Summary
이 프로토콜은 7 일 이내에 대규모 토양 샘플 세트에서 효모와 곰팡이 Aspergillus fumigatus를 배양하는 효과적이고 신속한 방법입니다. 이 방법은 실험에 필요한 다양한 인큐베이션 배지 및 온도를 수용하도록 쉽게 변형 될 수 있습니다.
Abstract
토양은 엄청난 양의 미생물 생명체의 숙주이며, 각 그램에는 수십억 개의 박테리아, 고고 및 곰팡이 세포가 포함되어 있습니다. 효모로 광범위하게 정의 된 곰팡이 및 단세포 균류와 같은 다세포 균류는 유기 물질의 분해제 및 다른 토양 거주자를위한 식량원으로서 토양 생태계에서 필수적인 역할을 수행합니다. 토양의 곰팡이 종의 다양성은 강우량 및 온도와 같은 다양한 기후 요인뿐만 아니라 유기물, pH 및 수분을 포함한 토양 특성에 달려 있습니다. 특히 아시아, 아프리카, 남미 및 중앙 아메리카 지역에서 적절한 환경 샘플링이 부족하면 토양 곰팡이 공동체의 특성화와 새로운 종의 발견을 방해합니다.
우리는 ~ 4,000 토양 샘플과 효모와 곰팡이의 분리를 위해 실험실에서 개발 된 프로토콜을 사용하여 여섯 대륙의 아홉 개국의 토양 곰팡이 공동체를 특성화했습니다. 이 프로토콜은 박테리아 성장을 억제하면서 액체 배지에서 효모와 의학적으로 관련된 곰팡이 Aspergillus fumigatus에 대한 별도의 선택적 농축으로 시작됩니다. 생성 된 콜로니는 고체 배지로 옮겨지고 순수한 배양물을 얻기 위해 추가로 처리되고 하류 유전 적 특성화가 뒤 따른다. 효모 종 동일성은 핵 리보솜 RNA 유전자 클러스터의 내부 전사 스페이서 (ITS) 영역의 시퀀싱을 통해 확립되며, A. fumigatus의 글로벌 인구 구조는 마이크로 위성 마커 분석을 통해 탐구됩니다.
이 프로토콜은 카메룬, 캐나다, 중국, 코스타리카, 아이슬란드, 페루, 뉴질랜드 및 사우디 아라비아의 토양 효모 및 A. fumigatus 개체군을 분리하고 특성화하는 데 성공적으로 적용되었습니다. 이 발견은 토양 효모 다양성의 글로벌 패턴뿐만 아니라 A. fumigatus의 글로벌 인구 구조 및 항진균 저항 프로파일에 대한 많은 필요한 통찰력을 보여주었습니다. 이 논문은 국제 토양 샘플에서 효모와 A. fumigatus를 분리하는 방법을 제시합니다.
Introduction
토양 생태계의 곰팡이는 유기물 분해, 영양 순환 및 토양 시비에 필수적인 역할을합니다1. 배양-독립적(즉, 고처리량 시퀀싱) 및 배양-의존적 접근법 둘 모두는 토양 진균 2,3의 연구에 널리 사용된다. 고처리량 메타바코드 시퀀싱에 의해 생성된 다량의 데이터는 공동체 구조와 다양성의 광범위한 패턴을 밝히는 데 유용하지만, 문화 의존적 접근 방식은 순수한 곰팡이 배양의 가용성으로 인해 다운스트림 다양성 및 기능 분석을 통해 개별 유기체의 분류 및 기능 구조에 대한 매우 보완적인 정보뿐만 아니라 개별 유기체의 보다 구체적인 프로파일을 제공할 수 있습니다.
토양 그램 당 수천 개의 세포를 거의 초과하지 않음에도 불구하고, 단세포 균류로 광범위하게 정의 된 효모는 다른 토양 거주자 4,5에게 필수적인 분해제 및 식품 공급원입니다. 사실, 효모는 남극 대륙 6,7과 같은 차가운 생물권에서 우세한 토양 균류일 수 있다. 토양은 또한 인간과 다른 포유류에 심각한 기회 감염을 일으키는 의학적으로 관련된 효모의 주요 저수지입니다8. 형태학적 유사성에도 불구하고, 효모 종은 계통유전학적으로 다양하며, 진균 왕국 내에서 두 개의 주요 필라, Ascomycota 및 Basidiomycota의 필라멘트 진균 사이에서 발생한다9. 효모는 핵 리보솜 RNA 유전자 클러스터(10)의 내부 전사된 스페이서(ITS) 영역인 진균 바코딩 유전자에서 정의된 DNA 시그니처가 결여되어, 메타게놈학 조사에서 다른 진균과 구별할 수 없게 만들고, 따라서 효모 종을 분리하기 위한 배양-의존적 방법의 사용을 필요로 한다.
아래 프로토콜은 9 개국의 토양 효모 공동체를 특성화하고 토양 효모 다양성9,11,12의 세계적인 추세와 패턴을 식별하기 위해 구현되었습니다. 메타게놈학 접근법은 효모 2,3과 같은 유기체의 표적 집단을 연구할 때 제한적으로 사용된다. 그들의 계통 발생 다양성으로 인해, 효모는 DNA 서열만으로 다른 곰팡이와 구별 될 수 없습니다. 따라서 효모 개체군을 연구하려면 문화 의존적 격리를 지속적으로 사용해야합니다. 그러나 배양은 종종 훨씬 더 많은 시간이 걸리고 실험을 수행하는 데 더 많은 인력이 필요합니다. 따라서 프로토콜은 제한된 인력으로 더 빠른 처리를 위해 최적화되고 간소화되었습니다. 배양의 가장 큰 장점은 확인 된 효모 종은 죽은 효모가 아닌 살아있는 효모이므로 토양에 존재하는 일시적인 세포보다는 진정한 토양 거주자가 될 가능성이 더 높다는 것입니다. 토양의 곰팡이 DNA의 약 40 %는 다른 환경, 세포 외 오염 물질 또는 더 이상 손상되지 않은 세포에서 나온 것으로 추정되어 곰팡이 풍부도를 55 % 과대 평가하기위한 높은 처리량 시퀀싱 접근법을 유발합니다 13. 배양-의존적 분리는 하류 분석에 사용될 순수한 배양물을 확보하는 추가적인 이점으로 효모 종 동일성을 쉽게 확인할 수 있다. 실제로, 44 추정 새로운 효모 종의 순수한 배양은 분류 및 기능적 특성을 자세히 연구하기 위해 다양한 방법의 사용을 허용하는이 토양 분리 프로토콜을 사용하여 확인되었습니다14.
아래의 프로토콜은 또한 A. fumigatus와 같은 토양 내에 존재하는 곰팡이를 분리하는 데 사용할 수 있습니다. 아스퍼질러스 푸미가투스(Aspergillus fumigatus)는 토양15에 널리 분포되어 있는 고온성 및 보호성 곰팡이입니다. 그것은 수많은 임상 및 비 임상 환경에서 분리되었습니다. 비임상 샘플링에는 일반적으로 공기, 유기 파편 (퇴비, 톱 먼지, 튤립 전구 폐기물) 및 토양 (농업, 정원 및 자연 토양)16,17,18,19이 포함됩니다. 아스퍼질러스 후미가투스(Aspergillus fumigatus)는 아스퍼질라증(aspergillosis)이라고 불리는 다양한 감염을 일으키는 인간 기회주의적 병원체로, 전 세계 800만 명 이상의 사람들에게 영향을 미치고16,20명에 이른다. 전 세계 약 300,000명의 사람들이 침습성 아스퍼질라증을 앓고 있으며, 이는 아스퍼질라증16의 가장 심각한 형태입니다. 환자 집단, 감염 부위 및 항진균 요법의 효능과 같은 요인에 따라 사망률은 90 %만큼 높을 수 있습니다. 지난 수십 년 동안 항진균 요법에 대한 내성이 증가하여 임상 및 환경 인구 모두에서 이러한 내성 유전자형21,22,23을 추적하기위한 전 세계적인 감시 노력이 필요했습니다. 50 ° C 이상의 온도에서 자랄 수있는 능력을 감안할 때,이 온도는 배양 의존적 인 방법을 사용하여 토양에서 A. fumigatus 분리물을 선택하기 위해 악용 될 수 있습니다. 아스퍼질러스 푸미가투스 단리물은 일반적으로 아홉 개의 고도로 다형성 짧은 탠덤 반복(STR) 유전자좌에서 유전자형화되며, 균주24 사이에 높은 차별력을 갖는 것으로 나타났다. 이러한 STR 유전자형은 약물 내성 유전자를 포함한 A. fumigatus 유전자형의 확산을 추적하기 위해 이전에 조사된 다른 개체군과 비교될 수 있다.
