Summary
Här beskrivs icke-invasiva metoder för lokalisering av fotoreceptormembranproteiner och bedömning av retinal degeneration i Drosophila-föreningsögat med eGFP-fluorescens.
Abstract
Membranproteinhandel reglerar införlivandet och avlägsnandet av receptorer och jonkanaler i plasmamembranet. Denna process är fundamentalt viktig för cellfunktion och cellintegritet hos neuroner. Drosophila fotoreceptorceller har blivit en modell för att studera membranproteinhandel. Förutom rodopsin, som vid belysning internaliseras från fotoreceptormembranet och bryts ned, uppvisar den övergående receptorpotentialliknande (TRPL) jonkanalen i Drosophila en ljusberoende translokation mellan det rabdomerala fotoreceptormembranet (där det ligger i mörkret) och fotoreceptorcellkroppen (till vilken den transporteras vid belysning). Denna intracellulära transport av TRPL kan studeras på ett enkelt och icke-invasivt sätt genom att uttrycka eGFP-märkt TRPL i fotoreceptorceller. eGFP-fluorescensen kan sedan observeras antingen i den djupa pseudopupilen eller genom vattennedsänkningsmikroskopi. Dessa metoder möjliggör detektion av fluorescens i det intakta ögat och är därför användbara för analyser med hög genomströmning och genetiska skärmar för Drosophila-mutanter som är defekta vid TRPL-translokation. Här förklaras beredningen av flugor, de mikroskopiska teknikerna samt kvantifieringsmetoder som används för att studera denna ljusutlösta translokation av TRPL i detalj. Dessa metoder kan tillämpas även för traffickingstudier på andra Drosophila fotoreceptorproteiner, till exempel rodopsin. Dessutom, genom att använda eGFP-märkta rabdomerala proteiner, kan dessa metoder användas för att bedöma degenereringen av fotoreceptorceller.
Introduction
Genom att leverera och avlägsna proteiner till och från plasmamembranet kontrollerar membranproteinhandel i neuroner plasmamembranutrustningen med receptorer såväl som jonkanaler och reglerar som ett resultat neuronal funktion. Felreglering eller defekter i proteinhandel har vanligtvis skadliga effekter på celler och resulterar i neuronal degeneration. Hos människor kan detta orsaka neurodegenerativa sjukdomar som Alzheimers och Parkinsons sjukdom eller Retinitis pigmentosa1. Fotoreceptorer i det sammansatta ögat av Drosophila melanogaster har blivit ett in vivo-modellsystem för att studera membranproteinhandel2. Detta beror inte bara på den genetiska mångsidigheten hos Drosophila som möjliggör effektiva genetiska skärmar, utan också för att alla väsentliga komponenter i det ljusabsorberande fotoreceptormembranet karakteriseras i detalj och effektiva mikroskopiska tekniker finns tillgängliga som kan appliceras på fluganga. Dessa tekniker är i fokus för den här artikeln.
I Drosophila fotoreceptorceller bildar det apikala plasmamembranet en tätt packad stapel av mikrovilli längs ena sidan av cellen, benämnt rhabdomere. Rhabdomererna av fotoreceptorceller R1-6 är anordnade i ett karakteristiskt trapetsformat mönster medan fotoreceptorcellerna R7 och R8 bildar en enda rhabdomere i mitten av denna trapezoid3. Membranproteinhandel behövs för en reglerad omsättning av rabdomerala membranproteiner såsom rodopsin och de ljusaktiverade TRP (övergående receptorpotentialen) och TRPL (TRP-liknande) jonkanalerna för att säkerställa rätt mängd av dessa fototransduktionsproteiner i rabdomeren. Fotoreceptormembranproteiner syntetiseras i endoplasmatisk retikulum och transporteras via Golgi-apparaten till rhabdomere. Efter aktivering av rodopsin med ljus kan en rodopsinmolekyl antingen inaktiveras genom absorption av en andra foton eller kan avlägsnas från rabdomeren genom klatrinmedierad endocytos. Endocytosed rhodopsin blir antingen nedbruten i lysosomen eller återvinns tillbaka till rhabdomere 4,5. Jonkanalen TRPL internaliseras också efter aktivering av fototransduktionskaskaden och genomgår en ljusberoende translokation mellan rhabdomere (där den är belägen när flugor hålls i mörkret) och ett ER-berikat förvaringsfack i cellkroppen (till vilket den transporteras inom flera timmar efter belysning)6,7,8,9,10 . Till skillnad från endocytosed rhodopsin bryts endast små mängder TRPL ned via den endolysosomala vägen, och majoriteten lagras intracellulärt istället och återvinns tillbaka till rhabdomere vid mörk anpassning6. TRPL kan således användas för att analysera ljusutlöst handel med plasmamembranproteiner. Drosophila fotoreceptorceller används också för att studera neuronal degeneration. Fotoreceptorcelldegenerering bestäms ofta genom att bedöma strukturen hos rabdomerer, som sönderfaller som ett resultat av degenerativa processer5.
För att studera den subcellulära lokaliseringen av TRPL och rodopsin i fotoreceptorceller eller fotoreceptorcelldegenerering har två fluorescensmikroskopimetoder som skiljer sig åt med avseende på analyshastighet och upplösning tillämpats här. En mycket snabb, icke-invasiv metod som kan användas för genetiska skärmar men med en begränsad rumslig upplösning är detekteringen av fluorescens i den djupa pseudopupilen (DPP). DPP är ett optiskt fenomen av leddjurssammansatte ögon vars geometriska ursprung har förklarats i detalj av Franceschini och Kirschfeld 197111. Kort sagt, på flera optiska plan under näthinnan kan överläggsbilder av rhabdomeres från intilliggande ommatidia observeras. På ett fokalplan genom mitten av ögats krökning bildar dessa överlagrade projektioner en bild som liknar den trapetsformade layouten av rabdomeres i ett enda ommatidium endast storleksordningar större. Detta fenomen kan också observeras oberoende av exogent uttryck av fluorescensproteiner (t.ex. TRPL::eGFP8), vilket ändå gör DPP lättare att detektera (figur 1A-A'')12. En andra icke-invasiv metod är vattennedsänkningsmikroskopi som bygger på avbildning av fluorescerande märkta proteiner efter optisk neutralisering av ögonens dioptriska apparater med vatten (figur 1B-C'')12. Med hjälp av vattennedsänkningsmetoden kan den relativa mängden TRPL::eGFP i rabdomererna eller cellkroppen bedömas kvantitativt för enskilda fotoreceptorceller. Vidare kan icke-translokerande fluorescensmärkta proteiner användas för att utvärdera rabdomeral integritet och för att bestämma tidsförloppet för en potentiell degeneration på ett kvantitativt sätt, som beskrivs här.
