Summary
Burada, ışık iletimi için optik fiberlere ve nöral kayıt için bir elektrot dizisine sahip bir optrode sisteminin üretim yöntemini sunuyoruz. Channelrhodopsin-2'yi eksprese eden transgenik farelerle yapılan in vivo deneyler, eşzamanlı optogenetik stimülasyon ve elektrofizyolojik kayıt için sistemin fizibilitesini göstermektedir.
Abstract
Son on yılda, optogenetik, seçici nöral modülasyon veya izleme konusundaki benzersiz kabiliyeti nedeniyle nöral sinyallemenin araştırılması için önemli bir araç haline gelmiştir. Spesifik nöronal hücre tipleri, opsin proteinlerini eksprese etmek için genetik olarak değiştirilebildiğinden, optogenetik, seçilen nöronların optik stimülasyonunu veya inhibisyonunu sağlar. Optogenetik için optik sistemde çeşitli teknolojik gelişmeler olmuştur. Son zamanlarda, optogenetik stimülasyon veya inhibisyona verilen nöral yanıtları eşzamanlı olarak izlemek için ışık iletimi için optik dalga kılavuzunun elektrofizyolojik kayıt ile birleştirilmesi önerilmiştir. Bu çalışmada, gömülü çok kanallı elektrotlarla implante edilebilir bir optrode dizisi (2x2 optik fiber) geliştirilmiştir.
Işık kaynağı olarak ışık yayan bir diyot (LED) kullanıldı ve optik fiberlerin ucunda yeterli ışık gücü sağlamak için mikrofabrikasyon bir mikrolens dizisi entegre edildi. Optrode dizi sistemi, tek kullanımlık parçayı ve yeniden kullanılabilir parçayı içerir. Tek kullanımlık kısım optik fiberlere ve elektrotlara sahipken, yeniden kullanılabilir kısım ışık kontrolü ve nöral sinyal işleme için LED ve elektronik devrelere sahiptir. İmplante edilebilir optrod dizi sisteminin yeni tasarımı, optrode implantasyon cerrahisi, optogenetik ışık stimülasyonu ve elektrofizyolojik nöral kayıt prosedürüne ek olarak eşlik eden videoda tanıtılmıştır. İn vivo deneylerin sonuçları, farelerin hipokampal uyarıcı nöronlarından gelen ışık uyaranları tarafından uyandırılan zaman kilitli nöral sivri uçları başarıyla gösterdi.
Introduction
Nöral aktiviteyi kaydetmek ve kontrol etmek, beynin bir sinir ağında ve hücresel seviyelerde nasıl çalıştığını anlamak için gereklidir. Geleneksel elektrofizyolojik kayıt yöntemleri, bir mikropipet kullanılarak yama kelepçesi 1,2,3,4 ve mikronöral elektrotlar 5,6,7,8 kullanılarak hücre dışı kaydı içerir. Bir nöromodülasyon yöntemi olarak, elektriksel stimülasyon, nöronal hücrelerin doğrudan veya dolaylı depolarizasyonu yoluyla fokal bir beyin bölgesini doğrudan uyarmak için sıklıkla kullanılmıştır. Bununla birlikte, elektriksel yöntem, kayıt veya stimülasyon için nöronal hücre tiplerini ayırt edemez, çünkü elektrik akımları her yöne yayılır.
Gelişmekte olan bir teknoloji olarak, optogenetik, sinir sisteminin nasıl çalıştığını anlamada yeni bir çağ başlattı 9,10,11,12,13,14,15,16. Optogenetik tekniklerin özü, genetiği değiştirilmiş hücreler tarafından eksprese edilen ışığa duyarlı opsin proteinlerinin aktivitesini kontrol etmek için ışığı kullanmaktır. Böylece, optogenetik, karmaşık nöral devrelerde genetik olarak seçilmiş hücrelerin sofistike modülasyonunu veya izlenmesini sağlar14,17. Optogenetik yaklaşımın daha geniş kullanımı, optik nöromodülasyonu doğrudan doğrulamak için eşzamanlı nöral kayıt gerektirmiştir. Bu nedenle, ışık kontrolü ve kayıt işlevlerine sahip entegre bir cihaz son derece değerli olacaktır 16,18,19,20,21,22,23,24,25.
Geleneksel, lazer tabanlı optogenetik stimülasyonun sınırlamaları vardır, bu da hantal ve pahalı bir ışık dağıtım sistemi gerektirir 26,27,28,29,30. Bu nedenle, bazı araştırma grupları, ışık dağıtım sisteminin boyutunu en aza indirmek için μLED tabanlı silikon problar kullandı31,32,33,34. Bununla birlikte, LED'lerin düşük enerji dönüşüm verimliliği nedeniyle μLED'lerle doğrudan temasın neden olduğu termal beyin hasarı riski vardır. Optik fiberler, SU-8 ve silikon oksinitrür (SiON) gibi hafif dalga kılavuzları, termal hasarı önlemek için uygulanmıştır 30,35,36,37,38,39. Bununla birlikte, bu stratejinin ışık kaynakları ve dalga kılavuzları arasındaki düşük bağlantı verimliliği nedeniyle de bir dezavantajı vardır.
Mikrolens dizisi daha önce LED'ler ve optik fiberler arasındaki ışık bağlantısı verimliliğini artırmak için tanıtılmıştı40. Optik stimülasyon ve mikro ölçekte elektriksel kayıt için mikroelektromekanik sistemler (MEMS) teknolojilerine dayanan bir optrode sistemi geliştirilmiştir40. LED ve optik fiberler arasındaki mikrolens dizisi, ışık verimliliğini 3,13 dB artırdı. Şekil 1'de gösterildiği gibi, 4x4 mikrolens dizisi üzerinde 2x2 optik fiber dizisi hizalanır ve LED, mikrolens dizisinin altına yerleştirilir. Beyin hasarını azaltmak için 4x4 yerine 2x2 optik fiberler monte edilir. Bir tungsten elektrot dizisi, elektrofizyolojik kayıt için delikler yoluyla silikon kullanılarak optrode dizisine bitişik olarak konumlandırılmıştır (Şekil 1B).
Sistem tek kullanımlık üst kısım ve sökülebilir alt parçalardan oluşmaktadır. Optik fiber dizisini, mikrolens dizisini ve tungsten elektrot dizisini içeren üst tek kullanımlık kısım, in vivo deneyler için beyne kalıcı olarak implante edilmek üzere tasarlanmıştır. Alt kısımda bir LED ışık kaynağı ve başka bir hayvan deneyi için kolayca çıkarılabilen ve yeniden kullanılabilen harici bir güç kaynağı hattı bulunur. Takılabilir plastik kapak, çıkarılabilir parça çıkarıldığında tek kullanımlık parçayı korur.
