Summary
Her presenterer vi en protokoll for å isolere og rense primærmikroglia i dyremodeller av demyeliniserende sykdommer, ved hjelp av kolonne magnetisk aktivert cellesortering.
Abstract
Mikroglia, de bosatte medfødte immuncellene i hjernen, er de primære responderne på betennelse eller skade i sentralnervesystemet (CNS). Mikroglia kan deles inn i hviletilstand og aktivert tilstand og kan raskt endre tilstand som svar på hjernens mikromiljø. Mikroglia vil bli aktivert under ulike patologiske forhold og vise forskjellige fenotyper. I tillegg er det mange forskjellige undergrupper av aktivert mikroglia og stor heterogenitet mellom forskjellige undergrupper. Heterogeniteten avhenger hovedsakelig av mikrogliaens molekylære spesifisitet. Studier har vist at mikroglia vil bli aktivert og spille en viktig rolle i den patologiske prosessen med inflammatorisk demyelinering. For bedre å forstå egenskapene til mikroglia i inflammatorisk demyeliniserende sykdommer som multippel sklerose og nevromyelittoptikkspektrumforstyrrelse, foreslår vi en perilesjonell primær mikroglial sorteringsprotokoll. Denne protokollen benytter kolonne magnetisk aktivert cellesortering (MACS) for å oppnå svært renset primærmikroglia og bevare mikrogliaens molekylære egenskaper for å undersøke de potensielle effektene av mikroglia i inflammatoriske demyeliniserende sykdommer.
Introduction
Mikroglia stammer fra eggeplomme-sac forfedre, som når den embryonale hjernen veldig tidlig og deltar i utviklingen av CNS 1,2. For eksempel er de involvert i synaptisk beskjæring3 og regulerer axonal vekst4. De utskiller faktorer som fremmer nevronal overlevelse og hjelper nevronal lokalisering5. Samtidig er de involvert i å fjerne unormale celler og apoptotiske celler for å sikre normal hjerneutvikling6. I tillegg, som de immun-kompetente cellene i hjernen, mikroglia kontinuerlig surveil hjernen parenchyma å fjerne døde celler, dysfunksjonelle synapser, og cellulære rusk7. Det har blitt demonstrert at mikroglial aktivering spiller en viktig rolle i en rekke sykdommer, inkludert inflammatoriske demyeliniserende sykdommer, nevrodegenerative sykdommer og hjernesvulster. Aktivert mikroglia ved multippel sklerose (MS) bidrar til differensiering av oligodendrocyttforløperceller (OPCer) og regenerering av myelin ved å oppsluke myelinrester8.
Ved Alzheimers sykdom (AD) aktiverer akkumulering av amyloid beta (Aβ) mikroglia, noe som påvirker fagocytiske og inflammatoriske funksjoner i mikroglia9. Aktivert mikroglia i gliomavevet, kalt glioma-assosiert mikroglia (GAM), kan regulere progresjonen av glioma og til slutt påvirke prognosen til pasienter10. Aktiveringen endrer dypt det mikrogliale transkripsjonssenteret, noe som resulterer i morfologiske endringer, uttrykk for immunreseptorer, økt fagocytisk aktivitet og forbedret cytokinsekresjon11. Det finnes forskjellige undergrupper av aktivert mikroglia ved nevrodegenerative sykdommer som sykdomsrelatert mikroglia (DAM), aktivert responsmikroglia (ARM) og mikroglial nevrodegenerativ fenotype (MGnD)8.