Medan inspelningar av DPP är överlägset de enklaste och snabbaste av dessa metoder att utföra, är den rumsliga upplösningen av data de genererar begränsad. Dessutom finns det många skäl till varför en DPP kan vara frånvarande, som inte nödvändigtvis kan urskiljas genom DPP-avbildning i sig. Eftersom DPP representerar en summering av flera ommatidier förloras information om enskilda celler. Således tjänar lågupplöst DPP-avbildning en viktig funktion vid screening av ett stort antal flugor men bör i allmänhet följas av inspelningar med högre upplösning genom mikroskopi med vattennedsänkning. Vattennedsänkningsmikrografer möjliggör tolkningar om enskilda celler, utvecklingsdefekter, ögonmorfologi, proteinfellokalisering eller retinal degeneration samt kvantifiering av dessa effekter. Detta protokoll beskriver dessa två tekniker i detalj.
Figur 1: Översikt över mikroskopivariationer för Drosophila-ögat som presenteras i detta protokoll. Schematiska representationer och exemplifierande mikrografer av (A-A'') fluorescerande djup pseudopupil (DPP) avbildning, (B-B'') dödlig vattennedsänkningsmikroskopi av fluorescerande rabdomeres och (C-C'') icke-dödlig vattendroppsmikroskopi av fluorescerande rabdomerer. Skalstång (A''): 100 μm. Skalstänger (B''-C''): 10 μm. Siffran har ändrats från referens13. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Allmänna överväganden
- Använd Drosophila-bestånd som uttrycker ett permanent rabdomeralt placerat fluorescensprotein för morfologisk analys (t.ex. TRP::eGFP, eGFP::NINAC) och translokerande proteiner för analyser avseende proteinhandel (t.ex. TRPL::eGFP, Arr2::eGFP).
- Förutbestämma ljusexponeringsförhållandena för utvalda flugor för den experimentella metoden.
- För mörk anpassning, håll flugorna i mörka lådor under önskad period vid 25 ° C. För belysning upp till 16 timmar i translokationsexperiment (t.ex. TRPL::eGFP som uttrycker flugor), håll flugor under ett lysrör vid rumstemperatur.
- I experiment som bedömer fotoreceptordegenerering (t.ex. TRP::eGFP som uttrycker flugor), håll flugorna under ett lysrör vid 25 °C i en 12 h ljus /12 h mörk cykel för långvarig belysning på upp till 28 dagar med vitt ljus.
- För att belysa flugor med färgat ljus, använd olika färgade transparenta plastlådor tillsammans med lysröret.
- Om flugbestånd med pigmenterade ögon används, åldras djur exakt för jämförande analys, eftersom ögonpigmentering kan öka avsevärt med åldern.
OBS: För datatolkning är det viktigt att notera att det finns en signalförskjutning på grund av den optiska vågledande effekten av den rabdomerala strukturen. Följaktligen kommer fluorescenssignalen från rhabdomeren alltid att förstärkas i viss utsträckning vid DPP-avbildning och vattennedsänkningsmikroskopi i förhållande till signaler erhållna från cellkroppen. Detta observeras mest framträdande i pigmenterade ögon, där fluorescens från utsidan av rhabdomeres absorberas av dessa pigment och är av särskild betydelse när intracellulärt translokerande fusionsproteiner ska detekteras. Således, när det gäller kritiska steg, betraktar denna studie vit- och rödögda flugor separat. - När det gäller vattennedsänkningsmikroskopi beskrivs två variationer. En snabbare dödlig variation samt en icke-dödlig variation som möjliggör återhämtning för efterföljande studier.
2. DPP-avbildning
- Förbered arbetsutrymmet med nödvändig utrustning och reagenser enligt figur 2. Bedöva flugor (1-3 dagar gamla) av en genotyp som uttrycker ett fluorescensprotein i fotoreceptorceller med CO2 på en flygplatta. Välj djur för avbildning under ett stereomikroskop med konventionell ljuskälla och låg förstoring (t.ex. 10x).
Bild 2: Arbetsyta för DPP-avbildning. Material som behövs är (A) CO2-anestesiapparat , (B) stereomikroskop med UV-lampa och fluorescensfilteruppsättning, (C) ljuskälla, (D) mikroskopmonterad kamera med (E) programvara, (F) pensel, (G) svart kartong och (H) flygflaska. Klicka här för att se en större version av denna figur.
- För DPP-avbildning, håll de valda flugorna bedövade och placera en av dem i mitten av mikroskopmålet på dess sida så att antingen vänster eller höger öga vetter mot målet exakt radiellt (Figur 3A).
OBS: Eftersom fotoreceptorcellernas ommatidiella layout visar spegelsymmetri vid dorsoventral mittlinje, observeras DPP bäst något över eller under ögats ekvatorn (figur 3B).
Figur 3: Placering av flugan under stereomikroskopet för DPP-avbildning. (A) Illustration av flugan på sidan med ett öga vänt mot mikroskopmålet radiellt. (B) Flughuvudet måste vridas något uppåt eller nedåt så att målet fokuserar på en punkt något över eller under ögats ekvatorn som indikeras av de röda pilarna. Klicka här för att se en större version av denna figur.
- Öka förstoringen så att den passar hela ögat (t.ex. 100x) och centrera ögats centrala ommatidier. Minska mikroskopets skärpedjup, t.ex. genom att justera dubbelirismembranet till en grund inställning (figur 4A-B').
- Stäng av den konventionella ljuskällan och slå på mikroskopets UV-lampa med maximal intensitet och välj mikroskopets fluorescensfilteruppsättning enligt fluorescensproteinet uttryckt i ögonen (Figur 4C-E). Ställ ljusbanan mot den mikroskopmonterade kameran.
- Använd live-bildfunktionen i programvaran för att justera bildens ljusstyrka till en inställning som endast detekterar specifika signaler från ögat genom att justera exponeringstiden och förstärkningsvärdet (t.ex. 80 ms respektive 12x). Justera mikroskopfokuset "in" i ögat (under hornhinnan) för att generera den överlagrade bilden av DPP (figur 4C-E').
