Summary
High-throughput RNA-interferentie (RNAi) screening met behulp van een pool van lentivirale shRNA's kan een hulpmiddel zijn om therapeutisch relevante synthetische dodelijke doelwitten bij maligniteiten te detecteren. We bieden een gepoolde shRNA-screeningsbenadering om de epigenetische effectoren bij acute myeloïde leukemie (AML) te onderzoeken.
Abstract
Het begrijpen van klinisch relevante drivermechanismen van verworven chemoresistentie is cruciaal voor het ophelderen van manieren om resistentie te omzeilen en de overleving te verbeteren bij patiënten met acute myeloïde leukemie (AML). Een klein deel van de leukemische cellen die chemotherapie overleven, hebben een geschikte epigenetische toestand om chemotherapeutische belediging te tolereren. Verdere blootstelling aan chemotherapie stelt deze medicijn persistercellen in staat om een vaste epigenetische toestand te bereiken, wat leidt tot veranderde genexpressie, wat resulteert in de proliferatie van deze medicijnresistente populaties en uiteindelijk terugval of refractaire ziekte. Daarom is het identificeren van epigenetische modulaties die de overleving van medicijnresistente leukemische cellen noodzakelijk maken, van cruciaal belang. We beschrijven een protocol om epigenetische modulatoren te identificeren die resistentie tegen het nucleoside analoge cytarabine (AraC) bemiddelen met behulp van gepoolde shRNA-bibliotheekscreening in een verworven cytarabine-resistente AML-cellijn. De bibliotheek bestaat uit 5.485 shRNA-constructies gericht op 407 menselijke epigenetische factoren, die epigenetische factorscreening met hoge doorvoer mogelijk maken.
Introduction
Therapeutische opties bij acute myeloïde leukemie (AML) zijn de afgelopen vijf decennia onveranderd gebleven, met cytarabine (AraC) en anthracyclines als hoeksteen voor de behandeling van de ziekte. Een van de uitdagingen voor het succes van AML-therapie is de resistentie van leukemische stamcellen tegen chemotherapie, wat leidt tot terugval van de ziekte 1,2. Epigenetische regulatie speelt een vitale rol in de pathogenese van kanker en resistentie tegen geneesmiddelen, en verschillende epigenetische factoren zijn naar voren gekomen als veelbelovende therapeutische doelen 3,4,5. Epigenetische regulerende mechanismen beïnvloeden proliferatie en overleving bij continue blootstelling aan chemotherapeutische geneesmiddelen. Studies in niet-hematologische maligniteiten hebben gemeld dat een klein deel van de cellen die het geneesmiddeleffect overwinnen verschillende epigenetische modificaties ondergaan, wat resulteert in de overleving van die cellen 6,7. De rol van epigenetische factoren bij het bemiddelen van verworven resistentie tegen cytarabine in AML is echter niet onderzocht.
High-throughput screening is een benadering van geneesmiddelenontdekking die in de loop van de tijd wereldwijd aan belang heeft gewonnen en in verschillende aspecten een standaardmethode is geworden om potentiële doelen in cellulaire mechanismen, voor routeprofilering en op moleculair niveaute identificeren 8,9. Het concept van synthetische letaliteit omvat de interactie tussen twee genen waarbij de verstoring van een van beide genen alleen levensvatbaar is, maar van beide genen tegelijkertijd resulteert in het verlies van levensvatbaarheid10. Het benutten van synthetische letaliteit bij de behandeling van kanker kan helpen bij het identificeren en mechanistisch karakteriseren van robuuste synthetische dodelijke genetische interacties11. We hebben een combinatorische benadering van high-throughput shRNA-screening met synthetische letaliteit aangenomen om de epigenetische factoren te identificeren die verantwoordelijk zijn voor verworven cytarabineresistentie in AML.
Van acute leukemieën gedreven door chromosomale translocatie van het gemengde-afstammingsleukemiegen (MLL of KMT2A) is bekend dat ze geassocieerd zijn met een slechte overleving bij patiënten. De resulterende chimere producten van MLL-genherschikkingen, d.w.z. MLL-fusie-eiwitten (MLL-FPs), kunnen hematopoëtische stam- / voorlopercellen (HSPC's) transformeren in leukemische blasten met de betrokkenheid van meerdere epigenetische factoren. Deze epigenetische regulatoren vormen een ingewikkeld netwerk dat het onderhoud van het leukemieprogramma dicteert en daarom potentiële therapeutische doelen kan vormen. In deze context gebruikten we de MV4-11 cellijn (met het MLL-fusiegen MLL-AF4 met de FLT3-ITD-mutatie; aangeduid als MV4-11 P) om de verworven cytarabine-resistente cellijn te ontwikkelen, aangeduid als MV4-11 AraC R. De cellijn werd blootgesteld aan toenemende doses cytarabine met intermitterend herstel van de medicamenteuze behandeling, bekend als een drugsvakantie. De half-maximale remmende concentratie (IC50) werd beoordeeld met behulp van een in vitro cytotoxiciteitstest.
We gebruikten de gepoolde epigenetische shRNA-bibliotheek (zie Tabel met materialen) aangedreven door de hEF1a-promotor met een pZIP lentiviral backbone. Deze bibliotheek bestaat uit shRNA's die zich richten op 407 epigenetische factoren. Elke factor heeft 5-24 shRNA's, met een totaal van 5.485 shRNA's, waaronder vijf niet-gerichte controle-shRNA's. De gemodificeerde "UltrmiR" miR-30 scaffold is geoptimaliseerd voor efficiënte primaire shRNA biogenese en expressie12,13.