아래에서 우리는 효모와 A. fumigatus를 배양 의존적 인 방식으로 토양 샘플에서 신속하게 분리하기위한 프로토콜을 설명합니다. 샘플 당 수득된 토양의 양에 따라, 토양 샘플은 두 프로토콜 사이에서 공유될 수 있다. 토양에서 효모와 A. fumigatus를 분리하는 유사한 방법과 비교하여,이 프로토콜은 얻은 분리 물 당 10 배 적은 토양을 사용합니다. 토양에서 A. fumigatus를 분리하려는 연구는 분리 된 토양 당 1 ~ 2g의 토양을 필요로하지만,이 프로토콜은 0.1-0.2g의 토양18,19,25 만 필요로합니다. 이 프로토콜은 처리량이 높은 설계를 용이하게 하는 더 작은 플라스틱과 용기를 사용합니다. 따라서 인큐베이터 및 롤러 드럼과 같은 장비를위한 더 적은 공간을 사용하여 더 많은 수의 샘플을 처리 할 수 있습니다. 토양 샘플은 7 일 이내에 분리 물을 얻기 위해 완전히 처리 될 수 있습니다. 이 프로토콜은 1 인당 하루에 최대 150-200 개의 샘플을 처리 할 수 있도록 최적화되었습니다.
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Protocol
참고 : 국제 토양 샘플 및 / 또는 A. fumigatus 포자 및 균사체를 활용하는 모든 단계는 레벨 2 유기체 (BSCII)의 생물 안전 캐비닛 내에서 작업해야합니다.
1. 토양에서 효모의 분리
- 항균 및 항진균 용액의 제조
- 클로람페니콜 분말을 70% 에탄올에 현탁하여 50g/L 원액을 제조하였다. 주사기 여과에 의해 멸균하고 4°C에서 보관한다.
참고 :이 항생제는 토양 효모 격리 중에 대부분의 박테리아의 성장을 방지합니다. 클로람페니콜 내성 박테리아가 여전히 성장할 수 있기 때문에, 효모와 박테리아를 구별할 때 콜로니 형태학을 신중하게 고려해야 합니다. 항생제 내성 박테리아 균주를 함유하는 것으로 의심되는 토양으로 작업할 때 추가적인 항생제가 배지에 첨가될 수 있다. 클로람페니콜이 보충된 배지의 세균 오염은 효모를 환경 토양에서 분리할 때 발생하는 문제가 되지 않았습니다. - 베노밀 분말을 DMSO에 현탁하여 5 g/L 원액을 제조하였다. 주사기 여과에 의해 멸균하고 4°C에서 보관한다.
참고 :이 선택적 항진균제는 토양 효모 분리26,27 동안 효모 성장에 영향을 미치지 않고 대부분의 필라멘트 성 곰팡이의 성장을 방지합니다.
- 클로람페니콜 분말을 70% 에탄올에 현탁하여 50g/L 원액을 제조하였다. 주사기 여과에 의해 멸균하고 4°C에서 보관한다.
- 문화 배지 및 멸균 장비의 제조
- YEPD(Yeast Extract-Peptone-Dextrose) 국물을 제조하기 위해, 이중 증류수 1 L에 효모 추출물 10 g, 펩톤 20 g 및 덱스트로스 20 g을 첨가한다. 잘 섞일 때까지 교반하고 121°C에서 40분 동안 오토클레이브한다. 사용할 때까지 실온에서 보관하십시오.
- YEPD 고체 한천 배지
- 효모 추출물 10g, 펩톤 20g, 덱스트로스 20g, 한천 20g을 물 1L에 섞는다. 잘 섞어 잘 저어주고 121°C에서 40분 동안 오토클레이브한다.
- 충분히 냉각되면 스톡 용액에서 클로람페니콜과 베노밀 1mL를 첨가하여 두 항균제의 최종 농도를 각각 50mg/L 및 5mg/L로 높입니다.
- 저어주면서 잘 섞어서 직경 10cm 페트리 접시에 붓는다. 실온에서 밤새 방치하고 사용 전까지 4°C에서 보관한다.
참고 : YEPD 1L에서 약 40 개의 플레이트를 부을 수 있습니다.
- 나무로 된 일반 팁이 달린 어플리케이터 스틱과 재사용 가능한 셀 스프레더를 오토클레이빙으로 살균하고 실온에서 보관하십시오.
- 액체 국물에 토양의 부화
- 멸균 13 mL 배양 튜브 세트를 토양 샘플 ID로 라벨링하여 준비한다.
- 혈청 학적 피펫을 사용하여 클로람페니콜과 베노밀로 보충 된 YEPD 국물 5 mL를 각 튜브에 첨가하십시오.
- BSCII에서 작업하면서 ~0.1g의 토양을 멸균된 목재 일반 팁 어플리케이터를 사용하여 적절한 배양 튜브로 옮깁니다.
참고: 각 토양 샘플에 대해 신선한 어플리케이터를 사용하고 시료 간의 교차 오염을 방지하기 위해 사용 즉시 폐기하십시오. - 유출을 방지하기 위해 튜브를 첫 번째 정류장에 단단히 고정시키지만 인큐베이션 중에는 공기 교환을 허용합니다. 배양 튜브를 효모 성장을 최대화하는데 최적으로 간주되는 온도에서 24 h 동안 롤러 드럼에서 인큐베이션한다.
참고 : 배양 온도는 토양 샘플의 원산지 국가의 평균 연간 온도를 기준으로 결정되어야합니다. 예를 들어, 아이슬란드로부터 토양 효모를 분리할 때, 배양 튜브는 14°C에서 인큐베이션된 반면, 사우디아라비아로부터의 토양은 30°C에서 인큐베이션되었다. 더 낮은 온도에서 효모 성장이 느려지기 때문에 배양 시간을 최대 72 시간까지 연장해야 할 수도 있습니다.
- 상청액을 고체 배지로 옮긴다.
- 단계 1.2에서 제조된 YEPD + 클로람페니콜 + 베노밀 한천 플레이트의 세트를 사용하여, 이들을 토양 샘플 ID로 라벨링한다.
- 단계 1.3에서 제조된 배양 튜브를 롤러 드럼으로부터 분리한다. BSCII에서 작업하면서 튜브를 간단히 와류하여 바닥에 정착했을 수있는 토양 입자와 세포를 다시 현탁액으로 그립니다.
- 마이크로피펫을 사용하여, 100 μL의 상청액을 플레이트 상으로 옮긴다. 멸균 된 재사용 가능한 세포 스프레더를 사용하여 액체를 한천 표면 위로 철저하고 고르게 퍼뜨립니다.
참고: 10개의 샘플 세트로 작업하면 이 프로세스 속도가 크게 빨라질 수 있습니다. 상층액을 먼저 10 개의 플레이트 상에 피펫 한 다음 확산을 수행하십시오. 샘플 간의 교차 오염을 피하기 위해 각 샘플에 대해 신선한 스프레더를 사용하십시오. - 플레이트를 비닐 봉지에 쌓고, 밀봉하고, 미생물 성장이 보일 때까지 액체 배양에 이전에 사용된 것과 동일한 온도에서 2-3일 동안 거꾸로 배양한다.
