल्पिक रूप से, एक विस्तारित-रिलीज एनाल्जेसिक दवा का उपयोग करने पर विचार करें, जिसके लिए हर 72 घंटे में 1 खुराक की आवश्यकता होती है।
    14. चेतना को पुनः प्राप्त करने के बाद जानवर को उसके विवेरियम पिंजरे में वापस कर दें, जब स्टर्नल और एम्बुलेटरी। सर्जिकल साइट संक्रमण या दर्द, सामान्य स्वास्थ्य स्थिति और जटिलताओं के संकेतों के लिए दैनिक रूप से जानवरों की निगरानी करें।
      नोट: जीवित रहने की सर्जरी से अच्छी तरह से ठीक नहीं होने वाले जानवरों को दर्द की दवा की अतिरिक्त खुराक दी जा सकती है और यदि सर्जरी के बाद 72 घंटे तक पूरी तरह से बरामद नहीं किया जाता है तो मानवीय रूप से euthanized किया जाएगा।
    15. ट्यूमर के विकास, वजन घटाने, और समग्र स्वास्थ्य स्थिति के लिए जानवर की निगरानी के रूप में चरण 2.6.6 में वर्णित है।
  10. रेट्रो-कक्षीय इंजेक्शन के लिए:
    नोट: इस तकनीक का उपयोग पूंछ शिरा इंजेक्शन के विकल्प के रूप में करें जब ऑपरेटर इस तकनीक में प्रशिक्षित और कुशल होता है और जब एक मजबूत वैज्ञानिक औचित्य होता है। इस मार्ग के माध्यम से वितरित सेल निलंबन रेट्रो-ऑर्बिटल स्पेस में ट्यूमर के विकास को प्रेरित कर सकते हैं; इसलिए, इस तकनीक को चुनते समय जोखिमों और लाभों पर सावधानीपूर्वक विचार किया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, एनास्टोमोसेस के माध्यम से इंट्रासेरेब्रल नसों के साथ रेट्रो-ऑर्बिटल शिरापरक साइनस के प्रत्यक्ष संचार कनेक्शन का लाभ उठाने के लिए, इस विधि का चयन करें जब मस्तिष्क ट्यूमर गठन अन्य इंजेक्शन मार्गों का उपयोग करके विफल हो गया है।
    1. एसेप्टिक स्थितियों को बनाए रखने के लिए एक जैव सुरक्षा कैबिनेट के अंदर पूरी प्रक्रिया करें। डॉन बाँझ पीपीई और दस्ताने.
    2. चरण 2.3-2.4 में वर्णित के रूप में जानवर को एनेस्थेटिक करें।
      नोट: इस प्रक्रिया के लिए, जानवर की आंखों पर बाँझ पेट्रोलेटम नेत्र मरहम लागू न करें क्योंकि यह इंजेक्शन में बाधा डालेगा; केवल स्थानीय संवेदनाहारी बूँदें लागू करें।
    3. एक 28-31 जी, 6 मिमी सुई के साथ एक इंसुलिन सिरिंज में सेल निलंबन लोड करें।
    4. प्रवण स्थिति में जानवर के साथ, पलकों को वापस लें जब तक कि आंख बाहर नहीं निकलती। प्रक्रिया से गुजरने वाले पक्ष पर आंख में स्थानीय संवेदनाहारी की 1 बूंद लागू करें।
    5. सुई को आंख और औसत दर्जे के एपिकैंथस के बीच 30-45 डिग्री के कोण पर डालें, जिसमें बेवल नीचे की ओर सामना करना पड़ रहा है। सेल निलंबन (10-150 μL) को धीरे-धीरे इंजेक्ट करें।
      नोट: धीमी गति से आंदोलनों आंख और injectate के backflow को नुकसान को रोकने के लिए।
    6. 2.7.5-2.7.6 में वर्णित चरणों को निष्पादित करें।
  11. प्लीहा इंजेक्शन के लिए:
    1. एसेप्टिक स्थितियों को बनाए रखने के लिए एक जैव सुरक्षा कैबिनेट के अंदर पूरी प्रक्रियाका प्रदर्शन करें 31। डॉन बाँझ पीपीई और बाँझ दस्ताने.
    2. एनेस्थेटाइज़ करें और चरण 2.3-2.5 में वर्णित के रूप में जानवर को शेव करें।
    3. जानवर को एक दाहिने पार्श्व recumbent स्थिति में रखें। आइसोप्रोपिल अल्कोहल के 3 अनुप्रयोगों के साथ बारी-बारी से 10% पोविडोन-आयोडीन के 3 अनुप्रयोगों के साथ प्रक्रिया क्षेत्र की त्वचा को साफ करें और चरण 2.9.5 में वर्णित सर्जिकल क्षेत्र को तैयार करें।
    4. Metzenbaum कैंची या एक scalpel का उपयोग करके, पेट की दीवार के बाएं फ्लैंक में 1 सेमी चीरा बनाएं, जिसके बाद पेरिटोनियम में एक चीरा लगाया जाता है।
      नोट: प्लीहा त्वचा चीरा बनाने के बाद पारभासी पेट की दीवार के माध्यम से देखा जाएगा। इस साइट में पेरिटोनियल चीरा बिल्कुल निष्पादित करें।
    5. चीरा के माध्यम से तिल्ली और प्लीहा हिलम को बेनकाब करें। एक 28-31 जी इंसुलिन सिरिंज सुई का उपयोग करते हुए, लंबाई में 6 मिमी, धीरे से सुई के बेवल के साथ प्लीहा को ऊपर की ओर और एक तीव्र कोण पर पंचर करें।
      नोट: यदि पंचर घाव खून बहता है, तो रक्तस्राव और बैकफ्लो को सीमित करने के लिए साइट को cauterize करें।
    6. सेल निलंबन की पूरी मात्रा (50-100 μL) को धीरे-धीरे इंजेक्ट करें। सुई को हटा दें। प्लीहा पर एक छोटा सा धुंध रखें और संदंश के साथ दबाव लागू करें। ठीक मच्छर संदंश का उपयोग कर धुंध के बीच हल्के से तिल्ली क्लैंप और 15 मिनट के लिए प्रतीक्षा करें।
    7. एक 3-0 या 4-0 रेशम टांके के साथ प्लीहा हिलम बांधकर एक splenectomy प्रदर्शन, यदि आवश्यक हो तो जहाजों cauterizing. एक 5-0 polydioxanone (PDS) या polyglycolic एसिड अवशोषित टांका के साथ peritoneum बंद करें।
    8. चरण 2.7.5-2.7.6 में वर्णित चरणों का पालन करें।
      नोट: जानवर जो रक्तस्राव जटिलताओं को प्रस्तुत करते हैं या जो सर्जरी के बाद पूरी तरह से 72h ठीक नहीं हुए हैं, उन्हें मानवीय रूप से euthanized होना चाहिए। याद रखें कि चूहों की भलाई हर समय प्राथमिकता है।

3. स्टेज्ड उत्तरजीविता सर्जरी (एसएसएस)

  1. चरण 2.2 से प्रयोगात्मक निष्कर्षों के आधार पर, जीवित रहने की सर्जरी के लिए उचित समय निर्धारित करें। सेल लाइन और प्रयोगात्मक परिकल्पना के आधार पर, ट्यूमर लकीर के लिए एक पहले के समय बिंदु का चयन करें (ट्यूमर की मात्रा = 150 मिमी3 पर) या बाद के समय बिंदु (ट्यूमर की मात्रा = 500 मिमी3) 26 पर।
    नोट: ट्यूमर की मात्रा सीमा 1,500 मिमी3 है जब ट्यूमर का बोझ जानवर की भलाई के लिए हानिकारक होने के लिए पर्याप्त रूप से अधिक होता है और जटिलताओं के लिए पूर्वनिर्धारित होता है।
  2. एनेस्थेटाइज़ करें और चरण 2.3-2.5 में वर्णित के रूप में जानवर को शेव करें।
    नोट: पूरी प्रक्रिया एक biosafety कैबिनेट के अंदर किया जाता है।
  3. आइसोप्रोपिल अल्कोहल के 3 अनुप्रयोगों के साथ बारी-बारी से 10% पोविडोन-आयोडीन के 3 अनुप्रयोगों के साथ प्रक्रिया क्षेत्र की त्वचा को साफ करें और चरण 2.9.5 में वर्णित सर्जिकल क्षेत्र को तैयार करें।
  4. आईरिस कैंची या एक स्केलपेल का उपयोग करके, त्वचा को इनिस करें, ट्यूमर के किनारे से 5-7 मिमी लकीर मार्जिन बनाए रखें।
    नोट: लकीर के लिए मार्जिन स्थानीय रूप से फैलने के लिए ट्यूमर की क्षमता पर निर्भर करता है। आक्रामक ट्यूमर के लिए, लकीर मार्जिन को बढ़ाएं, जबकि यह सुनिश्चित करें कि घाव बंद करने के लिए पर्याप्त त्वचा छोड़ दी गई है।
  5. इंट्राडर्मल ट्यूमर के मामले में, परिधीय त्वचा के साथ ट्यूमर को उच्छेदन करें।
  6. चमड़े के नीचे के ट्यूमर के लिए, विच्छेदन और त्वचा के नीचे ट्यूमर को हटा दें।
    नोट: यदि ट्यूमर पेरिटोनियम और / या त्वचा पर आक्रमण करता है, तो इसे ट्यूमर के साथ ब्लॉक में उच्छेदित करें और 5-0/
  7. 9 मिमी स्टैपलिंग डिवाइस के साथ घाव को बंद करें।
    नोट: स्टेपल को 7-10 दिनों के बाद सर्जरी के बाद निकालें। एनाल्जेसिक दवा का प्रशासन करें और ठीक होने के लिए जानवर को गर्म पैड पर रखें। 72 घंटे के बाद की सर्जरी के लिए एनाल्जेसिक दवा का प्रशासन जारी रखें, चरण 2.9.13 के अनुसार हर 12 घंटे में एक बार। रक्तस्राव जटिलताओं वाले जानवरों या जिन्होंने सर्जरी के बाद पूर्ण चेतना हासिल नहीं की है, उन्हें मानवीय रूप से euthanized किया जाना चाहिए।
  8. एकल घर एक पिंजरे में जानवर, एक गर्म पैड पर ठीक करने के लिए। चेतना को पुनः प्राप्त करने के बाद जानवर को विवेरियम पिंजरे में वापस कर दें, जब स्टर्नल और एम्बुलेटरी।
  9. स्थानीय पुनरावृत्ति, वजन घटाने, न्यूरोलॉजिकल, लोकोमोटर, और / या व्यवहार के संकेतों (सुस्ती, सौंदर्य की कमी, कम भोजन या पानी का सेवन) और समग्र स्वास्थ्य स्थिति के लिए पशु पोस्ट-सर्जरी की निगरानी करना जारी रखें।