Figur 4: Illustration av DPP och fluorescerande DPP-avbildning. Exemplifierande bilder av Drosophila ögon under konventionell och UV-belysning med GFP-filteruppsättning, tagna med varierande fokalplan illustrerade i schematiska tvärsnitt genom ögat. (A) Mikrograf inspelad med ljusa inställningar av en konventionell ljuskälla, 30 ms exponeringstid, 1x förstärkning, djupt skärpedjup och fokalplan nära hornhinnans yta enligt vad som illustreras i (A'). (B) Mikrograf inspelad med ljusa inställningar av en konventionell ljuskälla, 30 ms exponeringstid, 1x förstärkning, grunt skärpedjup och fokalplan cirka 180 μm under hornhinnans yta enligt bilden i punkt B'. DPP indikerade. (C-E) Mikrograf inspelad med högintensiva inställningar för UV-ljuskälla och GFP-filteruppsättning, 80 ms exponeringstid, 12x förstärkning, grunt skärpedjup och fokalplanet (C') nära, (D') något under eller (E') cirka 180 μm under hornhinnans yta. Fluorescerande DPP indikeras med en krökt pil. Skala stapel 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
- Ta en ögonblicksbild av den fluorescerande DPP. Byt mikroskopet tillbaka till synligt ljus och ljusvägen tillbaka mot okularen. Återställ det avbildade djuret i en flugflaska för vidare förfaranden enligt dess DPP-fenotyp (t.ex. kors). Fortsätt med nästa djur i steg 2.2.
3. Mikroskopi med vattennedsänkning
- Beredning av flugor
- Förbered arbetsutrymmet med nödvändig utrustning och reagenser enligt figur 5. Överför flugor med förutbestämd ålder och belysningsförhållanden till ett förkylt 15 ml centrifugrör och bedöva genom att inkubera dem på is i 15 till 30 minuter.
OBS: Bär med 1 dag gamla, mörkanpassade flugor som referens. I allmänhet bör mörkanpassade flugor överföras till en islåda med lock i mörkret. Ljusanpassade flugor kan överföras till isen i rumsljus.
- Förbered arbetsutrymmet med nödvändig utrustning och reagenser enligt figur 5. Överför flugor med förutbestämd ålder och belysningsförhållanden till ett förkylt 15 ml centrifugrör och bedöva genom att inkubera dem på is i 15 till 30 minuter.
Bild 5: Arbetsyta för mikroskopi med vattennedsänkning. Material som behövs är: (A) 15 ml centrifugrör, (B) isflingor, (C) kylt destillerat vatten, (D) stereomikroskop, (E) petriskål, (F) plasticin, (G) objektglidning, (H) insektsstift eller pipettspetsar och skalpell, (I) fluorescensmikroskop med (J) programvara. Klicka här för att se en större version av denna figur.
- Välj lämplig beredning bland de två som beskrivs nedan (3.1.3 dödlig variation eller 3.1.7 icke-dödlig variation) och följ respektive steg när differentiering mellan pigmenterade och icke-pigmenterade ögon görs.
- Förbered flugor för den dödliga variationen enligt följande.
- Fäst en bit plasticin på en föremålsrutschbana och en annan bit i mitten av en petriskål (t.ex. 94 mm Ø) och håll dem åtskilda för tillfället. Fyll petriskålen med iskylt destillerat vatten och lite isflingor (figur 6A).
- Lägg en isbedövad fluga under ett stereomikroskop ovanpå den plasticinbelagda föremålsrutschbanan. Vrid flugan på ryggen och genomborra en insektsstift genom mitten av bröstkorgen (figur 6B). Fäst stiftet horisontellt på den plasticinbelagda föremålsrutschbanan och orientera antingen vänster eller höger öga på flugan uppåt (Figur 6C).
- Fixera försiktigt föremålsrutschbanan, med sin plasticinfria sida vänd nedåt, i petriskålen som förhindrar rotation av flugan. Se till att flugan är täckt med vatten (Figur 6D). Använd en beredningsnål för att försiktigt ta bort eventuella luftbubblor som kan ha bildats runt ögat och fortsätt omedelbart till bildförvärv för bästa resultat.
OBS: Betydande förseningar i bildförvärv resulterar i återuppvaknande och rörelser av flugan som kan leda till suddiga bilder.
Figur 6: Förberedelse för dödlig vattennedsänkningsmikroskopi. Illustration av (A) plasticinbelagd objektglidning och petriskål, (B) klämning av en fluga genom bröstkorgen på plasticinmark, (C) flygorientering på den plasticinbelagda objektrutschbanan och (D) slutlig experimentell inställning. Klicka här för att se en större version av denna figur.
- Förbered flugor för den icke-dödliga variationen enligt följande.
- Överför en isbedövad fluga med huvudet före till en 200 μL pipettspets och tryck flugan försiktigt mot spetsen med tryckluft.
- Klipp av pipettspetsen precis framför huvudet med en skalpell. Använd pincett och tryck försiktigt flugan några millimeter bort från spetsen. Klipp av pipettspetsen igen och tryck tillbaka flugan mot spetsen med tryckluft så att endast flugans huvud sticker ut från pipettspetsen.
- Fäst en bit plasticin på en föremålsglid och tryck in pipettspetsen i den så att antingen flugans vänstra eller högra öga vetter uppåt (Figur 7A). Strax före bildförvärv, använd en laboratoriepipett för att fästa en stor droppe kylt vatten på undersidan av ett vattennedsänkningsmål (figur 7B). Fortsätt omedelbart till bildförvärv för bästa resultat.
OBS: Betydande förseningar i bildförvärv resulterar i återuppvaknande och rörelser av flugan som kan leda till suddiga bilder.
Figur 7: Förberedelse för icke-dödlig vattendroppsmikroskopi. Illustration av (A) en kallbedövad fluga fixerad inuti en 200 μL pipettspets monterad på plasticinbelagd föremålsrutschbana och (B) applicering av kylt vattenfall på undersidan av vattennedsänkningsmålet. Klicka här för att se en större version av denna figur.
- Bildförvärv
- Placera försiktigt petriskålen (steg 3.1.3) eller objektglidningen (steg 3.1.7) med den förberedda flugan på mikroskopsteget och välj ett vattennedsänkningsmål.
- Sänk vattennedsänkningsmålet manuellt tills det kommer i kontakt med vattenytan (steg 3.1.3) eller flugans öga vidrör droppen (steg 3.1.7) (figur 8A,B).
- Slå på mikroskopet UV-lampan och välj lämplig filteruppsättning. Använd okularen för att placera flugan under målet och fokusera mikroskopet på ögats yta.
- Växla ljusvägen mot mikroskopkameran och generera en levande bild i motsvarande programvara. Justera kamerans fokus och utvärdera ögats orientering, med tanke på att ögat måste möta mikroskopmålet radiellt som illustreras mer detaljerat i figur 8C-E.
Figur 8: Placering av flugan under fluorescensmikroskopet för avbildning av vattennedsänkning. Inställning och slutlig orientering för bildförvärv med hjälp av (A) dödliga eller (B) icke-dödliga flygberedningsprotokoll. (C) Illustration av flugorientering för att uppnå bästa resultat av mikroskopibilder med vattennedsänkning. Den ideala punkten att fokusera på ögat är inte det exakta centrumet med avseende på de främre / bakre och dorsala / ventrala axlarna utan ligger något ovanför ögats ekvatorn, vilket indikeras av den röda pilen. (D) Exempel på bild av vattennedsänkning för ett perfekt placerat öga. Alla tre symmetriaxlarna i den sexkantiga ommatidialplattan visas som raka linjer och den maximala mängden ommatidier kan vara i fokus samtidigt. (E) Exempel på vattennedsänkningsbild av ett felaktigt placerat öga. Bilden innehåller böjda axlar och ett grunt skärpedjup. Skala bar: 20 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
- Använd lämplig LUT (uppslagstabell) i bildprogramvaran för att upptäcka övermättnad (anges som röda pixlar).