- 효모의 검출 및 단일 식민지에 대한 줄무늬
- 충분한 인큐베이션 시간 (일반적으로 2-3 일, 그러나 더 낮은 온도에서 더 오래 걸릴 수 있음)을 허용 한 후, BSCII에서 플레이트를 검사하여 효모 성장이 있는지 검사하십시오. 박테리아 및 곰팡이 식민지와 쉽게 구별되는 크림 같은 둥글고 무광택 같은 효모를 찾으십시오.
참고 : 일부 효모는 착색 안료를 생성하고 검은 색 / 갈색, 노란색 또는 빨간색으로 나타날 수 있지만 전반적인 식민지 질감과 모양은 비 색소 효모와 유사합니다. - 추가 처리를 위해 각 플레이트에서 하나의 효모 같은 콜로니를 선택하십시오.
참고: 단일 플레이트에서 둘 이상의 형태학이 관찰되는 경우, 각 형태학적 유형에 대해 하나의 대표적인 콜로니를 선택하십시오. - 멸균 된 나무 일반 팁 어플리케이터 스틱을 사용하여 선택한 각 식민지를 신선한 YEPD + 클로람페니콜 + 베노밀 플레이트로 옮기고 단일 식민지에 줄무늬를 만듭니다. 세 개의 개별 줄무늬를 수행합니다.
- 어플리케이터 스틱을 사용하여 플레이트의 세 번째 위에 앞뒤로 줄무늬를 놓습니다. 두 번째 및 세 번째 줄무늬를 앞의 줄무늬에 걸쳐 어플리케이터를 한 번 줄무늬로 시작합니다. 모든 줄무늬에 대해 새로운 어플리케이터 스틱을 사용하십시오.
주: 분리형당 하나의 플레이트를 사용하십시오. 샘플 간의 교차 오염을 피하기 위해 사용시 즉시 어플리케이터를 폐기하십시오.
- 어플리케이터 스틱을 사용하여 플레이트의 세 번째 위에 앞뒤로 줄무늬를 놓습니다. 두 번째 및 세 번째 줄무늬를 앞의 줄무늬에 걸쳐 어플리케이터를 한 번 줄무늬로 시작합니다. 모든 줄무늬에 대해 새로운 어플리케이터 스틱을 사용하십시오.
- 접시를 비닐 봉지에 쌓고, 밀봉하고, 단일 식민지가 보일 때까지 이전에 사용 된 것과 동일한 온도에서 2-3 일 동안 거꾸로 배양하십시오.
- 충분한 인큐베이션 시간 (일반적으로 2-3 일, 그러나 더 낮은 온도에서 더 오래 걸릴 수 있음)을 허용 한 후, BSCII에서 플레이트를 검사하여 효모 성장이 있는지 검사하십시오. 박테리아 및 곰팡이 식민지와 쉽게 구별되는 크림 같은 둥글고 무광택 같은 효모를 찾으십시오.
- ITS 시퀀싱을 통한 효모 종 확인
- 토양 당 잘 분리된, 단일 콜로니를 선택하여 분리하고, 신선한 YEPD + 클로람페니콜 + 베노밀 플레이트 상에 계대배양하여 더 많은 세포를 얻었다. 이전에 사용한 것과 동일한 온도에서 2-3일 동안 배양한다.
- 갓 성장한 세포를 수확하고 이를 이중 증류수에 멸균된 30% 글리세롤 1 mL를 함유하는 -80°C 냉동고 튜브에 현탁시켜 세포 현탁액을 생성한다. 이러한 현탁액을 원액으로서 -80°C에서 유지한다.
- 신선한 세포를 사용하여 프라이머 ITS1 (5' TCCGTAGGTGAACCTGCGG 3') 및 ITS4 (5' TCCTCCGCTTATTGATGATGC 3')로 콜로니 PCR (중합 효소 연쇄 반응)을 수행하여 곰팡이 바코딩 유전자 인 ITS9를 증폭시킵니다. 다음의 열순환 조건을 사용하십시오: 95°C에서 10분 동안 초기 변성 단계, 이어서 (i) 30초 동안 95°C, (ii) 30초 동안 55°C, 및 (iii) 1분 동안 72°C의 35 사이클이 뒤따른다.
참고: 콜로니 PCR은 DNA 추출에 이어 PCR보다 높은 성공률과 빠른 처리 시간을 가지고 있습니다. - 균주에 대해 콜로니 PCR이 반복적으로 실패하는 경우, 선택한 프로토콜을 사용하여 DNA를 추출하고 추출된 게놈 DNA를 주형으로 사용하여 ITS PCR을 수행한다(위와 동일한 열순환 조건 사용).
참고 : 비교적 저렴한 클로로포름 기반 DNA 추출이 권장됩니다28. - 생어 시퀀싱을 수행하여 각 균주에 대해 증폭된 ITS 영역의 DNA 서열을 결정한다.
- 효모 균주의 수득된 ITS 서열을 NCBI GenBank 및 UNITE와 같은 공개 데이터베이스에 기탁된 서열과 비교하여 종 동일성을 확립한다.
2. 토양에서 아스퍼질러스 후미가투스의 분리
- 토양 시료 당 항생제 클로람페니콜이 보충된 멸균 Sabouraud 덱스트로스 브로스 (SDB) 1 mL를 준비하십시오.
- 펩톤 10g과 덱스트로스 20g을 증류수 1L에 첨가한다. 121°C에서 40분 동안 오토클레이브.
- SDB를 ~ 50 °C까지 식히고 50 g / L 클로람페니콜 1 mL를 첨가하여 농도를 50 mg / L로 유지하십시오.
참고: 클로람페니콜은 효모 분리를 위해 상기 기재된 바와 동일하게 제조된다. 박테리아 성장을 억제하는 것 외에도, 클로람페니콜은 또한 단계 2.2에 설명된 배양 단계 동안 튜브가 열리게 하는 박테리아로부터의 가스 생성을 방지한다. - 무균적으로 분취량 1 mL의 SDB를 기계적 피펫을 사용하여 토양 샘플 당 1.5 mL 미세원심분리 튜브에 넣는다.
- 1.5 mL 마이크로 원심분리 튜브에 토양을 추가하십시오.
- BSCII 내부에 벤치 코트 또는 흡수성 패딩을 깔아 엎질러진 토양을 처리하십시오.
- 오토클레이브 어플리케이터 스틱을 사용하여 약 0.1g의 토양을 1mL의 SBD가 들어있는 1.5mL 마이크로 원심분리 튜브로 옮깁니다. 튜브와 볼텍스를 닫습니다. 부유 토양을 50°C에서 3일 동안 인큐베이션한다.
참고: 인큐베이션 중 흔들림은 필요하지 않습니다.
- 토양 접종 국물의 균사 수확
- 맥아 추출물 한천 (MEA) 플레이트를 준비하십시오.
- MEA 1 리터 당 : 맥아 추출물 20g, 덱스트로스 20g, 펩톤 6g, 한천 15g을 증류수 1L에 첨가하십시오. 121°C에서 40분 동안 오토클레이브.
- MEA를 ~ 50 °C까지 식힌 다음 50 g / L 클로람페니콜 1 mL를 첨가하여 50 mg / L의 최종 농도로 유지하십시오.
- 균사체를 토양 접종 국물에서 MEA 플레이트로 옮깁니다.
- SDB에서 공기 경계까지 균사체 성장을 보이는 토양 접종물을 확인하십시오.
- 멸균 된 목재 일반 팁 어플리케이터 스틱을 사용하여 균사체를 MEA 플레이트의 중앙으로 옮깁니다. MEA 플레이트를 3일 동안 37°C에서 인큐베이션한다.
- 맥아 추출물 한천 (MEA) 플레이트를 준비하십시오.
- A. fumigatus 형태 학적 특성을 가진 균사체의 선택.
- 특징적인 A. fumigatus 형태 학적 특성 (성장과 같은 녹색 스웨이드)을 가진 곰팡이 식민지를 확인하십시오.