De contouren van dit experiment zijn geïllustreerd in figuur 1A. Het huidige protocol richt zich op RNAi-screening met behulp van de epigenetische factor shRNA-bibliotheek in de MV4-11 AraC R-cellijn (figuur 1B), een suspensiecellijn. Dit protocol kan worden gebruikt om elke gerichte bibliotheek in elke medicijnresistente cellijn naar keuze te screenen. Opgemerkt moet worden dat het transductieprotocol anders zal zijn voor adherente cellen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Volg de richtlijnen van het Institutional Biosafety Committee (IBSC) en gebruik de juiste faciliteit om lentivirus (BSL-2) te behandelen. Het personeel moet naar behoren worden opgeleid in de behandeling en verwijdering van lentivirus. Dit protocol volgt de bioveiligheidsrichtlijnen van Christian Medical College, Vellore.
1. Selectie van de krachtigste promotor om persistente en langdurige expressie van de shRNA's te verkrijgen
OPMERKING: Het is essentieel om een transductie-experiment uit te voeren met behulp van lentivirale vectoren met verschillende promotors die fluorescentie-eiwitten tot expressie brengen om de promotor te identificeren die een stabiele en langdurige expressie van shRNA's in de cellijn biedt die voor het experiment is geselecteerd. De meest gebruikte promotors voor dit doel zijn hEF1α (humane rekfactor 1α), hCMV (humaan cytomegalovirus) en SSFV (spleen focus-forming virus) promotors die groene fluorescentie-eiwit (GFP) tot expressie brengen (Figuur 2A).
- Voer het aantal cellen uit met de methode trypan blue exclusion. Suspensie van de MV4-11 AraC R-cellen in 10% RPMI-medium (RPMI met 10% FBS aangevuld met 100 U/ml penicilline en 100 U/ml streptomycine) met 8 μg/ml polybreen. Zaad 1 x 106 cellen in 1,5 ml medium/put van een zes-put plaat in drievoud.
- Voeg verschillende volumes geconcentreerde lentivirussen (bijvoorbeeld 10 μL, 20 μL en 40 μL, afhankelijk van de titer van de lentivirussen) toe aan elke put. Draai de plaat voorzichtig om de inhoud te mengen.
- Voer spinfectie uit door centrifugering bij 920 x g bij 37 °C gedurende 90 minuten.
- Incubeer de platen onmiddellijk in een CO2-incubator (5% CO2 bij 37 °C).
- Observeer de GFP-expressie na 48 uur onder een fluorescentiemicroscoop om een succesvolle transductie te garanderen.
- Kwantificeer de GFP-expressie door flowcytometrie na 72 uur om de transductie-efficiëntie te evalueren.
- Kweek de cellen gedurende in totaal 2 weken en controleer de GFP-expressie periodiek door middel van flowcytometrie. De vermindering van de GFP-expressie gemeten door de gemiddelde fluorescentie-intensiteit en het percentage GFP+ cellen duiden op promotoruitschakeling.
- Sorteer de GFP+ cellen op de 10e dag en kweek de cellen gedurende 1 week na sortering. Controleer de GFP-expressie regelmatig tijdens de cultuur.
- Gebruik de niet-vertaalde cellen om de poort in te stellen. Een populatie voorbij de schaal van 1 x10 1 naar rechts op de x-as wordt beschouwd als een positieve populatie voor GFP.
- Kies de promotor die een aanhoudende expressie van GFP vertoont in de langdurige kweek van de cellen.
2. Voorbereiding van gepoolde lentiviral humane epigenetische factor shRNA bibliotheek
- Kweek 293T-cellen (bij een laag passagegetal met een goede proliferatiesnelheid) in drie 10 cm celkweekschalen met 8 ml 10% DMEM-medium (DMEM met 10% FBS met 100 E/ml penicilline en 100 U/ml streptomycine) in elke plaat.
- Zodra de cellen 60% confluentie bereiken, vervangt u het medium door een volledig medium.
- Bereid het transfectiemengsel (zoals beschreven in tabel 1) dat serumvrij medium, lentivirale verpakking (psPAX2) en envelopplasmide (pMD2.G), gepoolde bibliotheekplasmiden en ten slotte het transfectiereagens bevat.
- Tik op het mengsel om het goed te mengen en incubeer bij kamertemperatuur gedurende 15 minuten.
- Voeg het transfectiemengsel toe aan de 293T-cellen en meng voorzichtig door de platen te draaien. Incubeer de platen in een CO2 incubator (5% CO2 bij 37 °C). Vervang het medium na 24 uur.
- Controleer na 48 uur op GFP-expressie onder een fluorescentiemicroscoop om een hoge transfectie-efficiëntie in de 293T-cellen te garanderen.
- Verzamel de virussupernatanten na 48 h, 60 h en 72 h en bewaar ze bij 4 °C. Voeg vers medium (8 ml) toe op elk tijdstip na het verzamelen van het virus.
- Pool de virussupernatanten. Het totale volume van de gepoolde virussen zal zijn: ~ 8 ml / plaat x 3 collecties = ~ 24 ml / plaat; ~24 ml/plaat x 3 platen = ~72 ml uit 3 platen.
- Filter de gepoolde virussen met het filter van 0,4 μm.
- Voor het verkrijgen van een hoge titer van virussen, concentreer de gepoolde virussen door ultracentrifugatie. Breng het gefilterde virussupernatant over in twee 70 Ti-buizen (32 ml/buis) en centrifugeer gedurende 2 uur bij 18.000x g met langzame versnelling en vertraging. Gebruik een rotor en centrifuge voorgekoeld tot 4 °C.