- När det gäller icke-pigmenterade flugor, justera exponeringstiden så att de ljusaste pixlarna ligger strax under mättnadsgränsen för varje bild.
- När det gäller pigmenterade flugor och den dödliga variationen, justera exponeringstiden så att alla ljusaste pixlar ligger strax under mättnadsgränsen hos minst fem enskilda 1-dagars gamla, mörkanpassade flugor. Applicera den beräknade genomsnittliga exponeringstiden på alla andra experimentella förhållanden (genotyper, belysningsförhållanden, tidpunkter etc.).
- När det gäller pigmenterade flugor (t.ex. rödögda) och den icke-dödliga variationen, justera exponeringstiden så att alla ljusaste pixlar ligger strax under mättnadsgränsen för varje 1 dag gammal, mörkanpassad fluga individuellt. Applicera denna exponeringstid på alla andra experimentella förhållanden (belysningsförhållanden, tidpunkter etc.) för denna fluga.
- Spela in en bild och spara den som en råfil för att arkivera alla motsvarande metadata för inspelningen. Exportera bilden i ett .tif format för följande kvantifiering.
OBS: När det gäller den icke-dödliga variationen, belysa flugorna i 5 minuter med rött ljus (t.ex. 630 nm) omedelbart efter bildförvärv, om de är avsedda att användas för ytterligare experiment. Rött ljus inaktiverar fototransduktionskaskaden som har aktiverats för mycket av intensivt kortvågigt ljus under bildförvärvet.
- Dataanalys och kvantifiering av relativ eGFP-fluorescens i rabdomererna av mikrografer för vattennedsänkning
- Ladda ner, installera och kör programvaran ImageJ / Fiji.
- Justera ImageJ-inställningarna genom att klicka på Analysera > Ställ in mätningar... och markera endast rutan för Genomsnittligt grått värde. Importera en .tif bild genom att klicka på Arkiv > Öppna... eller genom att dra och släppa. Välj en representativ region i bilden som är i fokus och förstora den till 200% -300% genom att upprepade gånger trycka på Ctrl och + tillsammans .
- Välj det ovala verktyget och när du trycker på Shift-tangenten genererar du ett cirkulärt urval i bilden som är betydligt mindre än en fluorescerande rhabdomere. Innan du släpper musknappen, leta efter den exakta storleken som visas under verktygsfältet i ImageJ-huvudfönstret. Använd samma storlek på cirkulärt urval för alla analyser.
OBS: Den exakta storleken på det cirkulära valet i pixlar eller mikron beror på den specifika inställningen. Använd en cirkel ungefär 1/3 eller 1/4 av den rabdomerala diametern hos 1 dag gamla, mörkanpassade kontrollflugor. - Flytta det cirkulära valet antingen genom att musklicka in i det och dra eller genom att trycka på piltangenterna på tangentbordet.
- För att mäta fluorescensintensiteterna inom det cirkulära valet, flytta cirkeln till den första rhabdomeren (r1) och klicka på Analysera > mät eller använd genvägen Ctrl + M. Ett resultatfönster med det uppmätta grå värdet dyker upp.
- Fortsätt med mätningar av r2-r6 som upprepade mätningar och en mätning av bakgrundssignalen (b). När det gäller icke-pigmenterade flugor, gör ytterligare mätningar av motsvarande cellkroppsområden (c1-c6) (figur 9).
Figur 9: Kvantifiering av relativ rabdomeral fluorescens för translokationsstudier. En illustration angående kvantifiering av relativ eGFP-fluorescens i rhabdomeres genom att mäta fluorescensintensiteten hos rhabdomere (r), cellkropp (c) och bakgrund (b) av tre olika representativa ommatidier (vita cirklar) i en vattennedsänkningsmikroskopibild; skalstång: 10 μm. Ett förstorat ommatidium visas till höger; skala bar: 2 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
- Upprepa steg 3.3.5 och 3.3.6 för ytterligare två ommatidia, vilket resulterar i tre tekniska replikat. Markera den analyserade ommatidia med hjälp av pennverktyget och spara den här bilden för dokumentation.
- Välj och kopiera de uppmätta grå värdena från resultatfönstret och klistra in dem i kalkylarksprogram för ytterligare beräkningar. Sortera värdena för fluorescensintensitet enligt deras ursprung i kategorierna rhabdomere (r), cellkropp (c) och bakgrund (b). Beräkna medelintensiteten från varje kategori (Ir, Ic, Ib).
- Beräkna den relativa mängden eGFP som finns i rhabdomere (R) med hjälp av följande formel (1) för icke-pigmenterad och formel (2) för pigmenterade ögon:
(1)
(2) - Fortsätt med nästa bild i steg 3.3.3. Det rekommenderas att använda bilder från minst fem individer i varje experimentell grupp som biologiska replikat för att få en tillförlitlig mätning.
(1)
(2)- Dataanalys och kvantifiering av ögonmorfologi med eGFP-fluorescens i mikrografer för vattennedsänkning
- Ladda ner, installera och kör ImageJ / Fiji-programvaran. Importera en .tif bild genom att klicka på Arkiv > Öppna ... eller genom att dra och släppa. Välj tre intilliggande ommatidia i en representativ region av bilden som är i fokus.
- Utvärdera de 18 rabdomererna i urvalet individuellt enligt deras eGFP-intensitet, kantskärpa och kontrast med avseende på den omgivande bakgrundssignalen för att generera ett degenerationsindex. Poäng tydligt synliga rhabdomeres med ett värde av 2, svagt synliga rhabdomeres med ett värde av 1 och frånvarande rhabdomeres med ett värde av 0 (Figur 10).
OBS: Detta sätt att kvantifiera resulterar i en poäng på 36 för helt intakta ögon och en poäng på 0 för helt degenererade ögon. Det rekommenderas att ställa in poängen 36 till 100% på degenerationsindexet.
Figur 10: Kvantifiering via rabdomere-utvärdering för degenerationsstudier. En illustration angående kvantifiering av ögonmorfologi genom att poängsätta rabdomererna av tre olika representativa ommatidier (vita cirklar) i en vattennedsänkningsmikroskopibild med värdena 2 (tydligt synlig; blå cirkel), 1 (svagt synlig; orange cirkel) eller 0 (frånvarande; röd cirkel). Skalstång: 10 μm. Ett förstorat ommatidium visas till höger; skala bar: 2 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
- Öppna nästa bild och fortsätt med steg 3.4.2. Det rekommenderas att använda bilder från minst åtta individer i varje experimentell grupp som biologiska replikat för att få en tillförlitlig mätning.