- BSCII에서 일하면서 멸균 된 목재 일반 팁 어플리케이터 스틱 또는 접종 루프를 사용하여 표면을 한 번 긁어 코니디아 / 균사체를 수확하십시오. 포자 / 균사체를 단일 식민지를 위해 한천에 묶어서 MEA 플레이트의 중앙으로 옮깁니다. 37°C에서 2일 동안 인큐베이션한다.
참고 : 여러 A. fumigatus 균주 및 / 또는 다른 곰팡이가 플레이트에 존재할 수 있으므로 단일 식민지에 대해 줄무늬를 두는 것이 중요합니다. 효모 분리 프로토콜에서 단계 1.5.3에서 단일 콜로니 스트레킹 프로토콜이 사용될 수 있다. - 멸균 어플리케이터 스틱 또는 접종 루프를 사용하여, 단계 2.4.1.2에서 생성된 단일 콜로니를 콜로니를 1회 스트레킹함으로써 MEA 상에 계대배양한다. 수확 된 포자를 플레이트의 중앙에 퍼뜨립니다. 37°C에서 2일 동안 인큐베이션한다.
- 문화 저장을위한 A. fumigatus 포자 / 균사체 수확
- 멸균 30% 글리세롤 용액을 제조하였다(100 mL 용액의 경우, 이중 증류수 70 mL와 혼합된 100% 글리세롤 30 mL를 가하고, 121°C에서 40분 동안 멸균).
- BSCII에서 작업하면서 p1000 피펫을 사용하여 30% 글리세롤 용액 1mL를 흡인합니다. 글리세롤 용액 1mL를 A. fumigatus 콜로니에 분배하여 포자/균사체를 수확합니다.
- A. fumigatus 포자 / 균사체의 소수성으로 인해 피펫 팁을 사용하여 플레이트의 조밀하게 다공 된 영역을 긁으십시오.
참고 : 글리세롤이 스크래치에 분배 될 때, 글리세롤은 한천 위로 굴러 가지 않고 스크래치 영역에 부착됩니다. - 글리세롤을 스크래치 부위에 천천히 분배하여 포자를 제거하고 글리세롤 용액에 현탁시킵니다.
- 일단 완전히 분배되면, 가볍게 플레이트를 팁하고 글리세롤 포자 / 균사체 현탁액을 흡인하십시오.
참고: 약 750 내지 800 μL가 흡인될 것이다. - 흡인물을 멸균 냉동고 튜브로 옮기고 -80°C에서 보관한다. 필요한 경우 2.5.2.1에서 2.5.2.4 단계를 반복하여 작업 스톡을 만듭니다.
- A. fumigatus 포자 / 균사체의 소수성으로 인해 피펫 팁을 사용하여 플레이트의 조밀하게 다공 된 영역을 긁으십시오.
- A. fumigatus 균주의 표현형 동정
- 단계 2.5.2로부터 생성된 포자 스톡을 사용하여, 물에 100x 희석물을 생성한다.
- 균사 및 포자 스톡의 10 μL를 흡인하고 990 μL의 물에 분배한다. 서스펜션을 소용돌이치십시오.
- 희석된 포자 현탁액 10 μL를 표준 현미경 슬라이드 상에 분주한다.
- 선택 사항: 균사체 및 포자 현탁액을 메틸렌 블루로 얼룩지게하십시오.
- 메틸렌 블루로 염색하려면 건조 될 때까지 Bunsen 버너 위로 슬라이드를 통과시켜 코니디아와 conidiophores를 슬라이드에 고정하십시오.
- 메틸렌 블루를 1-2 분 동안 바르고 물로 씻어 내십시오.
- 얼룩진 종이로 슬라이드를 말립니다.
- 400x 배율의 복합 현미경을 사용하여 현탁액을보고 conidiophores를 찾습니다. 관찰된 conidiophore 형태학을 A. fumigatus conidiophore 형태학과 비교한다.
- 단계 2.5.2로부터 생성된 포자 스톡을 사용하여, 물에 100x 희석물을 생성한다.
- A. 후미가투스 균주의 분자 동정
- 일반적인 곰팡이 DNA 추출 프로토콜에 따라 각 분리물에서 DNA를 추출하십시오.
- 아스퍼질러스 β-튜불린 유전자 (β-tub1 및 β-tub4)에 특이적인 프라이머를 사용하여, PCR을 실행하고, Alcazar-Fuoli et al.17에 의해 기술된 프로토콜에 따라 증폭된 산물에 대한 서열을 얻는다.
- 얻어진 서열을 BLAST를 사용하여 NCBI GenBank와 같은 공공 데이터베이스에 기탁된 서열과 비교한다.
- 균주 서열이 데이터베이스에서 A. fumigatus 서열과 가장 일치하는지 확인하십시오.
- 단계 2.7.2에 대한 대안으로, A. 훈증 짝짓기 유형 MAT1-1 및 MAT1-229를 표적으로 하는 멀티플렉스 PCR 반응을 실행한다.
- 멀티플렉스 PCR 반응에서 다음의 세 개의 프라이머 서열을 사용한다: AFM1: 5'-CCTTGACGCGATGGGGTGG-3'; AFM2: 5'-CGCTCCTCATCAGAACAACTCG-3'; AFM3: 5′-CGGAAATCTGATGTCGCCACG-3'.
- 다음 열순환기 파라미터를 사용하십시오: 95°C에서 5분, 95°C에서 30초의 35사이클, 60°C에서 30초, 72°C에서 1분 전에 72°C에서 최종 5분.
- 생성물을 확인하기 위해 겔 전기영동을 실행; 834 bp MAT-1 또는 438 bp MAT1-2를 찾으십시오. 짝짓기 유형 증폭을 양성 및 음성 대조군으로 확인한 A. fumigatus 균주를 사용하십시오.
- 단편 분석을 통한 A. fumigatus 균주의 미세위성 지노타이핑
참고: 아래 나열된 단계는 아홉 개의 미세위성(STR) 유전자좌에서 A. fumigatus의 지노타이핑을 광범위하게 다루지만, 몇 가지 중요한 고려 사항만 강조되었습니다. A. fumigatus STR 유전자형에 대한 자세한 내용은 De Valk et al.24,30을 참조하십시오.- De Valk et al.24에 의해 이전에 기술된 STRAf 프라이머를 사용하여 세 개의 PCR 멀티플렉스 마스터 믹스를 준비한다.
- 전방 프라이머를 형광 표지하여 모세관 전기영동을 통해 단편 크기를 결정한다. 정방향 프라이머의 농도가 마스터 믹스 내의 역방향 프라이머(1 μM)의 절반(0.5 μM)인지 확인한다.
참고: 최상의 결과를 얻으려면 모세관 전기영동 중에 사용된 선택된 염료 표준과 일치하는 흡광도 파장이 있는 형광 라벨을 사용하십시오. - 최상의 결과를 위해 핫스타트 중합효소를 사용하십시오.
- 반응 당 0.1 ng의 DNA 농도를 사용하십시오.
- 전방 프라이머를 형광 표지하여 모세관 전기영동을 통해 단편 크기를 결정한다. 정방향 프라이머의 농도가 마스터 믹스 내의 역방향 프라이머(1 μM)의 절반(0.5 μM)인지 확인한다.
- 다음의 PCR 프로그램을 사용하여 각 균주에 대해 멀티플렉스 PCR을 실행한다: 10분 동안 95°C, 30초 동안 95°C의 40 사이클, 30초 동안 60°C, 및 60초 동안 72°C, 이어서 72°C에서 10분 동안 유지하고, 4°C에서 유지시킨다.
- 겔 전기영동을 통해 증폭된 산물을 확인한다.
- 단편 분석 전문가가 권장하는대로 제품을 원하는 수준 (일반적으로 ~ 50x)으로 희석하고 모세관 전기 영동을 실행하십시오. 각 균주에 대해 세 번의 실행을 수행하며, 각 실행은 세 개의 서로 다른 형광 프로브로 세 개의 다중화 된 반응을 덮습니다.
