여기에서, 우리는 원주형 자기 활성화 세포 분류를 활용하여 탈수초성 질환의 동물 모델에서 원발성 미세아교세포를 분리하고 정제하는 프로토콜을 제시한다.
이 콘텐츠를 보려면 JoVE 구독이 필요합니다. 로그인하거나 오늘 무료 평가판을 시작하세요.
이 논문에서
요약
초록
뇌에 상주하는 선천적 면역 세포 인 Microglia는 중추 신경계 (CNS)의 염증 또는 손상에 대한 주요 반응자입니다. 미세아교세포는 휴지 상태와 활성화 상태로 나눌 수 있으며 뇌의 미세 환경에 반응하여 상태를 빠르게 변화시킬 수 있습니다. Microglia는 다른 병리학 적 조건 하에서 활성화되고 다른 표현형을 나타낼 것입니다. 또한, 활성화된 미세아교세포의 많은 상이한 하위군이 존재하며, 상이한 하위군 사이에 큰 이질성이 있다. 이질성은 주로 미세아교세포의 분자 특이성에 의존한다. 연구에 따르면 microglia가 활성화되고 염증성 탈수초화의 병리학 적 과정에서 중요한 역할을 할 것으로 나타났습니다. 다발성 경화증 및 신경 척수염 옵티카 스펙트럼 장애와 같은 염증성 탈수초성 질환에서 미세아교세포의 특성을 더 잘 이해하기 위해, 우리는 perilesional 원발성 미세아교세포 분류 프로토콜을 제안한다. 이 프로토콜은 원주형 자기 활성화 세포 분류 (MACS)를 사용하여 고도로 정제 된 일차 미세 아교세포를 얻고 미세 아교세포의 분자 특성을 보존하여 염증성 탈수초성 질환에서 미세 아교세포의 잠재적 영향을 조사합니다.
서론
Microglia는 노른자 - 낭 선조에서 유래하며, 배아 뇌에 매우 일찍 도달하여 CNS 1,2의 발달에 참여합니다. 예를 들어, 그들은 시냅스 가지치기3 및 축삭 성장 조절4에 관여한다. 그들은 신경 생존을 촉진하고 신경 국소화를 돕는 인자를 분비합니다5. 동시에, 그들은 정상적인 뇌 발달을 보장하기 위해 비정상적인 세포와 사멸 세포를 제거하는 데 관여합니다6. 또한, 뇌의 면역능력이 있는 세포로서, 미세아교세포는 뇌 실질종을 지속적으로 감시하여 죽은 세포, 기능장애성 시냅스, 세포 파편7을 제거한다. 미세아교세포 활성화가 염증성 탈수초성 질환, 신경 퇴행성 질환 및 뇌종양을 포함한 다양한 질환에서 중요한 역할을 한다는 것이 입증되었습니다. 다발성 경화증 (MS)에서 활성화된 미세아교세포는 올리고덴드로사이트 전구체 세포 (OPCs)의 분화 및 미엘린 파편을 삼킴으로써 미엘린의 재생에 기여한다8....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
프로토콜
모든 동물 절차는 Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, China의 동물 관리위원회 연구소의 승인을 받았습니다.
1. 재료
- 프로토콜을 시작하기 전에 다음 해결 방법을 준비하십시오.
- 인산완충식염수(PBS)에 우태아혈청(FBS, 2%)을 첨가하여 로딩버퍼를 준비한다.
- PBS에 중성 적색 (NR) 염료 (최종 1 %)를 첨가한다.
- 시판되는 성인 뇌 해리 키트를 사용하여 다음 용액을 준비 하십시오 (재료 표 참조).
- 효소 믹스 1을 제조하기 위해, 1.9 mL의 완충액 Z 및 50 μL의 효소 P를 피펫으로 15 mL 원심분리 튜브에 넣었다.
- 효소 믹스 2를 제조하기 위해, 20 μL의 완충액 Y 및 10 μL의 효소 A를 피펫으로 1.5 mL 마이크로원심분리 튜브에 넣었다.
- 이물질 제거 용액을 준비하십시오.
2. 생쥐 관류 및 해부
- ....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
결과
CD11b 비드를 사용하여 분리된 미세아교세포는 고순도를 갖는다.
