Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Optrode Array til samtidig optogenetisk modulering og elektrisk neural optagelse

Published: September 1, 2022 doi: 10.3791/63460
Automatic Translation
*1,2, *3, 3, 1, 1, 1,2, 3,4, 1,2,5
1Department of Electronic and Electrical Engineering, Ewha Womans University, 2Graduate Program in Smart Factory, Ewha Womans University, 3Department of Electrical and Computer Engineering, Seoul National University, 4Graduate School of Engineering Practice, Seoul National University, 5Department of Brain and Cognitive Sciences, Ewha Womans University
* These authors contributed equally

Summary

Her præsenterer vi fremstillingsmetoden for et optrodesystem med optiske fibre til lystilførsel og et elektrodearray til neural optagelse. In vivo-eksperimenter med transgene mus, der udtrykker channelrhodopsin-2, viser systemets gennemførlighed til samtidig optogenetisk stimulering og elektrofysiologisk optagelse.

Abstract

I løbet af det sidste årti er optogenetik blevet et vigtigt redskab til undersøgelse af neural signalering på grund af dets unikke evne til selektiv neural modulering eller overvågning. Da specifikke typer neuronale celler kan genetisk modificeres til at udtrykke opsinproteiner, muliggør optogenetik optisk stimulering eller hæmning af de udvalgte neuroner. Der har været flere teknologiske fremskridt i det optiske system til optogenetik. For nylig blev det foreslået at kombinere den optiske bølgeleder til lyslevering med elektrofysiologisk optagelse for samtidig at overvåge de neurale reaktioner på optogenetisk stimulering eller hæmning. I denne undersøgelse blev der udviklet et implanterbart optrode array (2x2 optiske fibre) med indlejrede multikanalelektroder.

En lysemitterende diode (LED) blev anvendt som en lyskilde, og et mikrofabrikeret mikrolinsearray blev integreret for at give tilstrækkelig lyseffekt ved spidsen af de optiske fibre. Optrode array-systemet omfatter engangsdelen og den genanvendelige del. Engangsdelen har optiske fibre og elektroder, mens den genanvendelige del har LED og elektronisk kredsløb til lysstyring og neural signalbehandling. Det nye design af det implanterbare optrode array-system introduceres i den ledsagende video ud over proceduren for optrodeimplantationskirurgi, optogenetisk lysstimulering og den elektrofysiologiske neurale optagelse. Resultaterne af in vivo-eksperimenter viste med succes tidslåste neurale pigge fremkaldt af lysstimuli fra hippocampale excitatoriske neuroner hos mus.

Introduction

Registrering og kontrol af neural aktivitet er afgørende for at forstå, hvordan hjernen fungerer i et neuralt netværk og på cellulære niveauer. Konventionelle elektrofysiologiske optagelsesmetoder omfatter patch clamp 1,2,3,4 ved hjælp af en mikropipette og ekstracellulær optagelse ved hjælp af mikroneuralelektroder 5,6,7,8. Som en neuromodulationsmetode er elektrisk stimulering ofte blevet brugt til direkte at stimulere en fokal hjerneregion gennem direkte eller indirekte depolarisering af neuronale celler. Den elektriske metode kan imidlertid ikke skelne mellem neuronale celletyper til optagelse eller stimulering, fordi de elektriske strømme spredes i alle retninger.

Som en ny teknologi har optogenetik indvarslet en ny æra i forståelsen af, hvordan nervesystemet fungerer 9,10,11,12,13,14,15,16. Essensen af optogenetiske teknikker er at bruge lys til at kontrollere aktiviteten af lysfølsomme opsinproteiner udtrykt af genetisk modificerede celler. Optogenetik muliggør således sofistikeret modulering eller overvågning af genetisk udvalgte celler i komplicerede neurale kredsløb14,17. Den bredere anvendelse af den optogenetiske tilgang har nødvendiggjort samtidig neural optagelse for direkte at bekræfte optisk neuromodulation. Derfor ville en integreret enhed med lysstyrings- og optagefunktioner være ekstremt værdifuld 16,18,19,20,21,22,23,24,25.

Der er begrænsninger for konventionel, laserbaseret optogenetisk stimulering, som kræver et omfangsrigt og dyrt lysleveringssystem 26,27,28,29,30. Derfor anvendte nogle forskergrupper μLED-baserede siliciumprober for at minimere størrelsen af lystilførselssystemet 31,32,33,34. Der er dog risiko for termisk hjerneskade forårsaget af direkte kontakt med μLED'er på grund af LED'ernes lave energieffektivitet. Lysbølgeledere, såsom optiske fibre, SU-8 og siliciumoxynitrid (SiON), er blevet anvendt for at undgå termisk skade 30,35,36,37,38,39. Denne strategi har imidlertid også en ulempe på grund af dens lave koblingseffektivitet mellem lyskilder og bølgeledere.

Mikrolinsearrayet blev tidligere introduceret for at forbedre lyskoblingseffektiviteten mellem lysdioder og optiske fibre40. Et optrodesystem blev udviklet baseret på mikroelektromekaniske systemer (MEMS) teknologier til optisk stimulering og elektrisk optagelse på en mikroskala40. Mikrolinsearrayet mellem en LED og optiske fibre øgede lyseffektiviteten med 3,13 dB. Som vist i figur 1 er et 2x2 optisk fiberarray justeret på 4x4 mikrolensarrayet, og LED'en er placeret under mikrolinsarrayet. De 2x2 optiske fibre er monteret i stedet for 4x4 for at reducere hjerneskade. Et wolframelektrodearray er placeret ved siden af optrodearrayet ved hjælp af silicium via huller til elektrofysiologisk optagelse (figur 1B).