4. विवो इमेजिंग में (चित्रा 2A)

  1. एक 1 मिलीलीटर इंसुलिन सिरिंज, 28 जी सुई के साथ इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा जानवरों को डी-लूसिफेरिन सब्सट्रेट (150 मिलीग्राम / किग्रा) का प्रशासन करें।
    नोट: ट्यूमर कोशिकाओं को ल्यूसिफेरस सीडीएनए के साथ स्थिर रूप से ट्रांसड्यूस किया जाना चाहिए।
  2. एनेस्थीसिया को प्रेरित करें जैसा कि डी-लूसिफेरिन सब्सट्रेट इंजेक्शन के 6 मिनट बाद चरणों 2.3-2.4 में वर्णित है।
  3. एक bioluminescence इमेजिंग (BLI) स्कैनर (विवो इमेजिंग प्रणाली में ) 26 का उपयोग कर इमेजिंग प्रदर्शन.
  4. इमेजिंग कक्ष के अंदर और नाक शंकु में जानवर ले जाएँ। इमेजिंग सिस्टम की क्षमता के आधार पर एक साथ 5 जानवरों तक की छवि।
  5. प्रारंभ दबाकर उपकरण प्रारंभ करें. ऑटो (1-120 s) के लिए एक्सपोज़र समय सेटिंग सेट करें।
  6. यदि आवश्यक हो तो किसी भी पृष्ठभूमि को घटाने के लिए एक रिक्त छवि कैप्चर करें। अधिग्रहण अनुक्रम पूरा होने के बाद प्राप्त करें और छवि सहेजें क्लिक करें.
  7. जानवर को एक पिंजरे में वापस रखें, जो संज्ञाहरण से उबरने के लिए वार्मिंग पैड पर आधार सतह क्षेत्र के 50% के साथ बैठता है। चेतना को पुनः प्राप्त करने के बाद जानवर को विवेरियम पिंजरे में वापस कर दें, जब स्टर्नल और एम्बुलेटरी।
  8. विवो इमेजिंग सॉफ़्टवेयर में उसी में डेटा विश्लेषण के लिए जिसके साथ छवियों पर कब्जा कर लिया गया था, उस फ़ोल्डर में नेविगेट करें जहां छवियों को सहेजा जाता है, और एक ही बार में प्रयोग से संबंधित सभी चूहों की छवियों को खोलें।
    नोट:: एक समय में एक छवि का विश्लेषण समूहों में सामान्यीकरण की अनुमति नहीं देगा।
  9. इकाइयों को चमक पर सेट करें ( गिनती नहीं)। सुनिश्चित करें कि व्यक्ति को इंगित करने वाला चेकबॉक्स अनियंत्रित है, क्योंकि यह समूहों में सिग्नल के सामान्यीकरण को रोक देगा।
  10. रुचि के क्षेत्र (ROI) ड्राइंग उपकरण का उपयोग करते हुए, मस्तिष्क क्षेत्र और शरीर के लिए आयताकार ROIs के लिए परिपत्र ROIs आकर्षित करें। मस्तिष्क आरओआई से कान और नाक को बाहर करने के लिए सावधान रहें, क्योंकि वे अनिर्दिष्ट ल्यूमिनेसेंस का उत्सर्जन करते हैं। इस प्रक्रिया में पूर्वाग्रह को कम करने के लिए, केवल चूहों की तस्वीरों पर आरओआई आकर्षित करें, बिना ल्यूमिनेसेंट सिग्नल के।
  11. संकेत को मापने और डेटा को स्प्रेडशीट में निर्यात करने के लिए मापें ROIs का चयन करें। ब्याज के शरीर क्षेत्रों में कुल luminescent फ्लक्स (p / sec / cm2 / sr) की साजिश रचकर समूहों के बीच अंतर का विश्लेषण करें।
    नोट: विशेष रूप से मस्तिष्क ट्रोपिज़्म में समूहों के बीच अंतर का आकलन करने के लिए, प्रत्येक माउस के लिए मस्तिष्क संकेत और शरीर के संकेत के बीच अनुपात की गणना करें। यह समग्र ट्यूमर बोझ में अंतर और प्रयोगात्मक समूहों के बीच लूसिफेरस अभिव्यक्ति के स्तर में अंतर के लिए इंटरमाउज भिन्नता के लिए नियंत्रण करता है।

5. पूर्व विवो चुंबकीय अनुनाद इमेजिंग

  1. इच्छामृत्यु के तुरंत बाद पूर्व विवो एमआरआई करें। वैकल्पिक रूप से, ब्याज के अंगों को काटें, उन्हें 72 घंटे तक फॉर्मेलिन में ठीक करें, और बाद के टाइमपॉइंट पर इमेजिंग करें।
  2. एक 7-टेस्ला (7-टी) (300-मेगाहर्ट्ज) माइक्रो-एमआरआई सिस्टम के साथ छवियों को प्राप्त करें जो एक एनएमआर कंसोल और शून्य-फोड़ा-बंद, क्षैतिज बोर चुंबक या इसी तरह के उपकरणों से सुसज्जित है।
    नोट:: प्रदर्शन के सही व्यापार बंद के साथ एक सक्रिय रूप से परिरक्षित ढाल कुंडल सम्मिलित करने की आवश्यकता महत्वपूर्ण है। इसे कम से कम 50 मिमी गतिशील गोलाकार आयतन (डीएसवी) की ग्रेडिएंट रैखिकता प्रदान करनी चाहिए ताकि बिना किसी ज्यामितीय विरूपण के साथ जांच किए गए नमूनों के सेट को कवर किया जा सके। ग्रेडिएंट ताकत (440 से 750 एमटी / मीटर तक) और ड्यूटी चक्र का संयोजन 3 x 30 ए से 3 x 87 ए तक की अधिकतम एक साथ डीसी धाराओं को सक्षम करने के लिए पर्याप्त इमेजिंग प्रदर्शन को सक्षम करेगा। उपयोग किया गया ग्रेडिएंट कॉइल सम्मिलित करें ( सामग्री की तालिका देखें) निम्नलिखित प्रदर्शन को सक्षम बनाता है: 660 mT / m, 130 μs वृद्धि समय, 3 x 87 A, और एक DSV = 80 मिमी।
  3. एक वाणिज्यिक संचारित-प्राप्त परिपत्र रूप से ध्रुवीकृत पूरे माउस शरीर रेडियोफ्रीक्वेंसी कॉइल (OD = 59 मिमी, आईडी = 38mm, एल = 40 मिमी) के साथ स्कैन करें 300.16 मेगाहर्ट्ज, 1एच प्रोटॉन लार्मर आवृत्ति के लिए ट्यून किया गया।
    नोट: यह आरएफ जांच 8-12 घंटे तक फैले रातभर स्कैन के दौरान सबमिलिमेट्रिक आइसोट्रोपिक रिज़ॉल्यूशन (<150 μm) के साथ 3 डी डेटासेट के अधिग्रहण को सक्षम बनाता है।
  4. एकाधिकअनुक्रमों 30 का उपयोग कर ट्यूमर बोझ का पता लगाएं।
    नोट: हाइपरइंटेंस सिग्नल एक टी 2-भारित द्वारा पता लगाया गया, Refocused Echoes (RARE) अनुक्रम के साथ रैपिड इमेजिंग ट्यूमर के आसपास के एडिमा को पहचानता है।
  5. निम्नलिखित अधिग्रहण पैरामीटर के साथ 3 डी दुर्लभ अनुक्रम निष्पादित करें: [120 μm]3 आइसोट्रोपिक रिज़ॉल्यूशन; अधिग्रहण समय 5 ज, 27 मिनट; पुनरावृत्ति समय (TR) = 500 ms; इको स्पेसिंग (ईएस) = 12.7 मिनट; टर्बो कारक TFx = 12; प्रभावी प्रतिध्वनि समय (TEeff) = 76.2 ms; बैंडविड्थ (BW) = 75 KHz; मैट्रिक्स का आकार = 2843; देखने का क्षेत्र (FOV) = [4.0 मिमी]3; औसत की संख्या (एनएवी) = 6।
  6. निम्न पैरामीटर्स का उपयोग कर मेटास्टेसिस का पता लगाएँ।
    1. सिग्नल ब्राइटनिंग के साथ पिगमेंटेड मेटास्टेसिस के लिए, निम्नलिखित मापदंडों के साथ एक टी1-भारित 3 डी ग्रेडिएंट इको अनुक्रम का उपयोग करें: [120 μm]3 आइसोट्रोपिक रिज़ॉल्यूशन; अधिग्रहण समय 2 ज, 41 मिनट; TR = 20 ms; प्रतिध्वनि समय (TE) = 4.0 ms; फ्लिप कोण (FA) = 18°; BW = 75 KHz; मैट्रिक्स आकार = 2843; FOV = [34.0 मिमी]3; नव = 6।
    2. Unpigmented और / या रक्तस्रावी मेटास्टेसिस के लिए, एक hypointense संकेत का उपयोग करें जब एक टी2 * - भारित, multigradient इको (एमजीई) अनुक्रम (3 डी एमजीई, [120 μm] 3 आइसोट्रोपिक संकल्प; अधिग्रहण समय 3 ज, 35 मिनट) के तहत प्राप्त; TR = 40 ms; TE = 3.6 ms; ईएस = 3.2 एमएस; 4 गूँज; FA = 20°; BW = 100 kHz; मैट्रिक्स का आकार = 2843; FOV = (34.0 मिमी)3; नव = 4।
  7. ट्यूमर के बोझ को मापने के लिए सभी 3 अनुक्रमों का उपयोग करें।
  8. सटीकता सुनिश्चित करने के लिए हिस्टोलॉजिकल वर्गों के साथ विश्लेषण के दौरान पहचाने गए ट्यूमर क्षेत्रों को क्रॉस-संदर्भित करें। अनुभाग 7 और 8 देखें.