OBS: Eftersom denna kvantifieringsmetod är mindre objektiv än metoden för kvantifiering av translokation med fluorescensintensitet är det rekommenderade antalet replikat högre.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Transgena Drosophila-flugor som uttrycker ett TRPL::eGFP-fusionsprotein under kontroll av rodopsin 1-promotorn har genererats. I dessa flugor uttrycks TRPL::eGFP i fotoreceptorceller R1-6 i det sammansatta ögat och visar en belysningsberoende lokalisering. När flugor hålls i mörkret införlivas TRPL::eGFP i de yttre rabdomererna. Efter belysning i flera timmar translokerar TRPL in i cellkroppen där den förvaras i ett ER-berikat fack. 8,10 När TRPL::eGFP är belägen i rhabdomeres kan dess fluorescens observeras i DPP. Rabdomeral fluorescens försvinner emellertid i ljuset som ett resultat av translokation av TRPL::eGFP (figur 11A,B). Detta har använts för att utföra en genetisk skärm för mutanter som är defekta i internaliseringen av TRPL::eGFP (Figur 11C,D)14,15. För att möjliggöra isolering av potentiellt homozygota dödliga mutationer utfördes denna skärm med hjälp av jäst Flp / FRT-systemet för generering av somatiska cellkloner i den utvecklande ögonvävnaden (dvs. mosaikögon). Förutom enkelheten i DPP-analysen är andra stora fördelar med denna fluorescensdetekteringsmetod dess höga genomströmning samt dess icke-invasiva karaktär som möjliggör identifiering av mutationer i levande flugor och att använda dessa flugor för generering av stabila mutanta flugbestånd.
Figur 11: Representativa resultat från en genetisk skärm på TRPL-translokationsdefekter. Hanflugor mutageniserades med etylmetansulfonat (EMS) och korsades till honor som uttryckte TRPL::eGFP i fotoreceptorceller R1-6. Den resulterande F1-generationen med homozygot mutanta Flp/FRT-inducerade mosaikögon screenades för defekter i TRPL-translokation genom avbildning av fluorescerande djupa pseudopupiler (DPP) efter en period av mörk anpassning (vänster kolumn) samt ljusanpassning (höger kolumn). (A,B) Icke-muterade flugor fördes med som kontroll för regelbunden ljusinducerad TRPL-translokation. Den icke-fluorescerande DPP indikeras med en pil. (C,D) Ett exemplariskt resultat av isolerade mutanter defekta i ljusutlöst TRPL-translokation. Skala bar: 100 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
TRPL-translokationsdefekt (ttd) mutanter som isolerades från denna genetiska skärm har senare identifierats och deras defekter karakteriseras mer detaljerat med hjälp av avbildning av vattennedsänkning. Vattennedsänkningsmikroskopi har tillämpats för att bedöma lokaliseringen av proteiner i rabdomererna och cellkropparna eller för att spåra defekter i den rabdomerala strukturen på grund av fotoreceptordegenerering kvantitativt enligt beskrivningen i protokollet. Figur 12A,B illustrerar kvantifiering av mängden TRPL::eGFP som finns i rhabdomeres av flugor med icke-mutanta och lolattd12 mutanta mosaikögon i mörkret, i ljus och efter en andra mörk anpassning. I kontroll (icke-mutanta) flugor translokerar TRPL::eGFP ut ur rhabdomererna till cellkroppen efter 16 timmars belysning vilket resulterar i en minskning av rabdomeral TRPL::eGFP till cirka 45% jämfört med det mörkanpassade tillståndet. Den andra mörka inkubationen höjer rabdomeral fluorescens igen till 95% av det ursprungliga värdet. Lolattd12-mutanten isolerades genom DPP-screening på grund av dess TRPL-translokationsdefekt. Följaktligen verkar TRPL::eGFP-fluorescensmönstret i vattennedsänkningsbilder av rabdomeres inte förändras lika drastiskt efter 16 timmars belysning och efterföljande mörkeranpassning i 24 timmar. Bilderna avslöjar emellertid också att lolattd12-mutanter är utvecklingsmässigt defekta, vilket framgår av enstaka frånvaro av fotoreceptorceller som beskrivits tidigare för andra lola-mutanter 16. Dessa morfologiska defekter resulterar i en oförmåga att mäta en giltig bakgrundssignal, vilket förhindrar en korrekt kvantifiering med formel (1). Däremot är vps35MH20 en mutant som visar en TRPL-translokationsdefekt utan att påverka ommatidial morfologin på detta sätt10. I denna mutant kan kvantifieringsmetoden som beskrivs här detektera en statistiskt mycket signifikant återvinningsdefekt (figur 12C,D).
Figur 12: Representativa resultat av en TRPL-translokerande defekt i lola- och vps35-mutantflugor och kvantifieringsmetodens gränser. (A) TRPL::eGFP-uttryckande icke-mutanta och lolattd12 mutanta mosaikögda flugor inkuberades i mörkret i 3 dagar, upplystes med orange ljus i 16 timmar och mörkanpassade i 24 timmar en andra gång. Bilder av fluorescerande rabdomerer togs genom vattennedsänkningsmikroskopi för att registrera subcellulär TRPL::eGFP-lokalisering enligt beskrivningen i steg 3.2.6. B) Kvantifiering av rabdomeral fluorescens hos icke-muterade (grå) och lolattd12-muterade (gröna) djur enligt beskrivningen i steg 3.3.9 med formel (1). Felstapl representerar SEM. (C) TRPL::eGFP-uttryckande icke-mutanta och vps35MH20-mutanta mosaikögda flugor inkuberades i mörkret i 3 dagar, upplystes med orange ljus i 16 timmar och mörkanpassade i 24 timmar en andra gång. Bilder av fluorescerande rabdomerer togs genom vattennedsänkningsmikroskopi för att registrera subcellulär TRPL::eGFP-lokalisering enligt beskrivningen i steg 3.2.6. D) Kvantifiering av rabdomeral fluorescens hos icke-muterade (grå) och vps35MH20-muterade (röda) djur enligt beskrivningen i steg 3.3.9 med formel (1). Statistisk signifikans beräknades som flera jämförelser med Bonferroni-korrigering efter ANOVA (ns, inte signifikant; *, p ≤ 0,05; ***, p ≤ 0,001). Skalstång: 10 μm. Panelerna C och D har ändrats från referens10. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Som redan nämnts i protokollet påverkar ögonpigmentering signifikant den resulterande vattennedsänkningsbilden. Vitögda flugor möjliggör detektering av fluorescenssignaler från både rhabdomere och cellkroppen, vilket möjliggör en ganska exakt bestämning av TRPL: : eGFP-distributionsförhållandet. Däremot är TRPL::eGFP-signalen hos rödögda flugor endast detekterbar i rhabdomererna men inte i cellkropparna (Figur 13A). Detta beror på att pigmentmolekyler absorberar det emitterade ljuset från TRPL::eGFP. Ändå, genom att använda formel (2) för pigmenterade ögon, avslöjar kvantifiering snyggt TRPL::eGFP-translokationsbeteende hos vit- såväl som rödögda flugor. Följaktligen minskar motsvarande värden för rhabdomere fluorescens från 100% i det mörkanpassade tillståndet till 25% och 5% efter belysning och ökar igen till 80% och 90% som ett resultat av en andra mörk inkubation (Figur 13B).