Sistemin fizibilitesi, Ca 2 + / kalmodüline bağımlı protein kinaz II-pozitif nöronlarda (CaMKIIα: : ChR2 fare) channelrhodopsin-2'yi (ChR2) eksprese eden transgenik farelerin beyinlerine implantasyon ile doğrulanır. Kayıt elektrotları, nöronların optik stimülasyonu sırasında bireysel nöronlardan gelen nöral aktiviteleri kaydetmek için kullanıldı.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Hayvan bakımı ve cerrahi prosedürler, Ewha Womans Üniversitesi'ndeki Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanımı Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır (no. 20-029).
1. Bir optrode dizisinin hazırlanması (Şekil 1 ve Şekil 2)
- Optik fiberleri mikrolens dizisine takın.
- Optik fiberin pasivasyon kaplamasını çıkarın ve hassas bir optik fiber kırıcı kullanarak 5 mm uzunluğunda parçalara ayırın.
- Optik fiberi şeffaf UV reçinesine batırın ve optik fiberleri mikrolens dizisine yerleştirin.
- UV lambası kullanarak reçineyi kürleyin.
- Epoksi kullanarak mikrolens dizisini 3D baskılı muhafazaya takın.
- Perfloroalkoksi (PFA) kaplı tungsten telleri hizalayın.
- 4 adet 30 mm uzunluğunda PFA tungsten tel ve 1 gümüş teli 5 pimli, 1,27 mm aralıklı dişi konektöre lehimleyin. Referans elektrodu olarak gümüş tel kullanın.
- 1,27 mm aralıklı dişi konnektörü baş ön amplifikatörüne bağlayın.
- Tungsten elektrotlarının ince hizalanmasına yardımcı olmak için tungsten tellerini silikondan deliklerden dikkatlice yerleştirin (Şekil 1B).
- Hizalanmış tungsten telleri optik fiber uzunluğundan 1 mm daha kısa kesin.
- Epoksi kullanarak konektörü 3D baskılı muhafazaya takın.
- LED yerleşimi
- LED'i 3D baskılı muhafazaya yerleştirin.
- LED'i, darbe genişliği modülasyonu (PWM) üreten sürüş devresine bağlayın.
NOT: PWM darbesi mikrodenetleyici tarafından oluşturulur. - LED sürüş devresinin neden olduğu gürültü göz önüne alındığında, kayıt elektrotlarının LED sürüş devresinden 50 mm uzakta olduğundan emin olun.
- Bir fotodiyot kullanarak optik fiber ucun ucundaki ışık yoğunluğunu ölçün.
- Tungsten elektrotları ve optik fiberleri 15 dakika boyunca alkole batırın. Daha sonra sistemi steril D.I suya batırın ve etilen oksit gazı ile sterilize edin.
2. İmplantasyon cerrahisi (Şekil 3 ve Şekil 4)
NOT: Ameliyat sırasında steril teknik izlenmelidir.
- Spesifik nöronal hücre tipinde ışığa duyarlı opsin proteinlerini eksprese etmek için genetik olarak modifiye edilmiş transgenik hayvanları hazırlayın.
NOT: Bu çalışmada Ca 2+/calmodulin-dependent protein kinaz II-pozitif nöronlarda (CaMKIIα::ChR2 fare) channelrhodopsin-2 (ChR2) eksprese eden 2 aylık transgenik fare41 kullanıldı. - Fareyi intraperitoneal uygulama ile bir ketamin-ksilazin kokteyli - ketamin (100 mg / kg) ve ksilazin (10 mg / kg) karışımı - ile anestezi altına alın.
- Bıyık hareketini ve pençe sıkışmasına tepkiyi izleyerek anestezi uygulanan hayvanı her 30 dakikada bir kontrol edin.
- Ek anestezi gerekiyorsa, ketamin-ksilazin kokteylini başlangıç dozunun yarısında enjekte edin.
- Kafa derisini tıraş edin ve anestezi uygulanan fareyi stereotaktik çerçeveye yerleştirin.
NOT: Cerrahi deri hazırlığı ve örtü hayvanı yapın. Cilt hazırlığı, epilasyonun ardından cildin antimikrobiyal ajanlarla temizlenmesini içerir.- Kafayı stereotaktik çerçeve içine yerleştirin ve kulak çubuklarını meatusun içine yerleştirin.
- Tam konumlandırma için kulak çubuklarını tekrar tekrar gevşetip sıkarak fare kafasını stereotaktik çerçevede ortalayın.
- Kesici çubuğu, üst kesici dişler ön iç kenarın üzerine takılacak şekilde yerleştirin.
- Kesici çubuğun yüksekliğini ayarlamak için kesici çubuğu ayarlayın ve burun kelepçesini buruna doğru sıkın.
- Cerrahi prosedürler boyunca vücut ısısını 37 ° C'de tutmak için stereotaktik çerçeveye gömülü termal ısıtma yastığını önceden açın.
- Homeotermik düzenleme için termal probu farenin rektumuna yerleştirin.
NOT: Kulak çubuğu yerleşimi, burnu hafifçe kavrayıp sallayarak kontrol edilmelidir. Burun yanal olarak ~4 mm'den fazla hareket ettirilebiliyorsa kulak çubuğu yeniden ayarlanmalıdır.
- Kuruluğu önlemek için gözleri petrol jölesi ile örtün (Malzeme Tablosuna bakınız).
- Kafa derisine% 1 lidokain enjekte edin. Başın derisini forsepslerle kaldırın, bir enjeksiyon boşluğu tutun ve lidokaini kafa derisinin altına enjekte edin.
- Bir neşter ve ince makas kullanarak sagital bir kesi yapın. Cerrahi alanın görünürlüğünü genişletmek için kesilmiş cildi bir mikrokelepçe ile tutun.
NOT: Kesi uzunluğu, interparietal kemiğin bregma ve kaudal kenarının <1 cm üzerindedir. - Periosteumu pamuklu çubuklarla çıkarın. Kanama varsa, kan damarlarını kapatmak için bir bovie kullanarak kafatasını koterize edin.