- 아홉 개의 STR 유전자좌 각각에 대한 정확한 단편 크기를 결정하려면 단편 분석이 가능한 소프트웨어를 사용하십시오.
- 모세관 전기영동으로부터 얻은 미가공 데이터를 검색한다. 단편 분석 소프트웨어(예를 들어, 오시리스)를 사용하여 가장 큰 피크를 기준으로 단편 크기를 점수화한다.
- 조각 크기를 아홉 개의 유전자좌 각각에 대해 반복 숫자로 변환합니다. De Valk et al.24에 의해 이전에 기술된 바와 같이 참조 균주 Af293의 반복 수의 단편 크기를 사용한다.
참고: 단편 크기의 약간의 변화는 상이한 모세관 전기영동 플랫폼 사이에서 발생할 수 있습니다. 따라서, 유전자형 균주를 위한 아홉 개의 유전자좌 각각에 대해 공지된 단편 크기를 갖는 공통 참조 균주(및 내부 사다리)를 포함하는 것이 중요하다.
- De Valk et al.24에 의해 이전에 기술된 STRAf 프라이머를 사용하여 세 개의 PCR 멀티플렉스 마스터 믹스를 준비한다.
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Representative Results
토양으로부터의 효모 분리
상기 효모 분리 프로토콜은 9,12개국 9,12개국의 53개 지역에서 유래한 토양 샘플로부터 효모를 배양하기 위해 구현되었다. 전체적으로, 1,473개의 효모 균주가 3,826개의 토양 샘플로부터 분리되었다. 아홉 개의 원산지 국가의 상이한 기후 조건을 고려할 때, 각 국가의 최상의 배양 온도는 그것의 평균 연간 온도에 기초하여 결정되었다 (표 1). 14°C에서 더 느린 효모 성장을 감안할 때, 아이슬란드로부터의 토양 샘플을 롤러 드럼 상에서 추가로 48 h (총 96-120 h) 동안 인큐베이션하였다. 고체 배지 상에서 2-3일간 배양한 후, 미생물 성장은 모든 샘플에 대한 플레이트 상에서 가시화되었다(도 1A). 플레이트 상에 존재하는 각각의 효모 형태학에 대해 무작위로 선택된 콜로니를 신선한 플레이트 상의 단일 콜로니에 대해 줄무늬로 묶었다(도 1B).
성공적인 효모 분리 속도는 국가마다 달랐다(표 1). 예를 들어, 사우디아라비아 토양 샘플 562개(17.3%)에서 97개의 효모 균주를 배양한 반면, 300개의 캐나다 토양 샘플(87%)에서 261개의 효모를 배양하였다. 희소 한 분석은 샘플링 된 위치에서 진정한 효모 다양성의 정확한 추정치를 얻기 위해 충분한 토양 샘플링이 수행되었는지 여부를 결정하기 위해 수행되어야합니다. 각 국가에 대한 희귀화 분석의 예가 미리 형성되었으며, 섀넌 다양성 지수가 토양 효모 다양성의 척도로 사용되었습니다 (그림 2). 결과 희박 곡선은 포화 점근선에 접근하여 추가 샘플링이 더 많은 효모 다양성을 산출하지 못했을 가능성이 있음을 나타냅니다.
ITS 영역의 시퀀싱을 통해 1,473 개의 효모 분리 물이 134 개의 별개의 종으로 분류 될 수 있음을 보여주었습니다. 여기에는 90 종의 알려진 종과 44 종의 잠재적으로 새로운 종이 포함되었습니다. 우리는 혼합 효과 모델을 적용하여 섀넌 다양성 지수31에 의해 정량화 된 글로벌 배양 가능한 토양 효모 다양성의 예측 인자를 식별했습니다. 이 모델에서, 샘플링 위치의 평균 연간 강수량, 평균 연간 온도, 고도 및 적도까지의 거리는 고정 효과로 적합하였고, 샘플링 국가는 랜덤 효과9로 설정되었다. 이 모델은 평균 연간 강수량이 섀넌 다양성 지수 (p = 0.012)와 유의한 상관 관계가 있음을 확인했지만 다른 예측 변수와 섀넌 다양성 지수9 사이에는 유의미한 상관 관계가 발견되지 않았습니다.
이 문화 기반 프로토콜을 문화 독립적 인 방법과 비교하기 위해 우리는이 결과를 메타 게놈학 2를 사용하여 토양 균류의 세계적인 다양성을 조사한 Tedersoo 및 동료의 이전 연구와 비교했습니다. Tedersoo와 동료들은 39 개국의 토양 샘플에서 직접 추출한 DNA에 대해 ITS 영역의 높은 처리량 시퀀싱을 수행했으며, 그 중 네 가지, 즉 카메룬, 캐나다, 중국 및 뉴질랜드도이 연구에서 샘플링되었습니다. 우리는 두 데이터 세트32에 존재하는 ITS 서열을 확인하기 위해 BLAST 검색을 수행했으며, ITS 서열의 26 %가 메타게놈학 데이터 세트에서 유의한 일치 (>98.41 % 뉴클레오티드 동일성)를 가졌다는 것을 발견했습니다. 그러나 <3 %는 동일한 국가의 곰팡이 서열과 일치했으며 나머지 23 %는 다른 국가9에서 발견되는 곰팡이 서열과 일치했습니다. 우리는 효모 종 정체성으로 ITS 서열에 주석을 달는 메타게놈학 연구보다 더 성공적이었다. Tedersoo와 동료들은 효모 OTU의 수를 알려지지 않은 총 50,589 개의 곰팡이 작동 분류 단위 (OTU)를보고했다. 이 곰팡이 OTU 중 33 %는 environmental_sequence (724, 1.4 %), uncultured_soil_fungus (2,405, 4.8 %), uncultured_ectomycorrhizal_fungus (1,407, 2.8 %), 또는 uncultured_fungus (11,898, 23.5 %)로 주석을 달았습니다.
아스퍼질러스 후미가투스 토양으로부터의 격리
마이크로 원심분리 튜브에서 1 mL의 SDB에서 50 °C에서 3 일간 토양 배양 후, 균사체는 SDB 내, SDB 상에서 공기 경계 및 / 또는 내벽에서 자라는 것을 발견 할 수 있습니다. 아스퍼질러스 후미가투스 균사체는 일반적으로 SDB에서 공기 경계까지 자라는 것으로 발견되지만 SDB 표면 바로 아래에서 수확 할 수도 있습니다. 이 단계 후, 균사체는 MEA로 옮겨지고 37°C에서 3일 동안 성장한다. 플레이트 상의 균사체 성장은 A. fumigatus의 전형적인 녹색 스웨이드 형태만을 형성할 수 있다(도 3A). 보다 일반적으로, 다른 내열성 주형은 동일한 토양 내에 존재할 수 있고 동일한 플레이트 상에 또는 그 자체로 A. fumigatus와 함께 성장할 수 있다(도3B-D). 아스퍼질러스 후미가투스 격리율은 토양 효모에 대해 발견된 것과 유사하게 지리적 위치에 따라 다를 수 있습니다. 예를 들어, 캐나다 밴쿠버 내에서는 이 방법을 통해 540개의 토양 샘플(46.5%)(미공개 결과)에서 251개의 분리물을 얻었다. 대조적으로, 카메룬 내에서는 495 개의 토양 샘플 (10.3 %)33에서 51 A. fumigatus 분리 물을 수확했습니다.
A. fumigatus conidiophore 구조는 광 현미경을 사용하여 볼 수 있고 확인할 수 있습니다. Conidiophores는 스틱 형태학에 공을 가지고 있습니다 (그림 4). 또한, A. fumigatus conidiophores는 uniseriate이며, conidia 사슬에 부착 된 phialides는 구형 소포에 직접 부착됩니다. 다른 아스퍼질러스 종에서, conidiophores는 biseriate이며, 여기서 phialides는 소포에 붙어있는 metulae에 연결됩니다.
