Summary
Bir lentiviral shRNA havuzu kullanılarak yüksek verimli RNA girişimi (RNAi) taraması, malignitelerde terapötik olarak ilgili sentetik ölümcül hedefleri tespit etmek için bir araç olabilir. Akut miyeloid lösemide (AML) epigenetik efektörleri araştırmak için havuzlanmış bir shRNA tarama yaklaşımı sunuyoruz.
Abstract
Kazanılmış kemo-direncin klinik olarak ilgili itici mekanizmalarını anlamak, akut miyeloid lösemili (AML) hastalarda direnci atlatmanın ve sağkalımı iyileştirmenin yollarını aydınlatmak için çok önemlidir. Kemoterapiden kurtulan lösemik hücrelerin küçük bir kısmı, kemoterapötik hakareti tolere etmek için hazır bir epigenetik duruma sahiptir. Kemoterapiye daha fazla maruz kalmak, bu ilaç persister hücrelerin sabit bir epigenetik duruma ulaşmasını sağlar, bu da değişmiş gen ekspresyonuna yol açar, bu da ilaca dirençli popülasyonların çoğalmasına ve sonunda nüks veya refrakter hastalığa neden olur. Bu nedenle, ilaca dirençli lösemik hücrelerin sağkalımını gerektiren epigenetik modülasyonların belirlenmesi kritik öneme sahiptir. Kazanılmış bir sitarabin-dirençli AML hücre hattında havuzlanmış shRNA kütüphanesi taramasını kullanarak nükleozid analog sitarabin'e (AraC) dirence aracılık eden epigenetik modülatörleri tanımlamak için bir protokol detaylandırıyoruz. Kütüphane, yüksek verimli epigenetik faktör taramasına izin veren 407 insan epigenetik faktörünü hedefleyen 5.485 shRNA yapısından oluşmaktadır.
Introduction
Akut miyeloid lösemide (AML) terapötik seçenekler neredeyse son elli yıldır değişmeden kalmıştır ve sitarabin (AraC) ve antrasiklinler hastalığın tedavisinde temel taşı olarak kullanılmıştır. AML tedavisinin başarısındaki zorluklardan biri, lösemik kök hücrelerin kemoterapiye direncidir ve bu da hastalığın nüksetmesine yol açar 1,2. Epigenetik regülasyon kanser patogenezinde ve ilaç direncinde hayati bir rol oynamaktadır ve umut verici terapötik hedefler olarak çeşitli epigenetik faktörler ortaya çıkmıştır 3,4,5. Epigenetik düzenleyici mekanizmalar, kemoterapötik ilaçlara sürekli maruz kalma durumunda proliferasyonu ve sağkalımı etkilemektedir. Hematolojik olmayan malignitelerde yapılan çalışmalar, ilaç etkisinin üstesinden gelen hücrelerin küçük bir kısmının çeşitli epigenetik modifikasyonlara uğradığını ve bu hücrelerin hayatta kalmasına neden olduğunu bildirmiştir 6,7. Bununla birlikte, epigenetik faktörlerin AML'de sitarabina karşı edinilmiş dirence aracılık etmedeki rolü araştırılmamıştır.
Yüksek verimli tarama, zamanla küresel önem kazanmış ve hücresel mekanizmalarda, yol profillemede ve moleküler düzeydepotansiyel hedefleri tanımlamak için farklı yönlerden standart bir yöntem haline gelen ilaç keşfine bir yaklaşımdır 8,9. Sentetik öldürücülük kavramı, her iki genin de tek başına pertürbasyonunun canlı olduğu, ancak her iki genin aynı anda canlılık kaybına neden olduğu iki gen arasındaki etkileşimi içerir10. Kanser tedavisinde sentetik öldürücülüğün kullanılması, sağlam sentetik öldürücü genetik etkileşimlerin tanımlanmasına ve mekanik olarak karakterize edilmesine yardımcı olabilir11. AML'de edinilmiş sitarabin direncinden sorumlu epigenetik faktörleri tanımlamak için sentetik öldürücülüğe sahip yüksek verimli shRNA taramasının kombinatoryal bir yaklaşımını benimsedik.
Karışık soy lösemi geninin (MLL veya KMT2A) kromozomal translokasyonu ile yönlendirilen akut lösemilerin, hastalarda kötü sağkalım ile ilişkili olduğu bilinmektedir. MLL gen yeniden düzenlemelerinin ortaya çıkan kimerik ürünleri, yani MLL füzyon proteinleri (MLL-FP'ler), hematopoetik kök / progenitör hücreleri (HSPC'ler) çoklu epigenetik faktörlerin katılımıyla lösemik patlamalara dönüştürebilir. Bu epigenetik düzenleyiciler, lösemi programının sürdürülmesini belirleyen karmaşık bir ağ oluşturur ve bu nedenle potansiyel terapötik hedefler oluşturabilir. Bu bağlamda, MV4-11 AraC R olarak adlandırılan edinilmiş sitarabin dirençli hücre hattını geliştirmek için MV4-11 hücre hattını (FLT3-ITD mutasyonu ile MLL füzyon geni MLL-AF4'ü barındıran; MV4-11 P olarak adlandırılır) kullandık. Hücre hattı, ilaç tatili olarak bilinen ilaç tedavisinden aralıklı iyileşme ile artan dozlarda sitarabin'e maruz kaldı. Yarı-maksimal inhibitör konsantrasyon (IC50) in vitro sitotoksisite testi ile değerlendirildi.
Bir pZIP lentiviral omurgaya sahip hEF1a promotörü tarafından yönlendirilen havuzlanmış epigenetik shRNA Kütüphanesini (bkz. Bu kütüphane, 407 epigenetik faktörü hedefleyen shRNA'lardan oluşur. Her faktörde 5-24 shRNA bulunur ve beş hedeflemeyen kontrol shRNA'sı da dahil olmak üzere toplam 5.485 shRNA bulunur. Modifiye edilmiş "UltrmiR" miR-30 iskelesi, verimli primer shRNA biyogenezi ve ekspresyonu12,13 için optimize edilmiştir.