Figur 13: Representativa resultat av TRPL::eGFP-fluorescens hos vit- och rödögda flugor. (A) TRPL::eGFP-uttryckande vit- och rödögda flugor inkuberades i mörkret i 1 dag, upplystes med orange ljus i 16 timmar och mörkanpassade i 24 timmar en andra gång. Bilder av fluorescerande rabdomerer togs genom icke-dödlig vattendroppsmikroskopi för att registrera subcellulär TRPL::eGFP-lokalisering enligt beskrivningen i steg 3.2.6 (vitögda flugor) och 3.2.8 (rödögda flugor). (B) Kvantifiering av rabdomeral fluorescens hos vitögda (grå) och rödögda (röda) flugor. Vitögda flugor kvantifierades med formel (1) och rödögda flugor med formel (2), enligt beskrivningen i steg 3.3.9. Felstaplar representerar SEM. Skalfält: 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
För bedömning av fotoreceptordegeneration kan ett degenerationsindex baserat på fluorescensen av TRP::eGFP i rhabdomererna bestämmas (se protokoll). Denna kvantifieringsmetod illustreras i figur 10. I de representativa resultaten här hölls icke-mutanta och sdhAttd11 mutanta mosaikögda flugor i en 12 h ljus / 12 h mörk cykel i 2 veckor och integriteten hos rabdomeres undersöktes var 2-4: e dag genom att observera TRP: : eGFP med hjälp av vattennedsänkningsmikroskopi (Figur 14A). Den resulterande kurvan visar en minskning av degenerationsindexet hos mutanten men inte i kontrollflugorna (figur 14B).
Figur 14: Representativa resultat av ljusinducerad retinaldegenerering hos sdhA-mutantflugor . (A) TRP::eGFP-uttryckande icke-mutanta och sdhAttd11-muterade mosaikögda flugor inkuberades i 14 dagar i en 12 h ljus /12 h mörk cykel vid 25 °C. Bilder av fluorescerande rabdomeres togs genom vattennedsänkningsmikroskopi med jämna mellanrum för att registrera retinal hälsa. B) Kvantifiering av rabdomeral fluorescens av vild typ (grå) och sdhAttd11-mutant (orange) flugor enligt beskrivningen i steg 3.4. Felstaplar representerar SEM. Skalfält: 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tillämpligheten av fluorescensproteiner och enkelheten i screening genom DPP-avbildning och retinal vattennedsänkningsmikroskopi har visat sig vara framgångsrik av många grupper12. Strategier som liknar de som presenteras här har använts i flera genetiska skärmar för att upptäcka defekter i rodopsinuttrycksnivåer, homeostas, retinal organisation eller cellulär integritet med hjälp av Rh1: eGFP 17,18,19,20,21. Som förklarats ovan kan translokerande fusionsproteiner som TRPL::eGFP användas för att upptäcka om proteinhandelsprocesser från och till rhabdomeren försämras, till exempel i mutagenesskärmar. Å andra sidan kan permanent rabdomerala fusionsproteiner som TRP::eGFP användas för att undersöka rabdomeremorfologi. DPP och vattennedsänkningsmikroskopi betraktas som utmärkta metoder för analyser och skärmar med hög genomströmning inom modellen för Drosophila-ögat. Det rekommenderas dock att i slutändan utföra (immun)histokemiska analyser av isolerade ommatidier eller kryosektionerad retinalvävnad för att bekräfta resultat erhållna genom DPP eller vattennedsänkningsmikroskopi. I kombination med högupplöst fluorescensmikroskopi möjliggör dessa tekniker tolkningar mot exakta subcellulära lokaliseringar. I det följande erbjuds några riktlinjer för hur man felsöker avbildningsprocesserna för DPP och retinal vattennedsänkningsmikroskopi som är särskilt viktig för korrekta kvantitativa analyser.
När det gäller DPP, om superpositionen av fluorescens är suddig eller otydlig, kanske inställningarna inte är rätt. En möjlighet är att ögat inte är vänt mot målet exakt radiellt eller att fokus är inställt på ögats perifera regioner. Eftersom fotoreceptorcellernas ommatidiella layout visar spegelsymmetri vid dorsoventral mittlinje kan ett ovanligt mönster i DPP ses om signalerna detekteras från båda halvkloten i ögat. Kvaliteten på DPP är också starkt beroende av ett grunt skärpedjup för att generera en optisk sektion genom det sammansatta ögat. Om flypadens yta visar autofluorescens kan flugan placeras på en liten bit svart icke-fluorescerande kartong ovanpå flypaden. En oförmåga att registrera en DPP kan vara kopplad till en mängd olika bakomliggande orsaker, inklusive suboptimal flygpositionering, låga uttrycksnivåer av det fluorescerande proteinet, en oorganiserad retinal arkitektur eller degenerativa processer. Vid avbildning av DPP bör det också noteras att cytoplasmatisk fluorescens hos vitögda flugor kan diffundera signalens gränser från rhabdomererna, och uttrycksnivåerna av protein kan variera avsevärt mellan individer och påverka kvaliteten på den resulterande DPP. Således, när det gäller fluorescerande DPP-avbildning, är det fördelaktigt att använda flugor med pigmenterade ögon. På grund av absorptionen av fluorescenssignaler från cellkropparna kan den resulterande DPP verka skarpare än hos vitögda flugor.