- Haal de buisjes voorzichtig uit de centrifuge en verwijder het supernatant volledig.
- Gebruik een micropipette om de pellet voorzichtig te resuspenderen in 400 μL DMEM (zonder FBS en antibiotica). Incubeer 1 uur op het ijs en meng de pellets uit beide buizen.
- Vul de virussen aan en bevries bij −80 °C.
OPMERKING: De buizen en virussen moeten tijdens stap 2.10.-2.13 op ijs worden gehouden. Vermijd schuimen terwijl u het virus resuspendeert met het gewone medium. Het medium moet op 4 °C worden gehouden. - Bereken de concentratie (x) van het virus zoals hieronder:
Totaal volume vóór concentratie = 72 ml (72.000 μl)
Volume na concentratie = 400 μL
De concentratie = 72.000/400= 180x
3. Schatting van de transductie-efficiëntie van lentivirussen
- Transduceer 293T-cellen met het geconcentreerde virus in verschillende volumes (2 μL, 4 μL, 8 μL) om de succesvolle bereiding van lentivirussen te bevestigen.
OPMERKING: Als geconcentreerde virussen een hoge transductie-efficiëntie vertonen (>50%) in kleine volumes (1-2 μL), is het raadzaam om het geconcentreerde virus in de gewenste hoeveelheden (100x tot 75x) te verdunnen. - Verdun het geconcentreerde virus tot 100x met DMEM (zonder FBS en antibiotica) om titratie-experimenten uit te voeren in de MV4-11 AraC R-cellijn.
- Zaad 1 x 106 cellen (MV4-11 AraC R cellijn in 1,5 ml 10% RPMI medium met 8 μg/ml polybreen) in één put van een zes-well plaat. Bereid vier putten voor op transduceren met verschillende volumes virussen.
- Voeg vier verschillende volumes (bijvoorbeeld 1 μL, 1,5 μL, 2 μL en 2,5 μL) van 100x virussen toe.
- Voer spinfectie uit door centrifugering van de plaat bij 920 x g gedurende 90 minuten bij 37 °C.
- Meet na 72 uur het percentage GFP+-cellen door middel van flowcytometrie.
- Bepaal het volume van de virussen om 30% transductie-efficiëntie te verkrijgen. Deze lage transductie-efficiëntie moet zorgen voor één shRNA-integratie per cel.
4. Transductie van gepoolde epigenetische shRNA-bibliotheek in de medicijnresistente cellijn
- Handhaaf de doelcellijn MV4-11 AraC R op een dichtheid van 0,5 x 106 cellen /ml. Zorg ervoor dat de cellen zich in de exponentiële groeifase in de cultuur bevinden.
- Bereken het aantal cellen dat voor het experiment moet worden genomen, zoals hieronder op basis van het aantal virale integranten.
Aantal cellen dat nodig is voor transductie = 5.485 (aantal shRNA's) × 500 (vouw shRNA-representatie) / 0,25 (MOI) = 10.982.000 ~ 11 x 106 cellen - Resuspend 1,1 x 107 cellen in 16 ml van 10% RPMI medium.
- Voeg polybreen (8 μg/ml) toe en meng goed. Voeg vervolgens het vereiste volume virussen toe om 30% transductie-efficiëntie te verkrijgen zoals berekend in de vorige sectie.
- Zaai alle cellen op een zes-well plaat met een dichtheid van 1 x 106 cellen / 1,5 ml van 10% RPMI medium per put.
- Centrifugeer de plaat gedurende 90 min bij 920 x g bij 37 °C.
- Incubeer de plaat een nacht in een CO2-incubator (5% CO2 bij 37 °C).
- Vervang na 24 uur het medium en breng de getransduceerde cellen over in een T-75 kolf.
- Controleer na 48 uur de GFP onder een fluorescentiemicroscoop om een succesvolle transductie te garanderen.
- Kwantificeer na 72 uur het percentage GFP+-cellen door middel van flowcytometrie.
5. Verrijking van GFP-positieve cellen
OPMERKING: Breid de getransduceerde cellen uit door ze te kweken met een dichtheid van 0,5 x 106 cellen / ml gedurende 5-7 dagen. Deze cellen zijn een gemengde populatie van getransduceerde en niet-getransduceerde, geselecteerd op basis van GFP door sortering, zoals vermeld in de volgende stap.
- Voer stroomsortering uit van GFP+ getransduceerde cellen met de stroomsorteerinstellingen ingesteld als hoge zuiverheid en lage opbrengst. Gebruik de niet-vertaalde cellen om de poort in te stellen. Een populatie van meer dan 1 x 102 naar rechts wordt beschouwd als een positieve populatie.
- Verzamel de gesorteerde cellen in 5% RPMI (RPMI met 5% FBS aangevuld met 100 U/ml penicilline en 100 U/ml streptomycine).
- Kweek de gesorteerde cellen in een 10% RPMI-medium.
- Voer na 72 uur de schatting na het sorteren uit van het percentage GFP+-cellen om >95% sorteerefficiëntie te garanderen.
OPMERKING: Zorg ervoor dat u ~ 3-5 x 106 GFP-positieve cellen verkrijgt na het sorteren om 450x tot ~ 500x representatie van de shRNA-bibliotheek te verkrijgen.
6. Dropout screening om epigenetische factoren te identificeren die resistentie tegen geneesmiddelen bemiddelen
- Kweek de shRNA-bibliotheek getransduceerde cellen in 10% RPMI gedurende maximaal 5 dagen. Cryopreserveer de getransduceerde cellen voor toekomstige experimenten, indien nodig, vóór de medicamenteuze behandeling.