탈수초화 마우스 모델에서 병변 주위의 미세아교세포를 상기 언급된 프로토콜을 사용하여 단리하고 유세포 분석기에 의해 시험하였다. 세포는 CD11b-플루오레세인 이소티오시아네이트 (FITC) 및 CD45-알로피코시아닌 (APC)으로 형광 표지되어 제조자의 지시에 따라 유세포 분석기에서 미세아교세포를 결정한다. CD11b 및 CD45 항체가 단리된 미세아교세포19,22의 순도를 확인하기에 충분하다는 것을 입증하는 다수의 문헌이 있다. 형광 보상은 염색되지 않은 단일 염색된 대조군 샘플을 사용하여 유동 세포계 상에서 완료되었다. 세포를 순방향 산란-높이 (FSC-H) 및 측면 산란 높이 (SSC-H)에 의해 게이팅하였고; 단일 세포를 순방향 산란 면적 (FSC-A) 및 FSC-H에 의해 게이팅하였다. 자기 분리 전후의 미세아교세포(.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
토론
이 프로토콜은 염증성 탈수초성 질환에서 미세아교세포의 기능적 특성을 연구하는 데 도움이 될 수 있는 탈수초성 병변 주위의 미세아교세포를 분리하는 방법을 제안한다. CD11b 비드를 사용하여 포획된 미세아교세포는 높은 순도 및 생존력을 나타낸다. 프로토콜의 중요한 단계에는 초점의 정확한 국소화와 최적의 미세아교세포 정제가 포함됩니다. 프로토콜 단계 2.1에서, 병변이 정확하게 표시될 수 있도록 마우스를 희생시키기 전에 NR 용액 2h를 주입할 필요가 있다(20). 프로토콜 단계 2.8에서, 해부를 위해 아이스 박스에 뇌 조직 절편을 배치하고 가능한 한 빨리이 단계를 완료하여, 세포 생존력을 향상시키도록 주의를 기울였다. 단계 2.9에서, 효소 소화 및 이물질 제거를 위한 하나의 샘플로서 적절한 조직을 선택할 필요가 있다. 이물질 제거 효과가 만족스럽지 않은 경우 3.7 단계를 건너 뛸 수 없습니다. 단계 4.3에서, PBS의 첨가는 상이한 층을 형성하기 위해 온화해야 하며, 가능한 한 많.......
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
공개 사항
저자들은 경쟁하는 이익이 존재하지 않는다고 선언했다.
감사의 글
이 연구는 Tongji Hospital (HUST) Foundation for Excellent Young Scientist (Grant No. 2020YQ06)의 지원을 받았다.
....액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재료
| 이름 | 회사 | 카탈로그 번호 | 댓글 |
|---|---|---|---|
| 1.5 mL 마이크로 원심분리기 튜브 | BIOFIL | CFT001015 | |
| 15 mL 원심분리기 튜브 | BIOFIL | CFT011150 | |
| 50 mL 원심분리기 튜브 | BIOFIL | CFT011500 | |
| 70 µ m 필터 | Miltenyi Biotec | 130-095-823 | |
| 성인 뇌 해리 키트, 마우스 및 쥐 | Miltenyi Biotec | 130-107-677 | |
| C57BL/6J 마우스 | SJA Labs | ||
| CD11b (Microglia) 구슬, 인간 및 마우스 | Miltenyi Biotec | 130-093-634 | |
| 소 태아 혈청 | BOSTER | PYG0001 | |
| FlowJo | BD Biosciences | V10 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| MiniMACS 분리기 | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MS 컬럼 | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| 중성 적색 | Sigma-Aldrich | 1013690025 | |
| NovoCyte 유세포 분석기 | Agilent | 구성 시스템 다양한 부품의 | |
| NovoExpress | Agilent | 1.4.1 | |
| PBS | BOSTER | PYG0021 | |
| Pentobarbital | Sigma-Aldrich | P-010 | |
| 실체현미경 | MshOt | MZ62 |
참고문헌
- Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), New York, N.Y. 841-845 (2010).
- Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), New York, N.Y. 86-90 (2012).
- Paolicelli, R. C., et al. Synaptic pruning by microglia is ....
액세스가 제한되었습니다. 이 콘텐츠를 보려면 로그인하거나 체험판을 시작하세요.
재인쇄 및 허가