För att undvika suddiga bilder i vattennedsänkningsmikroskopi måste bildförvärv utföras snabbt efter flugförberedelse för att förhindra återuppvaknande och rörelser av flugan. För högkvalitativa bilder måste de ljusaste fluorescenssignalerna från ögat nästan nå mättnad i alla bilder om man använder vitögda flugor. Detta kan uppnås genom att justera exponeringstiden under avbildningen. Eftersom pigmentering hindrar detektion av cytosolisk eGFP-fluorescens, skulle det beskrivna tillvägagångssättet för vitögda flugor att justera exponeringstiden alltid resultera i starka rabdomerala fluorescenssignaler i pigmenterade ögon, vilket snedvrider efterföljande tolkning och kvantifiering. Dessutom, genom att använda pigmenterade ögon, kan fotoblekning på grund av stark exponering för blått ljus leda till svagare signaler och därmed feltolkning av data. Beroende på sammanhanget (dvs. dödligt eller icke-dödligt) presenteras två alternativa procedurer i protokollet för pigmenterade ögon. I allmänhet är den icke-dödliga variationen att föredra med pigmenterade ögon, eftersom samma fluga kan mätas upprepade gånger, och bedömningen av en specifik exponeringstid för varje enskild fluga resulterar i mer exakta kvantifieringar och högre reproducerbarhet än bestämningen av en genomsnittlig exponeringstid som genereras från ett prov. Men den icke-dödliga variationen kräver också mer försiktighet vid hantering av djur för att säkerställa deras överlevnad under upprepade mätningar. Detta kan uppnås genom att endast använda lågtrycksluft för att flytta flugor in i pipettspetsen och försiktigt använda pincett för att frigöra flugan från pipettspetsen efter avbildning. Eftersom flugorna inte är nedsänkta i iskylt vatten under proceduren finns det en ökad risk för återuppvaknande. Som ett resultat av de upprepade mätningarna från enskilda prover är hela mätserien endast giltig om flugan förblir oskadd från början till slut. Som ett resultat är den icke-dödliga variationen mycket arbetsintensiv och tidskrävande. Den dödliga variationen, å andra sidan, möjliggör en högre genomströmning eftersom flera flugor kan fästas i följd på samma insektsstift och registreras sekventiellt i en bildförvärvsrunda. Men flera flugor på samma stift kräver också ännu snabbare avbildning för att undvika återuppvaknande och rörelser. En sista nackdel med den dödliga variationen är uppenbarligen oförmågan att återhämta djuren efter avbildning för efterföljande tillämpningar (t.ex. kors, upprepade mätningar).
När det gäller kvantifiering av translokation presenterar detta protokoll formel (1), som tar hänsyn till fluorescenssignaler från rhabdomere såväl som cellkroppen och därmed genererar en mycket bra uppskattning för den relativa fördelningen av det translokerande proteinet i cellen (figur 12D). På grund av bristen på fluorescensmätningar från cellkroppen när det gäller pigmenterade ögon erbjuds formel (2), vilket fungerar bra för detta ofta förekommande problem (Figur 13B). Bortsett från ögonpigmentering finns det andra omständigheter som förhindrar kvantifiering med någon av dessa formler. Ett av dessa fall presenteras i figur 12A,B i form av lolattd12-mutanten. I denna mutant påverkar specifikt frånvaron av fotoreceptorcell R7 signifikant den ommatidiella morfologin och därmed förmågan att förvärva rimliga intensitetsmätningar av bakgrundsfluorescens från denna region. Om samma metod för translokationskvantifiering används trots dessa problem visar resultaten stora mängder varians, är svåra att jämföra med kontroller och kan eventuellt misstolkas. Exemplet med lolattd12-mutanten illustrerar således gränserna för denna kvantifieringsmetod som oundvikligen bygger på en "vild typ"-liknande morfologi för korrekta intensitetsmätningar. I sällsynta fall där proteintranslokationsdefekter ska kvantifieras i morfologiskt defekta ommatidier misslyckas det protokoll som presenteras här och måste anpassas i enlighet därmed. Detta inbegriper lämpliga ändringar av formeln för att utesluta mätningar som inte kan erhållas på ett rimligt sätt eller för att inkludera ytterligare mätningar av andra representativa regioner.
När det gäller kvantifiering av degenerativa processer visade sig fluorescensintensitetströsklar inte vara en bra indikator, eftersom det finns för mycket variation inom och mellan rhabdomererna. Denna varians är i genomsnitt ut över alla 18 uppmätta rabdomerer i metoden för kvantifiering av translokation. På grund av den individuella utvärderingen av varje rhabdomere vid bedömningen av degeneration kan dock variansen i fluorescensintensiteter inte medelvärdes ut. Dessutom är intensitet bara en av de egenskaper som måste beaktas. Andra viktiga aspekter är kontrast och skärpa i kanterna. Följaktligen presenterar detta protokoll en kvantifieringsmetod baserad på kategorisering av morfologin hos rhabdomeres enligt deras fluorescens med ögat. Detta är nödvändigtvis subjektivt till viss del. Men med tanke på tillräcklig erfarenhet har detta protokoll visat sig vara en användbar, snabb och reproducerbar kvantifieringsmetod för degenerering (figur 14) och har publicerats flera gånger22,10. Som med alla subjektiva utvärderingar är det alltid lämpligt att utföra dem i ett förblindat sammanhang. Protokoll från andra grupper använder vanligtvis bara två kategorier för att kvantifiera retinal degeneration i Drosophila (närvaro eller frånvaro av rabdomeres), vilket kan vara mindre subjektivt, men också mindre exakt. Dessutom har detta sätt att kvantifiera fortfarande frågan om att definiera en brytpunkt mellan de två kategorierna, vilket kan vara lika svårt att definiera objektivt.
När det gäller modifieringar och avancerade tillämpningar av de metoder som presenteras här är det också möjligt att bedöma den relativa mängden av två fluorescerande fusionsproteiner samtidigt genom dubbelfärgsavbildning. Genom att till exempel använda TRPL::HcRed och TRP::eGFP har TRPL::HcRed-translokationen bedömts med hänsyn till rabdomeral integritet i samma fluga23. Dubbel färgavbildning används också i Tomato / GFP-FLP / FRT-metoden, t.ex. för att identifiera faktorer som inducerar apoptos24. Denna variation gör det möjligt att visualisera degenerering av fotoreceptorceller via ninaC::eGFP i fluorescerande märkta cellkloner markerade med ninaC::tdTomato. En annan tillämpning av vattennedsänkningsmikroskopi är övervakningen av fosfoinositidomsättningen i fotoreceptorer. För detta ändamål används fluorescerande taggade fosfoinositidbindande domäner som pleckstrinhomologidomänen (PH) från PLCδ1. Dessa fluorescenssonder möjliggör spårning av fosfoinositidnedbrytning över tid genom att detektera minskningen av rabdomeral fluorescens orsakad av diffusionen av sonden från rhabdomere till cytosolen25,26.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inget att avslöja.