- Centrifugeer 1 x 107 cellen in duplicaten bij 280 x g gedurende 5 min bij 25 °C. Gooi het supernatant weg en bewaar de pellets bij −80 °C. Deze monsters zullen dienen als de referentie voor de epigenetische shRNA-bibliotheek.
- Kweek de resterende getransduceerde cellen als duplicaten (R1 en R2), elk onderhouden op een celtelling die een 500x weergave van de bibliotheek biedt.
- Behandel een van de duplicaten met het medicijn (10 μM cytarabine) (R2) en de andere zonder de medicamenteuze behandeling (R1).
- Vervang het medium voor de kolven met en zonder het medicijn om de 72 uur. Herhaal de mediumverandering 3x voor een cumulatieve blootstelling aan geneesmiddelen van 9 dagen.
- Controleer na 9 dagen medicamenteuze behandeling de levensvatbaarheid van de cellen met behulp van de trypan blue exclusion-methode.
- Centrifugeer de resterende cellen bij 280 x g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Resuspend de cellen in steriel PBS en was de cellen. Centrifugeer bij 280 x g gedurende 5 min bij kamertemperatuur.
- Gooi het supernatant weg en bewaar de pellets bij −80 °C voor DNA-extractie.
7. Versterking van de geïntegreerde shRNA's door PCR
- Extract DNA uit de getransduceerde uitgangscellen (T) (stap 6.2.) en de cellen behandeld met het geneesmiddel (R2) en onbehandeld met het geneesmiddel (R1).
- Controleer de concentratie van het monster met behulp van een fluorometer.
- Bereken de hoeveelheid DNA die nodig is voor PCR zoals hieronder:
5.485 (nr. van shRNA's) × 500 (shRNA-representatie) × 1 x 6,6−12 (g/diploïde genoom) = 15 μg DNA - Onderwerp de monsters aan de eerste ronde PCR.
OPMERKING: Het PCR-reactiemengsel is weergegeven in tabel 2 met de omstandigheden van de thermische cycler. Nadere bijzonderheden over de primers zijn opgenomen in aanvullende tabel 1. - Stel meerdere reacties in met 850 ng DNA per buis (voor een totaal van 43 reacties).
OPMERKING: De eerste ronde van PCR versterkt de flankerende gebieden van het shRNA, wat resulteert in een amplicongrootte van 397 bp. - Bundel de PCR-producten en zuiver de PCR-producten met behulp van 3-4 kolommen van een standaard gel / PCR-zuiveringskit.
OPMERKING: Details zijn opgenomen in tabel 3. - Eluteer het product in 50 μL buffer van elke kolom en bundel de elueren.
- Kwantificeer het DNA en bewaar het bij −20 °C.
OPMERKING: De reagentia zijn in tabel 4 in tabel aangegeven met de omstandigheden van de thermische cycler. De tweede ronde PCR maakt gebruik van de primers met de INDEX-sequentie die nodig is voor multiplexing in NGS in een singleflow-cel. Elk voorbeeld moet dus worden getagd met een andere index. Primersequenties zijn opgenomen in aanvullende tabel 1. - Stel vier reacties in met 500 ng van het primaire PCR-product in een totaal reactievolume van 50 μL voor elk monster en de negatieve controle.
- Laad het hele product voor elektroforese met 2% TBE agarose gel en bevestig de bandgrootte met behulp van een moleculaire ladder van 1 kb. De grootte van het amplicon is 399 bp.
- Visualiseer de PCR-producten op het geldocumentatiesysteem.
- Snijd de specifieke band weg en zuiver met behulp van een gelzuiveringskit.
OPMERKING: Berekeningen voor zuivering met de kit zijn opgenomen in tabel 3. - Elulaat in een eindvolume van 30 μL elutiebuffer. De geschatte concentratie van elk eluent zal ongeveer 80-90 ng/μL zijn met een totaal volume van 30 μL.
8. Next-generation sequencing en data-analyse
- Volg het gelgezuiverde product vanaf stap 7.13. op een sequencer van de volgende generatie (bijv. Illumina) om de afgelezen telling voor de uitgeputte shRNA's te verkrijgen.
- Trim de adapterreeksen van de gegenereerde FastQ-reads met behulp van de Fastx-toolkit (versie 0.7).
- Lijn de gefilterde reads uit op referentiesequenties met behulp van een Bowtie-aligner met de parameter van het toestaan van twee mismatches. Zorg ervoor dat de leeslengte na het trimmen van de adapter ongeveer 21 bp is.
- Laad de bestanden met behulp van het programma Samtools (versie 1.9). Gebruik de optie Flagstat en bereken het uitlijningsoverzicht.
- Laad de bijgesneden fastQ-bestanden in CRISPRCloud2 (CC2) -software (https://crispr.nrihub.org/) samen met de referentie shRNA-sequenties in de vorm van FASTA-bestanden en voer de analyse uit volgens de instructies.
- Klik op de link Analyse starten in de CC2.
- Selecteer het schermtype als Overlevings- en uitvalschermen. Stel het aantal groepen in en typ de naam voor elke groep.
- Upload de referentiebibliotheek in FASTA-bestandsindeling. De geüploade gegevens worden verwerkt. Klik op de uitvoer-URL om de resultaten te verkrijgen.
