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Biology

कवक जनसंख्या संरचना की जांच करने के लिए मिट्टी से कृषि योग्य खमीर और मोल्ड्स का अलगाव

Published: May 27, 2022 doi: 10.3791/63396
Automatic Translation
1, 1, 1
1Department of Biology, McMaster University

Summary

यह प्रोटोकॉल खमीर और मोल्ड एस्परगिलस फ्यूमिगेटस को 7 दिनों में मिट्टी के नमूनों के बड़े सेट से संवर्धन करने का एक प्रभावी, त्वरित तरीका है। प्रयोगों के लिए आवश्यक इनक्यूबेशन मीडिया और तापमान की एक श्रृंखला को समायोजित करने के लिए विधियों को आसानी से संशोधित किया जा सकता है।

Abstract

मिट्टी माइक्रोबियल जीवन की एक अविश्वसनीय मात्रा की मेजबानी करती है, जिसमें प्रत्येक ग्राम में अरबों जीवाणु, पुरातन और कवक कोशिकाएं होती हैं। बहुकोशिकीय कवक जैसे मोल्ड और एककोशिकीय कवक, मोटे तौर पर खमीर के रूप में परिभाषित, मिट्टी के पारिस्थितिक तंत्र में कार्बनिक पदार्थों के डीकंपोजर के रूप में और अन्य मिट्टी निवासियों के लिए खाद्य स्रोतों के रूप में आवश्यक भूमिकाओं को पूरा करते हैं। मिट्टी में कवक प्रजातियों की विविधता वर्षा और तापमान जैसे जलवायु कारकों की एक भीड़ पर निर्भर करती है, साथ ही कार्बनिक पदार्थ, पीएच और नमी सहित मिट्टी के गुण भी। पर्याप्त पर्यावरणीय नमूने की कमी, विशेष रूप से एशिया, अफ्रीका, दक्षिण अमेरिका और मध्य अमेरिका के क्षेत्रों में, मिट्टी के कवक समुदायों के लक्षण वर्णन और उपन्यास प्रजातियों की खोज में बाधा डालती है।

हमने ~ 4,000 मिट्टी के नमूनों और खमीर और मोल्डों के अलगाव के लिए प्रयोगशाला में विकसित एक प्रोटोकॉल का उपयोग करके छह महाद्वीपों में नौ देशों में मिट्टी कवक समुदायों की विशेषता बताई। यह प्रोटोकॉल खमीर और चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक मोल्ड एस्परगिलस फ्यूमिगेटस के लिए अलग-अलग चयनात्मक संवर्धन के साथ शुरू होता है, तरल मीडिया में, जबकि जीवाणु विकास को रोकता है। परिणामस्वरूप कॉलोनियों को तब ठोस मीडिया में स्थानांतरित कर दिया जाता है और शुद्ध संस्कृतियों को प्राप्त करने के लिए आगे संसाधित किया जाता है, इसके बाद डाउनस्ट्रीम आनुवंशिक लक्षण वर्णन होता है। खमीर प्रजातियों की पहचान परमाणु राइबोसोमल आरएनए जीन क्लस्टर के अपने आंतरिक ट्रांसक्रिप्टेड स्पेसर (आईटीएस) क्षेत्र के अनुक्रमण के माध्यम से स्थापित की जाती है, जबकि ए फ्यूमिगेटस की वैश्विक जनसंख्या संरचना माइक्रोसैटेलाइट मार्कर विश्लेषण के माध्यम से खोजी जाती है।

प्रोटोकॉल को कैमरून, कनाडा, चीन, कोस्टा रिका, आइसलैंड, पेरू, न्यूजीलैंड और सऊदी अरब में मिट्टी खमीर और ए फ्यूमिगेटस आबादी को अलग करने और चिह्नित करने के लिए सफलतापूर्वक लागू किया गया था। इन निष्कर्षों से मिट्टी खमीर विविधता में वैश्विक पैटर्न के साथ-साथ वैश्विक जनसंख्या संरचना और ए फ्यूमिगेटस के एंटिफंगल प्रतिरोध प्रोफाइल पर बहुत आवश्यक अंतर्दृष्टि का पता चला। यह पेपर अंतरराष्ट्रीय मिट्टी के नमूनों से खमीर और ए फ्यूमिगेटस दोनों को अलग करने की विधि प्रस्तुत करता है।

Introduction

मिट्टी के पारिस्थितिक तंत्र में कवक कार्बनिक पदार्थ अपघटन, पोषक तत्व साइकिल चालन और मिट्टी के निषेचन में आवश्यक भूमिका निभाते हैं1. दोनों संस्कृति-स्वतंत्र (यानी, उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण) और संस्कृति-निर्भर दृष्टिकोण व्यापक रूप से मिट्टी कवक 2,3 के अध्ययन में उपयोग किए जाते हैं। जबकि उच्च-थ्रूपुट मेटाबारकोड अनुक्रमण द्वारा उत्पन्न डेटा की बड़ी मात्रा सामुदायिक संरचना और विविधता में व्यापक पैमाने पर पैटर्न को स्पष्ट करने के लिए उपयोगी है, संस्कृति-निर्भर दृष्टिकोण कवक समुदायों के वर्गीकरण और कार्यात्मक संरचनाओं पर अत्यधिक पूरक जानकारी प्रदान कर सकता है, साथ ही शुद्ध कवक संस्कृतियों की उपलब्धता के कारण डाउनस्ट्रीम विविधता और कार्यात्मक विश्लेषण के माध्यम से व्यक्तिगत जीवों के अधिक विशिष्ट प्रोफाइल भी प्रदान कर सकता है।

मिट्टी के प्रति ग्राम शायद ही कभी हजारों कोशिकाओं से अधिक होने के बावजूद, खमीर, मोटे तौर पर एककोशिकीय कवक के रूप में परिभाषित किया गया है, अन्य मिट्टी निवासियों 4,5 के लिए आवश्यक डीकंपोजर और खाद्य स्रोत हैं। वास्तव में, खमीर महाद्वीपीय अंटार्कटिका 6,7 जैसे ठंडे जीवमंडलों में प्रमुख मिट्टी कवक हो सकता है। मिट्टी चिकित्सकीय रूप से प्रासंगिक खमीर का एक प्राथमिक भंडार भी है जो मनुष्यों और अन्य स्तनधारियों में गंभीर अवसरवादी संक्रमण का कारण बनतीहै 8. रूपात्मक समानता के बावजूद, खमीर प्रजातियां फाइटोलैनेटिक रूप से विविध हैं और कवक साम्राज्य 9 के भीतर दो प्रमुख फाइला, एस्कोमाइकोटा और बेसिडिओमाइकोटा में फिलामेंटस कवक के बीच होतीहैं। खमीर में फंगल बारकोडिंग जीन में एक परिभाषित डीएनए हस्ताक्षर की कमी होती है, परमाणु राइबोसोमल आरएनए जीन क्लस्टर10 के आंतरिक ट्रांसक्रिप्टेड स्पेसर (आईटीएस) क्षेत्र, उन्हें मेटाजेनोमिक्स जांच में अन्य कवक से अप्रभेद्य बनाते हैं और इस प्रकार खमीर प्रजातियों को अलग करने के लिए संस्कृति-निर्भर तरीकों के उपयोग की आवश्यकता होती है।

नीचे दिए गए प्रोटोकॉल को नौ देशों के मिट्टी खमीर समुदायों को चिह्नित करने और मिट्टी खमीर विविधता 9,11,12 में वैश्विक रुझानों और पैटर्न की पहचान करने के लिए लागू किया गया था। खमीर 2,3 जैसे जीवों के लक्षित समूहों का अध्ययन करते समय मेटाजेनोमिक्स दृष्टिकोण सीमित उपयोग के होते हैं। उनकी फाइटोलैनेटिक विविधता के कारण, खमीर को अकेले डीएनए अनुक्रम के आधार पर अन्य कवक से अलग नहीं किया जा सकता है। इस प्रकार, खमीर आबादी का अध्ययन करने के लिए संस्कृति-निर्भर अलगाव के निरंतर उपयोग की आवश्यकता होती है। हालांकि, संवर्धन अक्सर काफी अधिक समय लेने वाला होता है और प्रयोगों को करने के लिए अधिक कर्मियों की आवश्यकता होती है। इसलिए, प्रोटोकॉल को सीमित कर्मियों के साथ तेजी से प्रसंस्करण के लिए अनुकूलित और सुव्यवस्थित किया गया है। संवर्धन का मुख्य लाभ यह है कि पहचानी गई खमीर प्रजातियां जीवित खमीर हैं और मृत नहीं हैं, और इस प्रकार मिट्टी में मौजूद क्षणिक कोशिकाओं के बजाय सच्चे मिट्टी के निवासी होने की अधिक संभावना है। यह अनुमान लगाया गया है कि मिट्टी में लगभग 40% फंगल डीएनए या तो अन्य वातावरण, बाह्य कोशिकीय से दूषित होते हैं, या कोशिकाओं से आते हैं जो अब बरकरार नहीं हैं, जिससे उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण दृष्टिकोण फंगल समृद्धि को 55% 13 तक अधिक अनुमानित करते हैं। संस्कृति पर निर्भर अलगाव आसानी से डाउनस्ट्रीम विश्लेषण में उपयोग किए जाने वाले शुद्ध संस्कृति को सुरक्षित करने के अतिरिक्त लाभ के साथ खमीर प्रजातियों की पहचान की पुष्टि कर सकता है। दरअसल, इस मिट्टी अलगाव प्रोटोकॉल का उपयोग करके 44 नई खमीर प्रजातियों की शुद्ध संस्कृतियों की पहचान की गई थी जिसने विस्तार से अपने वर्गीकरण और कार्यात्मक गुणों का अध्ययन करने के लिए कई तरीकों के उपयोग की अनुमति दीथी।