Bu deneyin ana hatları Şekil 1A'da gösterilmiştir. Mevcut protokol, bir süspansiyon hücre hattı olan MV4-11 AraC R hücre hattındaki epigenetik faktör shRNA kütüphanesini kullanarak RNAi taramasına odaklanmaktadır (Şekil 1B). Bu protokol, kişinin seçtiği herhangi bir ilaca dirençli hücre hattındaki hedeflenen herhangi bir kütüphaneyi taramak için kullanılabilir. Transdüksiyon protokolünün yapışkan hücreler için farklı olacağına dikkat edilmelidir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Kurumsal Biyogüvenlik Komitesi (IBSC) yönergelerini takip edin ve lentivirüsü (BSL-2) işlemek için uygun tesisi kullanın. Personel, lentivirüsün kullanımı ve bertarafı konusunda uygun şekilde eğitilmelidir. Bu protokol, Vellore'deki Christian Medical College'ın biyogüvenlik yönergelerini takip etmektedir.
1. ShRNA'ların kalıcı ve uzun süreli ekspresyonunu elde etmek için en güçlü promotörün seçimi
NOT: Deney için seçilen hücre hattında shRNA'ların kararlı ve uzun süreli ekspresyonunu sağlayan promotörü tanımlamak için floresan proteinlerini eksprese eden farklı promotörlere sahip lentiviral vektörler kullanarak bir transdüksiyon deneyi yapmak önemlidir. Bu amaçla en sık kullanılan promotörler, yeşil floresan proteini (GFP) eksprese eden hEF1α (insan uzama faktörü 1α), hCMV (insan sitomegalovirüsü) ve SSFV (dalak odak oluşturan virüs) promotörleridir (Şekil 2A).
- Tripan mavisi dışlama yöntemini kullanarak hücre sayımını gerçekleştirin. MV4-11 AraC R hücrelerini, 8 μg / mL polibren içeren% 10 RPMI ortamında (100 U / mL penisilin ve 100 U / mL streptomisin ile desteklenmiş% 10 FBS ile% 10 FBS ile RPMI) askıya alın. Tohum 1 x 106 hücre 1.5 mL orta/kuyucuk içinde altı delikli bir plaka halinde üçlü olarak.
- Her bir oyuğa farklı hacimlerde konsantre lentivirüsler (örneğin, lentivirüslerin titresine bağlı olarak 10 μL, 20 μL ve 40 μL) ekleyin. İçeriği karıştırmak için plakayı yavaşça döndürün.
- 90 dakika boyunca 37 °C'de 920 x g'de santrifüjleme ile serpinti gerçekleştirin.
- Plakaları derhal bir CO 2 inkübatöründe inkübe edin (37 ° C'de% 5 CO2).
- Başarılı bir transdüksiyon sağlamak için GFP ekspresyonunu 48 saat sonra bir floresan mikroskobu altında gözlemleyin.
- Transdüksiyon verimliliğini değerlendirmek için 72 saat sonra akış sitometrisi ile GFP ekspresyonunu ölçün.
- Hücreleri toplam 2 hafta boyunca kültürleyin ve GFP ekspresyonunu periyodik olarak akış sitometrisi ile izleyin. Ortalama floresan yoğunluğu ve GFP + hücrelerinin yüzdesi ile ölçülen GFP ekspresyonundaki azalma, promotör susturulmasını gösterir.
- GFP + hücrelerini 10. günde sıralayın ve sıralamadan sonra hücreleri 1 hafta boyunca kültürleyin. GFP ekspresyonunu kültür sırasında periyodik olarak kontrol edin.
- Kapıyı ayarlamak için dönüştürülmemiş hücreleri kullanın. X ekseninde sağa doğru 1 x 101 ölçeğinin ötesinde bir popülasyon, GFP için pozitif bir popülasyon olarak kabul edilir.
- Hücrelerin uzun süreli kültüründe GFP'nin kalıcı bir ekspresyonunu gösteren promotörü seçin.
2. Havuzlanmış lentiviral insan epigenetik faktör shRNA kütüphanesinin hazırlanması
- Her plakada 8 mL% 10 DMEM ortamı (100 U / ml penisilin ve 100 U / ml streptomisin içeren% 10 FBS içeren DMEM) içeren üç adet 10 cm hücre kültürü kabında kültür 293T hücreleri (iyi bir proliferasyon hızına sahip düşük bir geçiş sayısında).
- Hücreler% 60 akıcılığa ulaştığında, ortamı tam bir ortamla değiştirin.
- Serumsuz ortam, lentiviral ambalaj (psPAX2) ve zarf plazmidi (pMD2.G), havuzlanmış kütüphane plazmidleri ve son olarak transfeksiyon reaktifi içeren transfeksiyon karışımını ( Tablo 1'de belirtildiği gibi) hazırlayın.
- İyice karıştırmak için karışıma dokunun ve oda sıcaklığında 15 dakika kuluçkaya yatırın.
- Transfeksiyon karışımını 293T hücrelerine ekleyin ve plakaları döndürerek yavaşça karıştırın. Plakaları bir CO 2 inkübatöründe inkübe edin (37 ° C'de% 5 CO2). Ortamı 24 saat sonra değiştirin.
- 48 saat sonra, 293T hücrelerinde yüksek transfeksiyon verimliliği sağlamak için bir floresan mikroskobu altında GFP ekspresyonunu kontrol edin.
- Virüs süpernatantlarını 48 saat, 60 saat ve 72 saat sonra toplayın ve 4 ° C'de saklayın. Virüsü topladıktan sonra her zaman noktasına taze ortam (8 mL) ekleyin.
- Virüs süpernatantlarını bir havuza alın. Havuzlanan virüslerin toplam hacmi şöyle olacaktır: ~8 mL/plaka x 3 koleksiyon= ~24 mL/plaka; ~24 mL/plaka x 3 plaka = 3 plakadan ~72 mL.
- Havuza alınmış virüsleri 0,4 μm filtreyle filtreleyin.