6. एकल सेल या थोक आरएनए अनुक्रमण के लिए ऊतक प्रसंस्करण

  1. संस्था के IACUC द्वारा अनुमोदित किसी भी विधि का उपयोग करके जानवर को Euthanize करें। चरण 2.6.6 के नोट में वर्णित कार्यविधियों में से एक देखें।
  2. ब्याज के अंगों को विच्छेदित करें और उन्हें बर्फ पर हांक के संतुलित नमक समाधान (एचबीएसएस) वाली प्लेट के अलग-अलग कुओं में रखें। तेजी से काम करें और सेल व्यवहार्यता को अधिकतम करने के लिए ऊतक को हर समय बर्फ पर रखें।
    नोट:: निम्न चरणों मस्तिष्क प्रसंस्करण के लिए विशिष्ट हैं। अपनी आवश्यकताओं के आधार पर विशिष्ट ऊतक के लिए कोलेजनेज प्रकार को समायोजित करें।
  3. प्रत्येक कुएं में 3 मिलीलीटर एचबीएसएस के साथ एक 6-अच्छी तरह से प्लेट तैयार करें।
  4. विच्छेद को देखने और आगे विच्छेदन का मार्गदर्शन करने में मदद करने के लिए, एक प्रतिदीप्ति माइक्रोस्कोप का उपयोग करें और लेबल किए गए क्षेत्रों की पहचान करें।
  5. फ्लोरोसेंट क्षेत्रों को विच्छेदित करें और ऊतक के टुकड़ों को 6-अच्छी तरह से प्लेट में रखें (1 टुकड़ा प्रति अच्छी तरह से यदि व्यक्तिगत मेटास्टैटिक फोकी का विश्लेषण किया जाना है या एक अंग से कई टुकड़े यदि एक ही अंग में कई मेटास्टेसिस का विश्लेषण किया जाना है)। बाँझ रेजर ब्लेड का उपयोग करें ताकि ऊतक को यथासंभव छोटे टुकड़ों में कीमा बनाया जा सके (प्रत्येक नमूने के लिए इस चरण पर 1-2 मिनट से अधिक खर्च किए बिना)।
    नोट: ट्यूमर के प्रसंस्करण समय को सीमित करने से सेल व्यवहार्यता को संरक्षित करने में मदद मिलती है।
  6. Aspirate और एक 15 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब के लिए प्रत्येक अच्छी तरह से की सामग्री हस्तांतरण.
    नोट: बड़े टुकड़ों के हस्तांतरण को सुविधाजनक बनाने के लिए एक 1,000 μL पिपेट टिप की नोक काटें।
  7. अच्छी तरह से HBSS के 1 मिलीलीटर जोड़ें और सुनिश्चित करें कि शेष ऊतक टुकड़े / कोशिकाओं को 15 एमएल ट्यूब में स्थानांतरित कर दिया जाता है, जिसमें 4 एमएल की अंतिम मात्रा होगी। प्रत्येक ट्यूब के लिए कोलेजनेज प्रकार I (40 मिलीग्राम / एमएल) और 12.5 μL DNase I (2,000 इकाइयों / एमएल) के 50 μL जोड़ें।
  8. शंक्वाकार ट्यूबों को 45 मिनट के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर गर्म पानी के स्नान में रखें। संक्षेप में हर 5 मिनट में शंक्वाकार ट्यूबों भंवर.
  9. HBSS के साथ एक 70 μm छलनी Prewet. एक निष्फल माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूब या एक सिरिंज प्लंजर के प्लास्टिक भाग के कैप्ड अंत का उपयोग करें और एक नए 50 एमएल शंक्वाकार ट्यूब में 70 μm छलनी के माध्यम से ऊतक homogenates पीस।
    नोट: HBSS या FACS बफर के साथ strainers prewetting तनाव की सुविधा देता है.
  10. एचबीएसएस के 1 एमएल के साथ छलनी को धोएं। HBSS के साथ एक 40 μm छलनी Prewet. एक नए 50 मिलीलीटर शंक्वाकार ट्यूब में एक 40μm छलनी के माध्यम से प्रत्येक नमूने को फिर से फ़िल्टर करें। इसे धोने के लिए 40 μm छलनी में FBS के 1 mL जोड़ें। शंक्वाकार ट्यूबों को हर समय बर्फ पर रखें।
  11. बर्फ-ठंडे DPBS के साथ शंक्वाकार ट्यूब को 50 मिलीलीटर तक भरें। कोशिकाओं को नीचे स्पिन करें (4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 180 × जी )। supernatant त्याग, सावधान किया जा रहा है सेल गोली खोने के लिए नहीं किया जा रहा है.
    नोट: मस्तिष्क के नमूनों के लिए, 38% घनत्व पृथक्करण समाधान के 2.5 मिलीलीटर में कोशिकाओं को फिर से निलंबित करें (एचबीएसएस में पतला करें और कमरे के तापमान (आरटी) पर स्टोर करें)। 5 एमएल FACS ट्यूबों के लिए स्थानांतरण. 800 × ग्राम पर 20 मिनट के लिए स्पिन। एक 1,000 μL पिपेट टिप की नोक काटें और शीर्ष वसा परत को हटा दें। ट्यूबों की दीवारों पर कोई वसा न छोड़ें। यदि कोई वसा छोड़ दिया जाता है, तो फिर से नीचे स्पिन करें और प्रक्रिया को दोहराएं। यह एक महत्वपूर्ण कदम है । तरल चरण के बाकी हिस्सों को हटा दें (गोली पारभासी और कल्पना करने के लिए कठिन होगी)।
  12. लाल रक्त कोशिका (RBC) लाइसिस बफर के 1 mL में कोशिकाओं को पुन: निलंबित करें और RT पर 60 s के लिए इनक्यूबेट करें। DPBS के 20 mL को जोड़कर lysis समाधान को बुझाएं।
  13. 4 डिग्री सेल्सियस पर 10 मिनट के लिए 180 × जी पर कोशिकाओं को नीचे स्पिन करें। supernatant निकालें और FACS बफर (DPBS में 5% FBS) के 2 mL में कोशिकाओं resuspend।
  14. या तो थोक या एकल-सेल आरएनए-अनुक्रमण के लिए लेबल किए गए कक्षों और / या लाइब्रेरी तैयारी को सॉर्ट करने के साथ आगे बढ़ें।
    नोट: कोशिकाओं को नीचे काता जा सकता है, स्नैप-फ्रोजन किया जा सकता है, और थोक आरएनए-सेक के लिए आरएनए अलगाव से पहले -80 डिग्री सेल्सियस पर संग्रहीत किया जा सकता है।

7. पशु ऊतक परफ्यूजन और immunohistological विश्लेषण के लिए तैयारी

  1. एक इंसुलिन सिरिंज और एक 28 जी सुई के साथ इंट्रापेरिटोनियल इंजेक्शन द्वारा केटामाइन (300 मिलीग्राम / किग्रा) और xylazine (30 मिलीग्राम / किग्रा) कॉकटेल की अधिक मात्रा के साथ जानवर को एनेस्थेटिक करें।
  2. स्थूल विच्छेदन द्वारा हृदय को उजागर करें और दाहिने आलिंद में चीरा लगाएं। लंबे, घुमावदार संदंश के साथ धीरे से दिल को पकड़ें, जो पूर्वकाल का सामना कर रहे हैं।
    नोट: फॉर्मेलिन और पैराफॉर्मेल्डिहाइड (पीएफए) कार्सिनोजेन्स हैं। सुरक्षा डेटा शीट (एसडीएस) पढ़ें, धुएं के संपर्क से बचें, और उपयुक्त पीपीई पहनें।
  3. 22 जी, 22 मिमी सुई के साथ 10 एमएल सिरिंज का उपयोग करते हुए, 10 मिलीलीटर डीपीबीएस इंजेक्ट करें, इसके बाद बाएं वेंट्रिकल में 4% पीएफए के 10 मिलीलीटर के बाद।
  4. अंगों को काटने के लिए आगे बढ़ें और उन्हें प्रीलेबल हिस्टोलॉजिकल कैसेट में लोड करें। कैसेट को एक उचित आकार के कंटेनर में रखें जो ऊतकों को कवर करने के लिए पर्याप्त फिक्सेटिव (फॉर्मेलिन) को समायोजित करता है।
    नोट: आदर्श रूप से, फिक्सेटिव वॉल्यूम ऊतकों की मात्रा का 5-10 गुना होना चाहिए।
  5. हिस्टोलॉजिकल कैसेट के अंदर अंगों को 48-72 घंटे के लिए 10% फॉर्मेलिन में ठीक करें। 10% फॉर्मेलिन को छोड़ दें और कैसेट को 1x DPBS के साथ दो बार धोएं।
  6. 2 घंटे के लिए 70% इथेनॉल में कैसेट को डुबोकर निर्जलीकरण प्रक्रिया शुरू करें। इथेनॉल सांद्रता बढ़ाने में कैसेट को क्रमिक रूप से विसर्जित करना जारी रखें: 80%, 95%, 100% प्रत्येक के लिए 1 घंटे। 1.5 घंटे के बाद 100% समाधान को दो बार बदलें। 1.5 घंटे के लिए जाइलीन में कैसेट को विसर्जित करें और समाधान के तीन परिवर्तन करें।
  7. पैराफिन मोम में कैसेट को 58-60 डिग्री सेल्सियस पर एम्बेड करें। पैराफिन ब्लॉकों अनुभाग. Hematoxylin और eosin (H &E) orimmunohistochemistry धुंधला करने के लिए आगे बढ़ें।
  8. मेलेनोमा कोशिकाओं की पहचान करने के लिए, इन मार्करों या पैनल में से किसी एक का उपयोग करें: S100, Melan-A, HMB-45, Tyrosinase, MITF। जब संभव हो, तो परमाणु माइटोटिक उपकरण प्रोटीन (NuMA) धुंधला का उपयोग करें क्योंकि यह एक अत्यधिक विशिष्ट मानव सेल मार्कर है।
    नोट: NuMA धुंधला मेजबान (माउस) और engrafted कोशिकाओं (मानव) है कि छवि प्रसंस्करण और बाद के ट्यूमर परिमाणीकरण चरणों में सहायता के बीच एक तेज delineation प्रदान करता है.