Systemet består af en øverste engangsdel og aftagelige bunddele. Den øverste engangsdel, som omfatter det optiske fiberarray, mikrolenarray og wolframelektrodearrayet, er designet til at blive permanent implanteret i hjernen til in vivo-eksperimenter . Den nederste del indeholder en LED-lyskilde og en ekstern strømforsyningsledning, som let kan fjernes og genbruges til et andet dyreforsøg. Et vedhæftet plastdæksel beskytter engangsdelen, når den aftagelige del fjernes.

Systemets gennemførlighed verificeres ved implantation i hjernen hos transgene mus, der udtrykker channelrhodopsin-2 (ChR2) i Ca2+/calmodulinafhængig proteinkinase II-positive neuroner (CaMKIIα::ChR2 mus). Optagelseselektroder blev brugt til at registrere de neurale aktiviteter fra individuelle neuroner under optisk stimulering af neuronerne.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Dyreplejen og kirurgiske procedurer blev godkendt af Institutional Animal Care and Use Committee (IACUC) ved Ewha Womans University (nr. 20-029).

1. Forberedelse af et optrode array (figur 1 og figur 2)

  1. Fastgør optiske fibre med mikrolinsearrayet.
    1. Fjern passiveringsbelægningen af den optiske fiber, og skær den i 5 mm lange stykker ved hjælp af en præcisionsoptisk fiberkløver.
    2. Dyp den optiske fiber i den klare UV-harpiks, og anbring de optiske fibre på mikrolinsarrayet.
    3. Hærd harpiksen ved hjælp af en UV-lampe.
    4. Fastgør mikrolinsearrayet til det 3D-printede hus ved hjælp af epoxy.
  2. Juster perfluoralkoxy (PFA)-belagte wolframtråde.
    1. Lod de 4 stykker 30 mm lange PFA wolframtråde og 1 sølvtråd til det 5-polede, 1,27 mm pitch hun-stik. Brug sølvtråd som referenceelektrode.
    2. Tilslut 1,27 mm pitch hun-stikket til hovedtageforforstærkeren.
    3. Sæt forsigtigt wolframtråde gennem siliciumet via hullerne (figur 1B) for at hjælpe den fine justering af wolframelektroderne.
    4. Skær de justerede wolframtråde 1 mm kortere end den optiske fiberlængde.
    5. Fastgør stikket til det 3D-printede hus ved hjælp af epoxy.
  3. LED-placering
    1. Placer LED'en i det 3D-printede hus.
    2. Tilslut LED'en til det kørekredsløb, der genererer pulsbreddemodulation (PWM).
      BEMÆRK: PWM-pulsen genereres af mikrocontrolleren.
    3. I betragtning af den støj, der induceres af LED-kørekredsløbet, skal du sikre dig, at optageelektroderne er 50 mm fra LED-kørekredsløbet.
    4. Mål lysintensiteten i slutningen af den optiske fiberspids ved hjælp af en fotodiode.
  4. Nedsænk wolframelektroderne og optiske fibre i alkohol i 15 minutter. Derefter nedsænkes systemet i sterilt D.I-vand og steriliseres med ethylenoxidgas.

2. Implantationskirurgi (figur 3 og figur 4)

BEMÆRK: Steril teknik skal følges under operationen.