På samme måte sameksisterer flere dynamiske funksjonelle undergrupper av mikroglia også i hjernen i inflammatoriske demyeliniserende sykdommer12. Å forstå heterogeniteten mellom ulike undergrupper av mikroglia er avgjørende for å undersøke patogenesen av inflammatoriske demyeliniserende sykdommer og for å finne deres potensielle terapeutiske strategier. Heterogeniteten til mikroglia avhenger hovedsakelig av molekylær spesifisitet8. Det er viktig å beskrive molekylære endringer av mikroglia nøyaktig for studiet av heterogeniteten. Fremskritt innen encellet RNA-sekvenseringsteknologi (RNA-seq) har gjort det mulig å identifisere de molekylære egenskapene til aktivert mikroglia under patologiske forhold13. Derfor er evnen til å isolere cellepopulasjoner avgjørende for videre undersøkelse av disse målcellene under bestemte forhold.
Studier utført for å forstå egenskapene og funksjonene til mikroglia er vanligvis in vitro-studier, siden det har blitt funnet at et stort antall primære mikroglia kan tilberedes og dyrkes fra musevalphjerner (1-3 dager gamle), som festes til kulturflaskene og vokser på plastoverflaten med andre blandede glialceller. Deretter kan ren mikroglia isoleres basert på den forskjellige klebeevnen til blandede glialceller14,15. Denne metoden kan imidlertid bare isolere mikroglia fra perinatalhjernen og tar flere uker. Potensielle variabler i cellekulturen kan påvirke mikrogliale egenskaper som molekylært uttrykk16. Videre kan mikroglia isolert av disse metodene bare delta i in vitro-eksperimenter ved å simulere forholdene til CNS-sykdommer og kan ikke representere egenskapene og funksjonene til mikroglia i in vivo sykdomstilstander. Derfor er det nødvendig å utvikle metoder for å isolere mikroglia fra den voksne musehjernen.
Fluorescensaktivert cellesortering (FACS) og magnetisk separasjon er to mye brukte metoder, selv om de har sine egne forskjellige begrensninger 16,17,18,19. Deres respektive fordeler og ulemper vil bli kontrastert i diskusjonsdelen. Modningen av MACS-teknologi gir muligheten til raskt å rense celler. Huang et al. har utviklet en praktisk metode for å merke demyeliniserende lesjoner i hjernen20. Ved å kombinere disse to tekniske tilnærmingene foreslår vi en rask og effektiv kolonne CD11b magnetisk separasjonsprotokoll, som gir en trinnvis beskrivelse for å isolere mikroglia rundt demyeliniserende lesjoner i voksne musehjerner og bevare mikrogliaens molekylære egenskaper. Fokal demyelinerende lesjoner var forårsaket av stereotaktisk injeksjon av 2 μL lysolecitinoppløsning (1% LPC i 0,9% NaCl) i corpus callosum 3 dager før du starter protokollen21. Denne protokollen legger grunnlaget for å utføre neste trinn i in vitro-eksperimenter. Videre sparer denne protokollen tid og forblir mulig for utbredt bruk i ulike eksperimenter.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreprosedyrene er godkjent av Institute of Animal Care Committee ved Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Kina.
1. Materialer
- Klargjør følgende løsninger før du starter protokollen.
- Forbered lastebufferen ved å tilsette foster bovint serum (FBS, 2%) til fosfatbufret saltvann (PBS).
- Tilsett nøytral rød (NR) fargestoff (endelig 1%) til PBS.
- Forbered følgende løsninger ved hjelp av det kommersielt tilgjengelige Adult Brain Dissociation Kit (se materialtabellen).
- For å forberede enzymblanding 1, pipette 1,9 ml buffer Z og 50 μL enzym P i et 15 ml sentrifugerør.
- For å forberede enzymblanding 2, pipette 20 μL buffer Y og 10 μL enzym A i et 1,5 ml mikrocentrifugerør.
- Forbered avfallsfjerningsløsningen.
2. Musperfusjon og disseksjon
- Intraperitonealt (dvs.) injiserer musen med 500 μL 1% NR-fargestoff i PBS 2-3 timer før anestesi.
MERK: Intraperitoneal injeksjon av NR i demyeliniserende musemodeller bidrar til å skjelne lesjonene (figur 1). - Bedøv musen med pentobarbital (50 mg/kg, dvs.), og sørg for at musen er bedøvet ved å undersøke smerteresponsene.