- Kafatasını salinle temizleyin ve manipülatör bir kol kullanarak kraniyotomi bölgelerini işaretleyin: hipokampus Anterior-Posterior (AP) -1.8 ila -2.8 mm, Medial-Lateral (ML) 0.5-2.5 mm ve Dorsal-Ventral (DV) -1 ila -2 mm.
NOT: Fare kafatasının kalınlığını göz önünde bulundurarak, optrode dizisini -1,2 ila -2,2 mm arasında maruz kalan beyin bölgesinden yerleştirin. Hipokampal yol göz önüne alındığında, CA3'ün piramidal hücreleri aksonlarını CA1'e gönderir. Bu nedenle, optik fiberler kayıt elektrotlarından 1 mm daha uzundur, böylece optik fiberler CA3'e ve kayıt elektrotları CA1'e yerleştirilir. - Beyinciğin üzerinde bir delik açın ve toprak için bir vida yerleştirin. Topraklama vidasını, beyinciğin tepesine ulaşana kadar hassas bir vida ile 0,5 mm derinliğe yerleştirin.
NOT: Diş çimentosunun yapışması için üç boyutlu yüzeyi arttırdığından, implantasyonun uzun vadeli stabilitesini en üst düzeye çıkarmak için bir toprak elektrodu ve destekleyici bir yapı olarak kullanılacak olan vidanın sıkıca yerleştirildiğinden emin olun. - İşaretli alanı delin ve kafatasının bir parçasını forseps ile çıkarın.
- 26 G'lık bir iğne ucunu saat yönünde 120 ° 'ye bükün ve iğnenin yukarı bakan eğim tarafını yerleştirerek beyin bölgesini açığa çıkarın. Beyne ve kan damarlarına zarar vermemeye dikkat edin.
- Kemik tozunu ve yabancı maddeleri temizlemek için maruz kalan beyni tuzlu suyla temizleyin.
- Optrode dizisini manipülatör koluna sabitleyin ve maruz kalan bölgeye yaklaşın.
NOT: Cihazı yerleştirirken, hedef alanın bregma'dan tekrar hesaplanması, yerleşimin doğruluğunu artırabilir. - Optrode dizisini yavaşça takın ve topraklama vidasını sisteme bağlı gümüş tel42'ye bağlayın.
NOT: Bu işlemde, yerleştirme sırasında mikro hareketten kaynaklanan beyin hasarını önlemek için yalpalamayı en aza indirmek için dizi, manipülatör koluna sıkıca sabitlenmelidir. Yerleştirme yavaşça yapılmalı, yerleştirildikten sonra bastırılmış olabilecek beynin şişmesini hesaba katmak için 10 dakika dinlendirilmelidir. Sinyal-gürültü oranının yüksek kalitesi ve ayrılabilir tek ünite sayısı42 için beyin dokusuna 1 μm / s'nin altında yerleştirme hızı önerilir. - Kanama varsa, kuru pamuklu çubukla ağartıcılara doğrudan basınç uygulayın veya koter kullanın. Kanama tamamen durana kadar sonraki adımlara geçmeyin.
- Kimyasalları beyinle doğrudan temastan korumak için maruz kalan beyin ile cihaz arasına jel köpük yerleştirin.
NOT: Jel köpük ayrıca hemostaza yardımcı olur ve beyni nemli tutar. - Nemi mümkün olduğunca gidermek için kafatasını pamuklu çubuklarla silin ve bir sonraki sabitleme adımına geçin.
- Cihazı sabitlemek ve jel köpüğü örtmek için kafatasına diş çimentosunu dikkatlice uygulayın. Diş çimentosu tamamen sertleşmeden önce, diş çimentosuna tutturulmuşsa kafa derisini ayırın. Sertleşmiş diş çimentosunu örtmek ve kafa derisini dikmek için kesilmiş cildi forseps ile çekin. Ardından, cihazı manipülatör kolundan serbest bırakın.
NOT: Diş çimentosunun cilde yapışmadığından ve sadece kafatası bölgesini kapladığından emin olun. Cilt büyüdüğünde, çimentoyu uzaklaştırabilir ve sonunda cihaz düşer. Bu, uzun vadeli in vivo deneyler için kritik bir soruna neden olacaktır.
3. İyileşme ve implant bakımı
- Fareyi stereotaktik çerçeveden çıkarın.
- Carprofen çözeltisini 26 G'lık bir iğne kullanarak uygulayın. Ağrıyı azaltmak için ameliyattan önce bir kez ve 12 saat (öğleden sonra ameliyatı durumunda ertesi sabah) ve ameliyattan 24 saat sonra enjekte edin.
NOT: Şişedeki ilaç konsantrasyonu 50 mg/mL'dir ve 4 °C'de saklanır. Karprofen viskozdur ve steril suda 1:10 oranında seyreltilmesi gerekir. Sterilite korunursa, çözelti 4 haftaya kadar saklanabilir. İlacın etkili süresini korumak için, Carprofen çözeltisini 12 saatlik aralıklarla enjekte edin. - Fareyi ısıtma yastığının üzerine yerleştirin ve anesteziden iyi iyileşip iyileşmediğini kontrol edin.
NOT: Hayvan, yeterli bilinci yeniden kazanana kadar gözetimsiz bırakılmaz. - Ameliyattan 7-10 gün sonra dikiş ipliklerini çıkarın.
- Hayvanın 1 hafta boyunca iyileşmesine izin verin. İyileşme süresi boyunca yiyecek ve su alımını izleyin. Analjeziği uygulayın ve rahatsızlık veya ağrı belirtilerini kontrol edin.
NOT: Ameliyat olan hayvanlar, tamamen iyileşene kadar diğer hayvanlarla birlikte kalamazlar.- İyileşme döneminde, ağırlık değişikliklerini kontrol etmek için fareyi her gün tartın. Yaş ve cinsiyete uygun kontrol hayvanlarına kıyasla% 20 kilo kaybı varsa, fareyi feda edin (bkz. bölüm 6).
4. Optogenetik stimülasyon ve elektrofizyolojik kayıt
- Fareyi anestezi altına alın ve anestezi uygulanan fareyi stereotaktik çerçeveye yerleştirin.
- Stimülasyon parametrelerini ayarlayın.
- Işık darbesi tarifini %4 görev döngüsüne ve 10 Hz frekans43'e ayarlayın. Nöral kayıt sırasında 2 s (20 darbe) için ışık stimülasyonunu ayarlayın.
- Optik fiber ucunda 3 mW/mm2 ışık yoğunluğu sağlamak için 50 mA akım kullanın. Bir fotodiyot ve güç ölçer kullanarak ışık gücünü ölçün ve ışık gücünü optik fiber faset alanına bölün.