  1. Forbered de transgene dyr, som er genetisk modificeret til at udtrykke lysfølsomme opsinproteiner i den specifikke type neuronale celler.
    BEMÆRK: En mandlig, 2 måneder gammel, transgen mus, der udtrykker channelrhodopsin-2 (ChR2) i Ca2+/calmodulinafhængige proteinkinase II-positive neuroner (CaMKIIα::ChR2-mus) blev anvendt i denne undersøgelse41.
  2. Bedøv musen med en ketamin-xylazincocktail - en blanding af ketamin (100 mg/kg) og xylazin (10 mg/kg) - ved intraperitoneal administration.
    1. Kontroller det bedøvede dyr hvert 30. minut ved at overvåge whisker bevægelse og reaktion på pote klemme.
    2. Injicer ketamin-xylazincocktailen med halvdelen af den indledende dosis, hvis der er behov for yderligere anæstesi.
  3. Barber hovedhuden og placer den bedøvede mus i den stereotaktiske ramme.
    BEMÆRK: Udfør kirurgisk hudforberedelse og drapering af dyr. Hudforberedelse indebærer hårfjerning efterfulgt af rengøring af huden med antimikrobielle midler.
    1. Placer hovedet inden for den stereotaktiske ramme, og indsæt ørestænger i meatus.
    2. Centrer musehovedet i den stereotaktiske ramme ved gentagne gange at løsne og stramme ørestængerne for nøjagtig placering.
    3. Placer fortænderne, så de øverste fortænder hægter sig fast over den forreste inderkant.
    4. Juster fortænderne for at indstille fortændernes højde, og stram næseklemmen mod snuden.
    5. Tænd den termiske varmepude, der er indlejret i den stereotaktiske ramme på forhånd for at holde kropstemperaturen på 37 ° C under de kirurgiske procedurer.
    6. Sæt den termiske sonde i musens endetarm til homeoterm regulering.
      BEMÆRK: Ørestangens placering skal kontrolleres ved forsigtigt at gribe og svinge snuden. Ørebjælken skal justeres igen, hvis snuden kan flyttes mere end ~ 4 mm sideværts.
  4. Dæk øjnene med vaselin (se materialetabellen) for at forhindre tørhed.
  5. Injicer 1% lidokain i hovedbunden. Løft hovedets hud med pincet, fastgør et injektionsrum, og injicer lidokainen under hovedbunden.
  6. Udfør et sagittal snit ved hjælp af en skalpel og en fin saks. Hold den indskårne hud med en mikroklamp for at udvide synligheden af det kirurgiske område.
    BEMÆRK: Snitlængden er <1 cm over bregma og kaudalkanten af den interparietale knogle.
  7. Fjern periosteum ved hjælp af vatpinde. Hvis der er blødning, cauterize kraniet ved hjælp af en bovie til at forsegle blodkarrene.
  8. Rengør kraniet med saltvand og marker kraniotomistederne ved hjælp af en manipulatorarm: hippocampus Anterior-Posterior (AP) -1,8 til -2,8 mm, Medial-Lateral (ML) 0,5-2,5 mm og Dorsal-Ventral (DV) -1 til -2 mm.
    BEMÆRK: I betragtning af tykkelsen af musekraniet skal du indsætte det modsatte array -1,2 til -2,2 mm fra det udsatte hjerneområde. I betragtning af hippocampusvejen sender pyramideceller af CA3 deres axoner til CA1. Derfor er optiske fibre 1 mm længere end optageelektroder, således at de optiske fibre placeres i CA3 og optageelektroderne i CA1.
  9. Bor et hul over cerebellum og indsæt en skrue til jorden. Sæt jordskruen 0,5 mm dyb med en præcisionsskrue, indtil den når toppen af lillehjernen.
    BEMÆRK: Sørg for tæt indsættelse af skruen, som vil blive brugt som en jordelektrode og en understøttende struktur for at maksimere den langsigtede stabilitet af implantation, da det øger den tredimensionelle overflade til vedhæftning af tandcementen.
  10. Bor det markerede område og fjern et stykke af kraniet med tang.
  11. Bøj en 26 G nålespids til 120° med uret, og udsæt hjerneområdet ved at indsætte den skrå side af nålen opad. Pas på ikke at beskadige hjernen og blodkarrene.
  12. Rengør den udsatte hjerne med saltvand for at vaske knoglestøv og fremmedlegemer ud.
  13. Fastgør optrodearrayet i manipulatorarmen, og bevæg dig tæt på det udsatte område.
    BEMÆRK: Når du placerer enheden, kan genberegning af målområdet igen fra bregma øge nøjagtigheden af placeringen.
  14. Indsæt langsomt optrodearrayet, og tilslut jordskruen til sølvtråden, der er fastgjort til systemet42.
    BEMÆRK: I denne proces skal arrayet være tæt fastgjort til manipulatorarmen for at minimere wobbling for at forhindre hjerneskade fra mikromotion under indsættelse. Indsættelse skal udføres langsomt med hvile i 10 minutter for at tage højde for hævelse af hjernen, der kan være blevet presset efter indsættelse. Indsættelseshastighed under 1 μm/s i hjernevævet anbefales på grund af signal/støj-forholdets høje kvalitet og antallet af adskillelige enkeltenheder42.
  15. Hvis der er blødning, skal du anvende direkte tryk på blødninger med en tør vatpind eller bruge cautery. Gå ikke videre til de næste trin, før blødningen er helt stoppet.
  16. Indsæt gelskum mellem den udsatte hjerne og enheden for at beskytte kemikalier mod direkte kontakt med hjernen.
    BEMÆRK: Gelskum hjælper også hæmostase og holder hjernen fugtig.
  17. Tør kraniet med vatpinde for at fjerne fugt så meget som muligt, og fortsæt til næste fikseringstrin.
  18. Påfør forsigtigt tandcement på kraniet for at fastgøre enheden og dække gelskummet. Før tandcementen er helt hærdet, skal du adskille hovedbunden, hvis den er fastgjort til tandcement. Træk den indskårne hud med pincet for at dække den hærdede tandcement og sutur hovedbunden. Slip derefter enheden fra manipulatorarmen.
    BEMÆRK: Sørg for, at tandcementen ikke klæber til huden og kun dækker kranieområdet. Når huden vokser, kan den skubbe cementen væk, og til sidst falder enheden af. Dette vil medføre et kritisk problem for langsigtede in vivo-eksperimenter .

3. Genopretning og implantatpleje

  1. Tag musen ud af den stereotaktiske ramme.
  2. Administrer Carprofen-opløsning ved hjælp af en 26 G nål. Injicer en gang før operationen og 12 timer (næste morgen i tilfælde af eftermiddagsoperation) og 24 timer efter operationen for at reducere smerter.
    BEMÆRK: Lægemiddelkoncentrationen i flasken er 50 mg / ml, og den opbevares ved 4 ° C. Carprofen er tyktflydende og skal fortyndes i sterilt vand 1:10. Hvis steriliteten opretholdes, kan opløsningen opbevares i op til 4 uger. For at opretholde den effektive varighed af lægemidlet injiceres Carprofen-opløsningen med 12 timers intervaller.
  3. Placer musen på varmepuden og kontroller, om den kommer sig godt fra anæstesien.
    BEMÆRK: Dyret efterlades ikke uden opsyn, før det genvinder tilstrækkelig bevidsthed.
  4. Fjern suturtrådene 7 - 10 dage efter operationen.
  5. Lad dyret komme sig i 1 uge. Overvåg mad- og vandindtag under restitutionstiden. Administrer smertestillende og kontroller for tegn på ubehag eller smerte.
    BEMÆRK: De dyr, der har gennemgået kirurgi, kan ikke blive hos de andre dyr, indtil de er helt raske.
    1. I løbet af restitutionsperioden skal du veje musen hver dag for at kontrollere for vægtændringer. Ofre musen (se afsnit 6), hvis der er et vægttab på 20 % sammenlignet med kontroldyr med alder og køn.