모세관 전기영동으로부터 원시 데이터의 단편 분석을 수행하여 모세관 전기영동 스펙트럼을 단편 크기로 변환하는 여러 소프트웨어 프로그램을 사용할 수 있습니다. 도 5는 오시리스 프로그램에 의해 생성된 크로마토그램이다. A. fumigatus dinucleotide (2A, 2B 및 2C), 트리뉴클레오티드 (3A, 3B, 및 3C), 및 테트라뉴클레오티드 (4A, 4B, 및 4C)의 단편 길이를 시각화하는 3개의 채널이 STR 유전자좌에 도시되어 있다. 또한, PCR 시 시료의 DNA 농도가 너무 높을 경우 발생하는 PCR 아티팩트도 나타내었다. 각 색상의 가장 높은 피크는 이 플롯에서 세 개의 STR 유전자좌의 단편 크기를 나타냅니다.
A. fumigatus STR 유전자형 사이에 존재하는 유전적 변이는 R 패키지 poppr을 사용하여 시각화될 수 있다. R 스크립트 bruvo.msn은 각 유전자형 쌍 사이에 쌍 방향 Bruvo의 유전 거리 매트릭스를 만듭니다. 이 행렬은 최소 스패닝 네트워크(MSN)를 생성하는 데 사용됩니다. 그런 다음 R 스크립트 plot_poppr_msn 또는 imsn을 사용하여 고품질 MSN을 생성할 수 있습니다(그림 6). 주성분(DAPC)에 대한 차별적 분석은 균주 간의 유전적 관계를 시각화하는 또 다른 방법이다(그림 7). R 패키지 adegenet의 R 스크립트 dapc는 DAPC를 수행하는 데 사용되며 이전에 알려지거나 알려지지 않은 그룹과 함께 사용할 수 있습니다. 알 수 없는 그룹 이전 항목에서는 K-means 클러스터링을 사용하여 가능한 개인 그룹 수를 식별합니다.
도 1: 토양 샘플로부터의 효모 분리 . (A) 미생물 성장은 배양 2-3일 후 고체 한천에서 볼 수 있다. 효모 식민지는 다른 곰팡이 / 박테리아 식민지 사이에 산재되어 있음을 알 수 있습니다. 플레이트 상의 각 형태학적 유형에 대해 하나의 대표적인 효모 콜로니가 단일 콜로니에 대해 줄무늬로 선택된다. (B) 효모 단리물의 단일 콜로니를 얻기 위해 세 줄무늬가 수행된다. 각각의 토양 단리물을 얻기 위해 하나의 플레이트를 사용하였다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 2: 토양 샘플링의 Rarefaction 분석. 아홉 개의 샘플링 된 각 국가에서 토양 효모 다양성은 섀넌 다양성 지수에 의해 정량화 된 바와 같이 토양 샘플 수가 증가함에 따라 포화에 접근합니다. 이 수치는 9에서 수정되었습니다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 3: Sabouraud dextroseagar의 Aspergillus fumigatus morphology. (A) Green suede-like A. fumigatus growth morphology. (B-D) A. 토양 샘플 내에 존재하는 다른 고온성 주형을 이용한 훈증균 성장. A. 훈증 수막은 B와 D에서 눈에 띄게 감소된다. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 4: 광학 현미경으로 아스퍼질러스 후미가투스 코니디오포어의 사진. 스케일 막대 = 10 μm. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 5: 아스퍼질러스 후미가투스 균주로부터의 아홉 개의 미세위성 유전자좌의 오시리스 출력. 출력은 (A) 디뉴클레오타이드 (2A, 2B 및 2C), (B) 트리뉴클레오타이드 (3A, 3B, 및 3C), 및 (C) 테트라뉴클레오타이드 (4A, 4B, 및 4C) STR 유전자좌에 상응한다. 정방향 프라이머 5' 형광 표지는: A = 6-FAM; B = HEX; C = ATTO550. 멀티플렉스 반응 생성물은 모세관 전기영동 전에 30x 희석하였다. LIZ600 염료 표준은 모세관 전기영동 동안 사용되었다. 원시 데이터는 60 내지 400 bp 사이의 잠재적 피크를 식별하는 피크 분석 소프트웨어 오시리스를 사용하여 분석되었다. 몇몇 PCR 아티팩트는 형광 출혈, 끊김 피크 및 N-1 피크(C)를 유발하는 오프 스케일 피크이다. 약어: 6-FAM = 6-카르복시플루오레세인; HEX = 헥사클로로플루오레세인; STR = 짧은 탠덤 반복; RFU = 상대 형광 단위; BPS = 염기쌍. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 6: 아이슬란드의 A. fumigatus 의 MLGs와 캐나다의 북서부 준주 사이의 유전 관계를 보여주는 최소 스패닝 네트워크. 각 노드는 하나의 MLG를 나타내며, 노드 크기는 각 MLG에 대한 균주 수에 해당합니다. 유전적으로 더 유사한 노드는 가장자리가 더 어둡고 두꺼운 반면, 유전적으로 멀리 있는 노드는 더 밝고 얇은 모서리를 갖습니다. 이 수치는 34에서 수정되었습니다. 약어: ISL = 아이슬란드; NWT = 캐나다의 북서부 영토; MLG = 다유전자좌 유전자형. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
그림 7: 아이슬란드, NWT, 유라시아, 북미 및 오세아니아 A. 후미가투스 개체군의 주성분(DAPC)의 판별 분석을 이용한 유전자 군집화. 단리물은 아홉 개의 미세위성 유전자좌에서 유전자형화되고 클론-보정되었으며, 총 1,703개의 독특한 다중유전자좌 유전자형이 있었다. 유전자형은 지리적 기원에 따라 착색되었다. 이 수치는 34에서 수정되었습니다. 약어: DAPC = 주성분의 판별 분석; NWT = 북서부 준주; ISL = 아이슬란드; CMR = 카메룬; CAN = 해밀턴, 온타리오, 캐나다; BEL = 벨기에; FRA = 프랑스; DEU = 독일; IND = 인도; NLD = 네덜란드; NOR = 노르웨이; NZL = 뉴질랜드; ESP = 스페인; CHE = 스위스; 미국 = 미국. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.
| 나라 | 배양 온도(°C) | 토양 샘플 | 효모 분리 물 | 알려진 종 / 소설 종 |
| 카메룬 | 30 | 493 | 110 | 10/9 |
| 캐나다 | 23 | 300 | 261 | 34/12 |
| 중국 | 23 | 340 | 230 | 23/5 |
| 코스타리카 | 30 | 388 | 95 | 20/2 |
| 프랑스 | 23 | 327 | 175 | 12/2 |
| 아이슬란드 | 14 | 316 | 211 | 11/0 |
| 뉴질랜드 | 23 | 610 | 155 | 14/4 |
| 페루 | 23 | 490 | 139 | 30/9 |
| 사우디아라비아 | 30 | 562 | 97 | 8/1 |
| 합계 | 3826 | 1473 | 90/44 |
표 1: 여섯 대륙의 아홉 개국에서 토양 효모 격리. 각 국가로부터의 토양 샘플에 대한 배양 온도는 그의 평균 연간 온도에 기초하여 결정되었다. 여기에 제시된 결과는 9,12에서 수정됩니다.
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Discussion
토양에서 효모와 A. fumigatus 를 분리하기 위해 개발 된 프로토콜은 높은 처리량의 토양 처리 및 곰팡이 격리를위한 빠르고 효율적인 방법입니다. 이 프로토콜은 샘플 당 소량의 토양 (0.1-0.2g) 만 필요하므로 비슷한 노력으로 더 많은 사이트를 샘플링 할 수 있습니다. 빠른 처리 시간을 통해 짧은 시간 내에 결과를 얻을 수 있으며 필요한 경우 문제 해결 및 반복 실험을 위한 시간을 허용합니다. 이 프로토콜은 표준 미생물학 및 세포 배양 장비를 사용하여 많은 실험실 환경에서 쉽게 복제 할 수 있습니다. 그러나 효모 나 곰팡이를 국제 토양에서 분리 할 때 추가 예방 조치가 필요합니다. 플라스틱 트레이 및 셀 스프레더와 같은 모든 비 일회용 플라스틱 장비는 10 % 표백제에 침수시킨 다음 오토 클레이빙하여 멸균해야합니다. 사용 된 벤치 코트는 비닐 봉지에 밀봉하고 폐기하기 전에 오토클레이브에서 멸균해야합니다.