OPMERKING: Deze software maakt gebruik van een bèta-binomiaal model met een gemodificeerde Student's t-test om verschillen in sgRNA / shRNA-niveaus te meten, gevolgd door Fisher's gecombineerde waarschijnlijkheidstest om de significantie op genniveau te schatten. Het berekent de geschatte totale log 2-voudige veranderingen (Log2Fc) van shRNA's voor de epigenetische factoren tussen de behandelde (verrijkte / uitgeputte) en de onbehandelde monsters (baseline) met "p-waarden" en "FDR-waarden."
- Zorg ervoor dat de FDR-waarde "Negatief" is voor een uitvalscherm en "Positief" voor een overlevingsscherm.
OPMERKING: CC2 is een analyseplatform voor het tellen van de reads en het berekenen van de vouwrepresentatie (verrijking of uitputting) van shRNA's tussen monsters. - Identificeer de aanzienlijk verrijkte en uitgeputte shRNA's (FDR <0,05) uit de CC2-resultaten.
OPMERKING: Er zijn 5-24 shRNA's tegen elke factor. Controleer de FDR-waarden voor elk van de shRNA's; overweeg de FDR, die <0,01 is, en neem een gemiddelde voor de geselecteerde shRNA's. Denk aan de top 40 hits. Plot de grafiek voor de geselecteerde factoren op basis van Log2Fc- of FDR-negatieve waarden. Zorg ervoor dat de niet-gerichte shRNA's ook significante FDR-waarden hebben om de authenticiteit van de gegevens te garanderen, aangezien ze dienen als controle-shRNA's.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
De algemene screeningsworkflow is weergegeven in figuur 1A. In vitro cytotoxiciteit van de MV4-11 AraC R (48 h) onthulde dat de IC50 tot cytarabine in de MV4-11 AraC R hoger was dan de MV4-11 P (figuur 1B). Deze cellijn werd in de studie gebruikt als model voor het screenen van de epigenetische factoren die verantwoordelijk zijn voor cytarabineresistentie.
Figuur 2A toont de gelineariseerde pZIP-vectorkaarten met drie verschillende promotors: hEF1α (humane elongatiefactor 1α), hCMV (humaan cytomegalovirus) en SSFV (miltfocusvormend virus), met het vervormde shRNA binnen de UltramiR-sequentie. Figuur 2B illustreert de pZIP-vectorkaart die werd gebruikt in het bibliotheekexperiment en het shRNA gericht op de epigenetische factor met Zsgreen en puromycine als de selecteerbare marker aangedreven door de hEF1a-promotor. Deze vectoren werden gebruikt bij de selectie van het krachtigste promotorexperiment.
De selectie van de krachtigste promotor om een consistente en langdurige expressie in de doelcellen te krijgen, wordt geïllustreerd in figuur 3. De kwantificering van GFP gemeten door MFI toonde meer dan 90% transductie-efficiëntie aan het einde van 72 h in MV4-11 AraC R voor alle drie de promotors. Het histogram voor GFP-expressie toont een heterogene populatie voor hCMV, maar een homogene populatie in het geval van hEF1a en SFFV op dag 3 van transductie (figuur 3A). Het staafdiagram toont de GFP-expressie aangedreven door drie verschillende promotors (hEF1α, hCMV en SFFV) op dag 3 van transductie in MV4-11 AraC R (figuur 3B). SFFV-gestuurde GFP toonde een afname van MFI op dag 5 van transductie (figuur 3C). Er werd geen afname van MFI waargenomen in de hEF1a-gestuurde GFP-getransduceerde MV4-11 ouderlijke lijnpostsortering. Zo werd de hEF1a-promotor geïdentificeerd als een geschikte promotor voor de cellijn (figuur 3D).
Figuur 4A illustreert de transfectie-efficiëntie van de gepoolde shRNA-bibliotheekplasmiden in 293T-cellen na 48 h transfectie. De GFP-expressie was helder, wat wijst op een goede transfectie-efficiëntie. Na virusverzameling werd de transductie-efficiëntie van het voorbereide gepoolde virus gecontroleerd in 293T-cellen in drie verschillende concentraties (2 μL, 4 μL en 8 μL). We zagen dat zelfs 2 μL-virus resulteerde in dezelfde efficiëntie als die van 8 μL-virus, waardoor de hoge virale titer werd bevestigd (figuur 4B).
Figuur 5 illustreert de gepoolde bibliotheektransductie in de MV4-11 AraC R-cellijn en de bepaling van de lentivirale titer. Het gepoolde shRNA-bibliotheek lentivirus werd 100x verdund en vervolgens toegevoegd aan de MV4-11 AraC R-cellijn in verschillende volumes (1 μL, 1,5 μL, 2 μL en 2,5 μL). De efficiëntie werd gecontroleerd aan het einde van 72 h. De transductie-efficiëntie was 30% voor 2-2,5 μL van het virus, wat één shRNA-integratie per cel bevestigt (figuur 5A). Transductie met 2,5μl gepoold bibliotheekvirus in 1,1 x 107 MV4-11 AraC R-cellen resulteerde in 30% transductie-efficiëntie. GFP-positieve cellen werden gesorteerd, die de gepoolde shRNA-bibliotheek vertegenwoordigden (figuur 5B).
Na de transductie van gepoold shRNA epigenetisch lentivirus in de MV4-11 AraC R cellijn, werden de GFP-positieve cellen gesorteerd op dag 5 of dag 7 (figuur 6). Deze gesorteerde cellen werden onderworpen aan langdurige blootstelling aan cytarabine gedurende 9 dagen. De levensvatbaarheid werd gecontroleerd op de 9e dag en de cellen werden verzameld voor DNA. (Figuur 6A). Het staafdiagram toont de vermindering van de proliferatiesnelheid van de getransduceerde cellen in aanwezigheid van cytarabine (figuur 6B).