4. Optogenetisk stimulering og elektrofysiologisk optagelse

  1. Bedøv musen og placer den bedøvede mus i den stereotaktiske ramme.
  2. Indstil stimuleringsparametrene.
    1. Indstil lyspulsopskriften til 4% driftscyklus og 10 Hz frekvens43. Indstil lysstimuleringen i 2 s (20 impulser) under neural optagelse.
    2. Brug en 50 mA strøm til at drive 3 mW/mm2 lysintensitet ved den optiske fiberspids. Mål lyseffekten ved hjælp af en fotodiode og effektmåler, og del lyseffekten med det optiske fiberfacetområde.
  3. Tag plastikdækslet af, og fastgør den øverste del, der indeholder lysleveringssystemet, med den genanvendelige LED og kredsløb.
  4. Tilslut hovedtageforforstærkeren til det implanterede 5-polede stik.
  5. Åbn softwaren for at optage neurale signaler.
  6. Konfigurer softwarefiltrene. Brug et båndpasfilter ved 0,1-20 kHz og et hakfilter ved 60 Hz. Indstil forstærkerens samplingshastighed til 20 kHz.
  7. Før optagelsen skal du kontrollere, om de neurale spike-signaler registreres.
    BEMÆRK: Støjreduktion er vigtig, fordi neurale signaler er for små. Hvis støjniveauet er for højt, kan neurale signaler blive skjult af støj og blive usynlige. Brug passende jordforbindelse og elektromagnetisk bølgeafskærmning for at reducere støj.
  8. Efter signalkontrollen skal du optage neurale signaler uden lysstimulering til baseline-optagelse.
  9. Aflever LED-lys og registrer samtidig neuronale reaktioner (figur 5 og figur 6).
    BEMÆRK: Når det er stimuleret, skal det næste stimuleringseksperiment udføres efter et interval på mindst 5 minutter, så den neuronale aktivitet fremkaldt af den foregående stimulering ikke påvirker det næste eksperiment.

5. Analyse af data

  1. Indlæs de erhvervede data ved hjælp af MATLAB-programmet.
  2. Få enkelte neurale aktiviteter ved hjælp af en spike sortering algoritme "Wave-Clus"44,45. Detektere piggene i hver kanal ved hjælp af en amplitudetærskel som i Eq (1)45.
    Tærskel = 5 × median Equation 1 (1)
    Hvor x er det båndpasfiltrerede signal.
    1. For at installere "Wave-Clus" henvises til downloadlinket i materialetabellen.
    2. For at åbne den grafiske brugergrænseflade (GUI) skal du skrive wave_clus i kommandoprompten til MATLAB.
    3. Skriv Get_spikes ('filnavn.ext') funktion til filtypenavn forberedt til spike detektion. Kør derefter Do_clustering ('filename_spikes.mat') til spike sortering.
  3. Tæl de sorterede pigge før, under og efter lysstimulering med specifikke tidsbeholdere. Brug 0,2 s og 2 s tidsbeholdere til analyse.
  4. Plot antallet af pigge fra hver optagekanal.
    BEMÆRK: Gennemsnit med standardfejl af middelværdien (SEM) af dataene fra resultaterne af 8 gentagne forsøg blev beregnet og plottet.

6. Eutanasi

  1. Efter alle eksperimenterne ofrer musen ved indånding af kuldioxid (CO2).
  2. Uden at oplade kammeret før, skal du placere musen i det gennemsigtige eutanasikammer uden CO2 -forsyning og / eller lækager.
  3. Tænd for CO2 -gassen, og fortræng luften med en hastighed på 30 - 50% af mængden af eutanasikammerluft pr. Min.
    BEMÆRK: Et flowmeter skal tilsluttes CO2 -gascylinderen for at sikre, at luftforskydningshastigheden er 30-50% af volumenet af eutanasikammeret pr. Min.
  4. Overvåg den ofrede mus for manglende åndedræt og ændret øjenfarve.
    BEMÆRK: Den forventede tid for eutanasi er normalt inden for 10 til 15 min.
  5. Efter at have observeret dødstegnene, fjern musen fra eutanasikammeret.
  6. For at afslutte eutanasiproceduren skal du verificere døden ved at bekræfte åndedræts- og hjertestop.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Optrodesystemet er med succes fremstillet for at give tilstrækkelig lyskraft til at aktivere målneuronerne. Den fine justering af wolframelektroderne opnås gennem det mikrofabrikerede silicium via hullerne. Den målte lysintensitet er 3,6 mW/mm2 ved den optiske fiberspids, når der tilføres 50 mA strøm. Mikrolinserne øgede lyseffektiviteten med 3,13 dB. På grund af mikrolinsearrayet, som forbedrer lyskoblingen, er den påførte strøm ca. halvdelen af den strøm, der kræves for at opnå den samme lysintensitet uden mikrolinsearraysystemet. Da LED'en genererer mere varme med mere strøm, er det naturligvis fordelagtigt at anvende mikrolinsarrayet til at sænke enhedens varme. Den gennemsnitlige impedans af 4 elektroder var 71, 39 kΩ ved 1 kHz frekvens, hvilket er lavt nok til påvisning af handlingspotentialerne. Desuden omfatter optrode array engangs- og genanvendelige dele for at reducere omkostningerne og minimere den samlede vægt af implantation. Vægten af engangsdelen er ~ 0,58 g.

En CaMKIIα::ChR2-mus blev brugt til direkte at stimulere de ChR2-ekspressive neuroner, og de fremkaldte neurale pigge blev registreret med succes, som vist i figur 6. Vi viste hele de registrerede bølgeformer med nøjagtige forhold, herunder 2 s lysperiode i midten (figur 6A). Spike-sortering fra rådatasignalet blev udført ved hjælp af en specialfremstillet MATLAB-kildekode. Den samlede neurale aktivitet blev analyseret efter sortering af to forskellige enheder. Antallet af fremkaldte individuelle neurale pigge efter hver lysstimuleringsimpuls steg signifikant sammenlignet med baseline (figur 6A, B) med forskellige tidsbeholdere på 2 s og 0,2 s. Som et resultat kunne vi identificere den klare effekt af optogenetisk stimulering på neuronerne.