- Plastik kapağı çıkarın ve ışık dağıtım sistemini içeren üst kısmı yeniden kullanılabilir LED ve devrelerle takın.
- Baş ön amplifikatörünü implante edilmiş 5 pimli konektöre bağlayın.
- Nöral sinyalleri kaydetmek için yazılımı açın.
- Yazılım filtrelerini ayarlayın. 0,1-20 kHz'de bir bandpass filtresi ve 60 Hz'de bir çentik filtresi kullanın. amplifikatör örnekleme hızını 20 kHz'e ayarlayın.
- Kayıttan önce, nöral ani yükseliş sinyallerinin algılanıp algılanmadığını kontrol edin.
NOT: Nöral sinyaller çok küçük olduğu için gürültü önleme önemlidir. Gürültü seviyesi çok yüksekse, nöral sinyaller gürültü tarafından gizlenebilir ve görünmez hale gelebilir. Gürültüyü azaltmak için uygun topraklama ve elektromanyetik dalga kalkanı kullanın. - Sinyal kontrolünden sonra, temel kayıt için ışık uyarımı olmadan nöral sinyalleri kaydedin.
- LED ışığı verin ve aynı anda nöronal yanıtları kaydedin (Şekil 5 ve Şekil 6).
NOT: Bir kez uyarıldıktan sonra, bir sonraki stimülasyon deneyi en az 5 dakikalık bir aralıktan sonra yapılmalıdır, böylece önceki stimülasyon tarafından uyarılan nöronal aktivite bir sonraki deneyi etkilemez.
5. Veri analizi
- Alınan verileri MATLAB programını kullanarak yükleyin.
- Bir başak sıralama algoritması "Wave-Clus"44,45 kullanarak tek nöral aktiviteler elde edin. Her kanaldaki ani artışları Eq (1)45'te olduğu gibi bir genlik eşiği ile tespit edin.
Eşik = 5 × medyan
(1)
Burada x, bandpass filtreli sinyaldir.- "Wave-Clus"u yüklemek için Malzeme Tablosu'ndaki indirme bağlantısına bakın.
- Grafik kullanıcı arabirimini (GUI) açmak için, MATLAB'ın komut istemine wave_clus yazın.
- Başak algılamaya hazırlanan dosya uzantısı için Get_spikes('filename.ext') işlevi yazın. Ardından, ani sıralama için Do_clustering('filename_spikes.mat') çalıştırın.
- Belirli zaman kutuları ile ışık stimülasyonundan önce, sırasında ve sonrasında sıralanmış sivri uçları sayın. Analiz için 0,2 s ve 2 s zaman kutuları kullanın.
- Her kayıt kanalından ani artışların sayısını çizin.
NOT: Standart hata ile ortalamanın ortalamaları (SEM) 8 tekrarlanan deneyin sonuçlarından elde edilen veriler hesaplanmış ve çizilmiştir.
(1)6. Ötenazi
- Tüm deneylerden sonra, fareyi karbondioksit (CO2) solumasıyla kurban edin.
- Odayı önceden şarj etmeden, fareyi CO2 beslemesi ve / veya sızıntısı olmadan şeffaf ötenazi odasına yerleştirin.
- CO2 gazını açın ve havayı dakikada ötenazi odası havasının hacminin% 30 - 50'si oranında değiştirin.
NOT: Hava yer değiştirme hızının dakikada ötenazi odasının hacminin% 30-50'si olmasını sağlamak için CO2 gaz silindirine bir debimetre bağlanmalıdır. - Kurban edilen fareyi solunum eksikliği ve değişen göz rengi açısından izleyin.
NOT: Ötanazi için beklenen süre genellikle 10 ila 15 dakika arasındadır. - Ölüm işaretlerini gözlemledikten sonra, fareyi ötenazi odasından çıkarın.
- Ötanazi prosedürünü tamamlamak için, solunum ve kalp durmasını doğrulayarak ölümü doğrulayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Optrode sistemi, hedef nöronları aktive etmek için yeterli ışık gücü sağlamak için başarıyla üretilmiştir. Tungsten elektrotlarının ince hizalaması, mikrofabrikasyon silikon yoluyla delikler yoluyla elde edilir. 50 mA akım uygulandığında optik fiber ucunda ölçülen ışık yoğunluğu 3,6 mW/mm2'dir . Mikrolens, ışık verimliliğini 3,13 dB artırdı. Işık bağlantısını geliştiren mikrolens dizisi nedeniyle, uygulanan akım, mikrolens dizi sistemi olmadan aynı ışık yoğunluğunu elde etmek için gereken akımın yaklaşık yarısıdır. LED daha fazla akımla daha fazla ısı ürettiğinden, cihazın ısısını düşürmek için mikrolens dizisini kullanmak açıkça avantajlıdır. 4 elektrotun ortalama empedansı, aksiyon potansiyellerinin tespiti için yeterince düşük olan 1 kHz frekansta 71.39 kΩ idi. Ayrıca, optrode dizisi, maliyeti düşürmek ve implantasyonun toplam ağırlığını en aza indirmek için tek kullanımlık ve yeniden kullanılabilir parçalardan oluşur. Tek kullanımlık parçanın ağırlığı ~ 0.58 g'dır.
ChR2 eksprese eden nöronları doğrudan uyarmak için bir CaMKIIα::ChR2 faresi kullanıldı ve Şekil 6'da gösterildiği gibi uyarılan nöral sivri uçlar başarıyla kaydedildi. Kaydedilen tüm dalga formlarını, ortada 2 s ışık açma periyodu da dahil olmak üzere kesin koşullarla gösterdik (Şekil 6A). Ham veri sinyalinden ani sıralama, özel yapım bir MATLAB kaynak kodu kullanılarak gerçekleştirildi. Toplam nöral aktivite, iki farklı birim ayrıldıktan sonra analiz edildi. Her ışık stimülasyon darbesini takiben uyarılan bireysel nöral sivri uçların sayısı, 2 s ve 0.2 s'lik farklı zaman kutuları ile taban çizgisine (Şekil 6A, B) kıyasla önemli ölçüde artmıştır. Sonuç olarak, optogenetik stimülasyonun nöronlar üzerindeki net etkisini tanımlayabiliriz.