Het geëxtraheerde DNA uit de monsters werd onderworpen aan twee rondes PCR en het uiteindelijke gel-geëlueerde product vertegenwoordigde de verrijkte shRNA's gekwantificeerd door NGS. Figuur 7A toont de bindingsgebieden van de primer die wordt gebruikt in de 1e en de 2e ronde van PCR, waarbij de 1e ronde primers binden aan de flankerende gebieden van het geïntegreerde shRNA, en de 2e voorwaartse primer bindt aan de lussequentie. De omgekeerde primer bindt aan een gebied van de versterkte vector in de 1e ronde van PCR. Figuur 7B en figuur 7C illustreren de bandgrootte van het PCR-product aan het einde van de 1e (397 bp) en de 2e ronde PCR (399 bp), die gel-eluted, gezuiverd en ingediend voor NGS-analyse werd ingediend.
Na het onderwerpen van het DNA aan een standaard kwaliteitscontroleprocedure, werden de monsters verwerkt voor NGS-analyse. We gebruikten CRISPRCloud2, een gebruiksvriendelijk, cloudgebaseerd analyseplatform voor het identificeren van verrijkte en uitgeputte shRNA's in de gepoolde shRNA-screening. Figuur 8 illustreert de weergave van verrijkte of uitgeputte shRNA's gericht op epigenetische factoren die cytarabineresistentie in AML zouden kunnen bemiddelen.
Figuur 1: Overzicht en model van het onderzoek. (A) Illustratie van het overzicht van de workflow. (B) MV4-11-ouder- en AraC-resistente cellen behandeld met toenemende cytarabineconcentraties (0,1 μM tot 1000 μM) en beoordeeld met een MTT-test. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2. Illustratie van de gelineariseerde vectoren. (A) De drie vectorkaarten met drie verschillende promotors, hEF1α (humane rekfactor 1α), hCMV (humaan cytomegalovirus) en SSFV (miltfocusvormend virus), met het vervormde shRNA binnen de UltramiR-sequentie. (B) Illustratie van de vectorkaart die is gebruikt in het bibliotheekexperiment met hEF1α-promotor en het shRNA gericht op de epigenetische factor met Zsgreen en puromycine als selecteerbare marker. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Selectie van de krachtigste promotor om persistente en langdurige expressie van de shRNA's te verkrijgen. (A) Representatieve stroomplots voor GFP gekwantificeerd door flowcytometrie aan het einde van 72 h voor hEF1a-, hCMV- en SFFV-promotors. hCMV toont een heterogene piek, terwijl hEF1a en SFFV een enkele homogene piek laten zien. (B) Promotor efficiëntie in de MV4-11 AraC R cellijn. (C) SFFV-gestuurde GFP toont het zwijgen van GFP in langdurige cultuur. (D) hEF1a-gestuurde GFP-cellen vertonen aanhoudende expressie na het sorteren van de cellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: Controle van de efficiëntie van het geprepareerde gepoolde shRNA lentivirus. (A) Fluorescentiemicroscopiebeelden tonen de transfectie-efficiëntie van de gepoolde shRNA-bibliotheek getransfecteerd in 293T aan het einde van 48 uur met behulp van 10x vergroting. (B) De transductie-efficiëntie van het gepoolde virus werd beoordeeld in 293T-cellen met verschillende virusvolumes (2μL, 4μL en 8μL) met behulp van 10x vergroting. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Gepoolde bibliotheektransductie in de doelcellijn en bepaling van lentivirale titer. (A) MV4-11 AraC R-cellijn getransduceerd met verschillende virusvolumes (1μL, 1,5μL, 2μL en 2,5μL). De efficiëntie werd gecontroleerd aan het einde van 72 h. (B) Transductie van gepoold bibliotheekvirus in 1 x 107 MV4-11 AraC R-cellen om 30% transductie-efficiëntie te bereiken, vervolgens sorteren van GFP-positieve cellen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Uitvalscreening om epigenetische factoren te identificeren die resistentie tegen geneesmiddelen bemiddelen. (A) Schematische illustratie van medicamenteuze behandeling voor de verrijking van resistente cellen. Bibliotheek geïnfecteerde cellen werden onderworpen aan langdurige blootstelling aan cytarabine gedurende 9 dagen, gevolgd door het controleren van de levensvatbaarheid en het verzamelen van de cellen voor DNA-extractie. (B) Vermindering van de levensvatbaarheid bij langdurige blootstelling aan cytarabine in resistente cellijnen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Voorbereiding van de ampliconen die het geïntegreerde shRNA vertegenwoordigen. (A) De bindingsgebieden van de primer die worden gebruikt in de 1e en de 2e ronde van PCR, waarbij de 1e ronde primers binden aan de flankerende gebieden van het geïntegreerde shRNA en de tweede voorwaartse primer bindt aan de lussequentie. De achterkant bindt aan een gebied van het versterkte vectorgebied in de 1e PCR. (B) Illustratie van de bandgrootte van het PCR-product aan het einde van de 1e ronde PCR (397 bp). (C) Het 2e ronde PCR-product (399bp) werd gel-eluted, gezuiverd en gegeven voor NGS. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 8: Screeningsresultaten in de AML-cellijn (MV-4-11 Ara-C R-cellijn). Na het onderwerpen van het DNA aan een standaard kwaliteitscontroleprocedure, werden de monsters verwerkt voor NGS-analyse. We gebruikten CRISPRCloud2, een gebruiksvriendelijk, cloudgebaseerd analyseplatform, om verrijkte en uitgeputte shRNA's te identificeren in de gepoolde shRNA-screening. Het cijfer vertegenwoordigt verrijkte of uitgeputte shRNA's die zich richten op epigenetische factoren die cytarabineresistentie in AML kunnen bemiddelen. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Tabel 1: Bereiding van transfectieplasmidemix (berekening voor 10cm plaat) Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 2: PCR-reactiemengsel voor1e ronde PCR Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 3: Berekeningen voor de zuivering van de producten van 1st van PCR Klik hier om deze tabel te downloaden.