Figure 1
Figur 1: Skematisk diagram over optrode array og microlens array. (A) 3D skematisk visning og krydssektionel visning; (B) SEM-billede af 4X4 mikrolens array og silicium vias. Skala bar = 1 mm (B). Forkortelse: LED = lysemitterende diode. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 2
Figur 2: Enhedsprototype af optrodesystem. (A) Helhedsbillede af systemet. (B) Forstørret visning af optrode array. Vægtstænger = 5 mm (A), 2 mm (B). Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 3
Figur 3: Implantationskirurgi. (A) Kraniet eksponeres og rengøres ved at fjerne periosteum. (B) Målhjerneområdet blev eksponeret, og jordskruen blev indsat over lillehjernen. (C) Optrode array blev indsat i hjernen for at målrette dybde. Jorden var tilsluttet elektrisk. (D) Dental cement påføres for at fastgøre enheden. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 4
Figur 4: Skematisk diagram over administration, drift og in vivo eksperiment tidslinje.

Figure 5
Figur 5: Eksperimentel opsætning af elektrofysiologisk optagesystem. (A) LED-lys slukket, (B) LED-lys tændt. Forkortelse: LED = lysemitterende diode. Klik her for at se en større version af denne figur.

Figure 6
Figur 6: Elektrofysiologiske registreringsresultater. (A) Repræsentative bølgeformer af neural optagelse og forstørret bølgeform i rødt stiplet rektangel, der angiver to lysstimuli (blå søjler) og sorterede pigge (røde og sorte pilespidser). (B) Spike histogram for hver kanal før, under og efter lysstimulering. Indsat figur angiver placeringen af det implanterede optrode array. (C) Spike histogram med 100 ms tidsbeholder. Blå bjælke angiver perioden med LED-lys tændt. Forkortelse: LED = lysemitterende diode. Klik her for at se en større version af denne figur.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Gennemførligheden af systemet til samtidig optogenetisk stimulering og elektrofysiologisk optagelse blev verificeret (figur 6). De store pigge under lysstimulering er fotoelektriske artefakter, der forekommer samtidig med lysstimuleringen (figur 6A). Dette er tydeligt i den zoomede visning af bølgeformen i det røde stiplede rektangel (figur 6A). Som vist i figur 6A kunne de fotoelektriske artefakter klart sorteres fra de registrerede bølgeformer, og de neuronale reaktioner induceret af optogenetisk stimulering af hippocampussignalvejen blev tydeligt identificeret. Figur 6B,C angiver antallet af pigge og viser stimuleringseffekten tydeligt. Figur 6A er en af de bølgeformer, der bruges til at opnå histogrammerne i figur 6B,C, fordi optagelsesresultaterne opnås fra 8 gentagne optagelsessessioner.

Figur 6A viser den lysinducerede stigning i neural aktivitet. Vi har udført det samme forsøg med kontrolmus uden ChR2-ekspression. I så fald øgede den optogenetiske stimulering ikke den neurale aktivitet. Da de fotoelektriske artefakter let udelukkes fra optagelsesdataene, er resultatet fra kontroldyret ikke inkluderet i manuskriptet. Desuden kan forskellene i optagelsesresultaterne mellem de 4 kanaler, som vist i figur 6, begrundes ved at overveje, at afstanden mellem wolframoptagelseselektroderne er 300 μm (center-til-center). Det er sandsynligt, at spike-aktiviteterne i forskellige kanaler er fra forskellige neuroner. Men fordi neuronale celler er forbundet, især i den lokale hjerneregion, var de overordnede mønstre for neuronal spiking ens, men ikke nøjagtigt de samme.

For at sikre succesen med disse dyreforsøg kræver flere kritiske trin høj nøjagtighed og yderligere opmærksomhed under implantationsoperationen. For det første skal blødning fra hjernens blodkar håndteres omhyggeligt. Fortsæt ikke til de næste trin, før blødningen er helt stoppet. Dette vil muliggøre fast fastgørelse af den implanterede enhed på hjernen og klar synlighed under den kirurgiske procedure. Cauterizing blødning pletter med en bovie, sterilisering med saltvand, og indsættelse af gel skum kan være nyttigt at stoppe blødningen.

For det andet skal musehjernen beskyttes mod tørhed under optrodeimplantationen. Saltvand og gelskum bruges til at holde fugtigt. Hvis dura-membranen fjernes, og hjernen er helt udsat, skal de andre kirurgiske trin udføres så hurtigt som muligt. For det tredje er den langsomme indsættelseshastighed for optroden også afgørende. Langsommere indsættelse reducerer vævsskader og forbedrer nøjagtigheden af implantationen på det målrettede sted46. Da deformationen af hjernevævet er uundgåelig under indsættelsen af optrode, er langsom indsættelse meget nyttig for det deformerede væv for at genoprette dets oprindelige form og volumen.

For det fjerde bestemmer fikseringsprocessen langsigtet stabilitet. Det er nyttigt at gøre kraniets overflade tør, før tandcementen størknes for forbedret, langsigtet fastgørelse. Derudover skal man sørge for at undgå at påføre for meget tandcement eller lade cementen klæbe direkte til huden. Da den indskårne hud regenererer over tid, kan den gradvist skubbe og løsne cementen fra kraniet, når huden vokser. Desuden skal direkte kontakt mellem tandcement og hjernevæv undgås, fordi tandcement er skadeligt for hjernevæv. Dette kan effektivt forhindres ved indsættelse af gelskum mellem den udsatte hjerne og enheden.

Udover de kirurgiske procedurer skal optrodesystemet kontrolleres omhyggeligt, inden forsøgene påbegyndes. Først skal den implanterbare del af det optiske fiberarray og elektroderne undersøges under et mikroskop inden indsættelse. Det er nødvendigt at kontrollere, om der er brud i den optiske fiber, fordi selv en lille revne kan forårsage kritisk lystab. Endvidere skal justeringen mellem de optiske fibre og optageelektroderne kontrolleres for præcis indsættelse. Fine tang kan minutiøst bøje wolframelektroderne for at rette op på deres forkerte justering.