Figure 2
चित्रा 2: बीएलआई, ब्राइटफील्ड, पूर्व विवो प्रतिदीप्ति, और एच एंड ई स्टेनिंग छवियों के उदाहरण मेलेनोमा मेटास्टेसिस में उम्मीदवार जीन के प्रभावों के विश्लेषण के लिए बहुआयामी दृष्टिकोण को दर्शाते हैं। (ए) बीएलआई, (बी) बीएफ, (सी) पूर्व विवो प्रतिदीप्ति, और (डी) एच एंड ई धुंधला छवियां। चित्रण के उद्देश्य के लिए उपयोग की जाने वाली छवियां एक प्रयोग के अनुरूप हैं जिसमें 131/6-4L मेलेनोमा कोशिकाओं को एक गैर-लक्ष्यीकरण नियंत्रण shRNA (shNTC) या FUT8 को लक्षित करने वाले एक shRNA के साथ ट्रांसड्यूस किया गया था, जिसे immunodeficient (NSG) चूहों में इंजेक्ट किया गया था। FUT8 मौन मेलेनोमा कोशिकाओं के मेटास्टैटिक प्रसार बिगड़ा. स्केल बार और रंग पट्टी = p/sec/cm2/sr × 106 (A), 100 mm (B, C), 100 μm (D). संक्षेप: BLI = bioluminescence इमेजिंग; H&E = hematoxylin और eosin; shRNA = छोटे हेयरपिन आरएनए; shNTC = गैर-लक्ष्यीकरण नियंत्रण shRNA; एनएसजी = गैर मोटापे से ग्रस्त मधुमेह गंभीर संयुक्त immunodeficiency गामा; FUT8 = fucosyltransferase 8; BF = brightfield कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

8. परमाणु माइटोटिक उपकरण प्रोटीन (NuMA) धुंधला (चित्रा 3)

  1. ऊतक वर्गों में मेटास्टैटिक बोझ की पहचान और परिमाणीकरण के लिए एक अत्यधिक मानव-विशिष्ट माइटोटिक स्पिंडल मार्कर के रूप में एंटी-न्यूमा एंटीबॉडी का उपयोग करें। 8.1. मेलेनोमा कोशिकाओं की अत्यधिक विशिष्ट और संवेदनशील पहचान प्राप्त की जाती है।
  2. NuMA के लिए क्रोमोजेनिक immunohistochemistry एक स्वचालित immunostaining उपकरण पर किया जाता है, तो32 वर्णित के रूप में इन चरणों का पालन करें:
  3. जाइलीन में वर्गों deparaffinize और क्रमिक रूप से इथेनॉल सांद्रता को कम करने में उन्हें rehydrate. स्लाइड को जाइलीन में 15 मिनट के लिए जलमग्न रखें और उन्हें एक और 15 मिनट के लिए 100% इथेनॉल में स्थानांतरित करें।
    नोट: इथेनॉल पुनर्जलीकरण चरणों (95%, 80%, 75%) के शेष 3 से 5 मिनट प्रत्येक के लिए पिछले।
  4. विआयनीकृत पानी में स्लाइड कुल्ला.
  5. एक कंटेनर में स्लाइड को डुबोकर एपिटोप पुनर्प्राप्ति करें (उदाहरण के लिए, कोप्लिन स्टेनिंग जार) 10 mM सोडियम साइट्रेट बफर, पीएच 6.0 में, 1200 वाट माइक्रोवेव ओवन में 10 मिनट के लिए 100% शक्ति पर।
  6. लेबलिंग के लिए असंयुग्मित, पॉलीक्लोनल खरगोश एंटी-ह्यूमन न्यूमा एंटीबॉडी का उपयोग करें, ट्राइस-बोवाइन सीरम एल्ब्यूमिन (बीएसए) (25 एमएम ट्रिस, 15 एमएम एनसीएल, 1% बीएसए, पीएच 7.2) में 1: 7,000 पतला। अध्ययन अनुभागों के साथ समानांतर में उपयुक्त सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण चलाएँ।
  7. 12 घंटे के लिए प्राथमिक एंटीबॉडी के साथ स्लाइड इनक्यूबेट करें। बकरी विरोधी खरगोश HRP संयुग्मित multimer के साथ प्राथमिक एंटीबॉडी का पता लगाने और 3,3-diaminobenzidine और एक तांबा सल्फेट बढ़ाने के साथ परिसर की कल्पना.
  8. आसुत पानी में स्लाइड को धोएं, हेमेटोक्सिलिन के साथ काउंटरस्टेन, निर्जलित करें, और स्थायी माध्यम के साथ माउंट करें।
    नोट:: निर्जलीकरण चरण चरण 8.3 में वर्णित rehydration चरणों के रिवर्स हैं। 20x या 40x आवर्धन पर उपलब्ध स्कैनर के साथ स्लाइड्स को स्कैन करें और उन्हें डेटाबेस पर अपलोड करें।
  9. सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके, अन्य अंग पैरेन्काइमा और खाली स्थानों को छोड़कर, अंग ऊतक के भीतर सभी NuMA-दाग कोशिकाओं को शामिल करने के लिए ROIs आकर्षित करें।
  10. प्रत्येक अंग के लिए उपयुक्त सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण का उपयोग करते समय NuMA-सकारात्मक और NuMA-नकारात्मक कोशिकाओं को वर्गीकृत करने के लिए सेटिंग्स समायोजित करें। प्रत्येक नमूने के लिए NuMA-धनात्मक कोशिकाओं की कुल संख्या/प्रतिशत को मापने के लिए एक स्थापित सॉफ़्टवेयर एल्गोरिथ्म का उपयोग करें.

9. ऊतक टुकड़ा immunofluorescence

मेटास्टैटिक चरण की पहचान करने के लिए जिसमें एक विशेष जीन उम्मीदवार की आवश्यकता होती है (उदाहरण के लिए, सीडिंग के बाद एक्सट्रावेशन बनाम उत्तरजीविता), कोई भी इंजेक्शन से ट्यूमर सेल प्रगति को ट्रैक करने के लिए अलग-अलग समय बिंदुओं पर ऊतक स्लाइस इम्युनोफ्लोरेसेंस निर्धारित कर सकता है दूर के अंग आक्रमण, सीडिंग और विकास। यह दृष्टिकोण पड़ोसी कोशिकाओं के लिए मार्करों के अतिरिक्त को एक्सट्रावेशन घटना और आसपास के ट्यूमर माइक्रोएन्वायरमेंट परिवर्तनों को पकड़ने की अनुमति देताहै 33।

  1. चरण 7.1 में वर्णित के रूप में जानवर को एनेस्थेटिकाइज़ करें।
  2. संवहनी एंडोथेलियम को चित्रित करने के लिए, प्रत्येक जानवर के बाएं वेंट्रिकल में फ्लोरोफोर संयुग्मित लाइकोपर्सिकॉन एस्कुलेंटम (टमाटर) लेक्टिन के 100 μg को इंजेक्ट करें, परफ्यूजन से 3 मिनट पहले।
    नोट: टमाटर लेक्टिन के लिए पूरे सिस्टम में पुन: परिसंचरण करने के लिए समय की अनुमति दें।
  3. चरण 7.2-7.3 में वर्णित के रूप में जानवर perfuse. ब्याज के अंगों को काट लें और उन्हें 4% पीएफए से भरे प्रीलेबल कंटेनरों में स्थानांतरित करें। ऊतक को 24 से 48 घंटे के लिए ठीक करें। 30-50 μm मोटी स्लाइस में एक vibratome का उपयोग कर ऊतक अनुभाग.
    नोट: मोटाई को अनुकूलित किया जाना चाहिए। 30 μm और 50 μm मोटाई के बीच स्लाइस की सिफारिश की जाती है, खासकर जब z-स्टैक इमेजिंग का प्रदर्शन किया जाता है।
  4. RT में 2 ज के लिए बफर (10% सामान्य बकरी सीरम, 2% BSA, 0.25% Triton X-100 DPBS में) को अवरुद्ध करने में स्लाइस इनक्यूबेट करें।
  5. धुंधला अनुकूलन प्रयोग करें।
    नोट: एंटीजन पुनर्प्राप्ति समय के रूप में, एंटीजन पुनर्प्राप्ति, तापमान, विभिन्न एंटीबॉडी / विभिन्न लॉट के लिए उपयोग किए जाने वाले बफर, और ऊतक के प्रकार धुंधला को प्रभावित करते हैं, अनुकूलन प्रयोग आवश्यक हैं।
  6. एक अनुकूलित कमजोर पड़ने पर प्राथमिक एंटीबॉडी जोड़ें और एक अनुकूलित तापमान पर एक अनुकूलित समय के लिए इनक्यूबेट करें ( तालिका 1 में उदाहरण देखें)।
    नोट:: प्राथमिक/द्वितीयक एंटीबॉडी और unstained ऊतक के नमूनों के लिए उपयुक्त नियंत्रण का उपयोग करें।
  7. DPBS में 0.25% Triton X-100 के साथ 5 मिनट के लिए ऊतक स्लाइस को 3 बार धोएं।
  8. द्वितीयक एंटीबॉडी में ऊतक स्लाइस को वांछित समय के लिए अवरुद्ध समाधान में पतला करें (तालिका 1)।
  9. DPBS में 0.25% Triton X-100 के साथ 5 मिनट के लिए ऊतक स्लाइस को 3 बार धोएं।
  10. 4', 6-diamidino-2-phenylindole (DAPI) के साथ नाभिक दाग DPBS में 1: 1,000 पतला या 5 मिनट के लिए बफर को अवरुद्ध.
  11. एक coverslip करने के लिए antifade प्रतिदीप्ति बढ़ते माध्यम की 2 बूँदें जोड़ें और कांच स्लाइड पर ऊतक माउंट, सुनिश्चित करें कि स्लाइस पूरी तरह से बढ़ते माध्यम से कवर कर रहे हैं.
    नोट: सुनिश्चित करें कि स्लाइस पर सीधे कोई हवा के बुलबुले नहीं हैं क्योंकि यह माइक्रोस्कोपी को विकृत करता है।
  12. एक 60x तेल विसर्जन उद्देश्य का उपयोग कर उपलब्ध माइक्रोस्कोप के साथ confocal छवियों पर कब्जा.
    नोट: confocal छवियों को प्राप्त करते समय, प्रयोग के भीतर सभी छवियों में एक ही सेटिंग्स पैरामीटर (वोल्टेज, हवादार इकाइयों, और लाभ) लागू होते हैं।
  13. 10x, 20x, या 40x पर माइक्रोस्कोप का उपयोग करके गैर-confocal छवियों को कैप्चर करें।
  14. एक छवि विश्लेषण सॉफ़्टवेयर में चित्रों को अपलोड करें और पसंद के मापदंडों (यानी, क्षेत्र, संख्या, मार्करों की तीव्रता, या आसन्न कोशिकाओं के साथ संपर्क) की तुलना करके उनका विश्लेषण करें।