नीचे दिए गए प्रोटोकॉल का उपयोग मिट्टी के भीतर मौजूद सांचों को अलग करने के लिए भी किया जा सकता है, जैसे कि ए। एस्परगिलस फ्यूमिगेटस मिट्टी15 में एक विस्तृत, वैश्विक वितरण के साथ एक थर्मोफिलिक और सैप्रोफाइटिक मोल्ड है। इसे कई नैदानिक और गैर-नैदानिक वातावरण से अलग किया गया है। गैर-नैदानिक नमूने में आमतौर पर हवा, कार्बनिक मलबे (खाद, देखा धूल, ट्यूलिप बल्ब अपशिष्ट), और मिट्टी (कृषि, उद्यान और प्राकृतिक मिट्टी) 16,17,18,19 शामिल हैं। एस्परगिलस फ्यूमिगेटस एक मानव अवसरवादी रोगज़नक़ है जो सामूहिक रूप से एस्परगिलोसिस नामक संक्रमण की एक श्रृंखला का कारण बनता है, जो दुनिया भर में16,20 में 8 मिलियन से अधिक लोगों को प्रभावित करता है। दुनिया भर में लगभग 300,000 लोग आक्रामक एस्परगिलोसिस से पीड़ित हैं, जो एस्परगिलोसिस16 का सबसे गंभीर रूप है। रोगी आबादी, संक्रमण की साइट और एंटिफंगल थेरेपी की प्रभावकारिता जैसे कारकों के आधार पर, मृत्यु दर 90% जितनी अधिक हो सकती है। पिछले कई दशकों में, एंटिफंगल उपचारों के प्रतिरोध में वृद्धि हुई है, इन प्रतिरोध जीनोटाइप21,22,23 को ट्रैक करने के लिए नैदानिक और पर्यावरणीय आबादी दोनों में वैश्विक निगरानी प्रयासों की आवश्यकता है। 50 डिग्री सेल्सियस से ऊपर के तापमान पर बढ़ने की क्षमता को देखते हुए, इस तापमान का उपयोग संस्कृति-निर्भर तरीकों का उपयोग करके मिट्टी से ए फ्यूमिगेटस आइसोलेट्स के लिए चयन करने के लिए शोषण किया जा सकता है। एस्परगिलस फ्यूमिगेटस आइसोलेट्स को आमतौर पर नौ अत्यधिक बहुरूपी लघु अग्रानुक्रम दोहराव (एसटीआर) लोकी पर जीनोटाइप किया जाता है, जो उपभेदों24 के बीच उच्च भेदभावपूर्ण शक्ति दिखाया जाता है। इन एसटीआर जीनोटाइप की तुलना दुनिया भर में दवा प्रतिरोध जीन सहित ए फ्यूमिगेटस जीनोटाइप के प्रसार को ट्रैक करने के लिए अन्य पहले सर्वेक्षण की गई आबादी से की जा सकती है।

नीचे हम एक संस्कृति-निर्भर तरीके से मिट्टी के नमूनों से खमीर और ए फ्यूमिगेटस के त्वरित अलगाव के लिए एक प्रोटोकॉल का वर्णन करते हैं। प्रति नमूना प्राप्त मिट्टी की मात्रा के आधार पर, मिट्टी के नमूने दो प्रोटोकॉल के बीच साझा किए जा सकते हैं। मिट्टी से खमीर और ए फ्यूमिगेटस को अलग करने वाले समान तरीकों की तुलना में, यह प्रोटोकॉल प्राप्त प्रति अलग 10x कम मिट्टी का उपयोग करता है। मिट्टी से ए फ्यूमिगेटस को अलग करने का प्रयास करने वाले अध्ययनों के लिए प्रति पृथक 1 से 2 ग्राम मिट्टी की आवश्यकता होती है, जबकि इस प्रोटोकॉल के लिए केवल 0.1-0.2 ग्राम मिट्टी 18,19,25 की आवश्यकता होती है। यह प्रोटोकॉल छोटे प्लास्टिक और कंटेनरों का उपयोग करता है जो इसके उच्च-थ्रूपुट डिजाइन की सुविधा प्रदान करते हैं। इसलिए, इनक्यूबेटर और रोलर ड्रम जैसे उपकरणों के लिए कम जगह का उपयोग करके बड़ी संख्या में नमूनों को संसाधित किया जा सकता है। मिट्टी के नमूनों को 7 दिनों में आइसोलेट्स प्राप्त करने के लिए पूरी तरह से संसाधित किया जा सकता है। इस प्रोटोकॉल को प्रति व्यक्ति प्रति दिन 150-200 नमूनों के प्रसंस्करण की अनुमति देने के लिए अनुकूलित किया गया है।

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Protocol

नोट: अंतरराष्ट्रीय मिट्टी के नमूनों और / या ए फ्यूमिगेटस बीजाणुओं और मायसेलिया का उपयोग करने वाले किसी भी कदम को स्तर 2 जीवों (बीएससीआईआई) के लिए जैव सुरक्षा कैबिनेट के भीतर काम करने की आवश्यकता होती है।