For det andet skal lysintensiteten kontrolleres inden implantationskirurgi for at afgøre, om lyseffekten er over tærsklen og høj nok til at aktivere opsinerne. I praksis er det kendt, at excitationstærsklen for ChR2 er ca. 1 mW/mm247. Imidlertid skal lysgenereret vævsopvarmning minimeres, samtidig med at der tilvejebringes tilstrækkelig lysintensitet til at ophidse neuronale celler. For stærk lysenergi kan beskadige hjernevævet på grund af en stigning i temperaturen. En temperaturstigning på 6-8 °C i hjernen kan forårsage øjeblikkelig og irreversibel vævsskade12,48. En tidligere undersøgelse viste, at temperaturstigningen ved den optiske fiberspids er mindre end 0,5 °C49. En lav driftscyklus med optisk stimulering med en kort varighed kan være nyttig. Sammenlignet med tidligere undersøgelser, der rapporterede temperaturproblemer med optogenetisk stimulering, er vores udgangseffekt (2 mW/mm2) og protokollen med lysstimulering med 4 ms ved 20 Hz i 2 sekunder passende og inden for det sikre område.

En stor udfordring for neural optagelse er at fjerne artefakter induceret af optisk stimulering. Artefakter synkron med optisk stimulering skal overvejes i flere forskellige aspekter, fordi både elektriske og optiske mekanismer kan generere disse artefakter. For det første kan elektriske artefakter være forårsaget af det elektriske kredsløb, der driver LED'en. Når en elektrisk strøm strømmer i et kredsløb for at drive lysstimulering, kan der genereres elektriske artefakter. Dette problem kan overvindes ved at minimere antallet af ledninger til LED-forbindelserne og maksimere afstanden mellem lysstimuleringskredsløbet og ledningerne forbundet med wolframoptagelseselektroderne. For det andet kan fotoelektriske artefakter genereres af den fotoelektrokemiske effekt under optogenetisk stimulering. Disse artefakter kan minimeres ved at undgå direkte eksponering af optageelektroden for stimuleringslyset og øge afstanden mellem de optiske fibre og elektroderne. Det er imidlertid vanskeligt at eliminere lysinducerede artefakter på grund af lysspredning i hjernevævet.

Der er stadig begrænsninger i det foreslåede optrode array, som kan forbedres i fremtidige undersøgelser. Selvom den optiske fiberspids blev skåret fladt i denne undersøgelse, vil affasning eller nedtrapning af fiberspidser minimere vævsskader under indsættelse og øge lysvinklen, der spredes fra spidserne50. En anden begrænsning er lav lysintensitet. På trods af resultaterne af den elektrofysiologiske optagelse har det foreslåede system en relativt lavere udgangseffekt end et laserbaseret system. Derfor kan det foreslåede LED-baserede system opogenetisk excitere en mindre hjerneregion end det laserbaserede system. Dette skyldes hovedsageligt, at de fleste lysdioder har meget lavere effekt end lasere generelt. Men da effektiviteten og den maksimale intensitet af lysdioder er blevet dramatisk forbedret for nylig, kan led'er med en højere udgangseffekt udvikles med nye halvlederteknologier. Den anden begrænsning er, at der ikke blev udført en longitudinel optagelsesundersøgelse. Det blev dog bekræftet, at enheden var godt fastgjort til musene i en måned. Dette resultat viser muligheden for, at enheden er egnet til langsigtede eksperimenter. Derfor udføres langsigtede in vivo-tests for at verificere enhedens stabilitet.

Den mest typiske metode til optogenetik i laboratorier er at bruge et lasersystem som lyskilde. Selvom en laser kan give en højere udgangseffekt end lysdioder til aktivering af opsiner, kan det laserbaserede system ikke let miniaturiseres og kræver implementering med høje omkostninger. I modsætning hertil har det LED-baserede optogenetiske system flere fordele, såsom lav systemkompleksitet, omkostningseffektivitet, og lavt strømforbrug, som er fordelagtige for udviklingen af det trådløse system. Derfor, i denne undersøgelse, LED'en anvendes som lyskilde, og mikrolinsarrayet vedtages for at øge LED'ens lysintensitet.

Derudover omfatter lyskilden og de nuværende drivkredsløb de aftagelige og genanvendelige dele af systemet. Nye lysdioder med forskellige bølgelængder kan let bruges i enheden ved simpel udskiftning, og systemomkostningerne kan reduceres betydeligt på grund af genbrug i flere eksperimenter. Hele systemet kan implementeres yderligere som et trådløst system, der optogenetisk stimulerer og registrerer neuronale signaler uden bundne linjer ved at vedtage et trådløst system med lav effekt i den miniaturiserede integrerede enhed.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Forfatterne har ingen interessekonflikter at afsløre.