Tabel 4: PCR-reactiemengsel voor de 2e ronde van PCR Klik hier om deze tabel te downloaden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
RNA-interferentie (RNAi) wordt veel gebruikt voor functionele genomicastudies, waaronder siRNA- en shRNA-screening. Het voordeel van shRNA is dat ze kunnen worden opgenomen in plasmidevectoren en kunnen worden geïntegreerd in genomisch DNA, wat resulteert in stabiele expressie en dus langdurigere knockdown van het doelmRNA. Een gepoolde shRNA-bibliotheekscreening is robuust en kosteneffectief in vergelijking met de conventionele arrayed screens (siRNA). Het identificeren van de essentialiteit van een specifieke klasse eiwitten in een genoombreed scherm kan omslachtig zijn. Gerichte screeningsbenaderingen kunnen de essentialiteit van individuele eiwitten voor de overleving van kankercellen of geneesmiddelresistentie binnen de specifieke klasse met verminderde ruis onthullen. Dit protocol benadrukt het RNAi-scherm van epigenetische factoren om zowel essentiële als niet-essentiële genen systematisch te ondervragen, en het toont het gebruik van deze aanpak als een functioneel platform waarmee doelen kunnen worden geïdentificeerd die verantwoordelijk zijn voor AML-medicijnresistentie.
Deze krachtige technologie vereist bepaalde voorzorgsmaatregelen bij het ontwerp en de uitvoering van de experimenten. De eerste is de keuze van promotors die tijdens de celkweek geen significante uitschakeling ondergaan voor de expressie van shRNA's, omdat hun robuuste expressie van cruciaal belang is voor het uitschakelen van doelgenen. Ten tweede is het behoud van shRNA-representatie (het aantal cellen dat met elk shRNA wordt getransduceerd) van bijzonder belang. Gedurende het shRNA-scherm vergroot een gemiddelde weergave van >500 cellen per shRNA-construct het potentieel voor het identificeren van de shRNA's die fenotypische effecten veroorzaken.
De RNAi-screeningstrategie is een competitief groeischerm; daarom is het van cruciaal belang om ervoor te zorgen dat de doelcellen zich in de logaritmische groeifase bevinden en niet te veel samenvloeien tijdens het scherm om het verlies van representatie veroorzaakt door beperkte groei te minimaliseren. Het is ideaal om de cellen op 50% -70% samenvloeiing te houden om experimentele variaties te minimaliseren. We raden aan om consistente veel media, sera, virale supernatanten, medicijnen en plastic voor weefselkweek te behouden voor alle schermreplicaties om experimentele variatie te verminderen.
Het is raadzaam om pilootexperimenten uit te voeren om de transductie-efficiëntie van het lentivirus te optimaliseren om het volume virussen te berekenen dat nodig is om één integratie van shRNA per cel te bereiken. Om deze integratie van één shRNA per cel te bereiken, moet de transductie-efficiëntie minder dan 30% zijn. Omdat de hoeveelheid virussen om 30% getransduceerde cellen te verkrijgen kan variëren tussen de cellijnen die voor de experimenten worden gebruikt, is een standaardisatie-experiment voor elke cellijn vereist. Transductie-efficiëntie kan ook worden beïnvloed door celkweekomstandigheden en de snelheid van celproliferatie. Daarom moeten functionele titers in het proefexperiment worden bepaald met behulp van dezelfde omstandigheden die in het screeningsexperiment worden gebruikt. Het handhaven van 3-6 replicaties is altijd raadzaam om statistisch significante hits te krijgen.
De twee belangrijkste zorgen van de shRNA-screeningsbenadering zijn de off-target effecten en de variabele knockdown-efficiëntie van shRNA's16. Deze kunnen worden overwonnen door meerdere shRNA's van elk gen te gebruiken. Het aanpassen van het prokaryote immuunsysteem CRISPR-Cas9 in zoogdiercellen heeft eenvoudige, efficiënte en kosteneffectieve genoombewerking in gekweekte menselijke cellen mogelijk gemaakt. Dit systeem is op grote schaal gebruikt om genoombrede genetische schermen uit te voeren die vergelijkbaar zijn met die met shRNA. Het lot van cellen met een bepaalde single-guide RNA (sgRNA) sequentie kan worden gevolgd met behulp van diepe sequencing. De hier geschetste experimentele opzet kan ook worden gebruikt voor CRISPR-screening.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten en niets te onthullen.