1. मिट्टी से खमीर का अलगाव

  1. जीवाणुरोधी और एंटिफंगल समाधान की तैयारी
    1. एल स्टॉक समाधान तैयार करने के लिए 70% इथेनॉल में क्लोरैम्फेनिकॉल पाउडर को निलंबित करें। सिरिंज निस्पंदन द्वारा निष्फल करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट: यह एंटीबायोटिक मिट्टी खमीर अलगाव के दौरान अधिकांश बैक्टीरिया के विकास को रोक देगा। चूंकि क्लोरैम्फेनिकोल प्रतिरोधी बैक्टीरिया अभी भी बढ़ सकते हैं, बैक्टीरिया से खमीर को अलग करते समय कॉलोनी आकृति विज्ञान को सावधानीपूर्वक ध्यान में रखा जाना चाहिए। एंटीबायोटिक प्रतिरोधी जीवाणु उपभेदों वाले संदिग्ध मिट्टी के साथ काम करते समय अतिरिक्त एंटीबायोटिक दवाओं को मीडिया में जोड़ा जा सकता है। क्लोरैम्फेनिकॉल-पूरक मीडिया में जीवाणु संदूषण पर्यावरणीय मिट्टी से खमीर को अलग करते समय एक मुद्दा नहीं था।
    2. एल स्टॉक समाधान तैयार करने के लिए डीएमएसओ में बेनोमिल पाउडर को निलंबित करें। सिरिंज निस्पंदन द्वारा निष्फल करें और 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
      नोट: यह चयनात्मक एंटिफंगल दवा मिट्टी खमीर अलगाव26,27 के दौरान खमीर वृद्धि को प्रभावित किए बिना अधिकांश फिलामेंटस कवक के विकास को रोकती है।
  2. संस्कृति मीडिया और बाँझ उपकरणों की तैयारी
    1. वाईईपीडी (खमीर निकालें-पेप्टोन-डेक्सट्रोज) शोरबा तैयार करने के लिए, 10 ग्राम खमीर निकालें, 20 ग्राम पेप्टोन, और 20 ग्राम डेक्सट्रोज को 1 एल डबल-डिस्टिल्ड पानी में जोड़ें। 121 डिग्री सेल्सियस पर 40 मिनट के लिए अच्छी तरह से मिश्रित और आटोक्लेव तक हिलाओ। उपयोग होने तक कमरे के तापमान पर स्टोर करें।
    2. वाईईपीडी ठोस अगर माध्यम
      1. 1 लीटर पानी में 10 ग्राम खमीर निकालने, 20 ग्राम पेप्टोन, 20 ग्राम डेक्सट्रोज और 20 ग्राम अगर मिलाएं। 121 डिग्री सेल्सियस पर 40 मिनट के लिए मिश्रण और आटोक्लेव करने के लिए अच्छी तरह से हिलाओ।
      2. एक बार पर्याप्त रूप से ठंडा हो जाने के बाद, दो रोगाणुरोधी की अंतिम सांद्रता को क्रमशः 50 मिलीग्राम / एल और 5 मिलीग्राम / एल तक लाने के लिए स्टॉक समाधान से 1 एमएल क्लोरैम्फेनिकॉल और बेनोमाइल जोड़ें।
      3. सरगर्मी करके अच्छी तरह मिलाएं और 10 सेमी व्यास पेट्री डिश में डालें। उपयोग होने तक 4 डिग्री सेल्सियस पर सेट और स्टोर करने के लिए रात भर कमरे के तापमान पर छोड़ दें।
        नोट: वाईईपीडी के 1 एल से, लगभग 40 प्लेटें डाली जा सकती हैं।
    3. आटोक्लेविंग द्वारा लकड़ी के सादे इत्तला दे दी आवेदक छड़ें और पुन: प्रयोज्य सेल स्प्रेडर बाँझ और कमरे के तापमान पर स्टोर करें।
  3. तरल शोरबा में मिट्टी का इनक्यूबेशन
    1. मिट्टी के नमूना आईडी के साथ लेबलिंग करके बाँझ 13 एमएल संस्कृति ट्यूबों का एक सेट तैयार करें।
    2. एक सीरोलॉजिकल पिपेट का उपयोग करके, प्रत्येक ट्यूब में क्लोरैम्फेनिकॉल और बेनोमाइल के साथ पूरक वाईईपीडी शोरबा के 5 मिलीलीटर जोड़ें।
    3. एक बीएससीआईआई में काम करना, एक बाँझ, लकड़ी के सादे-इत्तला दे दी आवेदक का उपयोग करके उपयुक्त संस्कृति ट्यूब में ~ 0.1 ग्राम मिट्टी स्थानांतरित करें।
      नोट: प्रत्येक मिट्टी के नमूने के लिए एक ताजा आवेदक का उपयोग करें और नमूनों के बीच क्रॉस-संदूषण से बचने के लिए उपयोग पर तुरंत त्यागें।
    4. स्पिलेज को रोकने के लिए ट्यूब को पहले स्टॉप पर सुरक्षित रूप से कैप करें लेकिन फिर भी इनक्यूबेशन के दौरान हवा के आदान-प्रदान की अनुमति दें। खमीर वृद्धि को अधिकतम करने के लिए इष्टतम समझे गए तापमान पर 24 घंटे के लिए एक रोलर ड्रम में संस्कृति ट्यूबों सेते हैं।
      नोट: इनक्यूबेशन तापमान मिट्टी के नमूनों के मूल देश के औसत वार्षिक तापमान के आधार पर तय किया जाना चाहिए। उदाहरण के लिए, आइसलैंड से मिट्टी के खमीर को अलग करते समय, संस्कृति ट्यूबों को 14 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन किया गया था, जबकि सऊदी अरब की मिट्टी को 30 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन किया गया था। कम तापमान पर धीमी खमीर वृद्धि के कारण, इनक्यूबेशन समय को 72 घंटे तक बढ़ाना पड़ सकता है।
  4. सतह पर तैरनेवाला ठोस माध्यम में स्थानांतरित करें।
    1. चरण 1.2 में तैयार किए गए वाईईपीडी + क्लोरैम्फेनिकॉल + बेनोमाइल अगर प्लेटों के सेट का उपयोग करके, उन्हें मिट्टी के नमूने आईडी के साथ लेबल करें।
    2. रोलर ड्रम से चरण 1.3 में तैयार संस्कृति ट्यूबों निकालें। एक बीएससीआईआई में काम करना, संक्षेप में मिट्टी के कणों और कोशिकाओं को आकर्षित करने के लिए ट्यूब को भंवर करें जो निलंबन में नीचे बस गए होंगे।
    3. एक माइक्रोपिपेट का उपयोग करके, एक प्लेट पर सतह पर तैरनेवाला के 100 μL स्थानांतरित करें। अगर सतह पर तरल को अच्छी तरह से और समान रूप से फैलाने के लिए एक बाँझ, पुन: प्रयोज्य सेल स्प्रेडर का उपयोग करें।
      नोट: 10 नमूनों के सेट में काम करना इस प्रक्रिया को काफी तेज कर सकता है। पिपेट सतह पर तैरनेवाला पर 10 प्लेटों पहले और फिर प्रसार प्रदर्शन करते हैं। नमूनों के बीच क्रॉस-संदूषण से बचने के लिए प्रत्येक नमूने के लिए एक ताजा स्प्रेडर का उपयोग करें।
    4. प्लास्टिक की थैलियों में प्लेटों को ढेर करें, सील करें, और माइक्रोबियल विकास दिखाई देने तक तरल शोरबा इनक्यूबेशन के लिए पहले उपयोग किए गए एक ही तापमान पर 2-3 दिनों के लिए उल्टा सेते हैं।
  5. एकल उपनिवेशों के लिए खमीर और लकीर का पता लगाना
    1. पर्याप्त इनक्यूबेशन समय (आमतौर पर 2-3 दिन, लेकिन कम तापमान पर अधिक समय लग सकता है) की अनुमति देने के बाद, किसी भी खमीर वृद्धि के लिए बीएससीआईआई में प्लेटों का निरीक्षण करें। मलाईदार, गोल, मैट जैसे खमीर की तलाश करें जो आसानी से बैक्टीरिया और मोल्ड कॉलोनियों से अलग होते हैं।
      नोट: कुछ खमीर रंगीन वर्णक का उत्पादन करते हैं और काले / भूरे, पीले या लाल दिखाई दे सकते हैं, लेकिन उनकी समग्र कॉलोनी बनावट और आकार गैर-वर्णक खमीर के समान होगा।
    2. आगे की प्रक्रिया के लिए प्रत्येक प्लेट से एक खमीर जैसी कॉलोनी का चयन करें।
      नोट: यदि एक प्लेट पर एक से अधिक प्रकार की आकृति विज्ञान मनाया जाता है, तो प्रत्येक रूपात्मक प्रकार के लिए एक प्रतिनिधि कॉलोनी का चयन करें।
    3. बाँझ, लकड़ी के सादे इत्तला दे दी आवेदक छड़ें का उपयोग करके, प्रत्येक चयनित कॉलोनी को एक ताजा वाईईपीडी + क्लोरैम्फेनिकॉल + बेनोमिल प्लेट और एकल कॉलोनियों के लिए लकीर पर स्थानांतरित करें। तीन अलग-अलग लकीरें करें।
      1. एक आवेदक छड़ी का उपयोग करके प्लेट के एक तिहाई पर आगे और पीछे लकीर। एक बार पूर्ववर्ती लकीर में आवेदक को लकीर करके दूसरी और तीसरी लकीर शुरू करें। हर लकीर के लिए एक नए आवेदक छड़ी का उपयोग करें।
        नोट: पृथक प्रति एक प्लेट का उपयोग करें। नमूनों के बीच क्रॉस-संदूषण से बचने के लिए उपयोग करने पर तुरंत आवेदकों को त्यागें।
    4. प्लेटों को प्लास्टिक की थैलियों में ढेर करें, सील करें, और 2-3 दिनों के लिए उसी तापमान पर उल्टा सेते हैं जो पहले इस्तेमाल किया जाता है जब तक कि एकल कॉलोनियां दिखाई न दें।
  6. आईटीएस अनुक्रमण के माध्यम से खमीर प्रजातियों की पहचान
    1. अधिक कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए एक ताजा वाईईपीडी + क्लोरैम्फेनिकॉल + बेनोमाइल प्लेट पर मिट्टी अलग और उपसंस्कृति प्रति एक अच्छी तरह से अलग, एकल कॉलोनी का चयन करें। पहले इस्तेमाल किए गए एक ही तापमान पर 2-3 दिनों के लिए सेते हैं।
    2. ताजा उगाई गई कोशिकाओं को हार्वेस्ट करें और सेल निलंबन बनाने के लिए डबल-डिस्टिल्ड पानी में निष्फल 30% ग्लिसरॉल के 1 एमएल युक्त -80 डिग्री सेल्सियस फ्रीजर ट्यूबों में उन्हें निलंबित करें। स्टॉक समाधान के रूप में -80 डिग्री सेल्सियस पर इन निलंबन को बनाए रखें।
    3. फंगल बारकोडिंग जीन, आईटीएस9 को बढ़ाने के लिए प्राइमर आईटीएस 1 (5 'टीसीसीजीटीएजीटीएसीजी 3') और आईटीएस 4 (5 'टीसीसीटीसीसीजीसीटीएटीएटीजीजीसी 3') के साथ कॉलोनी पीसीआर (पोलीमरेज़ चेन रिएक्शन) करने के लिए ताजा कोशिकाओं का उपयोग करें। निम्नलिखित थर्मोसाइक्लिंग स्थितियों का उपयोग करें: 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस पर एक प्रारंभिक विकृतीकरण कदम के बाद (i) 30 सेकंड के लिए 95 डिग्री सेल्सियस, (ii) 30 एस के लिए 55 डिग्री सेल्सियस, और (iii) 1 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस के 35 चक्र।
      नोट: कॉलोनी पीसीआर में उच्च सफलता दर और पीसीआर के बाद डीएनए निष्कर्षण की तुलना में तेजी से टर्नअराउंड समय होता है।
    4. यदि कॉलोनी पीसीआर बार-बार तनाव के लिए विफल रहता है, तो पसंद के प्रोटोकॉल का उपयोग करके डीएनए निकालें और टेम्पलेट के रूप में निकाले गए जीनोमिक डीएनए का उपयोग करके आईटीएस पीसीआर करें (उपरोक्त के समान थर्मोसाइक्लिंग स्थितियों का उपयोग करें)।
      नोट: अपेक्षाकृत सस्ती क्लोरोफॉर्म-आधारित डीएनए निष्कर्षण की सिफारिश की जाती है28.
    5. प्रत्येक तनाव के लिए प्रवर्धित आईटीएस क्षेत्र के डीएनए अनुक्रम को निर्धारित करने के लिए सेंगर अनुक्रमण करें।
    6. प्रजातियों की पहचान स्थापित करने के लिए एनसीबीआई जेनबैंक और यूनाइट जैसे सार्वजनिक डेटाबेस में जमा अनुक्रमों के लिए खमीर उपभेदों के प्राप्त आईटीएस अनुक्रम की तुलना करें।