Resim 1: Optrode dizisi ve mikrolens dizisinin şematik diyagramı. (A) 3B şematik görünüm ve kesitsel görünüm; (B) 4X4 mikrolens dizisinin ve silikon vias'ın SEM görüntüsü. Ölçek çubuğu = 1 mm (B). Kısaltma: LED = ışık yayan diyot. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 2: Optrode sisteminin cihaz prototipi . (A) Sistemin tüm görünümü. (B) Optrode dizisinin genişletilmiş görünümü. Ölçek çubukları = 5 mm (A), 2 mm (B). Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 3: İmplantasyon cerrahisi . (A) Kafatası açığa çıkarılır ve periost çıkarılarak temizlenir. (B) Hedef beyin bölgesi açığa çıkarıldı ve beyincik üzerine topraklama vidası yerleştirildi. (C) Optrode dizisi, derinliği hedeflemek için beyne yerleştirildi. Zemin elektriksel olarak bağlandı. (D) Cihazı sabitlemek için diş çimentosu uygulanır. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 4: Yönetim, işlem ve in vivo deney zaman çizelgesinin şematik diyagramı. Bu şeklin daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Resim 5: Elektrofizyolojik kayıt sisteminin deneysel kurulumu . (A) LED ışığı kapalı, (B) LED ışık yanıyor. Kısaltma: LED = ışık yayan diyot. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Şekil 6: Elektrofizyolojik kayıt sonuçları . (A) Nöral kaydın temsili dalga formları ve iki ışık uyaranını (mavi çubuklar) ve sıralanmış sivri uçları (kırmızı ve siyah ok uçları) gösteren kırmızı kesikli dikdörtgen içinde genişlemiş dalga formu. (B) Işık stimülasyonu öncesinde, sırasında ve sonrasında her kanal için ani histogram. Dahili şekil, implante edilmiş optrode dizisinin yerini gösterir. (C) 100 ms zaman bölmeli ani histogram. Mavi çubuk, LED ışığının yanma süresini gösterir. Kısaltma: LED = ışık yayan diyot. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Eşzamanlı optogenetik stimülasyon ve elektrofizyolojik kayıt için sistemin fizibilitesi doğrulandı (Şekil 6). Işık stimülasyonu sırasındaki büyük sivri uçlar, ışık stimülasyonu ile aynı anda meydana gelen fotoelektrik eserlerdir (Şekil 6A). Bu, kırmızı kesikli dikdörtgendeki dalga formunun yakınlaştırılmış görünümünde açıktır (Şekil 6A). Şekil 6A'da gösterildiği gibi, fotoelektrik artefaktlar kaydedilen dalga formlarından açıkça ayrılabilir ve hipokampal sinyal yolunun optogenetik stimülasyonu tarafından indüklenen nöronal tepkiler açıkça tanımlanmıştır. Şekil 6B,C, stimülasyon etkisini açıkça gösteren sivri uçların sayısını gösterir. Şekil 6A, Şekil 6B,C'deki histogramları elde etmek için kullanılan dalga formlarından biridir, çünkü kayıt sonuçları 8 tekrarlanan kayıt oturumundan elde edilir.
Şekil 6A , nöral aktivitedeki ışık kaynaklı artışı göstermektedir. Aynı deneyi ChR2 ekspresyonu olmayan kontrol fareleri ile gerçekleştirdik. Bu durumda, optogenetik stimülasyon nöral aktiviteyi arttırmadı. Fotoelektrik eserler kayıt verilerinden kolayca çıkarılabildiğinden, kontrol hayvanından elde edilen sonuç makalede yer almamaktadır. Ayrıca, Şekil 6'da gösterildiği gibi, 4 kanal arasındaki kayıt sonuçlarındaki farklılıklar, tungsten kayıt elektrotları arasındaki mesafenin 300 μm (merkezden merkeze) olduğu dikkate alınarak haklı çıkarılabilir. Farklı kanallardaki ani yükselme aktivitelerinin farklı nöronlardan olması muhtemeldir. Bununla birlikte, nöronal hücreler, özellikle yerel beyin bölgesinde, birbirine bağlı olduğu için, nöronal spikingin genel kalıpları benzerdi, ancak tam olarak aynı değildi.
Bu hayvan deneylerinin başarısını sağlamak için, birkaç kritik adım, implantasyon cerrahisi sırasında yüksek doğruluk ve ek dikkat gerektirir. İlk olarak, beyin kan damarlarından kanama dikkatlice ele alınmalıdır. Kanama tamamen durana kadar sonraki adımlara devam etmeyin. Bu, implante edilen cihazın beyne sıkıca bağlanmasını ve cerrahi prosedür sırasında net görünürlüğü sağlayacaktır. Kanama lekelerini bir bovie ile koterize etmek, salin ile sterilize etmek ve jel köpük eklemek kanamayı durdurmak için yardımcı olabilir.
İkincisi, fare beyni optrode implantasyonu sırasında kuruluktan korunmalıdır. Tuzlu ve jel köpük nemli tutmak için kullanılır. Dura zarı çıkarılırsa ve beyin tamamen açığa çıkarsa, diğer cerrahi adımlar mümkün olduğunca çabuk yapılmalıdır. Üçüncüsü, optrodun yavaş yerleştirme hızı da çok önemlidir. Daha yavaş yerleştirme, doku hasarını azaltır ve hedeflenen yere implantasyonun doğruluğunu artırır46. Optrode yerleştirme sırasında beyin dokusunun deformasyonu kaçınılmaz olduğundan, yavaş yerleştirme, deforme olmuş dokunun orijinal şeklini ve hacmini geri kazanması için çok yararlıdır.
Dördüncüsü, fiksasyon işlemi uzun vadeli stabiliteyi belirler. İyileştirilmiş, uzun süreli bağlantı için diş çimentosunu katılaştırmadan önce kafatası yüzeyini kurutmak yararlıdır. Ek olarak, çok fazla diş çimentosu uygulamaktan veya çimentonun doğrudan cilde yapışmasına izin vermemeye özen gösterilmelidir. Kesilmiş cilt zamanla yenilendikçe, cilt büyüdükçe çimentoyu kafatasından yavaş yavaş itebilir ve ayırabilir. Ayrıca, diş çimentosunun beyin dokusu ile doğrudan temasından kaçınılmalıdır, çünkü diş çimentosu beyin dokusuna zararlıdır. Bu, maruz kalan beyin ve cihaz arasına jel köpük yerleştirilmesiyle etkili bir şekilde önlenebilir.