- Åpne musens thoraxhule og eksponer hjertet.
- Klipp av et lite hjørne av høyre atrium forsiktig og intracardially parfyme musen med 20-30 ml kald PBS fra venstre ventrikel.
- Halshugge musen under anestesi.
- Åpne musens hodeskalle og frigjør hjernen forsiktig fra skallen.
- Overfør hjernen til musen hjernen kutte mugg og kutte hjernen i 0,1 cm skiver.
- Fjern hjerneskivene og legg dem i kald PBS i en Petri-tallerken (60/15 mm). Mikrodissect lesjonene merket med NR fargestoff rundt corpus callosum under et stereomikroskop ved hjelp av mikroskopiske tang.
MERK: Sørg for at det dissekerte vevet er så komplett som mulig for å lette den påfølgende overføringen; den totale disseksjonsfremdriften skal være fullført i 2 timer. - Overfør det dissekerte vevet til 15 ml sentrifugerør som inneholder riktig mengde kaldlastebuffer.
MERK: Slå sammen corpus callosumvevet fra 2-3 mus sammen i ett rør som en prøve.
3. Vev dissosiasjon
- Sentrifuger det dissekerte vevet ved 300 ×g i 30 s (etter å ha nådd denne hastigheten) for å samle prøven nederst på røret.
- Forvarm enzymblanding 1 og enzymblanding 2 til 37 °C i en inkubator.
- Tilsett 1950 μL forvarmet enzymblanding 1 til en prøve og fordøye i en inkubator ved 37 °C i 5 minutter.
- Tilsett 30 μL forvarmet enzymblanding 2 og bland forsiktig.
- Fordøy i en inkubator ved 37 °C i 15 minutter og bland forsiktig hver 5.
- Tilsett 4 ml kald PBS i røret etter fordøyelsen og rist forsiktig.
- Plasser 70 μm filtre på 50 ml sentrifugerør og fortrekk filtrene med 500 μL kald PBS. Filtrer det dissosierte vevet ved å sende de fordøyde vevsprøvene gjennom filtrene, og overfør den filtrerte suspensjonen i 50 ml sentrifugerøret til et 15 ml sentrifugerør.
MERK: Hopp over dette trinnet hvis mengden vev er for liten. - Sentrifuger de filtrerte vevsprøvene ved 300 ×g i 10 min ved 4 °C og aspirer supernatanten sakte og fullstendig.
MERK: Alle trinnene skal utføres på is, bortsett fra den enzymatiske fordøyelsen.
4. Fjerning av rusk
- Resuspend cellepellet forsiktig med 1550 μL kald PBS.
- Tilsett 450 μL kald oppløsning for fjerning av rusk og bland godt.
- Legg over blandingen ovenfor veldig sakte og forsiktig med 2 x 1 ml kald PBS ved hjelp av en 1000 μL pipette.
MERK: Vipp sentrifugerøret med 45 ° og legg sakte PBS langs rørveggen med pipetten. - Overfør røret sakte og forsiktig til en sentrifuge og spinn ved 4 °C og 3000 × g i 10 minutter.
- Se etter tre lag etter sentrifugering. Aspirer de to øverste lagene fullstendig ved å bruke en pipette på 1000 μL (figur 2).
- Fyll røret opptil 5 ml med kaldlastebuffer og inverter røret forsiktig tre ganger.
- Sentrifuge ved 4 °C og 1000 × g i 10 minutter. Aspirer supernatanten helt og unngå å forstyrre cellepellet.
5. Magnetisk separasjon av mikrogliale celler
- Resuspend cellepellet med 90 μL lastebuffer og tilsett 10 μL CD11b (Microglia) perler.
- Bland godt og inkuber i 15 min ved 4 °C.
- Tilsett 1 ml lastebuffer og pipette væsken forsiktig opp og ned med en 1000 μL pipette for å vaske cellene etter inkubasjonen. Sentrifuger cellene ved 4 °C og 300 × g i 10 minutter og aspirer supernatanten helt for å fjerne de ubundne perlene.