2. मिट्टी से एस्परगिलस फ्यूमिगेटस का अलगाव

  1. मिट्टी के नमूने प्रति एंटीबायोटिक क्लोरैम्फेनिकॉल के साथ पूरक बाँझ सबौरौड डेक्सट्रोज शोरबा (एसडीबी) के 1 मिलीलीटर तैयार करें।
    1. आसुत जल के 1 एल में 10 ग्राम पेप्टोन और 20 ग्राम डेक्सट्रोज जोड़ें। 40 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर आटोक्लेव।
    2. एसडीबी को ~ 50 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करने की अनुमति दें, एकाग्रता को 50 मिलीग्राम / एल तक लाने के लिए 50 ग्राम / एल क्लोरैम्फेनिकॉल का 1 मिलीलीटर जोड़ें।
      नोट: क्लोरैम्फेनिकॉल खमीर अलगाव के लिए ऊपर वर्णित के रूप में ही तैयार किया जाता है। जीवाणु वृद्धि को बाधित करने के अलावा, क्लोरैम्फेनिकॉल बैक्टीरिया से गैस के उत्पादन को भी रोकता है जो चरण 2.2 में विस्तृत इनक्यूबेशन चरण के दौरान ट्यूबों को खोलने का कारण बनता है।
    3. एक यांत्रिक पिपेट का उपयोग करके मिट्टी के नमूने प्रति 1.5 एमएल माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में एसडीबी के 1 एमएल को सड़न रोकनेवाला विभाज्य।
  2. 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूबों में मिट्टी जोड़ें।
    1. बिखरी हुई मिट्टी के निपटान में सहायता के लिए बीएससीआईआई के अंदर बेंच कोट या शोषक पैडिंग बिछाएं।
    2. आटोक्लेव आवेदक छड़ें का उपयोग करके, लगभग 0.1 ग्राम मिट्टी को 1.5 मिलीलीटर माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में स्थानांतरित करें जिसमें 1 एमएल एसबीडी होता है। ट्यूब और भंवर बंद करें। 3 दिनों के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर निलंबित मिट्टी सेते हैं।
      नोट: इनक्यूबेशन के दौरान मिलाते हुए आवश्यक नहीं है।
  3. मिट्टी-टीका शोरबा की मायसेलियल फसल
    1. माल्ट निकालने अगर (एमईए) प्लेटें तैयार करें।
      1. विदेश मंत्रालय के प्रति लीटर: 20 ग्राम माल्ट निकालने, 20 ग्राम डेक्सट्रोज, 6 ग्राम पेप्टोन और 1 5 ग्राम अगर को आसुत जल के 1 एल में जोड़ें। 40 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर आटोक्लेव।
      2. एमईए को ~ 50 डिग्री सेल्सियस तक ठंडा करने की अनुमति दें, फिर 50 मिलीग्राम / एल की अंतिम एकाग्रता में लाने के लिए 50 ग्राम / एल क्लोरैम्फेनिकॉल का 1 एमएल जोड़ें।
    2. मिट्टी-टीका शोरबा से एमईए प्लेटों पर माइसेलिया को स्थानांतरित करें।
      1. मिट्टी के इनोकुलम की पहचान करें जिसमें एसडीबी से वायु सीमा पर माइसेलियल वृद्धि दिखाई देती है।
      2. एमईए प्लेट के केंद्र में मायसेलिया को स्थानांतरित करने के लिए निष्फल लकड़ी के सादे-इत्तला दे दी गई आवेदक छड़ें का उपयोग करें। 3 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर विदेश मंत्रालय प्लेटों सेते हैं।
  4. "ए फ्यूमिगेटस रूपात्मक गुणों के साथ मायसेलिया का चयन"..
    1. मोल्ड कॉलोनियों की पहचान करें जिनमें विशेषता ए फ्यूमिगेटस रूपात्मक गुण (विकास की तरह हरे साबर) हैं।
    2. एक बीएससीआईआई में काम करते हुए, एक बार सतह को स्क्रैप करके कोनिडिया / मायसेलिया की कटाई के लिए निष्फल लकड़ी के सादे-इत्तला दे दी गई आवेदक छड़ें या एक टीकाकरण लूप का उपयोग करें। एकल उपनिवेशों के लिए अगर पर लकीर करके एक एमईए प्लेट के केंद्र में बीजाणुओं / 2 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
      नोट: चूंकि प्लेट पर कई ए फ्यूमिगेटस उपभेदों और / या अन्य कवक मौजूद हो सकते हैं, इसलिए एकल कॉलोनियों के लिए लकीर करना महत्वपूर्ण है। खमीर अलगाव प्रोटोकॉल में चरण 1.5.3 में एकल कॉलोनी लकीर प्रोटोकॉल का उपयोग किया जा सकता है।
    3. एक बाँझ आवेदक छड़ी या टीकाकरण लूप का उपयोग करके, एक बार कॉलोनी को लकीर करके विदेश मंत्रालय पर चरण 2.4.1.2 में उत्पन्न एक एकल कॉलोनी को उपसंस्कृति करें। कटाई बीजाणुओं को प्लेट के केंद्र में फैलाएं। 2 दिनों के लिए 37 डिग्री सेल्सियस पर सेते हैं।
  5. संस्कृति भंडारण के लिए ए फ्यूमिगेटस बीजाणुओं /मायसेलिया की कटाई
    1. एक बाँझ 30% ग्लिसरॉल समाधान तैयार करें (100 एमएल समाधान के लिए, 70 मिलीलीटर डबल-डिस्टिल्ड पानी के साथ मिश्रित 100% ग्लिसरॉल के 30 एमएल जोड़ें, 40 मिनट के लिए 121 डिग्री सेल्सियस पर निष्फल)।
    2. एक बीएससीआईआई में काम करना, 30% ग्लिसरॉल समाधान के 1 एमएल की आकांक्षा करने के लिए पी 1000 पिपेट का उपयोग करें। मायसेलिया की कटाई के लिए ए फ्यूमिगेटस कॉलोनी पर ग्लिसरॉल समाधान के 1 मिलीलीटर का वितरण करें।
      1. मायसेलिया की हाइड्रोफोबिसिटी के कारण, प्लेट के घने स्पोरुलेटेड क्षेत्र को खरोंचने के लिए पिपेट टिप का उपयोग करें।
        नोट: जब ग्लिसरॉल को खरोंच में वितरित किया जाता है, तो ग्लिसरॉल अगर पर रोलिंग के बजाय खरोंच क्षेत्र का पालन करेगा।
      2. बीजाणुओं को हटाने और उन्हें ग्लिसरॉल समाधान में निलंबित करने के लिए धीरे-धीरे ग्लिसरॉल को खरोंच क्षेत्र पर वितरित करें।
      3. एक बार पूरी तरह से वितरित होने के बाद, प्लेट को हल्के ढंग से टिप दें और ग्लिसरॉल बीजाणु /
        नोट: लगभग 750 से 800 μL आकांक्षा की जाएगी।
      4. एक बाँझ फ्रीजर ट्यूब के लिए एस्पिरेट स्थानांतरण और -80 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर। यदि आवश्यक हो, तो चरण 2.5.2.1 से 2.5.2.4 को दोहराकर कार्यशील स्टॉक बनाएँ।
  6. ए फ्यूमिगेटस उपभेदों की फेनोटाइपिक पहचान
    1. चरण 2.5.2 से बनाए गए बीजाणु स्टॉक का उपयोग करके, पानी में 100x कमजोर पड़ने का निर्माण करें।
      1. मायसेलियल और बीजाणु स्टॉक के 10 μL की आकांक्षा करें और 990 μL पानी में वितरित करें। निलंबन भंवर।
    2. एक मानक माइक्रोस्कोप स्लाइड पर पतला बीजाणु निलंबन के 10 μL वितरण।
    3. वैकल्पिक: मिथाइलीन नीले रंग के साथ मायसेलियल और बीजाणु निलंबन को दाग दें।
      1. मेथिलीन नीले रंग के साथ दागने के लिए, सूखने तक बनसेन बर्नर पर स्लाइड पास करके स्लाइड में कोनिडिया और कोनिडियोफोरस को ठीक करें।
      2. 1-2 मिनट के लिए मेथिलीन ब्लू लगाएं और पानी से धो लें।
      3. सोख्ता कागज के साथ स्लाइड सूखी।
    4. 400x आवर्धन पर एक यौगिक माइक्रोस्कोप का उपयोग करके, निलंबन देखें और कोनिडियोफोरस का पता लगाएं। फ्यूमिगेटस कोनिडियोफोर आकृति विज्ञान के साथ देखे गए कोनिडियोफोर आकृति विज्ञान की तुलना करें।
  7. ए फ्यूमिगेटस उपभेदों की आणविक पहचान
    1. आम कवक डीएनए निष्कर्षण प्रोटोकॉल के बाद प्रत्येक पृथक से डीएनए निकालें।
    2. एस्परगिलस β-ट्यूबुलिन जीन (β-टब 1 और β-टब 4) के लिए विशिष्ट प्राइमरों का उपयोग करके, पीसीआर चलाएं और अल्कजार-फूली एट अल द्वारा वर्णित प्रोटोकॉल का पालन करते हुए प्रवर्धित उत्पादों के लिए अनुक्रम प्राप्त करें।
      1. ब्लास्ट का उपयोग करके एनसीबीआई जेनबैंक जैसे सार्वजनिक डेटाबेस में जमा अनुक्रमों के लिए प्राप्त अनुक्रमों की तुलना करें।
      2. पुष्टि करें कि तनाव अनुक्रम डेटाबेस में ए फ्यूमिगेटस अनुक्रमों के लिए एक शीर्ष मिलान है।
    3. चरण 2.7.2 के विकल्प, ए फ्यूमिगेटस संभोग प्रकार एमएटी 1-1 और एमएटी 1-229 को लक्षित करने वाली एक मल्टीप्लेक्स पीसीआर प्रतिक्रिया चलाएं।
      1. मल्टीप्लेक्स पीसीआर प्रतिक्रिया में निम्नलिखित तीन प्राइमर अनुक्रमों का उपयोग करें: एएफएम 1: 5 '-सीसीटीजीजीएसीजी -3'; एएफएम 2: 5'-सीजीसीटीसीसीटीसीसीएसीटीसीजी -3 '; एएफएम 3: 5'-सीजीजीएएटीजीजीटीसीजीसीजी -3'।
      2. निम्नलिखित थर्मोसाइक्लर मापदंडों का उपयोग करें: 95 डिग्री सेल्सियस पर 5 मिनट, 95 डिग्री सेल्सियस पर 30 एस के 35 चक्र, 60 डिग्री सेल्सियस पर 30 एस, और 72 डिग्री सेल्सियस पर अंतिम 5 मिनट से पहले 72 डिग्री सेल्सियस पर 1 मिनट।
      3. उत्पादों की पहचान करने के लिए जेल वैद्युतकणसंचलन चलाएं; 834 बीपी मैट -1 या 438 बीपी मैट 1-2 की तलाश करें। फ्यूमिगेटस उपभेदों का उपयोग करें जिन्होंने सकारात्मक और नकारात्मक नियंत्रण के रूप में संभोग प्रकार प्रवर्धन की पुष्टि की है।
  8. टुकड़ा विश्लेषण के माध्यम से ए फ्यूमिगेटस उपभेदों का माइक्रोसैटेलाइट जीनोटाइपिंग
    नोट: यद्यपि नीचे सूचीबद्ध चरण मोटे तौर पर नौ माइक्रोसैटेलाइट (एसटीआर) लोकी में जीनोटाइपिंग ए फ्यूमिगेटस को कवर करते हैं, केवल कुछ महत्वपूर्ण विचारों पर प्रकाश डाला गया है। फ्यूमिगेटस एसटीआर जीनोटाइपिंग के विवरण के लिए, डी वाल्क एट अल 24,30 देखें।
    1. डी वाल्क एट अल 24 द्वारा पहले वर्णित एसटीआरएएफ प्राइमरों का उपयोग करके तीन पीसीआर मल्टीप्लेक्स मास्टर मिक्स तैयार करें।
      1. केशिका वैद्युतकणसंचलन के माध्यम से टुकड़ा आकार निर्धारित करने के लिए फ्लोरोसेंटली लेबल फॉरवर्ड प्राइमर। सुनिश्चित करें कि आगे प्राइमरों की एकाग्रता मास्टर मिश्रण के भीतर रिवर्स प्राइमरों (1 μM) की आधी (0.5 μM) है।
        नोट: सर्वोत्तम परिणामों के लिए, फ्लोरोसेंट लेबल का उपयोग करें जिसमें अवशोषण तरंग दैर्ध्य हैं जो केशिका वैद्युतकणसंचलन के दौरान उपयोग किए जाने वाले चुने हुए डाई मानक से मेल खाते हैं
      2. सर्वोत्तम परिणामों के लिए गर्म स्टार्ट पोलीमरेज़ का उपयोग करें।
      3. प्रति प्रतिक्रिया 0.1 एनजी की डीएनए एकाग्रता का उपयोग करें।
    2. निम्नलिखित पीसीआर कार्यक्रम का उपयोग करके प्रत्येक तनाव के लिए मल्टीप्लेक्स पीसीआर चलाएं: 10 मिनट के लिए 95 डिग्री सेल्सियस, 30 एस के लिए 95 डिग्री सेल्सियस के 40 चक्र, 30 एस के लिए 60 डिग्री सेल्सियस, और 60 एस के लिए 72 डिग्री सेल्सियस, इसके बाद 10 मिनट के लिए 72 डिग्री सेल्सियस और 4 डिग्री सेल्सियस पर पकड़।
    3. जेल वैद्युतकणसंचलन के माध्यम से प्रवर्धित उत्पादों की जांच करें।
    4. टुकड़ा विश्लेषण विशेषज्ञों द्वारा अनुशंसित वांछित स्तर (आमतौर पर ~ 50x) तक उत्पादों को पतला करें और केशिका वैद्युतकणसंचलन चलाएं। प्रत्येक तनाव के लिए तीन रन करें, प्रत्येक रन तीन अलग-अलग फ्लोरोसेंट जांच के साथ तीन मल्टीप्लेक्स प्रतिक्रियाओं को कवर करता है।
    5. नौ एसटीआर लोकी में से प्रत्येक के लिए सही टुकड़ा आकार निर्धारित करने के लिए, टुकड़ा विश्लेषण में सक्षम सॉफ़्टवेयर का उपयोग करें।
      1. केशिका वैद्युतकणसंचलन से प्राप्त कच्चे डेटा को पुनः प्राप्त करें। टुकड़ा विश्लेषण सॉफ्टवेयर (जैसे, ओसिरिस) का उपयोग करके सबसे बड़ी चोटी के आधार पर टुकड़ा आकार स्कोर करें।
      2. नौ लोकी में से प्रत्येक के लिए संख्याओं को दोहराने के लिए टुकड़ा आकार परिवर्तित करें। संदर्भ तनाव Af293 की दोहराने की संख्या के टुकड़े आकार का उपयोग करें जैसा कि पहले डी वाल्क एट अल .24 द्वारा वर्णित है।
        नोट: विभिन्न केशिका वैद्युतकणसंचलन प्लेटफार्मों के बीच टुकड़े के आकार में मामूली बदलाव हो सकते हैं। इस प्रकार, जीनोटाइपिंग उपभेदों के लिए नौ लोकी में से प्रत्येक के लिए ज्ञात टुकड़े के आकार के साथ एक सामान्य संदर्भ तनाव (और एक आंतरिक सीढ़ी) को शामिल करना महत्वपूर्ण है।