Cerrahi prosedürlerin yanı sıra, deneylere başlamadan önce optrode sistemi dikkatlice kontrol edilmelidir. İlk olarak, optik fiber dizisinin implante edilebilir kısmı ve elektrotlar, yerleştirilmeden önce mikroskop altında incelenmelidir. Optik fiberde herhangi bir kırılma olup olmadığını kontrol etmek gerekir, çünkü küçük bir çatlak bile kritik ışık kaybına neden olabilir. Ayrıca, optik fiberler ve kayıt elektrotları arasındaki hizalama, hassas yerleştirme için kontrol edilmelidir. İnce forsepsler, yanlış hizalamalarını düzeltmek için tungsten elektrotlarını hafifçe bükebilir.
İkincisi, ışık gücünün eşiğin üzerinde olup olmadığını ve opsinleri aktive edecek kadar yüksek olup olmadığını belirlemek için implantasyon ameliyatından önce ışık yoğunluğu kontrol edilmelidir. Uygulamada, ChR2 için uyarma eşiğinin yaklaşık 1 mW /mm247 olduğu bilinmektedir. Bununla birlikte, nöronal hücreleri uyarmak için yeterli ışık yoğunluğu sağlarken, ışık kaynaklı doku ısınması en aza indirilmelidir. Çok güçlü ışık enerjisi, sıcaklıktaki artış nedeniyle beyin dokularına zarar verebilir. Beyindeki 6-8 °C'lik bir sıcaklık artışı acil ve geri dönüşümsüz doku hasarına neden olabilir12,48. Önceki bir çalışma, optik fiber uçtaki sıcaklık artışının 0,5 ° C49'dan az olduğunu göstermiştir. Kısa süreli düşük bir optik stimülasyon görev döngüsü yardımcı olabilir. Optogenetik stimülasyon ile sıcaklık sorunları bildiren önceki çalışmalarla karşılaştırıldığında, çıkış gücümüz (2 mW /mm2) ve 2 saniye boyunca 20 Hz'de 4 ms ile ışık stimülasyonu protokolü uygundur ve güvenli aralıktadır.
Nöral kayıt için büyük bir zorluk, optik stimülasyonun neden olduğu eserleri ortadan kaldırmaktır. Optik stimülasyonla senkronize olan artefaktlar birkaç farklı açıdan düşünülmelidir, çünkü hem elektriksel hem de optik mekanizmalar bu artefaktları üretebilir. İlk olarak, elektrik eserleri LED'i çalıştıran elektrik devresinden kaynaklanabilir. Işık stimülasyonunu yönlendirmek için bir devrede bir elektrik akımı aktığında, elektrik artefaktları üretilebilir. Bu sorun, LED bağlantıları için tel sayısını en aza indirerek ve ışık stimülasyon devresi ile tungsten kayıt elektrotlarına bağlı teller arasındaki mesafeyi en üst düzeye çıkararak aşılabilir. İkincisi, fotoelektrik eserler, optogenetik stimülasyon sırasında fotoelektrokimyasal etki ile üretilebilir. Bu eserler, kayıt elektrodunun stimülasyon ışığına doğrudan maruz kalmasını önleyerek ve optik fiberler ile elektrotlar arasındaki boşluğu artırarak en aza indirilebilir. Bununla birlikte, beyin dokusundaki ışık saçılması nedeniyle ışık kaynaklı artefaktları ortadan kaldırmak zordur.
Önerilen optrode dizisinde hala sınırlamalar vardır, bu da gelecekteki çalışmalarda geliştirilebilir. Bu çalışmada optik fiber uç düz kesilmiş olmasına rağmen, fiber uçların eğimlendirilmesi veya sivrilmesi, yerleştirme sırasında doku hasarını en aza indirecek ve50 uçtan yayılan ışığın açısını artıracaktır. Diğer bir sınırlama düşük ışık yoğunluğudur. Elektrofizyolojik kaydın sonuçlarına rağmen, önerilen sistem lazer tabanlı bir sistemden nispeten daha düşük bir çıkış gücüne sahiptir. Bu nedenle, önerilen LED tabanlı sistem, lazer tabanlı sistemden daha küçük bir beyin bölgesini optogenetik olarak uyarabilir. Bunun temel nedeni, çoğu LED'in genel olarak lazerlerden çok daha düşük güce sahip olmasıdır. Bununla birlikte, LED'lerin verimliliği ve maksimum yoğunluğu son zamanlarda önemli ölçüde iyileştirildiğinden, yeni yarı iletken teknolojilerle daha yüksek çıkış gücüne sahip LED'ler geliştirilebilir. Diğer sınırlama, uzunlamasına bir kayıt çalışmasının yapılmamış olmasıdır. Bununla birlikte, cihazın bir ay boyunca farelere iyi bağlandığı doğrulandı. Bu sonuç, cihazın uzun süreli deneyler için uygun olma olasılığını göstermektedir. Bu nedenle, cihazın stabilitesini doğrulamak için uzun süreli in vivo testler yapılacaktır.
Laboratuvarlarda optogenetik için en tipik yöntem, ışık kaynağı olarak bir lazer sistemi kullanmaktır. Bir lazer, opsinleri etkinleştirmek için LED'lerden daha yüksek bir çıkış gücü sağlayabilse de, lazer tabanlı sistem kolayca minyatürleştirilemez ve yüksek maliyetli uygulama gerektirir. Buna karşılık, LED tabanlı optogenetik sistem, kablosuz sistemin gelişimi için avantajlı olan düşük sistem karmaşıklığı, maliyet etkinliği ve düşük güç tüketimi gibi çeşitli avantajlara sahiptir. Bu nedenle, bu çalışmada, LED ışık kaynağı olarak kullanılmış ve LED'in ışık yoğunluğunu arttırmak için mikrolens dizisi benimsenmiştir.
Ek olarak, ışık kaynağı ve mevcut sürüş devreleri, sistemin sökülebilir ve yeniden kullanılabilir parçalarını oluşturur. Farklı dalga boylarına sahip yeni LED'ler, basit bir şekilde değiştirilerek cihazda kolayca kullanılabilir ve birden fazla deneyde yeniden kullanım nedeniyle sistem maliyeti önemli ölçüde azaltılabilir. Tüm sistem, minyatür entegre cihaza düşük güçlü bir kablosuz sistem benimseyerek bağlı hatlar olmadan nöronal sinyalleri optogenetik olarak uyaran ve kaydeden kablosuz bir sistem olarak daha da uygulanabilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacağı bir çıkar çatışması yoktur.