Acknowledgments
Vi vill tacka våra studentforskare genom åren. I synnerhet Nina Meyer, Sibylle Mayer, Juliane Kaim och Laura Jaggy, vars data har använts i detta protokoll som representativa resultat. Forskningen i vår grupp som presenteras här finansierades av bidrag från Deutsche Forschungsgemeinschaft (Hu 839/2-4, Hu 839/7-1) till Armin Huber.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 15 mL centrifuge tube | Greiner Bio-One | 188271 | |
| CO2 anaesthesia fly pad | Flystuff | 59-172 | |
| Cold light lamp (KL 1500 LCD) | Zeiss | ||
| Fiji/ImageJ | NIH | ||
| Fluorescence microscope with UV lamp, camera, filter set and software (AxioImager.Z1m, Axiocam 530 mono, 38 HE, ZEN2 blue edition) | Zeiss | ||
| Fluorescent tube (Lumilux T8, L 30W/840, 4000 K, G13) [1750 Lux, Ee470nm = 298 µW cm-2, Ee590nm = 215 µW cm-2] and [760 Lux, Ee470nm = 173 µW cm-2, Ee590nm = 147 µW cm-2] |
Osram | 4050300518039 | |
| Laboratory pipette (20-200 µL) | Eppendorf | ||
| Object slide | Roth | 0656.1 | |
| Petri dish (94 mm) | Greiner Bio-One | 633102 | |
| Pipette tips (200 µL) | Labsolute | 7695844 | |
| Plasticine (Blu-Tack) | Bostik | 30811745 | |
| Stereo microscope (SMZ445) | Nikon | ||
| Stereo microscope with UV lamp, camera, filer set and software (MZ16F, MC170 HD, GFP3, LAS 4.12) | Leica |
References
- Wang, X., Huang, T., Bu, G., Xu, H.
- Schopf, K., Huber, A. Membrane protein trafficking in Drosophila photoreceptor cells. European Journal of Cell Biology. 96 (5), 391-401 (2017).
- Hardie, R. C. The photoreceptor array of the dipteran retina. Trends in Neurosciences. 9, 419-423 (1986).
- Wang, T., Montell, C. Phototransduction and retinal degeneration in Drosophila. Pflügers Archiv - European Journal of Physiology. 454 (5), 821-847 (2007).
- Xiong, B., Bellen, H. J. Rhodopsin homeostasis and retinal degeneration: lessons from the fly. Trends in Neurosciences. 36 (11), 652-660 (2013).
- Bähner, M., et al. Light-regulated subcellular translocation of Drosophila TRPL channels induces long-term adaptation and modifies the light-induced current. Neuron. 34 (1), 83-93 (2002).
- Cronin, M. A., Lieu, M. -H., Tsunoda, S. Two stages of light-dependent TRPL-channel translocation in Drosophila photoreceptors. Journal of Cell Science. 119, 2935-2944 (2006).
- Meyer, N., Joel-Almagor, T., Frechter, S., Minke, B., Huber, A. Subcellular translocation of the eGFP-tagged TRPL channel in Drosophila photoreceptors requires activation of the phototransduction cascade. Journal of Cell Science. 119, Pt 12 2592-2603 (2006).
- Oberegelsbacher, C., Schneidler, C., Voolstra, O., Cerny, A., Huber, A. The Drosophila TRPL ion channel shares a Rab-dependent translocation pathway with rhodopsin. European Journal of Cell Biology. 90 (8), 620-630 (2011).
- Wagner, K., Smylla, T. K., Lampe, M., Krieg, J., Huber, A. Phospholipase D and retromer promote recycling of TRPL ion channel via the endoplasmic reticulum. Traffic. , (2021).
- Franceschini, N., Kirschfeld, K. Les phénoménes de pseudopupille dans l'oeil compose de Drosophila. Kybernetik. 9 (5), 159-182 (1971).
- Pichaud, F., Desplan, C. A new visualization approach for identifying mutations that affect differentiation and organization of the Drosophila ommatidia. Development. 128 (6), 815-826 (2001).
- Smylla, T. K., Wagner, K., Huber, A. Application of fluorescent proteins for functional dissection of the Drosophila visual system. International Journal of Molecular Sciences. 22 (16), (2021).
- Meyer, N. Mechanisms of the light-dependent translocation of the ion channel TRPL in the photoreceptors of Drosophila melanogaster: Dissertation for obtaining the academic degree Dr. rer. nat. University of Karlsruhe (TH). , Karlsruhe. (2005).
- Meyer, N., Oberegelsbacher, C., Dürr, T. D., Schäfer, A., Huber, A. An eGFP-based genetic screen for defects in light-triggered subcelluar translocation of the Drosophila photoreceptor channel TRPL. Fly. 2 (1), 36-46 (2008).
- Zheng, L., Carthew, R. W. Lola regulates cell fate by antagonizing Notch induction in the Drosophila eye. Mechanisms of Development. 125 (1-2), 18-29 (2008).
- Hibbard, K. L., O'Tousa, J. E. A role for the cytoplasmic DEAD box helicase Dbp21E2 in rhodopsin maturation and photoreceptor viability. Journal of Neurogenetics. 26 (2), 177-188 (2012).
- Huang, Y., Xie, J., Wang, T. A Fluorescence-based genetic screen to study retinal degeneration in Drosophila. PloS One. 10 (12), 0144925 (2015).
- Zhao, H., Wang, J., Wang, T. The V-ATPase V1 subunit A1 is required for rhodopsin anterograde trafficking in Drosophila. Molecular Biology of the Cell. 29 (13), 1640-1651 (2018).
- Xiong, L., et al. ER complex proteins are required for rhodopsin biosynthesis and photoreceptor survival in Drosophila and mice. Cell Death and Differentiation. 27 (2), 646-661 (2020).
- Zhao, H., Wang, T. PE homeostasis rebalanced through mitochondria-ER lipid exchange prevents retinal degeneration in Drosophila. PLoS Genetics. 16 (10), 1009070 (2020).
- Cerny, A. C., et al. The GTP- and phospholipid-binding protein TTD14 regulates trafficking of the TRPL ion channel in Drosophila photoreceptor cells. PLoS Genetics. 11 (10), 1005578 (2015).
- Richter, D. Structural and functional analyses of TRP ion channels in the photoreceptor cells of Drosophila melanogaster: Dissertation for obtaining the academic degree Dr. rer, nat. University of Karlsruhe (TH). , Karlsruhe. (2007).
- Gambis, A., Dourlen, P., Steller, H., Mollereau, B. Two-color in vivo imaging of photoreceptor apoptosis and development in Drosophila. Developmental Biology. 351 (1), 128-134 (2011).
- Hardie, R. C., Liu, C. -H., Randall, A. S., Sengupta, S. In vivo tracking of phosphoinositides in Drosophila photoreceptors. Journal of Cell Science. 128 (23), 4328-4340 (2015).
- Chakrabarti, P., et al. A dPIP5K dependent pool of phosphatidylinositol 4,5 bisphosphate (PIP2) is required for G-protein coupled signal transduction in Drosophila photoreceptors. PLoS Genetics. 11 (1), 1004948 (2015).