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Representative Results

निम्नलिखित आंकड़े बताते हैं कि मेलेनोमा मेटास्टेसिस के उपन्यास ड्राइवरों की पहचान के लिए वर्णित वर्कफ़्लो को कैसे लागू किया गया है। चित्रा 2 एक प्रकाशित अध्ययन के परिणामों को संक्षेप में प्रस्तुत करता है जिसमें विवो मेलेनोमा मेटास्टेसिस में फ्यूकोसिलट्रांसफरेज़ FUT8 को शांत करने के प्रभावों काअध्ययन किया गया था। संक्षेप में, मानव रोगी ग्लाइकोमिक डेटा (लेक्टिन सरणियों द्वारा प्राप्त) और ट्रांसक्रिप्टोमिक प्रोफाइलिंग के विश्लेषण से पता चला कि प्राथमिक से मेटास्टैटिक मेलेनोमा तक प्रगति से जुड़े अल्फा -1,6-फ्यूकोज़ के स्तर में वृद्धि हुई है, जो संबंधित फ्यूकोसिलट्रांसफरेज़ (FUT8) में वृद्धि के अनुरूप है।

113/6-4L मेलेनोमा कोशिकाओं को एक FUT8 shRNA या इसी गैर-लक्ष्यीकरण नियंत्रण (shNTC) ले जाने वाले lentiviruses के साथ transduced को अल्ट्रासाउंड-निर्देशित इंट्राकार्डियक इंजेक्शन द्वारा immunodeficient चूहों (NSG) में पेश किया गया था, जैसा कि ऊपर वर्णित है (खंड 2.9)। चूहों को विवो बीएलआई में मेटास्टैटिक प्रसार के लिए निगरानी की गई थी। प्रयोग के अंत में चूहों को euthanized किया गया था, अंगों को पूर्व विवो प्रतिदीप्ति के लिए जांच की गई थी और हिस्टोलॉजिकल विश्लेषण के लिए संसाधित किया गया था। एच एंड ई के अलावा, विशेष रूप से मुरीन ऊतकों में मानव कोशिकाओं की पहचान करने के लिए एनयूएमए स्टेनिंग किया गया था। जैसा कि चित्रा 3 में दिखाया गया है, NuMA-दाग वर्गों को कई वर्गों और प्रयोगात्मक समूहों में मेटास्टैटिक बोझ को मापने के लिए डिजिटल इमेजिंग द्वारा संसाधित किया गया था। मेलेनोमा मेटास्टेसिस के लिए अन्य उम्मीदवार जीन के योगदान का आकलन करने के लिए एक समान वर्कफ़्लो लागू किया जा सकता है।

Figure 3
चित्रा 3: NuMA-दाग फेफड़े के वर्गों( ए) बाएं, समूह I (नियंत्रण lentivirus के साथ संक्रमित मेलेनोमा कोशिकाओं) और समूह II (मेलेनोमा कोशिकाओं एक मेटास्टेसिस दमनकारी-व्यक्त lentivirus के साथ संक्रमित मेलेनोमा कोशिकाओं) से NuMA-सना हुआ फेफड़ों के वर्गों की प्रतिनिधि छवियों। स्केल सलाखों = 1,000 μm. इनसेट मेटास्टैटिक फोकी (मध्य) प्रदर्शित करते हैं जिन्हें सॉफ़्टवेयर का उपयोग करके परिमाणित किया जा सकता है। सही, मेटास्टैटिक मेलेनोमा कोशिकाओं को हरे रंग का लेबल दिया जाता है, और अंग क्षेत्र को एक हरे रंग की हैच की गई रेखा द्वारा चित्रित किया जाता है। NuMA-नकारात्मक कोशिकाओं को नीले रंग का लेबल दिया जाता है। स्केल बार = 100 μm. (B) NuMA-दाग फेफड़ों के वर्गों में एक माइक्रोमेटास्टेसिस का उदाहरण कोशिकाओं की एक छोटी संख्या का पता लगाने में सॉफ़्टवेयर की संवेदनशीलता को दर्शाता है। स्केल बार = 100 μm संक्षेप: NuMA = परमाणु माइटोटिक उपकरण प्रोटीन। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

रोग-प्रतिकारक निर्माता कैटलॉग नहीं मेजबान प्रजातियों जेट फ्लोरोफोर तनूकरण इनक्यूबेशन समय इनक्यूबेशन तापमान
विरोधी GFP Abcam ab6556 खरगोश चूहा असमंजसित करना 1:1000 24 घंटे 4°C
विरोधी GFAP Aves Labs GFAP मुर्गा चूहा असमंजसित करना 1:2000 24 घंटे 4°C
माध्यमिक इनविट्रोजन a11041 बकरी मुर्गा A568 1:500 2 घंटे कमरे का तापमान
माध्यमिक इनविट्रोजन a32731 बकरी खरगोश A488 1:500 2 घंटे कमरे का तापमान

तालिका 1: एंटीबॉडी के उदाहरण और मस्तिष्क स्लाइस immunofluorescence के लिए इनक्यूबेशन की स्थिति।

कक्ष रेखा प्रकार इच्छामृत्यु का समय चूहों के सेक्स चूहों की आनुवंशिक पृष्ठभूमि इंजेक्शन का मार्ग # कोशिकाओं इंजेक्शन मेटास्टेसिस की साइटें
12-273 BM+ मानव मेलेनोमा एसटीसी 4-5 सप्ताह M NSG इंट्राकार्डियक 100K मस्तिष्क पैरेन्काइमा, लेप्टोमेनिंग्स, जिगर, गुर्दे, अधिवृक्क ग्रंथियों
131/4-5B1* मानव मेलेनोमा 4-6 सप्ताह M एथिमिक नग्न या एनएसजी इंट्राकार्डियक 50-200K मस्तिष्क पैरेन्काइमा, जिगर, फेफड़े
113/6-4L* मानव मेलेनोमा 5-7 सप्ताह M एथिमिक नग्न या एनएसजी इंट्राकार्डियक 50-100K मस्तिष्क पैरेन्काइमा (कुछ), जिगर, फेफड़े
WM 4265-2** मानव मेलेनोमा एसटीसी 11 सप्ताह M एथिमिक नग्न या एनएसजी इंट्राकार्डियक 200K मस्तिष्क पैरेन्काइमा
WM 4257-1 ** मानव मेलेनोमा एसटीसी 10-13 सप्ताह M अथाइमिक नग्न इंट्राकार्डियक 100K मस्तिष्क पैरेन्काइमा (कुछ)
WM 4257-2 ** मानव मेलेनोमा एसटीसी 10-13 सप्ताह M अथाइमिक नग्न इंट्राकार्डियक 100K मस्तिष्क पैरेन्काइमा
10-230 BM+ मानव मेलेनोमा एसटीसी 8-9 सप्ताह M अथाइमिक नग्न इंट्राकार्डियक 100K मस्तिष्क पैरेन्काइमा, लेप्टोमेनिंग्स, जिगर (कुछ)

तालिका 2: वर्णित प्रोटोकॉल के बाद विभिन्न मानव मेलेनोमा सेल लाइनों और अल्पकालिक संस्कृतियों के विवो प्रयोगों में प्रतिनिधि से परिणामों का टूटना।

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Discussion

इस तकनीकी रिपोर्ट का उद्देश्य मेलेनोमा मेटास्टेसिस में संभावित अभिनेताओं की जांच के लिए एक मानकीकृत, शीर्ष-से-नीचे वर्कफ़्लो की पेशकश करना है। जैसा कि विवो प्रयोगों में महंगा और समय लेने वाला हो सकता है, दक्षता को अधिकतम करने और प्राप्त जानकारी के मूल्य को बढ़ाने के लिए रणनीतियां सर्वोपरि हैं।

एक ही प्रयोग के भीतर निष्कर्षों को क्रॉसवैलिडेट करने के लिए पूरक दृष्टिकोण का उपयोग करना आवश्यक है। उदाहरण के लिए, NuMA immunohistochemical staining और BLI दोनों मेटास्टैटिक बोझ को क्वांटिटेट करने के पूरक तरीके हैं क्योंकि न तो व्यापक है। जबकि बीएलआई विवो में ट्यूमर की प्रगति को ट्रैक करने का एक अमूल्य, noninvasive तरीका है, ये डेटा स्वाभाविक रूप से कम रिज़ॉल्यूशन के हैं। NuMA धुंधला निश्चित अंगों में मेटास्टैटिक बोझ के सावधानीपूर्वक विश्लेषण के लिए अनुमति देता है; हालांकि, पूरे ऊतक मोटाई के माध्यम से व्यापक सेक्शनिंग अव्यावहारिक है। जैसे, केवल प्रत्येक अंग का एक नमूना दाग दिया जा सकता है। दरअसल, लेखकों के अनुभव में, बीएलआई परिणाम हमेशा हिस्टोपैथोलॉजिकल विश्लेषण में स्पष्ट ट्यूमर के बोझ के लिए सीधे आनुपातिक नहीं होते हैं। यह इस विधि की सीमित संवेदनशीलता के कारण भाग में है, विशेष रूप से मस्तिष्क में, ट्रांसक्रैनियल क्षीणन34 के कारण। इसके अलावा, ये डेटा अपूर्ण लूसिफेरिन अपटेक और / या चर लूसिफेरस अभिव्यक्ति से प्रभावित हो सकते हैं। इसलिए, बीएलआई को पूर्व विवो इमेजिंग और हिस्टोपैथोलॉजिकल अध्ययनों के साथ संयोजन के रूप में व्याख्या की जानी चाहिए।