Acknowledgments
Bu araştırma, Kore Ulusal Araştırma Vakfı (NRF) aracılığıyla İnsanın Güçlendirilmesi için Yakınsak Teknoloji Ar-Ge Programı tarafından, Bilim ve BİT Bakanlığı (NRF-2019M3C1B8090805) tarafından finanse edilmiş ve Kore hükümeti (MSIT) tarafından finanse edilen Kore Ulusal Araştırma Vakfı (NRF) hibesi (no. 2019R1A2C1088909) tarafından desteklenmiştir. Seung-Hee Lee'nin KAIST, Daejeon, Kore'deki Biyolojik Bilimler Bölümü'ndeki laboratuvarına, transgenik fareleri nazik bir şekilde sağladıkları için teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 5-pin Connector | NW3 | HD127K | 1.27 mm (.050") pitch |
| Bovie | Fine Science Tools(F.S.T) | 18010-00 | High Temperature Cautery Kit |
| Data Acquisition Software | Intan Technologies, LLC | USB Interface Board software | Work with the RHD USB Interface Board |
| Dental Cement | Lang Dental Manufacturing Company, Inc. | 1223CLR | Use Jet Liquid and powder in jet denture repair package |
| Digital Manipulator Arm | Stoelting Co. | 51904/51906 | Left, Right each Digital Manipulator Arm, 3-Axes, Add-On |
| Gel Foam | Cutanplast | Standard (70*50*10 mm) | Sterile re-absorbable gelatin sponge with a haemostatic effect |
| Headstage Preamplifier | Intan Technologies, LLC | #C3314 | RHD 16-Channel Recording Headstages |
| Heating Pad | Stoelting Co. | 53800R | Stoelting Rodent Warmer X1 with Rat Heating Pad |
| LED | OSLON | GB CS8PM1.13 | λ typ. 470 nm, Viewing angle 80 °, Forward voltage 2.85 V |
| MATLAB | MathWorks, Inc. | R2019a | |
| Micro Clamp | SURGIWAY | 12-1002-04 | Straight type, Serre-fine DIEFFENBACH droite 3.5 cm |
| Optical Fiber | Thorlabs, Inc. | FT200UMT | 0.39 NA, Ø 200 µm Core Multimode Optical Fiber, High OH for 300 - 1200 nm |
| PFA-Coated Tungsten Wire | A-M System | Custom ordered | Rod type, Ø 101.6 μm (.004") |
| Photodiode | Thorlabs | S121C | |
| power meter | Thorlabs Inc. | PM100D | |
| Precision cleaver | FITEL | S326 | Fiber slicer tool |
| Prism | GraphPad | 5.01 version | |
| Scalpel | Feather™ | #20 | Scalpel blade with 100mm long Scalpel Handle |
| screw | Nasa Korea | stainless steel | diameter: 1.2 mm, length: 3 mm |
| Silver Wire | The Nilaco Corporation | AG-401265 | Ø 200 µm |
| Stereotaxic Fxrame | Stoelting Co. | 51500D | Digital new standard stereotaxic, rat and mouse |
| suture | ETHICON | W9106 | suture size: 4-0, length:75 cm, wire diameter: 4-0 |
| Vaseline | Unilever PLC | Original | 100% pure petroleum jelly |
| Wave_Clus | N/A | N/A | https://github.com/csn-le/wave_clus |
References
- Wang, Y., Liu, Y. Z., Wang, S. Y., Wang, Z. In vivo whole-cell recording with high success rate in anaesthetized and awake mammalian brains. Molecular Brain. 9 (1), 86 (2016).
- Segev, A., Garcia-Oscos, F., Kourrich, S.
- Lee, D., Shtengel, G., Osborne, J. E., Lee, A. K. Anesthetized- and awake-patched whole-cell recordings in freely moving rats using UV-cured collar-based electrode stabilization. Nature Protocols. 9 (12), 2784-2795 (2014).
- Tao, C., Zhang, G., Xiong, Y., Zhou, Y. Functional dissection of synaptic circuits: in vivo patch-clamp recording in neuroscience. Frontiers in Neural Circuits. 9, 23 (2015).
- Henze, D. A., et al. Intracellular features predicted by extracellular recordings in the hippocampus in vivo. Journal of Neurophysiology. 84 (1), 390-400 (2000).
- Takahashi, S., Anzai, Y., Sakurai, Y. Automatic sorting for multi-neuronal activity recorded with tetrodes in the presence of overlapping spikes. Journal of Neurophysiology. 89 (4), 2245-2258 (2003).
- Buzsáki, G.
- Rossant, C., et al. Spike sorting for large, dense electrode arrays. Nature Neuroscience. 19 (4), 634-641 (2016).
- Balasubramaniam, S., et al. Wireless communications for optogenetics-based brain stimulation: present technology and future challenges. IEEE Communications Magazine. 56 (7), 218-224 (2018).
- Bedbrook, C. N., et al. Machine learning-guided channelrhodopsin engineering enables minimally invasive optogenetics. Nature Methods. 16 (11), 1176-1184 (2019).
- Boyden, E. S., Zhang, F., Bamberg, E., Nagel, G., Deisseroth, K. Millisecond-timescale, genetically targeted optical control of neural activity. Nature Neuroscience. 8 (9), 1263-1268 (2005).
- Deng, W., Goldys, E. M., Farnham, M. M., Pilowsky, P. M. Optogenetics, the intersection between physics and neuroscience: light stimulation of neurons in physiological conditions. American journal of physiology. Regulatory, Integrative and Comparative Physiology. 307 (11), 1292-1302 (2014).
- Fenno, L., Yizhar, O., Deisseroth, K. The development and application of optogenetics. Annual Review Neuroscience. 34, 389-412 (2011).
- Mahmoudi, P., Veladi, H., Pakdel, F. G. Optogenetics, tools and applications in neurobiology. Journal of Medical Signals and Sensors. 7 (2), 71-79 (2017).
- Sasaki, Y., et al. Near-infrared optogenetic genome engineering based on photon-upconversion hydrogels. Angewandte Chemie International Edition in English. 58 (49), 17827-17833 (2019).
- Zhang, Y., et al. Battery-free, lightweight, injectable microsystem for in vivo wireless pharmacology and optogenetics. Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (43), 21427-21437 (2019).
- Bernstein, J. G., Boyden, E. S. Optogenetic tools for analyzing the neural circuits of behavior. Trends in Cognitive Sciences. 15 (12), 592-600 (2011).