참고로, 상기 프로토콜을 사용하여 단리된 효모의 수 및 동일성은 사용된 배양 조건 및 배지에 의해 제한될 수 있다. 예를 들어, 롤러 드럼에서의 24시간 인큐베이션은 느리게 성장하는 종에 비해 빠르게 성장하는 호기성 효모의 분리를 선호할 수 있다. 또한, 효모 분리를 위한 영양이 풍부한 YEPD 배지의 사용은 상이한 영양 요건 및 선호도를 갖는 효모 종을 배제했을 수 있다. 또한, 여기에 샘플링 된 대부분의 위치는 일년 내내 온도 및 기타 기후 조건의 계절적 변화를 경험합니다. 시간과 자원이 허용하는 경우, 동일한 토양 샘플을 서로 다른 온도 범위에서 처리하여 이러한 토양에 서식하는 더 넓은 범위의 효모를 분리 할 수 있습니다.
문화 독립적 인 방법은 환경 곰팡이 다양성의 대규모 패턴을 밝히는 데 중요하지만 효모와 같은 표적 균류 그룹에게는 충분한 정보를 제공하지 못합니다. 문화 의존적 격리의 사용은 지구 토양 효모 다양성과 그 예측 인자에 대한 포괄적 인 조사를 가능하게했다9. Tedersoo와 동료들이 수행 한 메타 게놈 연구는 토양 곰팡이 다양성의 글로벌 예측 인자와 패턴을 확인했지만, 이러한 발견이 효모 다양성에 특별히 적용되는 정도는 해명 될 수 없었습니다2. Tedersoo와 동료들은 평균 연간 강수량을 전 세계적으로 토양 곰팡이 다양성의 주요 기후 동인으로 확인했습니다2. 이 연구는 지구 토양에서 평균 연간 강수량과 배양 가능한 효모 다양성 사이의 유사한 상관 관계를 발견했으며, 배양 의존적 인 방법이 고 처리량 시퀀싱 접근법의 결과를 보완하고 확장 할 수 있음을 강조했다9.
클로람페니콜의 첨가는 박테리아에 의한 곰팡이 성장 간섭을 방지하기 위해 고체 및 액체 배지를 준비하는 데 중요한 단계입니다. 액체 배지에 클로람페니콜을 첨가하는 것은 항생제가 부족하여 토양에 존재하는 박테리아가 발효 될 수 있기 때문에 중요합니다. 이것은 프로토콜에서 토양 인큐베이션 동안 사용되는 마이크로 원심분리 튜브 또는 13 mL 배양 튜브를 강제로 열 가스의 생산으로 이어질 것입니다. 한천 / 국물을 함유 한 클로람페니콜의 박테리아 오염이 문제가되는 경우, 클로람페니콜은 더 강한 항생제로 대체되거나 보충 될 수 있습니다. 토양으로부터 A. fumigatus를 분리할 때, SD 브로스는 소수성 A. fumigatus conidia35,36을 현탁시키는 것을 돕기 위해 트윈 20 용액 (1% 트윈 20을 갖는 0.2 M NaCl)으로 대체될 수 있다. 현탁액 후, 100 μL를 SD 한천 상에 플레이팅하고 50°C에서 인큐베이션할 수 있다.
아스퍼질러스 푸미가투스 는 빠르게 자라며 22°C와 50°C 사이에서 SD 한천 및 MEA 배지 둘 다에서 단독으로 배양할 때 풍부하게 포자화된다. 그러나 토양 샘플에 존재하는 다른 내열성 종에 따라 A. fumigatus 성장 및 다공이 방해받을 수 있습니다 (그림 3A, D). 이러한 상황 하에서, 후속 수확 및 특성화를 위해 순수한 콜로니를 얻기 위해 하나 내지 여러 개의 계대 배양 단계가 요구될 수 있다.
도 5에서 A. fumigatus 균주의 단편 분석은 오시리스 프로그램을 사용하여 수행하였다. 몇몇 PCR 아티팩트들이 도 5C에서 강조되었고, De Valk et al.30에 의해 상세히 논의된다. 더 짧은 반복 값을 갖는 B-1 말더듬 피크는 DNA 중합효소에 의한 안티센스 가닥의 합성 동안 가닥 미끄러짐에 의해 야기된다. N-1 피크는 PCR 중에 DNA 농도가 너무 높을 때 발생합니다. 권장 DNA 농도는 위의 프로토콜에 명시된 바와 같이 0.1ng입니다. 또 다른 아티팩트는 겹치지 않는 흡광도 파장을 갖는 형광 표지를 사용하여 교정될 수 있는 염료 출혈이다. 예를 들어, 형광 표지 6-FAM, HEX 및 ATTO550 및 LIZ600 염료 표준은 별개의 단편 피크를 생성합니다 (그림 5). 마지막으로, 오프 스케일 피크를 방지하기 위해, 모세관 전기영동 전에 각 PCR 반응을 희석(이 경우, ∼50배 희석하였다). 반응 혼합물에서 사용되지 않은 정방향 프라이머의 형광을 더욱 감소시키기 위해, 마스터 믹스를 생성할 때 역방향 프라이머에 비해 정방향 프라이머 농도를 반으로 줄이십시오.
이 프로토콜의 높은 처리량과 보수적 인 특성으로 인해 토양에서 많은 효모와 곰팡이를 비교적 빠르고 쉽게 얻을 수 있습니다. 그러나 샘플링 방법론에는 두 가지 주요 제한 사항이 있습니다. 첫째, 토양에서 자란 효모 식민지의 형태학적 특성을 이용하여 독특한 종을 선택하였다. 그런 다음 이들은 계대 배양되어 ITS 시퀀싱을 통한 종 식별에 사용되었습니다. 이것은 존재하는 효모 종의 표현을 극대화하기 위해 수행되었습니다. 그러나, 선택된 콜로니에 유사하거나 동일한 형태를 공유하는 효모 종은 계대배양되지 않을 수 있다. 둘째, A. fumigatus 격리 동안, 토양 샘플 당 하나의 개별 식민지 만 선택되기 때문에 토양 샘플 내에서 여러 개인의 존재가 놓칠 것입니다. 이것은 동일한 토양 샘플 내에 존재하는 독특한 유전자형이 수집되지 않기 때문에 샘플 집단 내에 존재하는 진정한 유전 적 다양성의 과소 표현으로 이어질 수 있습니다. 이 문제를 완화하기 위해, 고체 배지 상에서 첫 번째 배양에 이어 단일 콜로니 단계를 위한 줄무늬 동안, 추가적인 유전자형을 얻기 위해 여러 개의 단일 콜로니를 수집할 수 있다. 샘플 당 사용되는 토양의 작은 부피는 샘플 당 더 많은 양의 토양을 사용하는 방법과 비교할 때 이러한 샘플링 제한을 최소화하는 데 도움이됩니다.
효모와 곰팡이를 분리하기 위해이 높은 처리량과 노동 효율적인 프로토콜을 사용하면 토양 인구 내의 개체 수가 증가하면서 샘플 당 적은 노력을 사용합니다. 통계적 힘의 증가는 토양 내에서 배양 가능한 효모 공동체에 대한 더 나은 그림을 제공하고 A. fumigatus의 토양 개체군을 특성화하는 데 도움이 될 것입니다.
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Disclosures
저자는 선언 할 이해 상충이 없습니다.