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Representative Results

मिट्टी से खमीर अलगाव
उपरोक्त खमीर अलगाव प्रोटोकॉल नौ देशों 9,12 में 53 स्थानों से उत्पन्न मिट्टी के नमूनों से संस्कृति खमीर के लिए लागू किया गया था। कुल मिलाकर, 1,473 खमीर उपभेदों को 3,826 मिट्टी के नमूनों से अलग किया गया था। नौ मूल देशों की विभिन्न जलवायु परिस्थितियों को देखते हुए, प्रत्येक देश के लिए सबसे अच्छा इनक्यूबेशन तापमान उसके औसत वार्षिक तापमान (तालिका 1) के आधार पर निर्धारित किया गया था। 14 डिग्री सेल्सियस पर धीमी खमीर वृद्धि को देखते हुए, आइसलैंड से मिट्टी के नमूनों को अतिरिक्त 48 घंटे (96-120 घंटे कुल) के लिए रोलर ड्रम पर ऊष्मायन किया गया था। ठोस माध्यम पर इनक्यूबेशन के 2-3 दिनों के बाद, माइक्रोबियल विकास सभी नमूनों (चित्रा 1 ए) के लिए प्लेटों पर दिखाई दे रहा था। एक प्लेट पर मौजूद प्रत्येक खमीर आकृति विज्ञान के लिए एक बेतरतीब ढंग से चयनित कॉलोनी ताजा प्लेटों (चित्रा 1 बी) पर एकल कालोनियों के लिए लकीर थी।

सफल खमीर अलगाव की दर देशों के बीच भिन्न थी (तालिका 1)। उदाहरण के लिए, 97 खमीर उपभेदों को 562 सऊदी अरब मिट्टी के नमूनों (17.3%) से सुसंस्कृत किया गया था, जबकि 261 खमीर 300 कनाडाई मिट्टी के नमूनों (87%) से सुसंस्कृत थे। नमूना स्थानों में वास्तविक खमीर विविधता का सटीक अनुमान प्राप्त करने के लिए पर्याप्त मिट्टी नमूनाकरण किया गया है या नहीं, यह निर्धारित करने के लिए एक दुर्लभ विश्लेषण किया जाना चाहिए। प्रत्येक देश के लिए एक उदाहरण दुर्लभता विश्लेषण पूर्वनिर्धारित किया गया था जहां शैनन विविधता सूचकांक का उपयोग मिट्टी खमीर विविधता (चित्रा 2) के उपाय के रूप में किया गया था। परिणामी दुर्लभता घटता संतृप्ति एसिम्प्टोट से संपर्क करता है जो दर्शाता है कि अतिरिक्त नमूने से अधिक खमीर विविधता प्राप्त होने की संभावना नहीं थी।

आईटीएस क्षेत्र के अनुक्रमण से पता चला है कि 1,473 खमीर आइसोलेट्स को 134 अलग-अलग प्रजातियों में वर्गीकृत किया जा सकता है। इसमें 90 ज्ञात प्रजातियां और 44 संभावित उपन्यास प्रजातियां शामिल थीं। हमने वैश्विक कृषि योग्य मिट्टी खमीर विविधता के भविष्यवक्ताओं की पहचान करने के लिए एक मिश्रित प्रभाव मॉडल लागू किया, जैसा कि शैनन विविधता सूचकांक31 द्वारा निर्धारित किया गया है। इस मॉडल में, औसत वार्षिक वर्षा, औसत वार्षिक तापमान, ऊंचाई और नमूना स्थानों के भूमध्य रेखा की दूरी को निश्चित प्रभाव के रूप में फिट किया गया था, जबकि नमूनाकरण देश को यादृच्छिक प्रभाव9 के रूप में सेट किया गया था। इस मॉडल ने शैनन विविधता सूचकांक (पी = 0.012) के साथ काफी सहसंबद्ध होने के लिए औसत वार्षिक वर्षा की पहचान की, जबकि अन्य भविष्यवक्ता चर और शैनन विविधता सूचकांक9 के बीच कोई महत्वपूर्ण सहसंबंध नहीं पाया गया।