सामान्य दाग के साथ इलाज किए गए ऊतक के नमूनों का हिस्टोलॉजिकल मूल्यांकन, जैसे कि एच एंड ई, विशेष एनाटोमोपैथोलॉजी प्रशिक्षण की मांग करता है, अक्सर कम-थ्रूपुट होता है, और इंटरऑब्जर्वर विविधताओं के लिए प्रवण होता है। लेखक वर्तमान में जैव सूचना विज्ञान सहयोगियों के साथ काम कर रहे हैं ताकि हिस्टोपैथोलॉजिकल छवियों में अंग ऊतक अनुभाग के प्रतिशत के रूप में मेटास्टैटिक बोझ की स्वचालित और विश्वसनीय मात्रा के लिए एक मशीन लर्निंग एल्गोरिथ्म विकसित करके प्रयोगात्मक डेटा विश्लेषण को मानकीकृत और तेज किया जा सके। ये और अन्य उपकरण क्षेत्र के लिए महत्वपूर्ण होंगे, खासकर जब मेटास्टैटिक माइक्रोएन्वायरमेंट की भूमिका एक बेहतर रिज़ॉल्यूशन (जैसे, स्थानिक ट्रांसक्रिप्टोमिक्स) पर ध्यान केंद्रित करती है। फिर भी, ऊतक का विशेषज्ञ हिस्टोपैथोलॉजिकल मूल्यांकन आवश्यक है, विशेष रूप से मस्तिष्क मेटास्टेसिस के उपप्रकारों में जैसे कि लेप्टोमेनिंगियल, एक जैविक रूप से अलग उपप्रकार, जिसे अकेले बीएलआई के माध्यम से पैरेन्काइमल मस्तिष्क मेटास्टेसिस के रूप में आसानी से गलत समझा जाता है। NuMA धुंधला (धारा 8) मेटास्टैटिक बोझ के हिस्टोपैथोलॉजिकल मूल्यांकन को तेज करता है, जिससे माउस अंगों में मानव कोशिकाओं की निष्पक्ष पहचान और मात्रा के लिए अनुमति मिलती है। हालांकि, NuMA-दाग वर्गों पर एनाटॉमिक डिब्बों के बीच अंतर, जैसे कि मस्तिष्क पैरेन्काइमा बनाम लेप्टोमेनिंग्स, आगे जैविक अंतर्दृष्टि प्राप्त करने के लिए महत्वपूर्ण है।

यहां वर्णित तकनीकों का उपयोग मेलेनोमा मेटास्टैटिक कैस्केड के लिए ब्याज के जीन की कार्यात्मक प्रासंगिकता की जांच करने के लिए किया जा सकता है। एक पुनरुत्पादक फेनोटाइप के साथ एक मॉडल का चयन करना महत्वपूर्ण है जो प्रश्न में अध्ययन के लिए उपयुक्त है। उदाहरण के लिए, मेटास्टेसिस के मानव रोगी के नमूनों में एक जीन अपरेगुलेटेड को यह आकलन करने के लिए "खटखटाया" जा सकता है कि क्या यह नियंत्रण समूह की तुलना में मेटास्टैटिक बोझ को कम करता है। यह दृष्टिकोण एक मॉडल सेल लाइन या अल्पकालिक संस्कृति में सबसे अच्छा किया जाता है जिसमें दोनों विशेषताएं हैं ए) ब्याज के जीन की उच्च अभिव्यक्ति और बी) चूहों में इंजेक्ट किए जाने पर विश्वसनीय कैनेटीक्स के साथ महत्वपूर्ण मेटास्टैटिक बोझ उत्पन्न करता है, जैसे कि मेटास्टैटिक क्षमता में कमी प्रशंसनीय होगी और परीक्षण किए जा रहे आनुवंशिक गड़बड़ी के लिए असाइन करने योग्य होगी।

इसके अलावा प्रयोगात्मक डिजाइन में महत्वपूर्ण इंजेक्शन का चयनित मोड जांच के तहत मेटास्टेसिस के चरण के लिए सबसे उपयुक्त है। मेटास्टैटिक कैस्केड का प्रत्येक चरण मेलेनोमा कोशिकाओं के लिए अलग-अलग जैविक और शारीरिक बाधाओं को प्रस्तुत करता है। मेटास्टेसिस के प्रारंभिक चरणों, अर्थात् आक्रमण और इंट्रावेसेशन पर सवालों के जवाब देने की मांग करने वाले जांचकर्ताओं को क्रमशः इंट्राडर्मल और चमड़े के नीचे के इंजेक्शन के लिए अनुभाग 2 में उल्लिखित तकनीकों को नियोजित करना चाहिए, इसके बाद उत्तरजीविता सर्जरी (धारा 3)। महत्वपूर्ण रूप से, ये प्रक्रियाएं उस प्रक्रिया की नकल करती हैं जिसके द्वारा प्राथमिक मेलेनोमा को मनुष्यों में उच्छेदन किया जाता है, जिसके बाद एक रोगी मेटास्टेसिस के साथ उपस्थित हो सकता है या नहीं भी हो सकता है। जबकि तकनीकी रूप से चमड़े के नीचे इंजेक्शन की तुलना में अधिक नाजुक, इंट्राडर्मल मार्ग एनाटॉमिक डिब्बे में ट्यूमर कोशिकाओं को पौधों जहां मेलेनोमा मानव रोगियों में विकसित होते हैं। यह मेलेनोमा की प्रतिरक्षा निगरानी के अध्ययन में विशेष रूप से महत्वपूर्ण है, क्योंकि त्वचा में प्रतिरक्षा आबादी को गश्त करने का एक अनूठा पारिस्थितिकी तंत्रहै।

हालांकि, यदि मेटास्टेसिस के बाद के चरणों पर परीक्षण की जा रही परिकल्पना केंद्र, जैसे कि धमनी परिसंचरण से बहिष्करण, इंट्राकार्डियक, इंट्राकैरोटिड और रेट्रो-ऑर्बिटल इंजेक्शन जैसी विधियां लाभप्रद हैं। ये तकनीकें "प्राथमिक" ट्यूमर को शामिल करने वालों की तुलना में बहुत कम समय अवधि में बड़े पैमाने पर मेटास्टेसिस उत्पन्न करती हैं। मस्तिष्क मेटास्टेसिस के अध्ययन के लिए, विशेष रूप से, मॉडल जो मज़बूती से मस्तिष्क पैरेन्काइमा में ट्यूमर का उत्पादन करते हैं, उन्हें स्थापित करना मुश्किल हो सकता है। इन मामलों में, इंट्राकैरोटिड और रेट्रो-ऑर्बिटल इंजेक्शन कम "प्रवेश के लिए बाधाओं" वाले अंगों को दरकिनार करने के तरीकों का प्रतिनिधित्व करते हैं, जैसे कि यकृत और गुर्दे, जो इंट्राकार्डियक मार्ग के माध्यम से इंजेक्ट किए गए चूहों में समय से पहले मृत्यु दर का कारण बन सकते हैं।

ज़ेनो- या एलोग्राफ्ट प्रत्यारोपण के लिए पसंद की माउस आनुवंशिक पृष्ठभूमि कोशिकाओं (मानव, माउस) के स्रोत पर निर्भर करती है और कभी-कभी, प्रत्यारोपित कोशिकाओं के आनुवंशिक संशोधनों पर निर्भर करती है जो प्रतिरक्षा अस्वीकृति प्राप्त कर सकती हैं। मानव मॉडल से जुड़े प्रयोगआमतौर पर बिगड़ा हुआ अनुकूली और जन्मजात प्रतिरक्षा प्रणाली के साथ चूहों में आयोजित किए जाते हैं, NOD.Cg-PrkdcscidIl2rgtm1Wjl / SzJ (एनएसजी) चूहों; या अनुकूली प्रतिरक्षा की कमी वाले चूहों, जैसे कि टी सेल की कमी वाले एथाइमिक / न्यूड (एनयू / जे) चूहों। एक अन्य immunodeficient मॉडल अक्सर इस्तेमाल किया RAG2 नॉकआउट (KO) मॉडल है, जो बी और टी कोशिकाओं की कमी है और एक कार्यात्मक प्राकृतिक हत्यारा सेल आबादी को बरकरार रखता है। इन immunodeficient माउस मॉडल रणनीतिक रूप से तैनात किया जाना चाहिए, के रूप में प्रत्येक अपने आंतरिक प्रतिरक्षा की कमी से संबंधित कुछ कमियों की कीमत पर लाभ है. लेखकों के अनुभव में, एक ही सेल लाइन- या रोगी-व्युत्पन्न एसटीसी इंजेक्शन के मार्ग (जैसे, चमड़े के नीचे बनाम इंट्राकार्डियक) और / या प्राप्तकर्ता माउस स्ट्रेन (जैसे, एनएसजी बनाम एथाइमिक / न्यूड) के मार्ग के आधार पर विभिन्न अंग ट्रोपिज्म प्रदर्शित करता है ( तालिका 2 देखें)।

मेजबान से संबंधित प्रयोगात्मक परिवर्तनशीलता को कम करने के लिए जिसमें मेलेनोमा कोशिकाओं को प्रत्यारोपित किया जाता है (उदाहरण के लिए, प्रतिरक्षा प्रतिक्रिया, माइक्रोबायोटा), और 'लक्ष्य पर' और पुन: प्रस्तुत करने योग्य निष्कर्षों को अधिकतम करने के लिए, निम्नलिखित की सिफारिश की जाती है: i) प्रति समूह प्रयोगात्मक जानवरों की संख्या में वृद्धि (प्रभाव आकार के आधार पर एक इष्टतम संख्या तक पहुंचने के लिए शक्ति गणना का उपयोग करना), ii) जीन उम्मीदवारों में हेरफेर करने के लिए ऑर्थोगोनल तरीकों का उपयोग करना (यानी, CRISPR / Cas9, CRISPRi, shRNA), और 'ऐड-बैक' प्रयोगों (यानी, ब्याज के जीन के Cas9- या shRNA-प्रतिरोधी cDNA की सहवर्ती अस्थानिक अभिव्यक्ति)। ये पूरक तकनीकें ऑफ-टारगेट प्रभाव ों की संभावना और / या जैविक और प्रयोगात्मक भिन्नता को कम करती हैं।

हालांकि इस प्रोटोकॉल को निश्चित रूप से उम्मीदवार ड्राइवरों या मेटास्टेसिस के दमनकर्ताओं की परिकल्पना-संचालित सत्यापन के लिए लागू किया जा सकता है, ये विधियां निष्पक्ष, अन्वेषणात्मक अध्ययनों के लिए भी उपयोगी हो सकती हैं। उदाहरण के लिए, CRISPR/cas9, CRISPR-KRAB-dCas9 (CRISPRI), और shRNA-आधारित स्क्रीन vivo36 में खेलने के लिए डार्विनियन चयन की प्रक्रिया के लिए अनुमति देते हैं। इस तरह के अध्ययनों के लिए वैचारिक आधार इस प्रकार है: एक जीन के साथ एक सेल जो ब्याज के फेनोटाइप के लिए आवश्यक है (उदाहरण के लिए, ट्यूमर विकास) मर जाएगा या फैलने में विफल रहेगा, जैसे कि अनुक्रमित पुस्तकालय में इसका प्रतिनिधित्व बेसलाइन के सापेक्ष प्रयोग के समापन पर कम हो जाता है। यहां वर्णित प्रक्रियाओं को इस तरह के दृष्टिकोण के लिए लागू किया जा सकता है, जिसमें उपयुक्त अनुकूलन37,38 है।