Acknowledgments

Denne forskning blev støttet af Convergent Technology R&D Program for Human Augmentation gennem National Research Foundation of Korea (NRF), finansieret af Ministeriet for Videnskab og IKT (NRF-2019M3C1B8090805) og støttet af et National Research Foundation of Korea (NRF) tilskud finansieret af Koreas regering (MSIT) (nr. 2019R1A2C1088909). Vi takker Seung-Hee Lees laboratorium ved Institut for Biologiske Videnskaber, KAIST, Daejeon, Korea, for venligt at levere de transgene mus.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
5-pin Connector NW3 HD127K 1.27 mm (.050") pitch
Bovie Fine Science Tools(F.S.T) 18010-00 High Temperature Cautery Kit
Data Acquisition Software Intan Technologies, LLC USB Interface Board software Work with the RHD USB Interface Board
Dental Cement Lang Dental Manufacturing Company, Inc. 1223CLR Use Jet Liquid and powder in jet denture repair package
Digital Manipulator Arm Stoelting Co. 51904/51906 Left, Right each Digital Manipulator Arm, 3-Axes, Add-On
Gel Foam Cutanplast Standard (70*50*10 mm) Sterile re-absorbable gelatin sponge with a haemostatic effect
Headstage Preamplifier Intan Technologies, LLC #C3314 RHD 16-Channel Recording Headstages
Heating Pad Stoelting Co. 53800R Stoelting Rodent Warmer X1 with Rat Heating Pad
LED OSLON GB CS8PM1.13 λ typ. 470 nm, Viewing angle 80 °, Forward voltage 2.85 V
MATLAB MathWorks, Inc. R2019a
Micro Clamp SURGIWAY 12-1002-04 Straight type, Serre-fine DIEFFENBACH droite 3.5 cm
Optical Fiber Thorlabs, Inc. FT200UMT 0.39 NA, Ø 200 µm Core Multimode Optical Fiber, High OH for 300 - 1200 nm
PFA-Coated Tungsten Wire A-M System Custom ordered Rod type, Ø 101.6 μm (.004")
Photodiode Thorlabs S121C
power meter Thorlabs Inc. PM100D
Precision cleaver FITEL S326 Fiber slicer tool
Prism GraphPad 5.01 version
Scalpel Feather™ #20 Scalpel blade with 100mm long Scalpel Handle
screw Nasa Korea stainless steel diameter: 1.2 mm, length: 3 mm
Silver Wire The Nilaco Corporation AG-401265 Ø 200 µm
Stereotaxic Fxrame Stoelting Co. 51500D Digital new standard stereotaxic, rat and mouse
suture ETHICON W9106 suture size: 4-0, length:75 cm, wire diameter: 4-0
Vaseline Unilever PLC Original 100% pure petroleum jelly
Wave_Clus N/A N/A https://github.com/csn-le/wave_clus