- Yüksek bir virüs titresi elde etmek için, havuzlanmış virüsleri ultrasantrifüjleme ile konsantre edin. Filtrelenmiş virüs süpernatanı iki adet 70 Ti tüpe (32 mL/tüp) aktarın ve yavaş hızlanma ve yavaşlama ile 2 saat boyunca 18.000x g'de santrifüj yapın. 4 °C'ye kadar önceden soğutulmuş bir rotor ve santrifüj kullanın.
- Tüpleri santrifüjden yavaşça çıkarın ve süpernatantı tamamen çıkarın.
- Bir mikropipet kullanarak, peleti 400 μL DMEM'de (FBS ve antibiyotik olmadan) nazikçe askıya alın. Buz üzerinde 1 saat boyunca inkübe edin ve peletleri her iki tüpten de karıştırın.
- Virüsleri alikote edin ve -80 ° C'de dondurun.
NOT: Tüpler ve virüsler 2.10.-2.13 adımları sırasında buz üzerinde tutulmalıdır. Virüsü düz ortamla askıya alırken köpürmekten kaçının. Ortam 4 °C'de tutulmalıdır. - Virüsün konsantrasyonunu (x) aşağıdaki gibi hesaplayın:
Konsantrasyon öncesi toplam hacim = 72 mL (72.000 μL)
Konsantre olduktan sonraki hacim = 400 μL
Konsantrasyon = 72.000/400= 180x
3. Lentivirüslerin transdüksiyon etkinliğinin tahmini
- Lentivirüslerin başarılı bir şekilde hazırlandığını doğrulamak için konsantre virüs ile 293T hücrelerini farklı hacimlerde (2 μL, 4 μL, 8 μL) dönüştürün.
NOT: Konsantre virüsler küçük hacimlerde (1-2 μL) yüksek iletim verimliliği (>%50) gösteriyorsa, konsantre virüsün istenen miktarlarda (100x ila 75x) seyreltilmesi önerilir. - MV4-11 AraC R hücre hattında titrasyon deneyleri gerçekleştirmek için konsantre virüsü DMEM ile (FBS ve antibiyotikler olmadan) 100 kata kadar seyreltin.
- Tohum 1 x 106 hücre (MV4-11 AraC R hücre hattı, 8 μg / mL polibren içeren 1.5 mL% 10 RPMI ortamında) altı kuyucuklu bir plakanın bir kuyucuğunda. Farklı hacimlerde virüslerle dönüştürmek için dört kuyucuk hazırlayın.
- 100x virüslerden oluşan dört farklı birim (örneğin, 1 μL, 1,5 μL, 2 μL ve 2,5 μL) ekleyin.
- 37 °C'de 90 dakika boyunca plakanın 920 x g'de santrifüjlenmesiyle serpinti yapın.
- 72 saat sonra, GFP + hücrelerinin yüzdesini akış sitometrisi ile ölçün.
- %30 iletim verimliliği elde etmek için virüslerin hacmini belirleyin. Bu düşük iletim verimliliği, hücre başına tek shRNA entegrasyonu sağlamaktır.
4. İlaca dirençli hücre hattında havuzlanmış epigenetik shRNA kütüphanesinin transdüksiyonu
- Hedef hücre hattı MV4-11 AraC R'yi 0,5 x 106 hücre/mL yoğunlukta tutun. Hücrelerin kültürde üstel büyüme aşamasında olduğundan emin olun.
- Deney için alınacak hücre sayısını, viral integrantların sayısına göre aşağıdaki gibi hesaplayın.
Transdüksiyon için gerekli hücre sayısı = 5.485 (shRNA sayısı) × 500 (katlanır shRNA gösterimi) / 0.25 (MOI) = 10.982.000 ~11 x 106 hücre - 16 mL'lik %10 RPMI ortamında 1,1 x 107 hücreyi yeniden askıya alın.
- Polibrene (8 μg / mL) ekleyin ve iyice karıştırın. Ardından, önceki bölümde hesaplandığı gibi %30 iletim verimliliği elde etmek için gerekli virüs hacmini ekleyin.
- Tüm hücreleri altı kuyucuklu bir plaka üzerinde 1 x 106 hücre / 1.5 mL'lik bir yoğunlukta kuyu başına% 10 RPMI ortamına tohumlayın.
- Plakayı 37 °C'de 920 x g'de 90 dakika santrifüj yapın.
- Plakayı bir CO 2 inkübatöründe gece boyunca inkübe edin (37 ° C'de% 5 CO2 ).
- 24 saat sonra, ortamı değiştirin ve dönüştürülmüş hücreleri bir T-75 şişesine aktarın.
- 48 saat sonra, başarılı bir transdüksiyon sağlamak için GFP'yi bir floresan mikroskobu altında kontrol edin.
- 72 saat sonra, GFP + hücrelerinin yüzdesini akış sitometrisi ile sayın.
5. GFP pozitif hücrelerin zenginleştirilmesi
NOT: Dönüştürülen hücreleri 5-7 gün boyunca 0,5 x 106 hücre/mL yoğunlukta kültürleyerek genişletin. Bu hücreler, bir sonraki adımda belirtildiği gibi, GFP'ye göre sıralanarak seçilen, dönüştürülmüş ve dönüştürülmemiş karışık bir popülasyondur.
- GFP+ dönüştürülmüş hücrelerin, akış sıralama ayarları yüksek saflık ve düşük verim olarak ayarlanmış şekilde akış ayıklamasını gerçekleştirin. Kapıyı ayarlamak için dönüştürülmemiş hücreleri kullanın. 1 x 102'nin ötesinde sağa doğru bir popülasyon pozitif bir popülasyon olarak kabul edilir.
- Sıralanmış hücreleri% 5 RPMI'da toplayın (100 U / mL penisilin ve 100 U / mL streptomisin ile desteklenmiş% 5 FBS ile RPMI).
- Sıralanmış hücreleri% 10 RPMI ortamında kültürleyin.
- 72 saat sonra, %95 > sıralama verimliliği sağlamak için GFP+ hücrelerinin yüzdesinin sıralama sonrası tahminini gerçekleştirin.
NOT: shRNA kütüphanesinin 450x ila ~500xtemsilini elde etmek için sıralamadan sonra ~3-5 x 10 6 GFP pozitif hücre elde ettiğinizden emin olun.