संस्कृति-स्वतंत्र तरीकों से इस संस्कृति-आधारित प्रोटोकॉल की तुलना करने के लिए, हमने इन निष्कर्षों की तुलना टेडरसू और सहकर्मियों द्वारा पिछले अध्ययन से की, जिन्होंने मेटाजेनोमिक्स2 का उपयोग करके मिट्टी कवक की वैश्विक विविधता की जांच की। टेडरसू और उनके सहयोगियों ने 39 देशों के मिट्टी के नमूनों से सीधे निकाले गए डीएनए पर आईटीएस क्षेत्र के उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण का प्रदर्शन किया, जिनमें से चार, अर्थात् कैमरून, कनाडा, चीन और न्यूजीलैंड, इस अध्ययन में भी नमूना लिया गया था। हमने दोनों डेटासेट32 में मौजूद आईटीएस अनुक्रमों की पहचान करने के लिए ब्लास्ट खोजों का प्रदर्शन किया, और पाया कि 26% आईटीएस अनुक्रमों में मेटाजेनोमिक्स डेटासेट में एक महत्वपूर्ण मैच (>98.41% न्यूक्लियोटाइड पहचान) था। हालांकि, <3% एक ही देश से एक कवक अनुक्रम से मेल खाते हैं, जबकि शेष 23% एक अलग देश 9 में पाए जाने वाले फंगल अनुक्रम से मेल खातेहैं। हम खमीर प्रजातियों की पहचान के साथ आईटीएस अनुक्रमों को एनोटेट करने में मेटाजेनोमिक्स अध्ययन की तुलना में अधिक सफल थे। टेडरसू और उनके सहयोगियों ने कुल 50,589 फंगल परिचालन टैक्सोनोमिक इकाइयों (ओटीयू) की सूचना दी, जिसमें खमीर ओटीयू की संख्या ज्ञात नहीं थी। इन फंगल ओटीयू में से, 33% को केवल environmental_sequence (724, 1.4%), uncultured_soil_fungus (2,405, 4.8%), uncultured_ectomycorrhizal_fungus (1,407, 2.8%), या uncultured_fungus (11,898, 23.5%) के रूप में एनोटेट किया गया था।

मिट्टी से एस्परगिलस फ्यूमिगेटस अलगाव
माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब में एसडीबी के 1 एमएल में 50 डिग्री सेल्सियस पर मिट्टी के इनक्यूबेशन के 3 दिनों के बाद, माइसेलिया एसडीबी के भीतर, एसडीबी पर हवा की सीमा तक, और / एस्परगिलस फ्यूमिगेटस मायसेलिया आमतौर पर एसडीबी पर वायु सीमा तक बढ़ते हुए पाए जाते हैं, लेकिन एसडीबी सतह के ठीक नीचे से भी काटा जा सकता है। इस कदम के बाद, मायसेलिया को विदेश मंत्रालय में स्थानांतरित कर दिया जाता है और 37 डिग्री सेल्सियस पर 3 दिनों के लिए उगाया जाता है। प्लेटों पर माइसेलियल वृद्धि केवल ए फ्यूमिगेटस (चित्रा 3 ए) के विशिष्ट हरे साबर आकृति विज्ञान का निर्माण कर सकती है। अधिक सामान्यतः, अन्य थर्मोटोलरेंट मोल्ड एक ही मिट्टी के भीतर मौजूद हो सकते हैं और एक ही प्लेट पर या खुद से ए फ्यूमिगेटस के साथ बढ़ सकते हैं (चित्रा3 बी-डी)। एस्परगिलस फ्यूमिगेटस अलगाव दर भौगोलिक स्थानों के बीच भिन्न हो सकती है, जो मिट्टी के खमीर के लिए पाई गई है। उदाहरण के लिए, वैंकूवर, कनाडा के भीतर, 540 मिट्टी के नमूनों (46.5%) (अप्रकाशित परिणाम) से इस विधि के माध्यम से 251 आइसोलेट्स प्राप्त किए गए थे। इसके विपरीत, कैमरून के भीतर, 51 ए फ्यूमिगेटस आइसोलेट्स को 495 मिट्टी के नमूनों (10.3%) 33 से काटा गया था।

फ्यूमिगेटस कोनिडियोफोर संरचना को प्रकाश माइक्रोस्कोपी का उपयोग करके देखा और पहचाना जा सकता है। कोनिडियोफोरस में छड़ी आकृति विज्ञान (चित्रा 4) पर एक गेंद होती है। इसके अतिरिक्त, ए फ्यूमिगेटस कोनिडियोफोरस यूनिसेरिएट हैं, जहां कोनिडिया श्रृंखलाओं से जुड़े फीलाइड्स सीधे गोलाकार पुटिका से जुड़े होते हैं। अन्य एस्परगिलस प्रजातियों में, कोनिडियोफोरस बिसेरिएट होते हैं, जहां फीलाइड्स पुटिका से जुड़े मेटुला से जुड़े होते हैं।

केशिका वैद्युतकणसंचलन से कच्चे डेटा का टुकड़ा विश्लेषण करने के लिए कई सॉफ्टवेयर प्रोग्राम उपलब्ध हैं, जो केशिका वैद्युतकणसंचलन स्पेक्ट्रम को टुकड़े के आकार में परिवर्तित करते हैं। चित्रा 5 कार्यक्रम ओसिरिस द्वारा उत्पन्न एक क्रोमैटोग्राम है। फ्यूमिगेटस डाइन्यूक्लियोटाइड (2 ए, 2 बी, और 2 सी), ट्राइन्यूक्लियोटाइड (3 ए, 3 बी, और 3 सी), और टेट्रान्यूक्लियोटाइड (4 ए, 4 बी और 4 सी) एसटीआर लोकी की टुकड़े की लंबाई की कल्पना करने वाले तीन चैनल दिखाए गए हैं। इसके अलावा, पीसीआर कलाकृतियों कि पीसीआर के दौरान नमूना डीएनए एकाग्रता बहुत अधिक है भी दिखाया गया है। प्रत्येक रंग की उच्चतम चोटियां इस भूखंड में तीन एसटीआर लोकी के टुकड़े के आकार का प्रतिनिधित्व करती हैं।

फ्यूमिगेटस एसटीआर जीनोटाइप के बीच मौजूद आनुवंशिक भिन्नता को आर पैकेज पॉपर का उपयोग करके कल्पना की जा सकती है। आर स्क्रिप्ट ब्रूवो.एमएसएन जीनोटाइप की प्रत्येक जोड़ी के बीच एक जोड़ीदार ब्रूवो की आनुवंशिक दूरी मैट्रिक्स बनाता है। इस मैट्रिक्स का उपयोग तब न्यूनतम स्पैनिंग नेटवर्क (एमएसएन) उत्पन्न करने के लिए किया जाता है। एक उच्च गुणवत्ता वाले एमएसएन को आर स्क्रिप्ट plot_poppr_msn या आईएमएसएन (चित्रा 6) का उपयोग करके उत्पन्न किया जा सकता है। प्रमुख घटकों (डीएपीसी) का एक भेदभावपूर्ण विश्लेषण उपभेदों (चित्रा 7) के बीच आनुवंशिक संबंधों की कल्पना करने का एक और तरीका है। आर पैकेज एडीजेनेट में आर स्क्रिप्ट डैपक का उपयोग डीएपीसी करने के लिए किया जाता है और इसका उपयोग ज्ञात या अज्ञात समूह प्राथमिकताओं के साथ किया जा सकता है। अज्ञात समूह प्राथमिकताओं के साथ, यह व्यक्तियों के समूहों की संभावित संख्या की पहचान करने के लिए के-मीन्स क्लस्टरिंग का उपयोग करता है।