- Wang, J., et al. Integrated device for combined optical neuromodulation and electrical recording for chronic in vivo applications. Journal of Neural Engineering. 9 (1), 016001 (2012).
- Royer, S., et al. Multi-array silicon probes with integrated optical fibers: light-assisted perturbation and recording of local neural circuits in the behaving animal. European Journal of Neuroscience. 31 (12), 2279-2291 (2010).
- Zhang, J., et al. Integrated device for optical stimulation and spatiotemporal electrical recording of neural activity in light-sensitized brain tissue. Journal of Neural Engineering. 6 (5), 055007 (2009).
- Park, S. I., et al. Stretchable multichannel antennas in soft wireless optoelectronic implants for optogenetics. Proceedings of National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (50), 8169-8177 (2016).
- Kravitz, A. V., Owen, S. F., Kreitzer, A. C. Optogenetic identification of striatal projection neuron subtypes during in vivo recordings. Brain Research. 1511, 21-32 (2013).
- Aravanis, A. M., et al. An optical neural interface: in vivo control of rodent motor cortex with integrated fiberoptic and optogenetic technology. Journal of Neural Engineering. 4 (3), 143-156 (2007).
- Anikeeva, P., et al. Optetrode: a multichannel readout for optogenetic control in freely moving mice. Nature Neuroscience. 15 (1), 163-170 (2011).
- Obaid, S. N., et al. Multifunctional flexible biointerfaces for simultaneous colocalized optophysiology and electrophysiology. Advanced Functional Materials. 30 (24), 1910027 (2020).
- Wang, L., et al. An artefact-resist optrode with internal shielding structure for low-noise neural modulation. Journal of Neural Engineering. 17 (4), 046024 (2020).
- Shin, H., et al. Multifunctional multi-shank neural probe for investigating and modulating long-range neural circuits in vivo. Nature Communications. 10 (1), 3777 (2019).
- Kampasi, K., et al. Dual color optogenetic control of neural populations using low-noise, multishank optoelectrodes. Microsystem & Nanoengineering. 4, 10 (2018).
- Schwaerzle, M., Paul, O., Ruther, P. Compact silicon-based optrode with integrated laser diode chips, SU-8 waveguides and platinum electrodes for optogenetic applications. Journal of Micromechanics and Microengineering. 27 (6), 065004 (2017).
- Son, Y., et al. In vivo optical modulation of neural signals using monolithically integrated two-dimensional neural probe arrays. Scientific Reports. 5, 15466 (2015).
- Yasunaga, H., et al. Development of a neural probe integrated with high-efficiency MicroLEDs for in vivo application. Japanese Journal of Applied Physics. 60 (1), 016503 (2020).
- Kim, K., et al. Artifact-free and high-temporal-resolution in vivo opto-electrophysiology with microLED optoelectrodes. Nature Communications. 11 (1), 2063 (2020).
- Mendrela, A. E., et al. A high-resolution opto-electrophysiology system with a miniature integrated headstage. IEEE Transactions on Biomedical Circuits and Systems. 12 (5), 1065-1075 (2018).
- Scharf, R., et al. Depth-specific optogenetic control in vivo with a scalable, high-density muLED neural probe. Scientific Reports. 6, 28381 (2016).
- Oh, K., Sonsi, Y. -A., Ha, S. Optogenetic stimulator with µLED-coupled optical fiber on flexile substrate via 3D printed mount. 2021 21st International Conference on Solid-State Sensors, Actuators and Microsystems (Transducers). , 1476-1479 (2021).
- McAlinden, N., et al. Multisite microLED optrode array for neural interfacing. Neurophotonics. 6 (3), 035010 (2019).
- Kwon, K. Y., Lee, H. M., Ghovanloo, M., Weber, A., Li, W. Design, fabrication, and packaging of an integrated, wirelessly-powered optrode array for optogenetics application. Frontiers in Systems Neuroscience. 9, 69 (2015).
- Bernstein, J. G., Allen, B. D., Guerra, A. A., Boyden, E. S. Processes for design, construction and utilisation of arrays of light-emitting diodes and light-emitting diode-coupled optical fibres for multi-site brain light delivery. Journal of Engineering. , Stevenage. (2015).
- Stark, E., Koos, T., Buzsaki, G. Diode probes for spatiotemporal optical control of multiple neurons in freely moving animals. Journal of Neurophysiology. 108 (1), 349-363 (2012).
- Jeon, S., et al. Implantable optrode array for optogenetic modulation and electrical neural recording. Micromachines. 12 (6), Basel. 725 (2021).
- Song, Y. H., et al. A neural circuit for auditory dominance over visual perception. Neuron. 93 (4), 940-954 (2017).
- Fiáth, R., et al. Slow insertion of silicon probes improves the quality of acute neuronal recordings. Scientific Reports. 9 (1), 111 (2019).
- Melchior, J. R., Ferris, M. J., Stuber, G. D., Riddle, D. R., Jones, S. R. Optogenetic versus electrical stimulation of dopamine terminals in the nucleus accumbens reveals local modulation of presynaptic release. Journal of Neurochemistry. 134 (5), 833-844 (2015).
- Quiroga, R. Q., Nadasdy, Z., Ben-Shaul, Y. Unsupervised spike detection and sorting with wavelets and superparamagnetic clustering. Neural Computation. 16 (8), 1661-1687 (2004).
- Chaure, F. J., Rey, H. G., Quian Quiroga, R. A novel and fully automatic spike-sorting implementation with variable number of features. Journal of Neurophysiology. 120 (4), 1859-1871 (2018).
- Casanova, F., Carney, P. R., Sarntinoranont, M. Effect of needle insertion speed on tissue injury, stress, and backflow distribution for convection-enhanced delivery in the rat brain. PLoS One. 9 (4), 94919 (2014).
- Iseri, E., Kuzum, D. Implantable optoelectronic probes for in vivo optogenetics. Journal of Neural Engineering. 14 (3), 031001 (2017).
- Arias-Gil, G., Ohl, F. W., Takagaki, K., Lippert, M. T. Measurement, modeling, and prediction of temperature rise due to optogenetic brain stimulation. Neurophotonics. 3 (4), 045007 (2016).
- Jeon, S., et al. Multi-wavelength light emitting diode-based disposable optrode array for in vivo optogenetic modulation. Journal of Biophotonics. 12 (5), 201800343 (2019).
- Korposh, S., James, S. W., Lee, S. -W., Tatam, R. P. Tapered optical fibre sensors: current trends and future perspectives. Sensors. 19 (10), 2294 (2019).