- Resuspend cellene i 500 μL lastebuffer.
- Plasser MS-kolonnen med skilletegnet for positiv merking i magnetfeltet.
- Skyll kolonnen med 500 μL lastebuffer for å beskytte cellene og sikre effektiviteten av magnetisk sortering basert på produsentens protokoll.
- Bruk celleopphenget på MS-kolonnen, og forkast gjennomstrømningen som inneholder celler uten etikett.
- Tilsett 500 μL lastebuffer i kolonnen tre ganger for å vaske bort celler som fester seg til kolonneveggen og kast gjennomstrømningen.
MERK: Tilsett kun ny lastebuffer for vask når søylebeholderen er helt tom. - Fjern kolonnen fra separatoren etter vask av kolonnen og legg den på et 15 ml sentrifugerør.
- Tilsett 1 ml lastebuffer i kolonnen og skyv stempelet til bunnen av kolonnen for å skylle ut de magnetisk merkede cellene. Gjenta dette trinnet tre ganger for å samle de magnetisk merkede cellene fullstendig.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Microglia isolert ved hjelp av CD11b perler har høy renhet
Mikrogliale celler rundt lesjonene i demyelinasjonsmusmodeller ble isolert ved hjelp av ovennevnte protokoll og testet av strømningscytometri. Celler er fluorescerende merket med CD11b-fluorescein isothiocyanate (FITC) og CD45-allophycocyanin (APC) for å bestemme mikroglia i strømningscytometri i henhold til produsentens instruksjoner. Det er flere litteratur som viser at CD11b og CD45 antistoffer er nok til å se etter renheten av isolert mikroglia 19,22. Fluorescenskompensasjonen ble fullført på strømningscytometeret ved hjelp av uoppdagede og enkeltfargede kontrollprøver. Celler ble inngjerdet av fremoverspredningshøyde (FSC-H) og sidespredningshøyde (SSC-H); enkeltceller ble inngjerdet av fremoverspredningsområde (FSC-A) og FSC-H. Andelen mikroglia (identifisert som CD11b+CD45Intermediate) før og etter den magnetiske separasjonen ble testet av strømningscytometri. Back-loop teknikken ble brukt til å justere gating strategien for strømning cytometri analyse ved å bestemme porten for mikroglia. Sammenlignet med omtrent 3 × 104 celler og 6 × 103 mikroglia før magnetisk separasjon av hver musehjerne (figur 3A), gir MACS vanligvis omtrent 2,5 × 103 celler og 2 × 103 mikroglia per musehjerne (figur 3B), som var omtrent 85% av alle enkeltceller. Imidlertid var nesten 3% av myeloidcellene (identifisert som CD11b + CD45høye) til stede i MACS-separerte celler og var vanskelige å fjerne fra CD11b-populasjonen i denne protokollen. Renheten til den isolerte mikrogliaen kan økes til 95% ved hjelp av to magnetiske kolonner (Supplerende figur S1). MACS-sortering kan fange omtrent 33% av mikroglia i hjerneblandingsprøven.
Microglia isolert ved hjelp av CD11b perler har høy celle levedyktighet
Fluorokrom 7-aminoactinomycin D (7-AAD) brukes ofte til å vise celle levedyktigheten i strømningscytometrien. 7 AAD+ -celler representerer døde celler19. Levedyktigheten til MACS-separert mikroglia var omtrent 95% ved cellefarging med 7-AAD (figur 4).