6. İlaç direncine aracılık eden epigenetik faktörleri tanımlamak için bırakma taraması
- ShRNA kütüphanesini kültüre alın, hücreleri 5 güne kadar% 10 RPMI'da dönüştürdü. Kriyoproteksiyon, gerekirse ilaç tedavisinden önce gelecekteki deneyler için dönüştürülmüş hücreleri korur.
- 25 °C'de 5 dakika boyunca 280 x g'de 1 x 107 hücreyi çift halinde santrifüj yapın. Süper natantı atın ve peletleri -80 ° C'de saklayın. Bu örnekler epigenetik shRNA kütüphanesi için temel referans görevi görecektir.
- Kalan dönüştürülmüş hücreleri, her biri kitaplığın 500x temsilini sağlayan bir hücre sayısında tutulan kopyalar (R1 ve R2) olarak kültürleyin.
- Kopyalardan birini ilaçla (10 μM sitarabin) (R2) ve diğerini ilaç tedavisi (R1) olmadan tedavi edin.
- Her 72 saatte bir ilaçla ve ilaçsız şişelerin ortamını değiştirin. 9 günlük kümülatif ilaç maruziyeti için orta değişimi 3x tekrarlayın.
- 9 günlük ilaç tedavisinden sonra, tripan mavisi dışlama yöntemiyle hücrelerin yaşayabilirliğini kontrol edin.
- Kalan hücreleri oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 280 x g'de santrifüj yapın. Steril PBS'deki hücreleri yeniden askıya alın ve hücreleri yıkayın. Oda sıcaklığında 5 dakika boyunca 280 x g'de santrifüj.
- Süpernatantı atın ve DNA ekstraksiyonu için peletleri -80 ° C'de saklayın.
7. Entegre shRNA'ların PCR ile amplifikasyonu
- DNA'yı, dönüştürülmüş bazal hücrelerden (T) (adım 6.2.) ve ilaçla tedavi edilen (R2) ve ilaçla tedavi edilmeyen hücrelerden (R1) çıkarın.
- Bir florometre kullanarak numunenin konsantrasyonunu kontrol edin.
- PCR için gerekli DNA miktarını aşağıdaki gibi hesaplayın:
5,485 (hayır. shRNA'ların) × 500 (shRNA gösterimi) × 1 x 6.6−12 (g/diploid genom) = 15 μg DNA - Örnekleri PCR'nin ilk turuna tabi tutun.
NOT: PCR reaksiyon karışımı, termal döngü koşulları ile birlikte Tablo 2'de gösterilmiştir. Astarların detayları Ek Tablo 1'de verilmiştir. - Tüp başına 850 ng DNA içeren çoklu reaksiyonlar ayarlayın (toplam 43 reaksiyon için).
NOT: PCR'nin ilk turu, shRNA'nın yan bölgelerini yükseltir ve 397 bp'lik bir amplikon boyutu ile sonuçlanır. - PCR ürünlerini bir araya getirin ve standart bir jel / PCR saflaştırma kitinin 3-4 sütununu kullanarak PCR ürünlerini saflaştırın.
NOT: Ayrıntılar Tablo 3'te verilmiştir. - Ürünü her kolondan 50 μL tamponda süzün ve elutları bir araya getirin.
- DNA'yı nicelleştirin ve -20 ° C'de saklayın.
NOT: Reaktifler, termal döngücü koşulları ile Tablo 4'te tablolaştırılmıştır. İkinci tur PCR, tek akışlı bir hücrede NGS'de çoklama için gerekli olan INDEX dizisine sahip primerleri kullanır. Bu nedenle, her örnek farklı bir dizinle etiketlenmelidir. Astar dizileri Ek Tablo 1'de verilmiştir. - Her numune ve negatif kontrol için toplam 50 μL reaksiyon hacminde 500 ng birincil PCR ürünü ile dört reaksiyon ayarlayın.
- % 2 TBE agaroz jeli kullanarak tüm ürünü elektroforez için yükleyin ve 1 kb'lik bir moleküler merdiven kullanarak bant boyutunu onaylayın. Amplikonun boyutu 399 bp'dir.
- PCR ürünlerini jel dokümantasyon sisteminde görselleştirin.
- Belirli bandı tüketin ve bir jel saflaştırma kiti kullanarak saflaştırın.
NOT: Kit ile saflaştırma hesaplamaları Tablo 3'te verilmiştir. - 30 μL elüsyon tamponunun son hacminde elut. Her bir elüentin yaklaşık konsantrasyonu, toplam hacmi 30 μL olan yaklaşık 80-90 ng / μL olacaktır.
8. Yeni nesil sıralama ve veri analizi
- Jel saflaştırılmış ürünü adım 7.13'ten itibaren sıralayın. tükenmiş shRNA'lar için okuma sayısını elde etmek için yeni nesil bir sıralayıcıda (örneğin, Illumina).
- Fastx takım kitini (sürüm 0.7) kullanarak oluşturulan FastQ okumalarının adaptör dizilerini kırpın.
- Filtrelenmiş okumaları, iki uyumsuzluğa izin verme parametresiyle bir Bowtie hizalayıcısı kullanarak referans dizilerine hizalayın. Adaptör kırpmasından sonra okuma uzunluğunun yaklaşık 21 bp olduğundan emin olun.
- Samtools (sürüm 1.9) programını kullanarak dosyaları yükleyin. Flagstat seçeneğini kullanın ve hizalama özetini hesaplayın.
- Kırpılmış fastQ dosyalarını CRISPRCloud2 (CC2) yazılımına (https://crispr.nrihub.org/) referans shRNA dizileriyle birlikte FASTA dosyaları biçiminde yükleyin ve talimatları uygulayarak analizi gerçekleştirin.
- CC2'deki Analizi Başlat bağlantısına tıklayın.
- Ekran türünü Hayatta Kalma ve Bırakma ekranları olarak seçin. Grup sayısını ayarlayın ve her grubun adını yazın.
- Referans kitaplığını FASTA dosya biçiminde yükleyin. Yüklenen veriler işlenir. Sonuçları almak için çıktı URL'sine tıklayın.