Acknowledgments
Deze studie wordt gedeeltelijk gefinancierd door een subsidie van het Department of Biotechnology BT / PR8742 / AGR / 36/773/2013 aan SRV; en Department of Biotechnology India BT/COE/34/SP13432/2015 en Department of Science and Technology, India: EMR/2017/003880 to P.B. RVS en P.B. worden ondersteund door respectievelijk Wellcome DBT India Alliance IA/S/17/1/503118 en IA/S/15/1/501842. S.D. wordt ondersteund door de CSIR-UGC fellowship, en S.I. wordt ondersteund door een ICMR senior research fellowship. We bedanken Abhirup Bagchi, Sandya Rani en het personeel van de CSCR Flow Cytometry Core Facility voor hun hulp. We bedanken ook MedGenome Inc. voor het helpen met de high-throughput sequencing en data-analyse.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 100 bp Ladder Hyper Ladder | BIOLINE | BIO-33025 | |
| 1kb Ladder Hyper Ladder | BIOLINE | BIO-33056 | |
| Agarose | Lonza Seachekm | 50004 | |
| Betaine (5mM) | Sigma | B03001VL | |
| Boric Acid | Qualigens | 12005 | |
| Cell culture plasticware | Corning | as appicable | |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside hydrochloride | Sigma | C1768-500MG | |
| DMEM | MP BIO | 91233354 | |
| DMSO | Wak Chemie GMBH | Cryosure DMSO 10ml | |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| Ethidium Bromide | Sigma | E1510-10 mL | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | |
| Gel/PCR Purification Kit | MACHEREY-NAGEL | REF 740609.50 | |
| Gibco- RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 23400021 | |
| Glacial Acetic Acid | Thermo | Q11007 | |
| hCMV GFP Plasmid | Transomics | TransOmics Promoter selection KIT | |
| hEF1a GFPlasmid | Transomics | TransOmics Promoter selection KIT | |
| HEK 293T | ATCC | CRL-11268 | |
| HL60 cell line | ATCC | CCL-240 | |
| KOD Hot Start Polymerase | Merck | 71086 | |
| Molm13 cell line | Ellen Weisberg Lab, Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA | Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA | |
| MV4-11 cell line | ATCC | CRL-9591 | |
| Penicillin streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| psPAX2 and pMD2.G | Addgene | Addgene plasmid no.12260 & Addgene plasmid no. 12259 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | REF Q32854 | |
| SFFV GFP Plasmid | Transomics | TransOmics Promoter selection KIT | |
| shERWOOD-UltrmiR shRNA Library from Transomics | Transomics | Cat No. TLH UD7409; Lot No: A116.V 132.14 | |
| Trans-IT-LTI Mirus | Mirus | Mirus Catalog Number: MIR2300 | |
| Tris | MP Biomedicals | 0219485591 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154-100ML | |
| Ultra centrifuge Tubes | Beckman Coulter | 103319 | |
| Equipments | |||
| 5% CO2 incubator | Thermo Fisher | ||
| BD Aria III cell sorter | Becton Dickinson | ||
| Beckman Coulter Optima L-100K- Ultracentrifugation | Beckman coulter | ||
| Centrifuge | Thermo Multiguge 3SR+ | ||
| ChemiDoc Imaging system (Fluro Chem M system) | Fluro Chem | ||
| Leica AF600 | Leica | ||
| Light Microscope | Zeiss Axiovert 40c | ||
| Nanodrop | Thermo Scientific | ||
| Qubit 3.0 Fluorometer | Invitrogen | ||
| Thermal Cycler | BioRad |
References
- Döhner, H., Weisdorf, D. J., Bloomfield, C. D.
- De Kouchkovsky, I., Abdul-Hay, M. Acute myeloid leukemia: A comprehensive review and 2016 update. Blood Cancer Journal. 6 (7), 441 (2016).
- Zuber, J., et al. RNAi screen identifies Brd4 as a therapeutic target in acute myeloid leukaemia. Nature. 478 (7370), 524-528 (2011).
- Shi, J., et al. The Polycomb complex PRC2 supports aberrant self-renewal in a mouse model of MLL-AF9;NrasG12D acute myeloid leukemia. Oncogene. 32 (7), 930-938 (2013).
- Chen, C. -W., et al. DOT1L inhibits SIRT1-mediated epigenetic silencing to maintain leukemic gene expression in MLL-rearranged leukemia. Nature Medicine. 21 (4), 335-343 (2015).
- Li, F., et al. In vivo epigenetic CRISPR screen identifies Asf1a as an immunotherapeutic target in Kras-mutant lung adenocarcinoma. Cancer Discovery. 10 (2), 270-287 (2020).
- Balch, C., Huang, T. H. -M., Brown, R., Nephew, K. P. The epigenetics of ovarian cancer drug resistance and resensitization. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 191 (5), 1552-1572 (2004).
- Carnero, A. High throughput screening in drug discovery. Clinical and Translational Oncology. 8 (7), 482-490 (2006).
- Lal-Nag, M., et al. A high-throughput screening model of the tumor microenvironment for ovarian cancer cell growth. SLAS Discovery: Advancing Life Sciences R & D. 22 (5), 494-506 (2017).
- O'Neil, N. J., Bailey, M. L., Hieter, P.
- Hoffman, G. R., et al. Functional epigenetics approach identifies BRM/SMARCA2 as a critical synthetic lethal target in BRG1-deficient cancers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (8), 3128-3133 (2014).
- Fellmann, C., et al. An optimized microRNA backbone for effective single-copy RNAi. Cell Reports. 5 (6), 1704-1713 (2013).
- Knott, S. R. V., et al. A computational algorithm to predict shRNA potency. Molecular Cell. 56 (6), 796-807 (2014).
- Papaemmanuil, E., et al. Genomic classification and prognosis in acute myeloid leukemia. New England Journal of Medicine. 374 (23), 2209-2221 (2016).
- Vidal, S. J., Rodriguez-Bravo, V., Galsky, M., Cordon-Cardo, C., Domingo-Domenech, J. Targeting cancer stem cells to suppress acquired chemotherapy resistance. Oncogene. 33 (36), 4451-4463 (2014).
- Evers, B., et al. CRISPR knockout screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).