Acknowledgments
이 연구는 캐나다 자연 과학 및 공학 연구위원회 (Grant No. ALLRP 570780-2021) 및 McMaster University.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL microcentrifuge tube | Sarstedt Inc | 72.690.001 | |
| Benomyl powder | Toronto Research Chemicals | B161380 | |
| Chloramphenicol powder | Sigma-Aldrich | SKU: C0378-5G | |
| Dextrose | Sigma-Aldrich | SKU: D9434-500G | |
| Fragment Analysis Software | NCBI's Osiris | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/osiris/ | |
| ITS sequence database | NCBI GenBank | https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/ | |
| ITS sequence database | UNITE | https://unite.ut.ee/ | |
| Peptone | Sigma-Aldrich | SKU: P5905-500G | |
| Reusable cell spreaders | Fisher Scientific | 08-100-12 | |
| Sterile 10 cm diameter Petri dishes | Sarstedt Inc | 83.3902 | |
| Sterile 13 mL culture tubes | Sarstedt Inc | 62.515.006 | |
| Wooden plain-tipped applicator sticks | Fisher Scientific | 23-400-112 | |
| Yeast extract | Sigma-Aldrich | SKU: Y1625-250G |
References
- Frac, M., Hannula, S. E., Belka, M., Jȩdryczka, M. Fungal biodiversity and their role in soil health. Frontiers in Microbiology. 9, 707 (2018).
- Tedersoo, L., et al. Global diversity and geography of soil fungi. Science. 346 (6213), 1256688 (2014).
- Egidi, E., et al. A few Ascomycota taxa dominate soil fungal communities worldwide. Nature Communications. 10 (1), 1-9 (2019).
- Yurkov, A. M. Yeasts of the soil - obscure but precious. Yeast. 35 (5), 369-378 (2018).
- Botha, A. The importance and ecology of yeasts in soil. Soil Biology and Biochemistry. 43 (1), 1-8 (2011).
- Connell, L., et al. Diversity of soil yeasts isolated from South Victoria Land, Antarctica. Microbial Ecology. 56 (3), 448-459 (2008).
- Vishniac, H. S. A multivariate analysis of soil yeasts isolated from a latitudinal gradient. Microbial Ecology. 52 (1), 90-103 (2006).
- Kurtzman, C., Fell, J. W., Boekhout, T. The Yeasts: A Taxonomic Study. , Elsevier. (2011).
- Samarasinghe, H., et al. Global patterns in culturable soil yeast diversity. iScience. 24 (10), 103098 (2021).
- Xu, J.
- Samarasinghe, H., Aljohani, R., Jimenez, C., Xu, J. Fantastic yeasts and where to find them: the discovery of a predominantly clonal Cryptococcus deneoformans population in Saudi Arabian soils. FEMS Microbiology Ecology. 95 (9), 122 (2019).
- Aljohani, R., Samarasinghe, H., Ashu, T., Xu, J. Diversity and relationships among strains of culturable yeasts in agricultural soils in Cameroon. Scientific Reports. 8 (1), 1-11 (2018).
- Carini, P., et al. Relic DNA is abundant in soil and obscures estimates of soil microbial diversity. Nature Microbiology. 2 (3), 1-6 (2016).
- Xu, J. Fungal species concepts in the genomics era. Genome. 63 (9), 459-468 (2020).
- Brakhage, A. A., Langfelder, K. Menacing mold: The molecular biology of Aspergillus fumigatus. Annual Review of Microbiology. 56 (1), 433-455 (2002).
- Bongomin, F., Gago, S., Oladele, R., Denning, D. Global and multi-national prevalence of fungal diseases-Estimate precision. Journal of Fungi. 3 (4), 57 (2017).
- Alcazar-Fuoli, L., Mellado, E., Alastruey-Izquierdo, A., Cuenca-Estrella, M., Rodriguez-Tudela, J. L. Aspergillus section Fumigati: Antifungal susceptibility patterns and sequence-based identification. Antimicrobial Agents and Chemotherapy. 52 (4), 1244-1251 (2008).
- Rocchi, S., Godeau, C., Scherer, E., Reboux, G., Millon, L. One year later: The effect of changing azole-treated bulbs for organic tulips bulbs in hospital environment on the azole-resistant Aspergillus fumigatus rate. Medical Mycology. 59 (7), 741-743 (2021).
- Chowdhary, A., et al. Clonal expansion and emergence of environmental multiple-triazole-resistant Aspergillus fumigatus strains carrying the TR34/L98H mutations in the cyp51A gene in India. PLoS ONE. 7 (12), 52871 (2012).
- Kwon-Chung, K. J., Sugui, J. A. Aspergillus fumigatus-what makes the species a ubiquitous human fungal pathogen. PLoS pathogens. 9 (12), 1003743 (2013).
- Sewell, T. R., et al. Nonrandom distribution of azole resistance across the global population of Aspergillus fumigatus. mBio. 10 (3), 00392 (2019).
- Ashu, E. E., Hagen, F., Chowdhary, A., Meis, J. F., Xu, J. Global population genetic analysis of Aspergillus fumigatus. mSphere. 2 (1), 00019 (2017).
- Heo, S. T., et al. Changes in in vitro ausceptibility patterns of Aspergillus to triazoles and correlation with aspergillosis outcome in a tertiary care cancer center, 1999-2015. Clinical Infectious Diseases. 65 (2), 216-225 (2017).
- de Valk, H. A., et al. Use of a novel panel of nine short tandem repeats for exact and high-resolution fingerprinting of Aspergillus fumigatus isolates. Journal of Clinical Microbiology. 43 (8), 4112-4120 (2005).
- Yurkov, A. M., Kemler, M., Begerow, D. Assessment of yeast diversity in soils under different management regimes. Fungal Ecology. 5 (1), 24-35 (2012).
- Calhelha, R. C., Andrade, J. V., Ferreira, I. C., Estevinho, L. M. Toxicity effects of fungicide residues on the wine-producing process. Food Microbiology. 23 (4), 393-398 (2006).
- Thomas, J. H., Neff, N. F., Botstein, D. Isolation and characterization of mutations in the Β-tubulin gene of Saccharomyces cerevisiae. Genetics. 111 (4), 715-734 (1985).
- Xu, J., Ramos, A. R., Vilgalys, R., Mitchell, T. G. Clonal and spontaneous origins of fluconazole resistance in Candida albicans. Journal of Clinical Microbiology. 38 (3), 1214 (2000).
- Paoletti, M., et al. Evidence for sexuality in the opportunistic fungal pathogen Aspergillus fumigatus. Current Biology. 15 (13), 1242-1248 (2005).
- De Valk, H. A., Meis, J. F. G. M., De Pauw, B. E., Donnelly, P. J., Klaassen, C. H. W. Comparison of two highly discriminatory molecular fingerprinting assays for analysis of multiple Aspergillus fumigatus isolates from patients with invasive aspergillosis. Journal of Clinical Microbiology. 45 (5), 1415-1419 (2007).
- Bates, D., Mächler, M., Bolker, B. M., Walker, S. C. Fitting linear mixed-effects models using lme4. Journal of Statistical Software. 67 (1), 1-48 (2015).
- Camacho, C., Madden, T., Tao, T., Agarwala, R., Morgulis, A. BLAST ® Command Line Applications User Manual. National Center for Biotechnology Information. , 1-95 (2022).
- Ashu, E. E., Korfanty, G. A., Xu, J. Evidence of unique genetic diversity in Aspergillus fumigatus isolates from Cameroon. Mycoses. 60 (11), 739-748 (2017).
- Korfanty, G. A., Dixon, M., Jia, H., Yoell, H., Xu, J. Genetic diversity and dispersal of Aspergillus fumigatus in Arctic soils. Genes. 13 (1), 19 (2021).
- Snelders, E., et al. Possible environmental origin of resistance of Aspergillus fumigatus to medical triazoles. Applied and Environmental Microbiology. 75 (12), 4053-4057 (2009).
- Wang, H. -C., et al. mechanisms and genetic relatedness of the human pathogenic fungus Aspergillus fumigatus exhibiting resistance to medical azoles in the environment of Taiwan. Environmental Microbiology. 20 (1), 270-280 (2018).