NOT: Bu yazılım, sgRNA / shRNA seviyelerindeki farklılıkları ölçmek için değiştirilmiş bir Öğrenci t-testi ile bir beta-binom modeli kullanır, ardından gen seviyesi önemini tahmin etmek için Fisher'ın kombine olasılık testi gelir. Tedavi edilen (zenginleştirilmiş/tükenmiş) ve tedavi edilmemiş örnekler (baz çizgisi) arasındaki epigenetik faktörler için shRNA'ların tahmini log 2 kat değişikliklerini (Log2Fc) "p-değerleri" ve "FDR değerleri" ile hesaplar.
- FDR değerinin Bırakma ekranı için "Negatif" ve Hayatta Kalma ekranı için "Pozitif" olduğundan emin olun.
NOT: CC2, okumaları saymak ve shRNA'ların örnekler arasındaki kıvrım gösterimini (zenginleştirme veya tükenme) hesaplamak için kullanılan bir analiz platformudur. - CC2 sonuçlarından önemli ölçüde zenginleştirilmiş ve tükenmiş shRNA'ları (FDR <0.05) tanımlayın.
NOT: Her faktöre karşı 5-24 shRNA vardır. shRNA'ların her biri için FDR değerlerini kontrol edin; <0.01 olan FDR'yi düşünün ve seçilen shRNA'lar için bir ortalama alın. En iyi 40 isabeti düşünün. Log2Fc veya FDR negatif değerlerine göre seçilen faktörlerin grafiğini çizin. Hedeflemeyen shRNA'ların, kontrol shRNA'ları olarak hizmet ettikleri için verilerin orijinalliğini sağlamak için önemli FDR değerlerine sahip olduklarından emin olun.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Genel tarama iş akışı Şekil 1A'da gösterilmiştir. MV4-11 AraC R'nin (48 h) in vitro sitotoksisitesi, MV4-11 AraC R'deki IC50'nin sitarabine, MV4-11 P'den daha yüksek olduğunu ortaya koydu (Şekil 1B). Bu hücre hattı çalışmada sitarabin direncinden sorumlu epigenetik faktörlerin taranmasında model olarak kullanılmıştır.
Şekil 2A , doğrusallaştırılmış pZIP vektör haritalarını üç farklı promotörle göstermektedir: hEF1α (insan uzama faktörü 1α), hCMV (insan sitomegalovirüsü) ve SSFV (dalak odağı oluşturan virüs), UltramiR dizisi içindeki karıştırılmış shRNA ile. Şekil 2B, kütüphane deneyinde kullanılan pZIP vektör haritasını ve hEF1a promotörü tarafından yönlendirilen seçilebilir belirteç olarak Zsgreen ve puromisin ile epigenetik faktörü hedefleyen shRNA'yı göstermektedir. Bu vektörler en güçlü promotör deneyinin seçiminde kullanılmıştır.
Hedef hücrelerde tutarlı ve uzun süreli bir ekspresyon elde etmek için en güçlü promotörün seçimi Şekil 3'te gösterilmiştir. MFI ile ölçülen GFP'nin miktarı, her üç promotör için de MV4-11 AraC R'de 72 saatin sonunda% 90'dan fazla transdüksiyon verimliliği göstermiştir. GFP ekspresyonu için histogram, hCMV için heterojen bir popülasyonu, ancak transdüksiyonun 3. gününde hEF1a ve SFFV durumunda homojen bir popülasyonu göstermektedir (Şekil 3A). Çubuk grafik, MV4-11 AraC R'de transdüksiyonun 3. gününde üç farklı promotör (hEF1α, hCMV ve SFFV) tarafından yönlendirilen GFP ekspresyonunu göstermektedir (Şekil 3B). SFFV güdümlü GFP, transdüksiyonun 5. gününde MFI'da bir azalma gösterdi (Şekil 3C). hEF1a güdümlü GFP transdüced MV4-11 ebeveyn hattı sonrası sıralamada MFI'da azalma gözlenmedi. Böylece, hEF1a promotörü hücre hattı için uygun bir promotör olarak tanımlanmıştır (Şekil 3D).
Şekil 4A, 48 saatlik transfeksiyondan sonra 293T hücrelerinde havuzlanmış shRNA kütüphanesi plazmidlerinin transfeksiyon verimliliğini göstermektedir. GFP ifadesi parlaktı ve iyi transfeksiyon verimliliğini gösteriyordu. Virüs toplama sonrasında, hazırlanan havuzlanmış virüsün transdüksiyon verimliliği, 293T hücrelerinde üç farklı konsantrasyonda (2 μL, 4 μL ve 8 μL) kontrol edildi. 2 μL virüsünün bile 8 μL virüsünkiyle aynı verimle sonuçlandığını ve böylece yüksek viral titreyi doğruladığını gözlemledik (Şekil 4B).
Şekil 5 , MV4-11 AraC R hücre hattında havuzlanmış kütüphane transdüksiyonunu ve lentiviral titrenin belirlenmesini göstermektedir. Havuzlanmış shRNA kütüphanesi lentivirüsü 100x seyreltildi ve daha sonra MV4-11 AraC R hücre hattına farklı hacimlerde (1 μL, 1.5 μL, 2 μL ve 2.5 μL) eklendi. Verimlilik 72 saatin sonunda kontrol edildi. Transdüksiyon verimliliği, virüsün 2-2.5 μL'si için% 30 idi ve hücre başına bir shRNA entegrasyonunu doğruladı (Şekil 5A). 1.1 x 107 MV4-11 AraC R hücrelerinde 2.5μl havuzlanmış kütüphane virüsü ile transdüksiyon% 30 transdüksiyon verimliliği ile sonuçlandı. GFP-pozitif hücreler, havuzlanmış shRNA kütüphanesini temsil eden sıralandı (Şekil 5B).
MV4-11 AraC R hücre hattında havuzlanmış shRNA epigenetik lentivirüsünün transdüksiyonundan sonra, GFP-pozitif hücreler 5. gün veya 7. günde sıralandı (Şekil 6). Bu sıralanmış hücreler 9 gün boyunca sitarapine uzun süre maruz kaldı. Canlılık 9. günde kontrol edildi ve hücreler DNA için toplandı. (Şekil 6A). Çubuk grafik, sitarabin varlığında transdüke edilen hücrelerin proliferasyon hızındaki azalmayı göstermektedir (Şekil 6B).