उम्मीदवार जीन चयन के संबंध में, कई स्रोतों का खनन किया जा सकता है। मेलेनोमा रोगी ट्रांसक्रिप्टोमिक्स और प्रोटिओमिक्स डेटासेट सार्वजनिक रूप से एनसीबीआई जीन एक्सप्रेशन ओमनीबस (जीईओ) 39, यूरोपीय जीनोम-फिनोमआर्काइव 40, सीबायोपोर्टल41 (जो कैंसर जीनोम एटलस, या टीसीजीए42 की मेजबानी करता है) और अन्य होस्टिंग साइटों के माध्यम से सार्वजनिक रूप से उपलब्ध हैं। कच्चे डेटा के पुनर्विश्लेषण की सिफारिश की जाती है क्योंकि गुणवत्ता नियंत्रण उपाय सार्वजनिक डेटाबेस के बीच बहुत भिन्न हो सकते हैं, परिणामों को प्रभावित करते हैं। कच्चे डेटासेट से पूछताछ करते समय, यहां वर्णित वर्कफ़्लो के लिए आवेदन के लिए उपयुक्त उम्मीदवार जीन चयन के लिए उपयुक्त प्रश्नों में शामिल हैं: प्राथमिक मेलेनोमा नमूनों की तुलना में मेटास्टैटिक नमूनों में या मेलानोसाइटिक नेवी की तुलना में मेटास्टैटिक नमूनों में कौन से जीन ों को डिस्रेगुलेटेड किया जाता है? मेटास्टेसिस के विशिष्ट स्थलों में कौन से जीन डिस्रेगुलेटेड हैं?; उम्मीदवार जीन की dysregulated अभिव्यक्ति में सुधार रोगी के अस्तित्व के साथ जुड़े है?; क्या यह जीन एक बड़े जीन अभिव्यक्ति कार्यक्रम का हिस्सा है जो आमतौर पर डिस्रेगुलेटेड होता है?; जीन उत्पाद के interactors अच्छी तरह से विशेषता या अज्ञात कर रहे हैं?; क्या जीन उत्पाद दवा योग्य है, और यदि हां, तो क्या लक्ष्यीकरण उपकरण उपलब्ध हैं?; और बहुत महत्वपूर्ण बात यह है कि क्या जीन सभी मानव कोशिकाओं, या कई ऊतकों के लिए आवश्यक है, जैसे कि नैदानिक सेटिंग में इसकी गतिविधि के साथ हस्तक्षेप विषाक्त साबित हो सकता है?

ब्याज के जीन के हेरफेर के लिए उपयुक्त रणनीति परीक्षण की जाने वाली परिकल्पनाओं पर निर्भर करती है। उदाहरण के लिए, मेटास्टेसिस में एक जीन अपरेगुलेटेड को यह आकलन करने के लिए खटखटाया जा सकता है कि क्या संबंधित चूहे एक नियंत्रण समूह की तुलना में मेटास्टैटिक बोझ में कमी प्रदर्शित करेंगे। यह दृष्टिकोण एक मॉडल सेल लाइन या अल्पकालिक संस्कृति में सबसे अच्छा किया जाता है, जिसमें दोनों विशेषताएं हैं: ए) ब्याज के जीन की उच्च अभिव्यक्ति और बी) पुनरुत्पादक कैनेटीक्स के साथ चूहों में इंजेक्ट किए जाने पर प्रशंसनीय मेटास्टैटिक बोझ उत्पन्न करता है। नॉकडाउन दृष्टिकोण में shRNA- और CRISPR / Cas9 आधारित-विधियां शामिल हैं, जिनमें से दोनों को मेलेनोमा कोशिकाओं के लेंटिवायरल संक्रमण के माध्यम से इंजीनियर किया जा सकता है और एक अपरिवर्तनीय या संवैधानिक फैशन में तैनात किया जा सकता है। Inducible अभिव्यक्ति के फायदों में से एक ( सामग्री की तालिका में pLKO Tet-On देखें) नॉकडाउन का अस्थायी विनियमन है, जिसे इन विवो प्रयोग में लाभ उठाया जा सकता है। इस प्रकार, inducible shrnas / sgRNas का उपयोग एक "चिकित्सीय सेटिंग" मॉडल करने के लिए किया जा सकता है जिसमें स्थापित ट्यूमर कोशिकाओं को एक उम्मीदवार जीन नॉकडाउन के अधीन किया जाता है। हालांकि, उत्प्रेरण एजेंट के संपर्क में, उदाहरण के लिए, डॉक्सीसाइक्लिन, कुछ मेलेनोमा कोशिकाओं के व्यवहार के लिए परिणाम हो सकते हैं; इस प्रकार, नियंत्रण कोशिकाओं को शामिल करना एक तले हुए shRNA के साथ ट्रांसड्यूस किया गया है जो इस उपचार का भी अनुभव करता है, महत्वपूर्ण है।

जबकि shrnas अक्सर जीन अभिव्यक्ति का एक आंशिक नॉकडाउन उत्पन्न करते हैं, CRISPR / Cas9-आधारित सिस्टम डीएनए स्तर पर एक जीन को संपादित करते हैं, सैद्धांतिक रूप से एक पूर्ण "नॉकआउट" (KO) प्राप्त करते हैं। उनका उपयोग फायदे और नुकसान दोनों को प्रस्तुत करता है। यदि मेलेनोमा सेल व्यवहार्यता के लिए एक जीन आवश्यक है, तो एक पूर्ण केओ के साथ कोशिकाओं को विट्रो में नकारात्मक रूप से और बाद में विवो में चुना जाएगा। यद्यपि एकल-सेल क्लोन का चयन करके इस मुद्दे को आंशिक रूप से कम किया जा सकता है, मेलेनोमा कोशिकाएं एकल कोशिकाओं से बढ़ने के लिए संघर्ष करती हैं, जिसके परिणामस्वरूप अप्रत्याशित और अक्सर असमान अनुकूलन होते हैं। इस प्रकार, इंटरक्लोनल फेनोटाइपिक विविधताओं के लिए नियंत्रण करने के लिए कई केओ क्लोन का परीक्षण करने की आवश्यकता होती है। इसके अलावा, रोगी-व्युत्पन्न एसटीसी के मामले में विशेष रूप से, लेंटिवायरल संक्रमणों की संख्या जिसमें मेलेनोमा कोशिकाओं को उजागर किया जाता है, इन विट्रो प्रसार और विवो मेटास्टैटिक व्यवहार में बहुत प्रभावित कर सकते हैं। इसलिए, Cas9 और एक sgRNA को शामिल करने वाले एक एकल-वेक्टर, एकल-संक्रमण दृष्टिकोण ( सामग्री की तालिका में lentiCRISPRv2 देखें) की सिफारिश की जाती है। अन्य प्रणालियां ट्रांसक्रिप्शनल दमन ( सामग्री की तालिका में dCas9-KRAB) को प्राप्त करने के लिए "recombinase dead" Cas9 का उपयोग करती हैं।

एक लाभ-के-फ़ंक्शन दृष्टिकोण उपयुक्त हो सकता है यदि ब्याज के जीन को मेटास्टेसिस को बढ़ावा देने वाले जीन होने की परिकल्पना की जाती है। इस मामले में, एक मेलेनोमा लाइन का चयन चूहों में इंजेक्शन पर कुछ मेटास्टेसिस उत्पन्न करता है और ब्याज के जीन की कम बेसल अभिव्यक्ति की विशेषता महत्वपूर्ण है। Overexpression constructs (विशेष रूप से सीएमवी प्रमोटरों द्वारा संचालित) अक्सर supraphysiologic अभिव्यक्ति के स्तर को जन्म देते हैं, जो proteotoxic तनाव का कारण बनता है। इसलिए, लेंटिवायरल वैक्टर चुनने की सिफारिश की जाती है जो ब्याज के जीन की शारीरिक अभिव्यक्ति के लिए अनुमति देते हैं।

एक बार एक दृष्टिकोण का चयन किया गया है, यह कोशिकाओं के engraftment से पहले निम्नलिखित प्रयोगों को पूरा करने के लिए महत्वपूर्ण है। लेंटिवायरल संक्रमण प्रक्रियाएं प्रयोगशालाओं के बीच भिन्न होती हैं और प्रत्येक सेल लाइन और नॉकडाउन सिस्टम के लिए अनुकूलन की आवश्यकता होगी। हालांकि, सार्वभौमिक विचारों में जीन नॉकडाउन की विशेषता वाली कोशिकाओं का एक पूर्ण सकारात्मक या नकारात्मक चयन शामिल है (उदाहरण के लिए, फ्लोरोसेंट रिपोर्टरों या एंटीबायोटिक प्रतिरोध चयन के लिए एफएसीएस / सेल सॉर्टिंग, यदि लागू हो), इसके बाद आरटी-क्यूपीसीआर और पश्चिमी धब्बा उचित नियंत्रण के साथ पुन: प्रस्तुत करने योग्य और मजबूत नॉकडाउन या ब्याज के जीन के ओवरएक्सप्रेशन को प्रदर्शित करने के लिए। एक इन विट्रो प्रसार परख यह निर्धारित करने के लिए आयोजित किया जाना चाहिए कि ब्याज के जीन के साथ हस्तक्षेप सेल व्यवहार्यता को प्रभावित करता है या नहीं। यह चरण विश्वसनीय सेल लक्षण वर्णन के लिए और विवो परिणामों में की सही व्याख्या के लिए महत्वपूर्ण है। यहां एक नुकसान का एक उदाहरण है यदि वर्णित प्रयोगों का प्रदर्शन नहीं किया जाता है: यदि एक जीन नॉकडाउन के परिणामस्वरूप विट्रो में एक कठोर प्रसार दोष होता है, तो यह मेटास्टैटिक बोझ में कमी की व्याख्या को भ्रमित करेगा, क्योंकि मेटास्टैटिक कैस्केड में इस जीन के विशिष्ट योगदान का सटीक मूल्यांकन नहीं किया जा सकता है। प्रसार assays के विभिन्न तौर-तरीकों में व्यावसायिक रूप से उपलब्ध किट, लाइव सेल-इमेजिंग सिस्टम, या पारंपरिक सेल-संस्कृति-आधारित assays शामिल हैं, उदाहरण के लिए, क्रिस्टल बैंगनी, ट्रिपैन ब्लू बहिष्करण।

मेलेनोमा में मध्यस्थों की खोज में इस मंच के लिए प्रमुख सीमाओं में से एक यह है कि प्रस्तावित वर्कफ़्लो केवल ट्यूमर सेल-आंतरिक जीन उम्मीदवारों की जांच करता है, न कि विभिन्न मेटास्टैटिक चरणों में आसपास के माइक्रोएन्वायरमेंट की कोशिकाओं द्वारा व्यक्त जीन, जो ट्यूमर सेल अनुकूलन और डिस्टल अंगों के सीडिंग के प्रमुख मॉड्यूलेटर हैं। विचार करने के लिए एक और महत्वपूर्ण कारक एनग्राफ्टमेंट मार्ग के आधार पर विभेदक मेटास्टैटिक व्यवहार है। प्रस्तुत तकनीकों में से कुछ के लिए आंतरिक इंटरलेबोरेटरी और इंटरऑपरेटर परिवर्तनशीलता को मेटास्टेसिस अनुसंधान क्षेत्र में मानकीकरण द्वारा संबोधित किया जा सकता है। वर्तमान में, मानकीकरण के लिए सबसे उपयुक्त प्रोटोकॉल अल्ट्रासाउंड मार्गदर्शन और स्थैतिक इंजेक्शन उपकरणों के कारण इंट्राकार्डियक इंजेक्शन है, जो इंटरऑपरेटर परिवर्तनशीलता को कम करता है। यह प्रोटोकॉल मेलेनोमा मेटास्टेसिस के उपन्यास मध्यस्थों की पहचान पर काम करने वाली प्रयोगशालाओं में उपयोग किए जाने वाले तरीकों की एकरूपता, पुनरुत्पादन और पूरी तरह से प्रलेखन की दिशा में कई चरणों में से एक का प्रतिनिधित्व करता है।

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Disclosures

लेखकों के पास घोषित करने के लिए हितों का कोई संघर्ष नहीं है।

Acknowledgments

हम NYU Langone स्वास्थ्य में उन्नत अनुसंधान प्रौद्योगिकियों (DART) के प्रभाग को धन्यवाद देते हैं, और विशेष रूप से, प्रयोगात्मक पैथोलॉजी अनुसंधान प्रयोगशाला, जीनोम प्रौद्योगिकी केंद्र, साइटोमेट्री और सेल सॉर्टिंग प्रयोगशाला, पूर्व-नैदानिक इमेजिंग कोर, जो आंशिक रूप से Perlmutter Cancer Center Support Grant NIH / NCI 5P30CA016087 द्वारा समर्थित हैं। हम NYU अंतःविषय मेलेनोमा सहकारी समूह (पीआई: डॉ इमान उस्मान) को रोगी-व्युत्पन्न मेलेनोमा अल्पकालिक संस्कृतियों + (10-230बीएम और 12-273बीएम) तक पहुंच प्रदान करने के लिए धन्यवाद देते हैं, जो आईआरबी-अनुमोदित प्रोटोकॉल (यूनिवर्सल सहमति अध्ययन #s16-00122 और अंतःविषय मेलेनोमा सहकारी समूह अध्ययन # 10362) के माध्यम से प्राप्त किए गए थे। हम डॉ रॉबर्ट केर्बेल (टोरंटो विश्वविद्यालय) को 113/6-4L और 131/4-5B1 मेलेनोमा सेल लाइनों * और डॉ. मीनहार्ड हर्लिन (Wistar Institute) को WM 4265-2, WM 4257s-1, WM 4257-2 मेलेनोमा अल्पकालिक संस्कृतियों ** प्रदान करने के लिए धन्यवाद देते हैं। ई.एच. एनआईएच / एनसीआई आर01सीए243446, P01CA206980, एक अमेरिकन कैंसर सोसाइटी-मेलेनोमा रिसर्च एलायंस टीम साइंस अवार्ड, और एक एनआईएच मेलानोमा स्पोर (NCI P50 CA225450) द्वारा समर्थित है; पीआई: आई.ओ.)। चित्रा 1 Biorender.com के साथ बनाया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
#15 Scapel Blade  WPI 500242 For surgical procedures
#3 Scapel Handle WPI 500236 For surgical procedures
1 mL Tuberculin syringe, slip tip  BD 309626 Injections
10 mL syringe, slip tip  BD 301029 Perfusion
10% Formalin Sodium Buffered EK Industries 4499-20L For perfusion/tissue fixative
15 mL Conical Corning  430052 Cell culture
15 mL Conical Polypropylene Centrifuge Tubes Falcon 352196 Cell culture
200 Proof Ethanol Deacon Labs 04-355-223 Histology
22G – 22mm needle BD 305156 Perfusion
4-0 Vicryl Suture Ethicon J464G Suture
4% Carson's phosphate buffered paraformaldehyde  EMS 15733-10 For perfusion/tissue fixative
40µm Corning 431750 Tissue processing
5-0 Absorbable Suture  Ethicon 6542000 Closure
50 mL Conical  Corning  430828 Cell culture
50mL Conical Polypropylene Centrifuge Tubes Falcon 352070 Cell culture
7-0 Silk suture  FST 18020-70 Ligature
70µm Corning 431751 Tissue processing
Anti-fade mounting media   Vector Labs H-1000-10 Immunofluorescence
Approximator applying Forceps, 10cm  WPI 14189 For microsurgical procedures
Avance Bruker 3 HD NMR Console 
Biospec 7030  Bruker 7030 Micro MRI
BSA Bioreg A941 NuMA Staining
Castroviejo suturing forceps, straight tips 5.5mm tying platform, 11cm  WPI WP5025501 For microsurgical procedures
Coplin Staining Jar Bel-Art  F44208-1000 Histology
DAPI Sigma-Aldrich D9542-1MG Immunofluorescence
dCas9-KRAB Addgene 110820 Genetic manipulation
DNase I NEB M0303L Tissue processing
DPBS Corning 21-030-CM Tissue processing
Extra Sharp Uncoated Single Edge Blade GEM 62-0167 Tissue processing
Extracellular Matrix Substrate  Corning 354234 Consider the Growth Factor Reduced ( as alternative 
FBS Cytiva SH30910.03 Cell culture
Fiji Image J Fiji Image J Software Immunofluorescence
Goat anti-rabbit HRP conjugated multimer  Thermo Fisher A16104 NuMA Staining
Goat Serum Gibco PCN5000 Immunofluorescence
HBSS Corning 21-020-CV Tissue processing
Hematoxylin  Richard-Allan Scientific  7231 Histology
Illumina III  PerkinElmer CLS136334 BLI Instrument
Insulin syringe 28G - 8mm needle BD 329424 Injections
Insulin syringe 31G - 6mm needle  BD 326730 Injections
Iris Forceps, 10.2cm, Full Curve, serrated WPI 504478 For perfusion and surgical procedures
Isoflurane USP Covetrus 11695067772 Anesthesia
Jewelers #7 Forceps Titanium 11 cm 0.07 x 0.01 mm Tip WPI WP6570 For microsurgical procedures
Ketamine HCl 100mg/mL Mylan Ind. 1049007 Anesthesia
lentiCRISPRv2 Addgene 98290 Genetic manipulation
Lycopersicon Esculentum (Tomato) Lectin, DyLight 649 Invitrogen L32472 Vascular endothelial cells marker
MEM non-essential amino acids X 100 Corning 25-025-CI Cell culture
Metzenbaum Scissors WPI 503269 For surgical procedures
Microinjection Unit KOPF 5000 Intracardiac injections
NaCl Fisher S25877  NuMA Staining
Needle 30G x 25mm BD 305128 Intracardiac Injection
Needle 33G x 15mm Hamilton 7747-01 Intracarotid Injection
Needle holder, Castroviejo, 14cm, with lock, 1.2mm Serrated Jaws WPI 14137-G For microsurgical procedures
NOD.Cg-Prkdcscid Il2rgtm1Wjl/SzJ mice The Jackson Laboratory 005557 Murine model
NU/J mice The Jackson Laboratory 002019 Murine model
Nuclear Mitotic Apparatus Protein polyclonal rabbit anti-human  Abcam 97585 NuMA Staining
Penicillin-Streptomycin 10000U/mL Gibco 15140122 Cell culture
Percoll GE 0891-01 density separation solution 
PI Classic Surgical Gloves Cardinal Health 2D72PT75X Surgery
pLKO Tet-On Addgene 21915 Genetic manipulation
Povidone-Iodine 10% Solution Medline MDS093943 Surgery
Proparacaine Drops 0.5% Akorn Pharma AX0501 Opthalmic local anesthetic
Puralube Petrolatum Opthalmic Ointment Dechra 83592 Anesthesia
Razor Blade Double Edge Blades  EMS 72000 Shaving and Vibrotome Brain Slicing 
Reflex 9mm EZ Clip  Braintree EZC- KIT Wound closure
RPMI 1640  Corning 10-040-CM Cell culture
Scissors, Spring 10.5cm Str, 8mm Blades WPI 501235 For microsurgical procedures
Semi-Automatic Vibrating Blade Microtome Leica VT1200 Brain Slice Immunofluorescence
Single Channel Anesthesia Vaporizer System Kent Scientific VetFlo-1210S  Anesthesia
Smartbox Tabletop Chamber System and Exhaust Blower EZ Systems TT4000 CO2 Euthanasia
Sterile Fenestrated Disposable Drape Medline NON21002 Surgery
Sterile Non-Reinforced Aurora Surgical Gowns with Set-In Sleeves Medline DYNJP2715 Surgery
T25 Flask Corning  430639 Cell culture
Tris Corning 46-031-CM NuMA Staining
Triton X-100 Sigma-Aldrich X100-500ML Immunofluorescence
Troutman tying forceps, 10cm, Curved G pattern, 0.52mm tip with tying platform WPI WP505210 For microsurgical procedures
Vessel clips 10G Pressure 5x 0.8mm Jaws, 5/pkg WPI 15911 For microsurgical procedures
Visiopharm Visiopharm Visiopharm NuMA Staining Quantification Software
Xylasine 100mg/mL Akorn Pharma 59399-111-50 Anesthesia
Xylene Fisher X3P-1GAL Histology

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References

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