Figure 1
चित्रा 1: मिट्टी के नमूनों से खमीर अलगाव( ए) माइक्रोबियल वृद्धि इनक्यूबेशन के 2-3 दिनों के बाद ठोस अगर पर दिखाई देती है। खमीर कालोनियों को अन्य कवक / जीवाणु उपनिवेशों के बीच देखा जा सकता है। एक प्लेट पर प्रत्येक रूपात्मक प्रकार के लिए एक प्रतिनिधि खमीर कॉलोनी को एकल उपनिवेशों के लिए लकीर के लिए चुना जाता है। (बी) खमीर आइसोलेट्स की एकल कॉलोनियों को प्राप्त करने के लिए तीन लकीरें की जाती हैं। प्रत्येक मिट्टी को अलग करने के लिए एक प्लेट का उपयोग किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 2
चित्रा 2: मिट्टी के नमूने का दुर्लभ विश्लेषण। नौ नमूना देशों में से प्रत्येक में, मिट्टी खमीर विविधता, जैसा कि शैनन विविधता सूचकांक द्वारा निर्धारित किया गया है, मिट्टी के नमूने की संख्या बढ़ने के साथ संतृप्ति तक पहुंचता है। यह आंकड़ा 9 से अनुकूलित किया गया था। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 3
चित्रा 3: सबौरौड डेक्सट्रोसीगर पर एस्परगिलस फ्यूमिगेटस आकृति विज्ञान( ए) ग्रीन साबर की तरह ए फ्यूमिगेटस विकास आकृति विज्ञान। (बी-डी) मिट्टी के नमूने के भीतर मौजूद अन्य थर्मोफिलिक मोल्ड्स के साथ फ्यूमिगेटस वृद्धि। ए फ्यूमिगेटस कोनिडिएशन बी और डी में स्पष्ट रूप से कम हो जाता है। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 4
चित्रा 4: एक प्रकाश माइक्रोस्कोप के तहत एस्परगिलस फ्यूमिगेटस कोनिडियोफोर की तस्वीर। स्केल बार = 10 μm. कृपया इस आकृति का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 5
चित्रा 5: एस्परगिलस फ्यूमिगेटस तनाव से नौ माइक्रोसैटेलाइट लोकी का ओसिरिस आउटपुट। आउटपुट (ए) डाइन्यूक्लियोटाइड (2 ए, 2 बी, और 2 सी), (बी) ट्रिन्यूक्लियोटाइड (3 ए, 3 बी, और 3 सी), और (सी) टेट्रान्यूक्लियोटाइड (4 ए, 4 बी, और 4 सी) एसटीआर लोकी के अनुरूप हैं। फॉरवर्ड प्राइमर 5 'फ्लोरोसेंट लेबल हैं: ए = 6-एफएएम; बी = हेक्स; सी = एटीटीओ 550। मल्टीप्लेक्स प्रतिक्रिया उत्पादों को केशिका वैद्युतकणसंचलन से पहले 30x पतला किया गया था। केशिका वैद्युतकणसंचलन के दौरान एलआईजेड 600 डाई मानक का उपयोग किया गया था। कच्चे डेटा का विश्लेषण पीक विश्लेषण सॉफ्टवेयर ओसिरिस का उपयोग करके किया गया था जो 60 और 400 बीपी के बीच संभावित चोटियों की पहचान करता है। कई पीसीआर कलाकृतियां ऑफ-स्केल चोटियां हैं जो प्रतिदीप्ति रक्तस्राव, हकलाने वाली चोटियों और एन -1 चोटियों (सी) का कारण बनती हैं। संक्षिप्त नाम: 6-एफएएम = 6-कार्बोक्सीफ्लोरेसिन; हेक्स = हेक्साक्लोरोफ्लोरेसिन; एसटीआर = लघु अग्रानुक्रम दोहराता है; आरएफयू = सापेक्ष प्रतिदीप्ति इकाइयाँ; बीपीएस = बेस जोड़े। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 6
चित्रा 6: कनाडा में आइसलैंड और नॉर्थवेस्ट टेरिटरीज से ए फ्यूमिगेटस के एमएलजी के बीच आनुवंशिक संबंध दिखाने वाला न्यूनतम-स्पैनिंग नेटवर्क। प्रत्येक नोड एक एमएलजी का प्रतिनिधित्व करता है, जहां नोड आकार प्रत्येक एमएलजी के लिए उपभेदों की संख्या से मेल खाता है। नोड्स जो अधिक आनुवंशिक रूप से समान होते हैं, उनमें गहरे और मोटे किनारे होते हैं, जबकि आनुवंशिक रूप से दूर के नोड्स में हल्के और पतले किनारे होते हैं। यह आंकड़ा 34 से अनुकूलित किया गया था। संक्षिप्त नाम: आईएसएल = आइसलैंड; एनडब्ल्यूटी = कनाडा में नॉर्थवेस्ट क्षेत्र; एमएलजी = मल्टीलोकस जीनोटाइप। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

Figure 7
चित्रा 7: आइसलैंड, एनडब्ल्यूटी, यूरेशियन, उत्तरी अमेरिकी और ओशिनियन ए फ्यूमिगेटस आबादी के प्रमुख घटकों (डीएपीसी) के भेदभावपूर्ण विश्लेषण का उपयोग करके आनुवंशिक क्लस्टरिंग। आइसोलेट्स को नौ माइक्रोसैटेलाइट लोकी और क्लोन-सही पर जीनोटाइप किया गया था, जिसमें कुल 1,703 अद्वितीय मल्टीलोकस जीनोटाइप थे। भौगोलिक उत्पत्ति के अनुसार जीनोटाइप को रंगा गया था। यह आंकड़ा 34 से अनुकूलित किया गया था। संक्षिप्त नाम: डीएपीसी = प्रमुख घटकों का भेदभावपूर्ण विश्लेषण; एनडब्ल्यूटी = नॉर्थवेस्ट टेरिटरीज; आईएसएल = आइसलैंड; सीएमआर = कैमरून; कैन = हैमिल्टन, ओंटारियो, कनाडा; बेल = बेल्जियम; एफआरए = फ्रांस; डीईयू = जर्मनी; भारत = भारत; एनएलडी = नीदरलैंड; एनओआर = नॉर्वे; एनजेडएल = न्यूजीलैंड; ईएसपी = स्पेन; सीएचई = स्विट्जरलैंड; संयुक्त राज्य अमेरिका = संयुक्त राज्य अमेरिका। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

देश इनक्यूबेशन तापमान (डिग्री सेल्सियस) मिट्टी के नमूने खमीर अलग करता है ज्ञात प्रजातियां/उपन्यास प्रजातियां
कैमरून 30 493 110 10/9
कनाडा 23 300 261 34/12
चीन 23 340 230 23/5
कोस्टा रिका 30 388 95 20/2
फ़्रांस 23 327 175 12/2
आइसलैंड 14 316 211 11/0
न्यूज़ीलैंड 23 610 155 14/4
पेरू 23 490 139 30/9
सऊदी अरब 30 562 97 8/1
कुल 3826 1473 90/44

तालिका 1: छह महाद्वीपों में नौ देशों से मिट्टी खमीर अलगाव। प्रत्येक देश से मिट्टी के नमूनों के लिए इनक्यूबेशन तापमान उसके औसत वार्षिक तापमान के आधार पर निर्धारित किया गया था। यहां प्रस्तुत परिणाम 9,12 से अनुकूलित हैं।

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Discussion

मिट्टी से खमीर और ए फ्यूमिगेटस को अलग करने के लिए विकसित प्रोटोकॉल उच्च थ्रूपुट मिट्टी प्रसंस्करण और फंगल अलगाव के लिए एक तेज़ और कुशल तरीका है। प्रोटोकॉल केवल प्रति नमूना मिट्टी (0.1-0.2 ग्राम) की एक छोटी राशि की आवश्यकता होती है, जिससे अधिक साइटों को समान प्रयास के साथ नमूना दिया जा सकता है। त्वरित टर्नअराउंड समय यह सुनिश्चित करता है कि परिणाम थोड़े समय के भीतर प्राप्त किए जा सकते हैं और यदि आवश्यक हो तो समस्या निवारण और दोहराए जाने वाले प्रयोगों के लिए समय की अनुमति देता है। इस प्रोटोकॉल को मानक सूक्ष्म जीव विज्ञान और सेल संवर्धन उपकरणों का उपयोग करके कई प्रयोगशाला सेटिंग्स में आसानी से दोहराया जा सकता है। हालांकि, अंतरराष्ट्रीय मिट्टी से खमीर या मोल्डों को अलग करते समय, अतिरिक्त एहतियाती उपायों की आवश्यकता होती है। सभी गैर-डिस्पोजेबल प्लास्टिक उपकरण, जैसे प्लास्टिक ट्रे और सेल स्प्रेडर, को 10% ब्लीच में डूबने से निष्फल किया जाना चाहिए, इसके बाद ऑटोक्लेविंग किया जाना चाहिए। इस्तेमाल किए गए बेंच कोट को प्लास्टिक की थैली में सील कर दिया जाना चाहिए और त्यागने से पहले एक आटोक्लेव में निष्फल किया जाना चाहिए।

ध्यान दें, उपरोक्त प्रोटोकॉल का उपयोग करके अलग खमीर की संख्या और पहचान को इनक्यूबेटिंग स्थितियों और उपयोग किए जाने वाले मीडिया द्वारा सीमित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, रोलर ड्रम में 24 घंटे इनक्यूबेशन धीमी गति से बढ़ती प्रजातियों पर तेजी से बढ़ते एरोबिक खमीर के अलगाव का पक्ष ले सकता है। इसके अलावा, खमीर अलगाव के लिए पोषक तत्वों से भरपूर वाईईपीडी माध्यम के उपयोग ने विभिन्न पोषक तत्वों की आवश्यकताओं और वरीयताओं के साथ खमीर प्रजातियों को बाहर रखा हो सकता है। इसके अलावा, यहां नमूना लिए गए अधिकांश स्थान पूरे वर्ष तापमान और अन्य जलवायु परिस्थितियों में मौसमी भिन्नता का अनुभव करते हैं। यदि समय और संसाधन अनुमति देते हैं, तो एक ही मिट्टी के नमूनों को विभिन्न तापमानों की एक श्रृंखला के तहत संसाधित किया जा सकता है ताकि इन मिट्टी में रहने वाले खमीरों की एक विस्तृत श्रृंखला के अलगाव की अनुमति मिल सके।

जबकि संस्कृति-स्वतंत्र तरीके पर्यावरण कवक विविधता में बड़े पैमाने पर पैटर्न को स्पष्ट करने के लिए महत्वपूर्ण हैं, वे खमीर जैसे कवक के लक्षित समूहों के लिए पर्याप्त रूप से जानकारीपूर्ण होने में विफल रहते हैं। संस्कृति पर निर्भर अलगाव का उपयोग वैश्विक मिट्टी खमीर विविधता और इसके भविष्यवाणियों की व्यापक जांच के लिए अनुमतिदी 9. जबकि टेडरसू और सहकर्मियों द्वारा किए गए मेटाजेनोमिक्स अध्ययन ने मिट्टी कवक विविधता में वैश्विक भविष्यवक्ताओं और पैटर्न की पहचान की, जिस हद तक ये निष्कर्ष विशेष रूप से खमीर विविधता पर लागू होते हैं, उसे स्पष्ट नहीं किया जा सकताहै 2. टेडरसू और उनके सहयोगियों ने दुनिया भर में मिट्टी कवक विविधता के एक प्रमुख जलवायु चालक के रूप में औसत वार्षिक वर्षा की पहचान की2. इस अध्ययन में वैश्विक मिट्टी में औसत वार्षिक वर्षा और कृषि योग्य खमीर विविधता के बीच एक समान सहसंबंध पाया गया, यह उजागर करते हुए कि संस्कृति-निर्भर विधियां उच्च-थ्रूपुट अनुक्रमण दृष्टिकोण9 के निष्कर्षों पर पूरक और विस्तार कर सकती हैं।

क्लोरैम्फेनिकॉल के अलावा बैक्टीरिया द्वारा फंगल विकास हस्तक्षेप को रोकने के लिए ठोस और तरल मीडिया दोनों की तैयारी में एक महत्वपूर्ण कदम है। तरल मीडिया में क्लोरैम्फेनिकॉल का जोड़ महत्वपूर्ण है क्योंकि एंटीबायोटिक दवाओं की कमी मिट्टी में मौजूद बैक्टीरिया को किण्वित करने की अनुमति देगी। इससे गैसों का उत्पादन होगा जो प्रोटोकॉल में मिट्टी के इनक्यूबेशन के दौरान उपयोग किए जाने वाले माइक्रोसेंट्रिफ्यूज ट्यूब या 13 एमएल संस्कृति ट्यूबों को जबरन खोल देगा। शोरबा युक्त क्लोरैम्फेनिकॉल में जीवाणु संदूषण एक मुद्दा है, तो क्लोरैम्फेनिकॉल को मजबूत एंटीबायोटिक दवाओं के साथ प्रतिस्थापित या पूरक किया जा सकता है। मिट्टी से ए फ्यूमिगेटस को अलग करते समय, एसडी शोरबा को हाइड्रोफोबिक ए फ्यूमिगेटस कोनिडिया35,36 को निलंबित करने में मदद करने के लिए ट्वीन 20 समाधान (1% ट्वीन 20 के साथ 0.2 एम एनएसीएल) के साथ प्रतिस्थापित किया जा सकता है। निलंबन के बाद, 100 μL एसडी अगर पर चढ़ाया जा सकता है और 50 डिग्री सेल्सियस पर ऊष्मायन किया जा सकता है।

एस्परगिलस फ्यूमिगेटस जल्दी से बढ़ता है और 22 डिग्री सेल्सियस और 50 डिग्री सेल्सियस के बीच एसडी अगर और एमईए मीडिया दोनों पर अकेले ऊष्मायन करने पर प्रचुर मात्रा में फैलता है। हालांकि, मिट्टी के नमूने में अन्य थर्मोटोलरेंट प्रजातियां मौजूद हैं, इसके आधार पर, ए फ्यूमिगेटस विकास और स्पोरुलेशन बाधित हो सकता है (चित्रा 3 ए, डी)। ऐसी स्थिति में, बाद की फसल और लक्षण वर्णन के लिए एक शुद्ध कॉलोनी प्राप्त करने के लिए एक से कई उपसंवर्धन चरणों की आवश्यकता हो सकती है।

चित्रा 5 में ए फ्यूमिगेटस उपभेदों का टुकड़ा विश्लेषण कार्यक्रम ओसिरिस का उपयोग करके आयोजित किया गया था। कई पीसीआर कलाकृतियों चित्रा 5 सी में प्रकाश डाला गया है और डी वाल्क एट अल द्वारा विस्तार से चर्चा कर रहे हैं। बी -1 हकलाना चोटियों जिसमें छोटे दोहराव मूल्य होते हैं, डीएनए पोलीमरेज़ द्वारा एंटीसेंस स्ट्रैंड के संश्लेषण के दौरान स्ट्रैंड स्लिपेज के कारण होते हैं। एन -1 चोटियां तब होती हैं जब पीसीआर के दौरान डीएनए एकाग्रता बहुत अधिक होती है। अनुशंसित डीएनए एकाग्रता 0.1 एनजी है जैसा कि ऊपर प्रोटोकॉल में कहा गया है। एक अन्य विरूपण साक्ष्य डाई रक्तस्राव है जिसे गैर-अतिव्यापी अवशोषण तरंग दैर्ध्य के साथ फ्लोरोसेंट लेबल का उपयोग करके सुधारा जा सकता है। उदाहरण के लिए, फ्लोरोसेंट लेबल 6-एफएएम, हेक्स, और एटीटीओ 550, साथ ही एलआईजेड 600 डाई मानक, अलग-अलग टुकड़ा चोटियों (चित्रा 5) उत्पन्न करते हैं। अंत में, ऑफ-स्केल चोटियों को रोकने के लिए, केशिका वैद्युतकणसंचलन से पहले प्रत्येक पीसीआर प्रतिक्रिया (इस मामले में, यह ~ 50x कमजोर पड़ने था) को पतला करें। प्रतिक्रिया मिश्रण में अप्रयुक्त फॉरवर्ड प्राइमरों के प्रतिदीप्ति को कम करने के लिए, मास्टर मिश्रण बनाते समय रिवर्स प्राइमरों के सापेक्ष फॉरवर्ड प्राइमर सांद्रता को आधा करें।

इस प्रोटोकॉल की उच्च थ्रूपुट और रूढ़िवादी प्रकृति मिट्टी से कई खमीर और मोल्डों के अपेक्षाकृत त्वरित और आसान अधिग्रहण की अनुमति देती है। हालांकि, नमूना पद्धति के साथ दो मुख्य सीमाएं मौजूद हैं। सबसे पहले, मिट्टी से उगाए गए खमीर उपनिवेशों की रूपात्मक विशेषताओं का उपयोग अद्वितीय प्रजातियों के लिए चयन करने के लिए किया गया था। इन्हें तब उपसंस्कृत किया गया था और आईटीएस अनुक्रमण के माध्यम से प्रजातियों की पहचान के लिए उपयोग किया जाता था। यह मौजूद खमीर प्रजातियों के प्रतिनिधित्व को अधिकतम करने के लिए किया गया था। हालांकि, खमीर प्रजातियां जो चयनित कॉलोनियों के समान या समान आकृति विज्ञान साझा करती हैं, उपसंस्कृति करने में विफल हो सकती हैं। दूसरा, ए फ्यूमिगेटस अलगाव के दौरान, जैसा कि मिट्टी के नमूने के अनुसार केवल एक व्यक्तिगत कॉलोनी का चयन किया जाता है, मिट्टी के नमूने के भीतर कई व्यक्तियों की उपस्थिति याद की जाएगी। इससे नमूना आबादी के भीतर मौजूद वास्तविक आनुवंशिक विविधता का कम प्रतिनिधित्व हो सकता है, क्योंकि एक ही मिट्टी के नमूने के भीतर मौजूद अद्वितीय जीनोटाइप एकत्र नहीं किए जाएंगे। इस मुद्दे को कम करने के लिए, ठोस मीडिया पर पहली संवर्धन के बाद एकल कॉलोनी चरण के लिए लकीर के दौरान, अतिरिक्त जीनोटाइप प्राप्त करने के लिए कई एकल कॉलोनियों को एकत्र किया जा सकता है। प्रति नमूना उपयोग की जाने वाली मिट्टी की छोटी मात्रा प्रति नमूना बड़ी मात्रा में मिट्टी का उपयोग करने वाले तरीकों की तुलना में इस नमूना सीमा को कम करने में मदद करती है।

खमीर और मोल्ड के अलगाव के लिए इस उच्च-थ्रूपुट और श्रम-कुशल प्रोटोकॉल का उपयोग प्रति नमूना कम प्रयास का उपयोग करते हुए मिट्टी की आबादी के भीतर व्यक्तियों की संख्या में वृद्धि करेगा। सांख्यिकीय शक्ति में वृद्धि मिट्टी के भीतर कृषि योग्य खमीर समुदायों की बेहतर तस्वीर प्रदान करेगी और मिट्टी की आबादी को चिह्नित करने में मदद करेगी ए।

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Disclosures

लेखकों के पास घोषित करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

इस शोध को कनाडा के प्राकृतिक विज्ञान और इंजीनियरिंग अनुसंधान परिषद (अनुदान सं। एएलएलआरपी 570780-2021) और मैकमास्टर विश्वविद्यालय।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1.5 mL microcentrifuge tube Sarstedt Inc 72.690.001
Benomyl powder  Toronto Research Chemicals B161380
Chloramphenicol powder  Sigma-Aldrich SKU: C0378-5G
Dextrose Sigma-Aldrich SKU: D9434-500G
Fragment Analysis Software NCBI's Osiris https://www.ncbi.nlm.nih.gov/osiris/
ITS sequence database NCBI GenBank  https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/
ITS sequence database UNITE  https://unite.ut.ee/
Peptone Sigma-Aldrich SKU: P5905-500G
Reusable cell spreaders  Fisher Scientific 08-100-12
Sterile 10 cm diameter Petri dishes  Sarstedt Inc 83.3902
Sterile 13 mL culture tubes  Sarstedt Inc 62.515.006
Wooden plain-tipped applicator sticks  Fisher Scientific 23-400-112
Yeast extract Sigma-Aldrich SKU: Y1625-250G

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कवक जनसंख्या संरचना की जांच करने के लिए मिट्टी से कृषि योग्य खमीर और मोल्ड्स का अलगाव
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Samarasinghe, H., Korfanty, G., Xu, J. Isolation of Culturable Yeasts and Molds from Soils to Investigate Fungal Population Structure. J. Vis. Exp. (183), e63396, doi:10.3791/63396 (2022).

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