Örneklerden çıkarılan DNA, iki tur PCR'ye tabi tutuldu ve son jel salınımlı ürün, NGS tarafından nicelleştirilen zenginleştirilmiş shRNA'ları temsil etti. Şekil 7A, PCR'nin 1. ve 2. turlarında kullanılan astarın bağlanma bölgelerini göstermektedir; burada 1. tur primerler, entegre shRNA'nın yan bölgelerine bağlanır ve 2. ileri astar, döngü dizisine bağlanır. Ters astar, PCR'nin 1. turunda yükseltilmiş vektörün bir bölgesine bağlanır. Şekil 7B ve Şekil 7C, jel salınımlı, saflaştırılmış ve NGS analizi için gönderilen 1. (397 bp) ve 2. tur PCR (399 bp) sonunda PCR ürününün bant boyutunu göstermektedir.
DNA'yı standart bir kalite kontrol prosedürüne tabi tuttuktan sonra, örnekler NGS analizi için işlendi. Havuzlanmış shRNA taramasında zenginleştirilmiş ve tükenmiş shRNA'ları tanımlamak için kullanıcı dostu, bulut tabanlı bir analiz platformu olan CRISPRCloud2'yi kullandık. Şekil 8 , AML'de sitarabin direncine aracılık edebilecek epigenetik faktörleri hedef alan zenginleştirilmiş veya tükenmiş shRNA'ların temsilini göstermektedir.
Şekil 1: Etüdün anahattı ve modeli . (A) İş akışına genel bakışın çizimi. (B) MV4-11 ebeveyn ve AraC'ye dirençli hücreler, artan sitarabin konsantrasyonları (0.1 μM ila 1000 μM) ile tedavi edilir ve MTT testi ile canlılık açısından değerlendirilir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2. Doğrusallaştırılmış vektörlerin çizimi. (A) Üç vektör, UltramiR dizisi içindeki karıştırılmış shRNA ile hEF1α (insan uzama faktörü 1α), hCMV (insan sitomegalovirüsü) ve SSFV (dalak odağı oluşturan virüs) olmak üzere üç farklı promotörle haritalandırılır. (B) hEF1α promotörü ile kütüphane deneyinde kullanılan vektör haritasının ve seçilebilir belirteç olarak Zsgreen ve puromisin ile epigenetik faktörü hedefleyen shRNA'nın gösterilmesi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: shRNA'ların kalıcı ve uzun süreli ekspresyonunu elde etmek için en güçlü promotörün seçimi . (A) hEF1a, hCMV ve SFFV promotörleri için 72 saatin sonunda akış sitometrisi ile ölçülen GFP için temsili akış grafikleri. hCMV heterojen bir tepe noktası gösterirken, hEF1a ve SFFV tek bir homojen tepe noktası gösterir. (B) MV4-11 AraC R hücre hattında promotör verimliliği. (C) SFFV güdümlü GFP, uzun süreli kültürde GFP'nin susturulmasını gösterir. (D) hEF1a güdümlü GFP hücreleri, hücrelerin sıralanmasından sonra sürekli ekspresyon gösterir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Hazırlanan havuzlanmış shRNA lentivirüsünün etkinliğinin kontrol edilmesi . (A) Floresan mikroskopi görüntüleri, 10x büyütme kullanılarak 48 saatin sonunda 293T'de transfekte edilen havuzlanmış shRNA kütüphanesinin transfeksiyon verimliliğini göstermektedir. (B) Havuzlanan virüsün transdüksiyon verimliliği, 10x büyütme kullanılarak değişen virüs hacimlerine (2μL, 4μL ve 8μL) sahip 293T hücrelerinde değerlendirildi. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 5: Hedef hücre hattında havuzlanmış kütüphane transdüksiyonu ve lentiviral titrenin belirlenmesi. (A) MV4-11 AraC R hücre hattı, değişen virüs hacimleriyle (1μL, 1.5μL, 2μL ve 2.5μL) transdüke edildi. Verimlilik, 72 saat sonunda kontrol edildi. (B) Havuzlanmış kütüphane virüsünün 1 x 107 MV4-11 AraC R hücrelerinde transdüksiyonu,% 30 iletim verimliliği elde etmek için, daha sonra GFP-pozitif hücrelerin sıralanması. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: İlaç direncine aracılık eden epigenetik faktörleri tanımlamak için bırakma taraması . (A) Dirençli hücrelerin zenginleştirilmesi için ilaç tedavisinin şematik gösterimi. Kütüphane ile enfekte olmuş hücreler 9 gün boyunca uzun süreli sitarabin maruziyetine maruz bırakıldı, ardından canlılık kontrol edildi ve DNA ekstraksiyonu için hücreleri topladı. (B) Dirençli hücre hatlarında uzun süreli sitarabin maruziyetine canlılığın azaltılması. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 7: Entegre shRNA'yı temsil eden ampliklerin hazırlanması . (A) PCR'nin 1. ve 2. turlarında kullanılan astarın bağlanma bölgeleri, burada 1. yuvarlak primerler entegre shRNA'nın yan bölgelerine bağlanır ve ikinci ileri astar döngü dizisine bağlanır. Tersi, 1. PCR'deki yükseltilmiş vektör bölgesinin bir bölgesine bağlanır. (B) 1. tur PCR'nin (397 bp) sonundaki PCR ürününün bant boyutunun gösterimi. (C) 2. tur PCR ürünü (399bp) jel salınımlı, saflaştırılmış ve NGS için verilmiştir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 8: AML hücre hattında (MV-4-11 Ara-C R hücre hattı) tarama sonuçları. DNA'yı standart bir kalite kontrol prosedürüne tabi tuttuktan sonra, örnekler NGS analizi için işlendi. Havuzlanmış shRNA taramasında zenginleştirilmiş ve tükenmiş shRNA'ları tanımlamak için kullanıcı dostu, bulut tabanlı bir analiz platformu olan CRISPRCloud2'yi kullandık. Şekil, AML'de sitarabin direncine aracılık edebilecek epigenetik faktörleri hedef alan zenginleştirilmiş veya tükenmiş shRNA'ları temsil etmektedir. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Tablo 1: Transfeksiyon Plazmid Karışımının Hazırlanması (10cm plaka için hesaplama) Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Tablo 2: PCR'nin 1. Turu için PCR reaksiyon karışımı Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Tablo 3: 1. PCR ürünlerinin saflaştırılması için hesaplamalar Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Tablo 4: PCR'nin 2. Turu için PCR reaksiyon karışımı Bu tabloyu indirmek için lütfen tıklayınız.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
RNA girişimi (RNAi), siRNA ve shRNA taramasını içeren fonksiyonel genomik çalışmalar için yaygın olarak kullanılmaktadır. ShRNA'nın yararı, plazmid vektörlerine dahil edilebilmeleri ve genomik DNA'ya entegre edilebilmeleri, böylece kararlı ekspresyon ve dolayısıyla hedef mRNA'nın daha uzun süreli nakavtıyla sonuçlanmalarıdır. Havuzlanmış shRNA kütüphanesi taraması, geleneksel dizili ekranlara (siRNA) kıyasla sağlam ve uygun maliyetlidir. Genom çapında bir ekranda belirli bir protein sınıfının özgünlüğünü tanımlamak hantal olabilir. Hedefe yönelik tarama yaklaşımları, kanser hücresi sağkalımı veya azaltılmış gürültü ile spesifik sınıf içindeki ilaç direnci için bireysel proteinlerin gerekliliğini ortaya çıkarabilir. Bu protokol, hem esansiyel hem de esansiyel olmayan genleri sistematik olarak sorgulamak için epigenetik faktörlerin RNAi ekranını vurgulamakta ve bu yaklaşımın AML ilaç direncinden sorumlu hedeflerin belirlenmesine izin veren işlevsel bir platform olarak kullanıldığını göstermektedir.
Bu güçlü teknoloji, deneylerin tasarımında ve yürütülmesinde belirli önlemler alınmasını gerektirir. Birincisi, shRNA'ların ekspresyonu için hücre kültürü sırasında önemli ölçüde susturulmayan promotörlerin seçimidir, çünkü sağlam ekspresyonları hedef genlerin yıkılması için kritik öneme sahiptir. İkincisi, shRNA gösteriminin sürdürülmesi (her shRNA ile dönüştürülen hücre sayısı) özel bir öneme sahiptir. ShRNA ekranı boyunca, shRNA yapısı başına ortalama >500 hücrenin bir temsili, fenotipik etkilere neden olan shRNA'ları tanımlama potansiyelini arttırır.
RNAi tarama stratejisi rekabetçi bir büyüme ekranıdır; bu nedenle, sınırlı büyümenin neden olduğu temsil kaybını en aza indirmek için hedef hücrelerin logaritmik büyüme aşamasında olduğundan ve ekran sırasında aşırı akıcı olmadığından emin olmak çok önemlidir. Deneysel varyasyonları en aza indirmek için hücreleri% 50 -% 70 birleşimde tutmak idealdir. Deneysel varyasyonları azaltmak için tüm ekran replikasyonları için tutarlı sayıda ortam, serum, viral süpernatant, ilaç ve doku kültürü plastik eşyası bulundurmanızı öneririz.
Hücre başına bir shRNA entegrasyonu elde etmek için gereken virüs hacmini hesaplamak üzere lentivirüsün transdüksiyon verimliliğini optimize etmek için pilot deneyler yapılması önerilir. Hücre başına bir shRNA'nın bu entegrasyonunu sağlamak için, iletim verimliliği% 30'dan az olmalıdır. Virüslerin %30 oranında dönüştürülmüş hücreler elde etme miktarı, deneyler için kullanılan hücre hatları arasında değişebileceğinden, her hücre hattı için bir standardizasyon deneyi gereklidir. Transdüksiyon verimlilikleri, hücre kültürü koşullarından ve hücre çoğalma hızından da etkilenebilir. Bu nedenle, fonksiyonel titreler, tarama deneyinde kullanılan aynı koşullar kullanılarak pilot deneyde belirlenmelidir. İstatistiksel olarak anlamlı isabetler elde etmek için her zaman 3-6 kopyanın korunması önerilir.
shRNA tarama yaklaşımının iki ana endişesi, shRNA'ların hedef dışı etkileri ve değişken nakavt verimlilikleridir16. Bunlar, her genin çoklu shRNA'ları kullanılarak aşılabilir. Prokaryotik bağışıklık sistemi CRISPR-Cas9'un memeli hücrelerinde uyarlanması, kültürlenmiş insan hücrelerinde kolay, verimli ve uygun maliyetli genom düzenlemesine izin vermiştir. Bu sistem, shRNA kullanılarak yapılanlara benzer genom çapında genetik taramalar gerçekleştirmek için kapsamlı bir şekilde kullanılmıştır. Belirli bir tek kılavuzlu RNA (sgRNA) dizisini barındıran hücrelerin kaderi, derin dizileme kullanılarak izlenebilir. Burada özetlenen deney düzeneği, CRISPR taraması için de kullanılabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların çıkar çatışması ve açıklayacak hiçbir şeyleri yoktur.
Acknowledgments
Bu çalışma kısmen SRV'ye BT / PR8742 / AGR / 36/773/2013 hibe Biyoteknoloji Bölümü tarafından finanse edilmektedir; ve Biyoteknoloji Bölümü Hindistan BT / COE / 34 / SP13432 / 2015 ve Bilim ve Teknoloji Bölümü, Hindistan: EMR / 2017 / 003880 ila P.B. RVS ve P.B. sırasıyla Wellcome DBT Hindistan İttifakı IA / S / 17/1 / 503118 ve IA / S / 15 / 1 / 501842 tarafından desteklenmektedir. S.D. CSIR-UGC bursu tarafından desteklenmektedir ve S.I. ICMR kıdemli araştırma bursu tarafından desteklenmektedir. Abhirup Bagchi, Sandya Rani ve CSCR Flow Cytometry Core Facility personeline yardımları için teşekkür ederiz. MedGenome Inc.'e de yüksek verimli dizileme ve veri analizine yardımcı olduğu için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Reagents | |||
| 100 bp Ladder Hyper Ladder | BIOLINE | BIO-33025 | |
| 1kb Ladder Hyper Ladder | BIOLINE | BIO-33056 | |
| Agarose | Lonza Seachekm | 50004 | |
| Betaine (5mM) | Sigma | B03001VL | |
| Boric Acid | Qualigens | 12005 | |
| Cell culture plasticware | Corning | as appicable | |
| Cytosine β-D-arabinofuranoside hydrochloride | Sigma | C1768-500MG | |
| DMEM | MP BIO | 91233354 | |
| DMSO | Wak Chemie GMBH | Cryosure DMSO 10ml | |
| EDTA | Sigma | E5134 | |
| Ethidium Bromide | Sigma | E1510-10 mL | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher Scientific | 16000044 | |
| Gel/PCR Purification Kit | MACHEREY-NAGEL | REF 740609.50 | |
| Gibco- RPMI 1640 | Thermo Fisher Scientific | 23400021 | |
| Glacial Acetic Acid | Thermo | Q11007 | |
| hCMV GFP Plasmid | Transomics | TransOmics Promoter selection KIT | |
| hEF1a GFPlasmid | Transomics | TransOmics Promoter selection KIT | |
| HEK 293T | ATCC | CRL-11268 | |
| HL60 cell line | ATCC | CCL-240 | |
| KOD Hot Start Polymerase | Merck | 71086 | |
| Molm13 cell line | Ellen Weisberg Lab, Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA | Dana Farber Cancer Institute, Boston, MA, USA | |
| MV4-11 cell line | ATCC | CRL-9591 | |
| Penicillin streptomycin | Thermo Fisher Scientific | 15140122 | |
| psPAX2 and pMD2.G | Addgene | Addgene plasmid no.12260 & Addgene plasmid no. 12259 | |
| Qubit dsDNA HS Assay Kit | Invitrogen | REF Q32854 | |
| SFFV GFP Plasmid | Transomics | TransOmics Promoter selection KIT | |
| shERWOOD-UltrmiR shRNA Library from Transomics | Transomics | Cat No. TLH UD7409; Lot No: A116.V 132.14 | |
| Trans-IT-LTI Mirus | Mirus | Mirus Catalog Number: MIR2300 | |
| Tris | MP Biomedicals | 0219485591 | |
| Trypan Blue | Sigma-Aldrich | T8154-100ML | |
| Ultra centrifuge Tubes | Beckman Coulter | 103319 | |
| Equipments | |||
| 5% CO2 incubator | Thermo Fisher | ||
| BD Aria III cell sorter | Becton Dickinson | ||
| Beckman Coulter Optima L-100K- Ultracentrifugation | Beckman coulter | ||
| Centrifuge | Thermo Multiguge 3SR+ | ||
| ChemiDoc Imaging system (Fluro Chem M system) | Fluro Chem | ||
| Leica AF600 | Leica | ||
| Light Microscope | Zeiss Axiovert 40c | ||
| Nanodrop | Thermo Scientific | ||
| Qubit 3.0 Fluorometer | Invitrogen | ||
| Thermal Cycler | BioRad |
References
- Döhner, H., Weisdorf, D. J., Bloomfield, C. D.
- De Kouchkovsky, I., Abdul-Hay, M. Acute myeloid leukemia: A comprehensive review and 2016 update. Blood Cancer Journal. 6 (7), 441 (2016).
- Zuber, J., et al. RNAi screen identifies Brd4 as a therapeutic target in acute myeloid leukaemia. Nature. 478 (7370), 524-528 (2011).
- Shi, J., et al. The Polycomb complex PRC2 supports aberrant self-renewal in a mouse model of MLL-AF9;NrasG12D acute myeloid leukemia. Oncogene. 32 (7), 930-938 (2013).
- Chen, C. -W., et al. DOT1L inhibits SIRT1-mediated epigenetic silencing to maintain leukemic gene expression in MLL-rearranged leukemia. Nature Medicine. 21 (4), 335-343 (2015).
- Li, F., et al. In vivo epigenetic CRISPR screen identifies Asf1a as an immunotherapeutic target in Kras-mutant lung adenocarcinoma. Cancer Discovery. 10 (2), 270-287 (2020).
- Balch, C., Huang, T. H. -M., Brown, R., Nephew, K. P. The epigenetics of ovarian cancer drug resistance and resensitization. American Journal of Obstetrics and Gynecology. 191 (5), 1552-1572 (2004).
- Carnero, A. High throughput screening in drug discovery. Clinical and Translational Oncology. 8 (7), 482-490 (2006).
- Lal-Nag, M., et al. A high-throughput screening model of the tumor microenvironment for ovarian cancer cell growth. SLAS Discovery: Advancing Life Sciences R & D. 22 (5), 494-506 (2017).
- O'Neil, N. J., Bailey, M. L., Hieter, P.
- Hoffman, G. R., et al. Functional epigenetics approach identifies BRM/SMARCA2 as a critical synthetic lethal target in BRG1-deficient cancers. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 111 (8), 3128-3133 (2014).
- Fellmann, C., et al. An optimized microRNA backbone for effective single-copy RNAi. Cell Reports. 5 (6), 1704-1713 (2013).
- Knott, S. R. V., et al. A computational algorithm to predict shRNA potency. Molecular Cell. 56 (6), 796-807 (2014).
- Papaemmanuil, E., et al. Genomic classification and prognosis in acute myeloid leukemia. New England Journal of Medicine. 374 (23), 2209-2221 (2016).
- Vidal, S. J., Rodriguez-Bravo, V., Galsky, M., Cordon-Cardo, C., Domingo-Domenech, J. Targeting cancer stem cells to suppress acquired chemotherapy resistance. Oncogene. 33 (36), 4451-4463 (2014).
- Evers, B., et al. CRISPR knockout screening outperforms shRNA and CRISPRi in identifying essential genes. Nature Biotechnology. 34 (6), 631-633 (2016).