Morfologisk analyse av mikroglia rundt demyeliniserende lesjoner sortert etter MACS
Morfologisk analyse viste at mikroglia ikke ble aktivert av MACS. Microglia viser en typisk langsgående bipolar cellelegeme etter MACS, som ligner mikroglial morfologi etter FACS19. Mikroglia rundt demyeliniserende lesjoner vil bli aktivert i modellen av LPC-indusert demyelinasjon21. Mikroglia farget av ionisert kalsiumbindingsadaptermolekyl 1 (Iba-1) viste typisk ameb morfologi av aktivert mikroglia i denne protokollen. P2ry12 er et typisk molekyl av mikroglial hviletilstand. Det er en liten brøkdel av forgrenet og P2ry12 + mikroglia før MACS på grunn av utvidelsen av omfanget av de dissosierte lesjonene. Eksistensen av P2ry12+ mikroglia etter MACS indikerer imidlertid også at MACS ikke vil aktivere mikroglia (tilleggsfigur S2).
Figur 1: Bilder av de fokale demyeliniserende lesjonene merket med det nøytrale røde fargestoffet. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 2: Bilder av de tre lagene dannet av sentrifugering. De to øverste lagene (lag 1 + lag 2) må fjernes i avfallsfjerningsprosessen (se protokolltrinn 4.5). Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 3: Strømningssytometrianalyse av mikroglia isolert fra demyelinasjonsskader hos voksne mus før og etter MACS. (A) Skjematisk representasjon av gatingstrategi som brukes i flowcytometrianalyse før MACS: FSC-H og SSC-H for valg av celler, FSC-A og FSC-H for valg av enkeltceller, og CD11b-FITC og CD45-APC for valg av myeloide celler (opp) og mikroglia (ned). (B) Skjematisk representasjon av gating strategien som brukes i flow cytometri analyse utvalg etter MACS. Andelen mikroglia har økt betydelig etter MACS: FSC-H og SSC-H for valg av celler, FSC-A og FSC-H for valg av enkeltceller, og CD11b-FITC og CD45-APC for valg av myeloide celler (opp) og mikroglia (ned). Forkortelser: SSC-H = sidespredningshøyde; FSC-H = fremover spredningshøyde; FSC-A = fremoverspredningsområde; CD45-APC = allophycocyanin-merket CD45; CD11b-FITC = fluorescein isothiocyanate-merket CD11b; MACS = magnetisk aktivert cellesortering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Figur 4: FACS gating strategi for levende / døde enkeltceller etter MACS. 7-AAD og SSC-H for å velge levende celler etter MACS. Forkortelser: SSC-H = sidespredningshøyde; 7-AAD = 7-aminoactinomycin D; MACS = magnetisk aktivert cellesortering; FACS = fluorescensaktivert cellesortering. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
Supplerende figur S1: Strømningscytometrianalyse av mikroglia isolert fra voksne demyelinasjonsmus. (A) Skjematisk representasjon av gatingstrategien som brukes i strømningscytometrianalyseeksempelet før MACS. (B) Skjematisk representasjon av gating strategien som brukes i flow cytometri analyse prøve etter MACS ved hjelp av to magnetiske kolonner. (C) Histogram med én parameter av CD11b-FITC og CD45-APC i strømningscytometri etter MACS ved hjelp av to magnetiske kolonner. Forkortelser: SSC-H = sidespredningshøyde; FSC-H = fremover spredningshøyde; FSC-A = fremoverspredningsområde; CD45-APC = allophycocyanin-merket CD45; CD11b-FITC = fluorescein isothiocyanate-merket CD11b; MACS = magnetisk aktivert cellesortering; CD45Int = mellomliggende CD45-uttrykk. Klikk her for å laste ned denne filen.
Supplerende figur S2: Immunfluorescensfarging av mikroglia med Iba-1 og P2ry12 før og etter MACS. (A) Bilder av mikroglia før MACS. (B) Bilder av isolert mikroglia etter MACS. Skalastenger = 20 μm. Forkortelser: MACS = magnetisk aktivert cellesortering; Iba-1 = ionisert kalsiumbindende adaptermolekyl 1; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol. Klikk her for å laste ned denne filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollen foreslår en metode for å isolere mikroglia rundt de demyeliniserende lesjonene, noe som kan bidra til å studere de funksjonelle egenskapene til mikroglia i inflammatoriske demyeliniserende sykdommer. Mikroglia fanget ved hjelp av CD11b perler har høy renhet og levedyktighet. Kritiske trinn i protokollen inkluderer presis lokalisering av foci og optimal mikroglial rensing. I protokolltrinn 2.1 er det nødvendig å injisere NR-løsningen 2 timer før du ofrer musen for å sikre at lesjonene kan vises nøyaktig20. I protokolltrinn 2.8 ble det tatt hensyn til å plassere hjernevevsseksjoner på en isboks for disseksjon og fullføre dette trinnet så snart som mulig, og dermed forbedre celle levedyktigheten. I trinn 2.9 er det nødvendig å velge passende vev som en prøve for både enzym fordøyelse og rusk fjerning. Trinn 3.7 kan ikke hoppes over når effekten av fjerning av rusk ikke er tilfredsstillende. I trinn 4.3 må tilsetningen av PBS være skånsom for å danne forskjellige lag, slik at så mye rusk fjernes som mulig. Alle trinnene i protokollen, unntatt enzymatisk fordøyelse, bør utføres på is for å sikre celle levedyktighet og redusere transkripsjonsresponsen til mikroglia. Hvert trinn i protokollen er mildt og beholder høy levedyktighet, så det er unødvendig å bruke dødcellefjerningsløsningen 22,23.
Den enzymatiske dissosiasjonsmetoden for musehjerne i protokollen har vist seg egnet for encellet RNA-seq23. Selv om enzymene i protokollen er milde, har Marsh et al. funnet ut at ulike enzymatiske hydrolyseprotokoller ved 37 °C kan endre transkripsjonen av mikroglia24 betydelig. Å sette en sunn kontroll i eksperimentet for sammenligning kan bidra til å identifisere differensialt uttrykte gener av demyelinasjon, og dermed eliminere unormal transkripsjonsrespons i protokollen. I mellomtiden, for å prevent denne unormale transkripsjonstilstanden etter enzymatisk fordøyelse, kan protokollen optimaliseres ved å legge til ulike transkripsjons- og oversettelseshemmere som actinomycin D, triptolid og anisomycin på forskjellige trinn. Bruken av disse inhibitorene kan avsløre det virkelige genuttrykket til mikroglia in vivo uten innstilling av en kontroll. Derfor kan tilsetningen av disse inhibitorene til protokollen redusere antall dyr eller prøver som kreves i eksperimentet og er mer økonomisk for nedstrømsanalyse. Det skal imidlertid bemerkes at noen gener av mikroglia vil bli modulert av disse inhibitorene, noe som kan begrense bruken av disse inhibitorene for fremtidig arbeid24. Bruk av det spesialiserte dissosiatorinstrumentet etter tilsetning av enzymblanding 1 og enzymblanding 2 for vevsdissosiasjon kan også begrense transkripsjonsresponser i protokolltrinn 323.
Denne protokollen har noen begrensninger. Renheten av mikroglia er bare ca. 85% i protokollen, som ikke klarer å utgjøre mer enn 90% av alle enkeltceller som ligner på andre litteratur19,22. Erstatning av LS-kolonne med MS-kolonne, fravær av filtrene og kvaliteten på mikrober kan være de potensielle årsakene. Hvis renheten til den isolerte mikrogliaen ikke oppfyller kravene, vil forlengelse av den magnetiske inkubasjonstiden eller passere de sorterte cellene gjennom en annen magnetisk kolonne forbedre renheten (Supplerende figur S1). Hvis antall celler er lavt, bør vev høstes fra flere mus og celletap på grunn av uforsiktig aspirasjon unngås. Hvis celle levedyktigheten er lav, kan det å erstatte PBS i lastebufferen med RPMI 1640 medium forbedre celle levedyktigheten betydelig. Det er også gunstig for celle levedyktighet å sikre at alle løsningene som brukes i protokollen er friske, og protokollen er fullført så snart som mulig. Det er viktig for brukerne å balansere renheten og antall mikroglia oppnådd ved hjelp av denne protokollen.
Protokollen benytter bindingen av mikroglia med CD11b perler og berikelsen i et magnetfelt for å rense mikroglia. Derfor inneholder renset mikroglia forurensning av myeloide celler, noe som er uunngåelig i denne protokollen. I motsetning til FACS-gullstandarden for sortering av celler - renheten av mikroglia isolert av MACS er ikke tilstrekkelig høy for noen forseggjorte applikasjoner som dyp sekvensering, noe som begrenser den utbredte bruken. I tillegg kan FACS for sortering av mikroglia eliminere forurensning av myeloide celler. MACS er imidlertid en mildere metode, beholder mer originale morfologiske egenskaper ved glialceller spesielt astrocytter, tar mindre tid for å isolere mikroglia, og har et høyere celleutbytte enn FACS, noe som tyder på at det kan redusere antall mus som skal ofres og kan være mer egnet for tidssensitive eksperimenter19,25 . I mellomtiden er MACS mer kostnadseffektiv og allment tilgjengelig og har lavere tekniske krav til eksperimenter. MACS har vist seg å være den mest pålitelige og konsekvente metoden for å isolere mikroglia. Morfologisk analyse viste at mikroglia ikke ville bli aktivert av MACS, og RNA-seq har vist at mikroglia isolert ved denne metoden opprettholder en hviletilstand19,26.
Samlet sett er protokollen viktig for undersøkelsen av mikroglia ved demyeliniserende sykdommer, og mikroglia isolert av denne protokollen kan brukes til ulike nedstrømsapplikasjoner som kvantitativ RT-PCR og RNA-seq. Protokollen benytter nøytral rød fargestoff for å finne demyeliniserende lesjoner, noe som sikrer nøyaktigheten av lesjonssteder og reduserer forvirring med normalt vev under prøvetaking. Nøyaktig lokalisering av lesjoner kan bidra til å fokusere på effekten av sykdommer og studere den unike molekylære fenotypen og funksjonelle egenskapene til mikroglia ved demyeliniserende sykdommer. Dette vil gi grunnlag for å studere mekanismen for mikroglia ved demyeliniserende sykdommer. Denne metoden for å isolere mikroglia ved hjelp av magnetiske CD11b perler kan rense mikroglia med høy celle levedyktighet og utbytte på kort tid, med minimale krav til eksperimentelle forhold, noe som tillater utbredt bruk for å studere mikroglia under forskjellige forhold.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Forfatterne har erklært at det ikke finnes konkurrerende interesser.
Acknowledgments
Studien ble støttet av Tongji Hospital (HUST) Foundation for Excellent Young Scientist (Grant No. 2020YQ06).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Micro Centrifuge Tubes | BIOFIL | CFT001015 | |
| 15 mL Centrifuge Tubes | BIOFIL | CFT011150 | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | BIOFIL | CFT011500 | |
| 70 µm Filter | Miltenyi Biotec | 130-095-823 | |
| Adult Brain Dissociation Kit, mouse and rat | Miltenyi Biotec | 130-107-677 | |
| C57BL/6J Mice | SJA Labs | ||
| CD11b (Microglia) Beads, human and mouse | Miltenyi Biotec | 130-093-634 | |
| Fetal Bovine Serum | BOSTER | PYG0001 | |
| FlowJo | BD Biosciences | V10 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| MiniMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Neutral Red | Sigma-Aldrich | 1013690025 | |
| NovoCyte Flow Cytometer | Agilent | A system consisting of various parts | |
| NovoExpress | Agilent | 1.4.1 | |
| PBS | BOSTER | PYG0021 | |
| Pentobarbital | Sigma-Aldrich | P-010 | |
| Stereomicroscope | MshOt | MZ62 |
References
- Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), New York, N.Y. 841-845 (2010).
- Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), New York, N.Y. 86-90 (2012).
- Paolicelli, R. C., et al. Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development. Science. 333 (6048), New York, N.Y. 1456-1458 (2011).
- Squarzoni, P., et al. Microglia modulate wiring of the embryonic forebrain. Cell Reports. 8 (5), 1271-1279 (2014).
- Ueno, M., et al. Layer V cortical neurons require microglial support for survival during postnatal development. Nature Neuroscience. 16 (5), 543-551 (2013).
- Cunningham, C. L., Martínez-Cerdeño, V., Noctor, S. C. Microglia regulate the number of neural precursor cells in the developing cerebral cortex. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (10), 4216-4233 (2013).
- Colonna, M., Butovsky, O. Microglia function in the central nervous system during health and neurodegeneration. Annual Review of Immunology. 35, 441-468 (2017).
- Benmamar-Badel, A., Owens, T., Wlodarczyk, A. Protective microglial subset in development, aging, and disease: Lessons from transcriptomic studies. Frontiers in Immunology. 11, 430 (2020).
- Yıldızhan, K., Nazıroğlu, M. Microglia and its role in neurodegenerative diseases. Journal of Cellular Neuroscience and Oxidative Stress. 11 (2), 861-873 (2019).
- Gutmann, D. H., Kettenmann, H. Microglia/brain macrophages as central drivers of brain tumor pathobiology. Neuron. 104 (3), 442-449 (2019).
- Hammond, T. R., Robinton, D., Stevens, B. Microglia and the brain: Complementary partners in development and disease. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 523-544 (2018).
- Menassa, D. A., Gomez-Nicola, D. Microglial dynamics during human brain development. Frontiers in Immunology. 9, 1014 (2018).
- Masuda, T., Sankowski, R., Staszewski, O., Prinz, M.
- Ni, M., Aschner, M. Neonatal rat primary microglia: isolation, culturing, and selected applications. Current Protocols in Toxicology. , Chapter 12, Unit 12.17 (2010).
- Yildizhan, K., Naziroglu, M. Glutathione depletion and parkinsonian neurotoxin MPP(+)-induced TRPM2 channel activation play central roles in oxidative cytotoxicity and inflammation in microglia. Molecular Neurobiology. 57 (8), 3508-3525 (2020).
- Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L.
- Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).
- Gordon, R., et al. A simple magnetic separation method for high-yield isolation of pure primary microglia. Journal of Neuroscience Methods. 194 (2), 287-296 (2011).
- Pan, J., Wan, J. Methodological comparison of FACS and MACS isolation of enriched microglia and astrocytes from mouse brain. Journal of Immunological Methods. 486, 112834 (2020).
- Baydyuk, M., et al. Tracking the evolution of CNS remyelinating lesion in mice with neutral red dye. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (28), 14290-14299 (2019).
- Sahel, A., et al. Alteration of synaptic connectivity of oligodendrocyte precursor cells following demyelination. Frontiers in Cell Neuroscience. 9, 77 (2015).
- Schroeter, C. B., et al. One brain-all cells: A comprehensive protocol to isolate all principal CNS-resident cell types from brain and spinal cord of adult healthy and EAE mice. Cells. 10 (3), 651 (2021).
- Liu, L., et al. Dissociation of microdissected mouse brain tissue for artifact free single-cell RNA sequencing. STAR Protocols. 2 (2), 100590 (2021).
- Marsh, S. E., et al. Single cell sequencing reveals glial specific responses to tissue processing & enzymatic dissociation in mice and humans. bioRxiv. , (2020).
- Holt, L. M., Olsen, M. L. Novel applications of magnetic cell sorting to analyze cell-type specific gene and protein expression in the central nervous system. PLoS One. 11 (2), 0150290 (2016).
- He, Y., et al. RNA sequencing analysis reveals quiescent microglia isolation methods from postnatal mouse brains and limitations of BV2 cells. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 153 (2018).