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Wang, Y., Liu, Y. Z., Wang, S. Y., Wang, Z. In vivo whole-cell recording with high success rate in anaesthetized and awake mammalian brains. Molecular Brain. 9 (1), 86 (2016).
  2. Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S. Whole-cell patch-clamp recordings in brain slices. Journal of Visualized Experiments: JoVE. (112), e54024 (2016).
  3. Lee, D., Shtengel, G., Osborne, J. E., Lee, A. K. Anesthetized- and awake-patched whole-cell recordings in freely moving rats using UV-cured collar-based electrode stabilization. Nature Protocols. 9 (12), 2784-2795 (2014).
  4. Tao, C., Zhang, G., Xiong, Y., Zhou, Y. Functional dissection of synaptic circuits: in vivo patch-clamp recording in neuroscience. Frontiers in Neural Circuits. 9, 23 (2015).
  5. Henze, D. A., et al. Intracellular features predicted by extracellular recordings in the hippocampus in vivo. Journal of Neurophysiology. 84 (1), 390-400 (2000).
  6. Takahashi, S., Anzai, Y., Sakurai, Y. Automatic sorting for multi-neuronal activity recorded with tetrodes in the presence of overlapping spikes. Journal of Neurophysiology. 89 (4), 2245-2258 (2003).
  7. Buzsáki, G. Large-scale recording of neuronal ensembles. Nature Neuroscience. 7 (5), 446-451 (2004).
  8. Rossant, C., et al. Spike sorting for large, dense electrode arrays. Nature Neuroscience. 19 (4), 634-641 (2016).
  9. Balasubramaniam, S., et al. Wireless communications for optogenetics-based brain stimulation: present technology and future challenges. IEEE Communications Magazine. 56 (7), 218-224 (2018).
  10. Bedbrook, C. N., et al. Machine learning-guided channelrhodopsin engineering enables minimally invasive optogenetics. Nature Methods. 16 (11), 1176-1184 (2019).
  11. Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
  12. Deng, W., Goldys, E. M., Farnham, M. M., Pilowsky, P. M. Optogenetics, the intersection between physics and neuroscience: light stimulation of neurons in physiological conditions. American journal of physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 307 (11), 1292-1302 (2014).
  13. Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annual Review Neuroscience. 34, 389-412 (2011).
  14. Mahmoudi, P., Veladi, H., Pakdel, F. G. Optogenetics, tools and applications in neurobiology. Journal of Medical Signals and Sensors. 7 (2), 71-79 (2017).
  15. Sasaki, Y., et al. Near-infrared optogenetic genome engineering based on photon-upconversion hydrogels. Angewandte Chemie International Edition in English. 58 (49), 17827-17833 (2019).
  16. Zhang, Y., et al. Battery-free, lightweight, injectable microsystem for in vivo wireless pharmacology and optogenetics. Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (43), 21427-21437 (2019).
  17. Bernstein, J. G., Boyden, E. S. Optogenetic tools for analyzing the neural circuits of behavior. Trends in Cognitive Sciences. 15 (12), 592-600 (2011).
  18. Wang, J., et al. Integrated device for combined optical neuromodulation and electrical recording for chronic in vivo applications. Journal of Neural Engineering. 9 (1), 016001 (2012).
  19. Royer, S., et al. Multi-array silicon probes with integrated optical fibers: light-assisted perturbation and recording of local neural circuits in the behaving animal. European Journal of Neuroscience. 31 (12), 2279-2291 (2010).
  20. Zhang, J., et al. Integrated device for optical stimulation and spatiotemporal electrical recording of neural activity in light-sensitized brain tissue. Journal of Neural Engineering. 6 (5), 055007 (2009).
  21. Park, S. I., et al. Stretchable multichannel antennas in soft wireless optoelectronic implants for optogenetics. Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (50), 8169-8177 (2016).
  22. Kravitz, A. V., Owen, S. F., Kreitzer, A. C. Optogenetic identification of striatal projection neuron subtypes during in vivo recordings. Brain Research. 1511, 21-32 (2013).
  23. Aravanis, A. M., et al. An optical neural interface: in vivo control of rodent motor cortex with integrated fiberoptic and optogenetic technology. Journal of Neural Engineering. 4 (3), 143-156 (2007).
  24. Anikeeva, P., et al. Optetrode: a multichannel readout for optogenetic control in freely moving mice. Nature Neuroscience. 15 (1), 163-170 (2011).
  25. Obaid, S. N., et al. Multifunctional flexible biointerfaces for simultaneous colocalized optophysiology and electrophysiology. Advanced Functional Materials. 30 (24), 1910027 (2020).
  26. Wang, L., et al. An artefact-resist optrode with internal shielding structure for low-noise neural modulation. Journal of Neural Engineering. 17 (4), 046024 (2020).
  27. Shin, H., et al. Multifunctional multi-shank neural probe for investigating and modulating long-range neural circuits in vivo. Nature Communications. 10 (1), 3777 (2019).
  28. Kampasi, K., et al. Dual color optogenetic control of neural populations using low-noise, multishank optoelectrodes. Microsystem & Nanoengineering. 4, 10 (2018).
  29. Schwaerzle, M., Paul, O., Ruther, P. Compact silicon-based optrode with integrated laser diode chips, SU-8 waveguides and platinum electrodes for optogenetic applications. Journal of Micromechanics and Microengineering. 27 (6), 065004 (2017).
  30. Son, Y., et al. In vivo optical modulation of neural signals using monolithically integrated two-dimensional neural probe arrays. Scientific Reports. 5, 15466 (2015).
  31. Yasunaga, H., et al. Development of a neural probe integrated with high-efficiency MicroLEDs for in vivo application. Japanese Journal of Applied Physics. 60 (1), 016503 (2020).
  32. Kim, K., et al. Artifact-free and high-temporal-resolution in vivo opto-electrophysiology with microLED optoelectrodes. Nature Communications. 11 (1), 2063 (2020).
  33. Mendrela, A. E., et al. A high-resolution opto-electrophysiology system with a miniature integrated headstage. IEEE Transactions on Biomedical Circuits and Systems. 12 (5), 1065-1075 (2018).
  34. Scharf, R., et al. Depth-specific optogenetic control in vivo with a scalable, high-density muLED neural probe. Scientific Reports. 6, 28381 (2016).
  35. Oh, K., Sonsi, Y. -A., Ha, S. Optogenetic stimulator with µLED-coupled optical fiber on flexile substrate via 3D printed mount. 2021 21st International Conference on Solid-State Sensors, Actuators and Microsystems (Transducers). , 1476-1479 (2021).
  36. McAlinden, N., et al. Multisite microLED optrode array for neural interfacing. Neurophotonics. 6 (3), 035010 (2019).
  37. Kwon, K. Y., Lee, H. M., Ghovanloo, M., Weber, A., Li, W. Design, fabrication, and packaging of an integrated, wirelessly-powered optrode array for optogenetics application. Frontiers in Systems Neuroscience. 9, 69 (2015).
  38. Bernstein, J. G., Allen, B. D., Guerra, A. A., Boyden, E. S. Processes for design, construction and utilisation of arrays of light-emitting diodes and light-emitting diode-coupled optical fibres for multi-site brain light delivery. Journal of Engineering. , Stevenage. (2015).
  39. Stark, E., Koos, T., Buzsaki, G. Diode probes for spatiotemporal optical control of multiple neurons in freely moving animals. Journal of Neurophysiology. 108 (1), 349-363 (2012).
  40. Jeon, S., et al. Implantable optrode array for optogenetic modulation and electrical neural recording. Micromachines. 12 (6), Basel. 725 (2021).
  41. Song, Y. H., et al. A neural circuit for auditory dominance over visual perception. Neuron. 93 (4), 940-954 (2017).
  42. Fiáth, R., et al. Slow insertion of silicon probes improves the quality of acute neuronal recordings. Scientific Reports. 9 (1), 111 (2019).
  43. Melchior, J. R., Ferris, M. J., Stuber, G. D., Riddle, D. R., Jones, S. R. Optogenetic versus electrical stimulation of dopamine terminals in the nucleus accumbens reveals local modulation of presynaptic release. Journal of Neurochemistry. 134 (5), 833-844 (2015).
  44. Quiroga, R. Q., Nadasdy, Z., Ben-Shaul, Y. Unsupervised spike detection and sorting with wavelets and superparamagnetic clustering. Neural Computation. 16 (8), 1661-1687 (2004).
  45. Chaure, F. J., Rey, H. G., Quian Quiroga, R. A novel and fully automatic spike-sorting implementation with variable number of features. Journal of Neurophysiology. 120 (4), 1859-1871 (2018).
  46. Casanova, F., Carney, P. R., Sarntinoranont, M. Effect of needle insertion speed on tissue injury, stress, and backflow distribution for convection-enhanced delivery in the rat brain. PLoS One. 9 (4), 94919 (2014).
  47. Iseri, E., Kuzum, D. Implantable optoelectronic probes for in vivo optogenetics. Journal of Neural Engineering. 14 (3), 031001 (2017).
  48. Arias-Gil, G., Ohl, F. W., Takagaki, K., Lippert, M. T. Measurement, modeling, and prediction of temperature rise due to optogenetic brain stimulation. Neurophotonics. 3 (4), 045007 (2016).
  49. Jeon, S., et al. Multi-wavelength light emitting diode-based disposable optrode array for in vivo optogenetic modulation. Journal of Biophotonics. 12 (5), 201800343 (2019).
  50. Korposh, S., James, S. W., Lee, S. -W., Tatam, R. P. Tapered optical fibre sensors: current trends and future perspectives. Sensors. 19 (10), 2294 (2019).

Tags

Neurovidenskab udgave 187
Optrode Array til samtidig optogenetisk modulering og elektrisk neural optagelse
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Lee, Y., Ryu, D., Jeon, S., Lee, Y., … More

Lee, Y., Ryu, D., Jeon, S., Lee, Y., Cho, Y. K., Ji, C. H., Kim, Y. K., Jun, S. B. Optrode Array for Simultaneous Optogenetic Modulation and Electrical Neural Recording. J. Vis. Exp. (187), e63460, doi:10.3791/63460 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter