Summary
Här presenterar vi ett protokoll för att isolera och rena primär mikroglia i djurmodeller av demyeliniserande sjukdomar, med hjälp av kolumnär magnetaktiverad cellsortering.
Abstract
Microglia, de bosatta medfödda immuncellerna i hjärnan, är de primära svararna på inflammation eller skada i centrala nervsystemet (CNS). Microglia kan delas in i vilotillstånd och aktiverat tillstånd och kan snabbt ändra tillstånd som svar på hjärnans mikromiljö. Microglia kommer att aktiveras under olika patologiska förhållanden och uppvisa olika fenotyper. Dessutom finns det många olika undergrupper av aktiverad mikroglia och stor heterogenitet mellan olika undergrupper. Heterogeniteten beror huvudsakligen på mikroglias molekylära specificitet. Studier har visat att mikroglia kommer att aktiveras och spela en viktig roll i den patologiska processen med inflammatorisk demyelinering. För att bättre förstå egenskaperna hos mikroglia vid inflammatoriska demyeliniserande sjukdomar som multipel skleros och neuromyelit optica spectrum disorder, föreslår vi ett perilesionellt primärt mikroglial sorteringsprotokoll. Detta protokoll använder kolumnär magnetisk aktiverad cellsortering (MACS) för att erhålla högrenad primär mikroglia och bevara de molekylära egenskaperna hos microglia för att undersöka de potentiella effekterna av mikroglia vid inflammatoriska demyeliniserande sjukdomar.
Introduction
Microglia härstammar från äggulor, som når embryonhjärnan mycket tidigt och deltar i utvecklingen av CNS 1,2. Till exempel är de involverade i synaptisk beskärning3 och reglering av axonal tillväxt4. De utsöndrar faktorer som främjar neuronal överlevnad och hjälper neuronal lokalisering5. Samtidigt är de involverade i att ta bort onormala celler och apoptotiska celler för att säkerställa normal hjärnutveckling6. Dessutom, som de immunkompetenta cellerna i hjärnan, övervakar microglia kontinuerligt hjärnans parenkym för att rensa döda celler, dysfunktionella synapser och cellulärt skräp7. Det har visat sig att mikroglial aktivering spelar en viktig roll i en mängd olika sjukdomar, inklusive inflammatoriska demyeliniserande sjukdomar, neurodegenerativa sjukdomar och hjärntumörer. Aktiverad mikroglia vid multipel skleros (MS) bidrar till differentiering av oligodendrocytprekursorceller (OPC) och regenerering av myelin genom att uppsluka myelinskräp8.
Vid Alzheimers sjukdom (AD) aktiverar ackumulering av amyloid beta (Aβ) mikroglia, vilket påverkar de fagocytiska och inflammatoriska funktionerna hos microglia9. Aktiverad mikroglia i gliomvävnaden, kallad glioma-associerad microglia (GAM), kan reglera utvecklingen av gliom och i slutändan påverka prognosen för patienter10. Aktiveringen förändrar djupt det mikrogliala transkriptomet, vilket resulterar i morfologiska förändringar, uttryck av immunreceptorer, ökad fagocytisk aktivitet och förbättrad cytokinsekretion11. Det finns olika delmängder av aktiverad mikroglia vid neurodegenerativa sjukdomar såsom sjukdomsassocierad mikroglia (DAM), aktiverad responsmikroglia (ARM) och mikroglial neurodegenerativ fenotyp (MGnD)8.
På samma sätt samexisterar flera dynamiska funktionella delmängder av mikroglia också i hjärnan vid inflammatoriska demyeliniserande sjukdomar12. Att förstå heterogeniteten mellan olika delmängder av mikroglia är avgörande för att undersöka patogenesen av inflammatoriska demyeliniserande sjukdomar och för att hitta deras potentiella terapeutiska strategier. Heterogeniteten hos microglia beror huvudsakligen på molekylär specificitet8. Det är viktigt att beskriva de molekylära förändringarna av mikroglia exakt för studier av heterogeniteten. Framsteg inom encells RNA-sekvensering (RNA-seq) -teknik har möjliggjort identifiering av de molekylära egenskaperna hos aktiverad mikroglia vid patologiska tillstånd13. Därför är förmågan att isolera cellpopulationer avgörande för vidare undersökning av dessa målceller under specifika förhållanden.
Studier som utförs för att förstå egenskaperna och funktionerna hos microglia är vanligtvis in vitro-studier, eftersom det har visat sig att ett stort antal primära mikroglia kan framställas och odlas från musunghjärnor (1-3 dagar gamla), som fäster vid odlingskolvarna och växer på plastytan med andra blandade glialceller. Därefter kan ren mikroglia isoleras baserat på den olika vidhäftningen hos blandade gliaceller14,15. Denna metod kan dock bara isolera mikroglia från den perinatala hjärnan och tar flera veckor. Potentiella variabler i cellodling kan påverka mikrogliala egenskaper såsom molekylärt uttryck16. Dessutom kan mikroglia som isoleras med dessa metoder endast delta i in vitro-experiment genom att simulera tillstånden för CNS-sjukdomar och kan inte representera egenskaperna och funktionerna hos microglia i in vivo-sjukdomstillstånd. Därför är det nödvändigt att utveckla metoder för att isolera mikroglia från den vuxna mushjärnan.
Fluorescensaktiverad cellsortering (FACS) och magnetisk separation är två allmänt använda metoder, även om de har sina egna olika begränsningar 16,17,18,19. Deras respektive fördelar och nackdelar kommer att kontrasteras i diskussionsavsnittet. Mognaden av MACS-teknik ger möjlighet att snabbt rena celler. har utvecklat en bekväm metod för att märka demyeliniserande lesioner i hjärnor20. Genom att kombinera dessa två tekniska tillvägagångssätt föreslår vi ett snabbt och effektivt kolumnärt CD11b magnetiskt separationsprotokoll, vilket ger en steg-för-steg-beskrivning för att isolera mikroglia runt demyeliniserande lesioner i vuxna mushjärnor och bevara de molekylära egenskaperna hos microglia. De fokala demyeliniserande lesionerna orsakades av stereotaktisk injektion av 2 μl lysolecithinlösning (1% LPC i 0,9% NaCl) i corpus callosum 3 dagar innan protokollet21 startades. Detta protokoll lägger grunden för att utföra nästa steg i in vitro-experiment. Dessutom sparar detta protokoll tid och är fortfarande möjligt för utbredd användning i olika experiment.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurprocedurer har godkänts av Institute of Animal Care Committee of Tongji Medical College, Huazhong University of Science and Technology, Kina.
1. Material
- Förbered följande lösningar innan du påbörjar protokollet.
- Förbered laddningsbufferten genom att tillsätta fetalt bovint serum (FBS, 2%) till fosfatbuffrad saltlösning (PBS).
- Tillsätt neutralt rött (NR) färgämne (slutligt 1%) till PBS.
- Förbered följande lösningar med hjälp av det kommersiellt tillgängliga adult brain dissociation kit (se materialtabellen).
- För att framställa enzymblandning 1, pipettera 1,9 ml buffert Z och 50 μl enzym P i ett 15 ml centrifugrör.
- För att framställa enzymblandning 2, pipettera 20 μL buffert Y och 10 μl enzym A till ett 1,5 ml mikrocentrifugrör.
- Förbered lösningen för borttagning av skräp.
2. Mössperfusion och dissektion
- Injicera musen intraperitonealt (i.p.) med 500 μL 1% NR-färgämne i PBS 2-3 h före anestesi.
OBS: Intraperitoneal injektion av NR i demyeliniserande musmodeller hjälper till att urskilja lesionerna (figur 1). - Bedöva musen med pentobarbital (50 mg/kg, i.p.) och se till att musen sövs framgångsrikt genom att undersöka smärtreaktionerna.
- Öppna musens brösthålighet och exponera hjärtat.
- Skär av ett litet hörn av det högra atriumet försiktigt och genomdränka musen med 20-30 ml kall PBS från vänster kammare.
- Halshugga musen under anestesi.
- Öppna musens skalle och frigör försiktigt hjärnan från skallen.
- Överför hjärnan till musens hjärnskiva mögel och skär hjärnan i 0,1 cm skivor.
- Ta bort hjärnskivorna och lägg dem i kall PBS i en petriskål (60/15 mm). Mikrodissekera lesionerna märkta med NR-färgämne runt corpus callosum under ett stereomikroskop med hjälp av mikrokirurgiska pincett.
OBS: Se till att den dissekerade vävnaden är så fullständig som möjligt för att underlätta den efterföljande överföringen; Den totala dissektionsförloppet bör slutföras inom 2 timmar. - Överför den dissekerade vävnaden till 15 ml centrifugrör som innehåller lämplig mängd kallbelastningsbuffert.
OBS: Slå ihop corpus callosumvävnaden från 2-3 möss i ett rör som ett prov.
3. Vävnadsdissociation
- Centrifugera den dissekerade vävnaden vid 300 ×g i 30 s (efter att ha nått denna hastighet) för att samla provet i botten av röret.
- Förvärm enzymblandning 1 och enzymblandning 2 till 37 °C i en inkubator.
- Tillsätt 1 950 μl förvärmd enzymblandning 1 till ett prov och koka i en inkubator vid 37 °C i 5 minuter.
- Tillsätt 30 μl förvärmd enzymblandning 2 och blanda försiktigt.
- Smält i en inkubator vid 37 °C i 15 min och blanda försiktigt var 5:e minut.
- Tillsätt 4 ml kall PBS i röret efter matsmältningen och skaka försiktigt.
- Placera 70 μm filter på 50 ml centrifugrör och förvälla filtren med 500 μL kall PBS. Filtrera den dissocierade vävnaden genom att leda de smälta vävnadsproverna genom filtren och överför den filtrerade suspensionen i 50 ml centrifugröret till ett 15 ml centrifugrör.
OBS: Hoppa över det här steget om mängden vävnad är för liten. - Centrifugera de filtrerade vävnadsproverna vid 300 × g i 10 minuter vid 4 °C och aspirera supernatanten långsamt och fullständigt.
OBS: Alla steg ska utföras på is förutom den enzymatiska matsmältningen.
4. Borttagning av skräp
- Resuspendera cellpelleten försiktigt med 1,550 μL kall PBS.
- Tillsätt 450 μL kall lösning för borttagning av skräp och blanda väl.
- Överlagra ovanstående blandning mycket långsamt och försiktigt med 2 x 1 ml kall PBS med en 1 000 μL pipett.
OBS: Luta centrifugröret med 45 ° och tillsätt långsamt PBS längs rörväggen med pipetten. - Överför röret långsamt och försiktigt till en centrifug och snurra vid 4 °C och 3 000 × g i 10 minuter.
- Leta efter tre lager efter centrifugering. Aspirera de två översta skikten helt med hjälp av en 1 000 μL pipett (figur 2).
- Fyll röret upp till 5 ml med kall laddningsbuffert och vänd försiktigt röret tre gånger.
- Centrifugera vid 4 °C och 1 000 × g i 10 minuter. Aspirera supernatanten helt och undvik att störa cellpelleten.
5. Magnetisk separation av mikrogliaceller
- Resuspendera cellpelleten med 90 μL laddningsbuffert och tillsätt 10 μL CD11b (Microglia) pärlor.
- Blanda väl och inkubera i 15 min vid 4 °C.
- Tillsätt 1 ml lastbuffert och pipettera vätskan försiktigt upp och ner med en 1 000 μL pipett för att tvätta cellerna efter inkubationen. Centrifugera cellerna vid 4 °C och 300 × g i 10 minuter och aspirera supernatanten helt för att avlägsna de obundna pärlorna.
- Återsuspendera cellerna i 500 μL laddningsbuffert.
- Placera MS-kolonnen med dess separator för positivt urval i magnetfältet.
- Skölj kolonnen med 500 μL laddningsbuffert för att skydda cellerna och säkerställa effektiviteten i magnetisk sortering baserat på tillverkarens protokoll.
- Applicera cellsuspensionen på MS-kolumnen och kassera genomströmningen som innehåller omärkta celler.
- Tillsätt 500 μL laddningsbuffert till kolonnen tre gånger för att tvätta bort celler som fäster vid kolonnväggen och kasta genomströmningen.
OBS: Lägg bara till ny lastbuffert för tvätt när kolonnbehållaren är helt tom. - Ta bort kolonnen från separatorn efter tvättning av kolonnen och placera den på ett 15 ml centrifugrör.
- Tillsätt 1 ml lastbuffert i kolonnen och tryck kolven till botten av kolonnen för att spola ut de magnetiskt märkta cellerna. Upprepa detta steg tre gånger för att helt samla in de magnetiskt märkta cellerna.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Microglia isolerad med CD11b-pärlor har hög renhet
Mikrogliaceller runt lesionerna i demyeliniseringsmusmodeller isolerades med hjälp av ovannämnda protokoll och testades med flödescytometri. Cellerna är fluorescerande märkta med CD11b-fluoresceinisotiocyanat (FITC) och CD45-allophycocyanin (APC) för att bestämma mikroglia i flödescytometri enligt tillverkarens instruktioner. Det finns flera litteraturer som visar att CD11b- och CD45-antikroppar räcker för att kontrollera renheten hos isolerade microglia19,22. Fluorescenskompensationen slutfördes på flödescytometern med användning av ofärgade och enfärgade kontrollprover. Cellerna var gated av framåtspridningshöjd (FSC-H) och sidospridningshöjd (SSC-H); enskilda celler var gated av framåtspridningsarea (FSC-A) och FSC-H. Proportionerna av microglia (identifierad som CD11b + CD45Intermediate) före och efter den magnetiska separationen testades med flödescytometri. Back-loop-tekniken användes för att justera gatingstrategin för flödescytometrianalys genom att bestämma grinden för mikroglia. Jämfört med cirka 3 × 104 celler och 6 × 103 mikroglia före magnetisk separation av varje mushjärna (figur 3A), ger MACS i allmänhet cirka 2,5 × 103 celler och 2 × 103 mikroglia per mushjärna (figur 3B), vilket var cirka 85% av alla enskilda celler. Nästan 3% av myeloida celler (identifierade som CD11b + CD45höga) var dock närvarande i de MACS-separerade cellerna och var svåra att ta bort från CD11b-populationen i detta protokoll. Renheten hos den isolerade mikroglia kan ökas till 95% med användning av två magnetiska kolumner (Kompletterande figur S1). MACS-sortering kan fånga cirka 33% av mikroglia i hjärnblandningsprovet.
Microglia isolerad med CD11b-pärlor har hög cellviabilitet
Fluorokrom 7-aminoaktinomycin D (7-AAD) används ofta för att visa cellviabiliteten i flödescytometrin. 7-AAD+ celler representerar döda celler19. Livskraften hos MACS-separerad mikroglia var cirka 95% genom cellfärgning med 7-AAD (figur 4).
Morfologisk analys av mikroglia kring demyeliniserande lesioner sorterade efter MACS
Morfologisk analys visade att mikroglia inte aktiverades av MACS. Microglia uppvisar en typisk longitudinell bipolär cellkropp efter MACS, vilket liknar mikroglial morfologi efter FACS19. Microglia kring demyeliniserande lesioner kommer att aktiveras i modellen av LPC-inducerad demyelinering21. Microglia färgad av joniserad kalciumbindande adaptermolekyl 1 (Iba-1) visade typisk amebisk morfologi av aktiverad mikroglia i detta protokoll. P2ry12 är en typisk molekyl av mikroglialt vilotillstånd. Det finns en liten del av grenade och P2ry12+ mikroglia före MACS på grund av utvidgningen av omfattningen av de dissocierade lesionerna. Förekomsten av P2ry12 + microglia efter MACS indikerar dock också att MACS inte kommer att aktivera microglia (Kompletterande figur S2).
Figur 1: Bilder av de fokala demyeliniserande lesionerna märkta med det neutrala röda färgämnet.
Figur 2: Bilder av de tre skikten som bildas genom centrifugering. De två översta lagren (lager 1 + lager 2) måste tas bort i borttagningsprocessen för skräp (se protokollsteg 4.5). Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: Flödescytometrianalys av mikroglia isolerad från demyelineringsskador hos vuxna möss före och efter MACS. (A) Schematisk representation av grindstrategi som används vid flödescytometrianalys före MACS: FSC-H och SSC-H för att välja celler, FSC-A och FSC-H för att välja enstaka celler och CD11b-FITC och CD45-APC för att välja myeloida celler (upp) och mikroglia (ner). (B) Schematisk representation av grindstrategin som används i flödescytometrianalysprov efter MACS. Andelen mikroglia har ökat avsevärt efter MACS: FSC-H och SSC-H för att välja celler, FSC-A och FSC-H för att välja enstaka celler och CD11b-FITC och CD45-APC för att välja myeloida celler (upp) och mikroglia (ner). Förkortningar: SSC-H = sidospridningshöjd; FSC-H = spridningshöjd framåt; FSC-A = främre spridningsarea; CD45-APC = allophycocyanin-märkt CD45; CD11b-FITC = fluoresceinisotiocyanatmärkt CD11b; MACS = magnetaktiverad cellsortering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: FACS gating strategi för levande / döda enskilda celler efter MACS. 7-AAD och SSC-H för att välja levande celler efter MACS. Förkortningar: SSC-H = sidospridningshöjd; 7-AAD = 7-aminoaktinomycin D; MACS = magnetaktiverad cellsortering; FACS = fluorescensaktiverad cellsortering. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Kompletterande figur S1: Flödescytometrianalys av mikroglia isolerad från vuxna demyelineringsmöss. (A) Schematisk representation av gatingstrategin som används i flödescytometrianalysprov före MACS. (B) Schematisk representation av grindstrategin som används i flödescytometrianalysprov efter MACS med användning av två magnetiska kolumner. (C) Enparametershistogram av CD11b-FITC och CD45-APC i flödescytometri efter MACS med användning av två magnetiska kolumner. Förkortningar: SSC-H = sidospridningshöjd; FSC-H = spridningshöjd framåt; FSC-A = främre spridningsarea; CD45-APC = allophycocyanin-märkt CD45; CD11b-FITC = fluoresceinisotiocyanatmärkt CD11b; MACS = magnetaktiverad cellsortering; CD45Int = mellanliggande CD45-uttryck. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Kompletterande figur S2: Immunofluorescensfärgning av mikroglia med Iba-1 och P2ry12 före och efter MACS. (A) Bilder av microglia före MACS. (B) Bilder av isolerade mikroglia efter MACS. Skalstänger = 20 μm. Förkortningar: MACS = magnetaktiverad cellsortering; Iba-1 = joniserad kalciumbindande adaptermolekyl 1; DAPI = 4',6-diamidino-2-fenylindol. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Protokollet föreslår en metod för att isolera mikroglia runt de demyeliniserande lesionerna, vilket kan hjälpa till att studera de funktionella egenskaperna hos mikroglia vid inflammatoriska demyeliniserande sjukdomar. Microglia fångad med CD11b-pärlor uppvisar hög renhet och livskraft. Kritiska steg i protokollet inkluderar exakt lokalisering av foci och optimal mikroglial rening. I protokollsteg 2.1 är det nödvändigt att injicera NR-lösningen 2 timmar innan du offrar musen för att säkerställa att lesionerna kan visas korrekt20. I protokollsteg 2.8 såg man till att placera hjärnvävnadssektioner på en islåda för dissektion och slutföra detta steg så snart som möjligt och därigenom förbättra cellviabiliteten. I steg 2.9 är det nödvändigt att välja lämplig vävnad som ett prov för både enzymsmältning och borttagning av skräp. Steg 3.7 kan inte hoppas över när effekten av borttagning av skräp inte är tillfredsställande. I steg 4.3 måste tillsatsen av PBS vara skonsam för att bilda olika lager, vilket säkerställer att så mycket skräp tas bort som möjligt. Alla steg i protokollet, utom enzymatisk matsmältning, bör utföras på is för att säkerställa cellviabilitet och minska mikroglians transkriptionella svar. Varje steg i protokollet är milt och behåller hög livskraft, så det är onödigt att använda lösningen för borttagning av döda celler 22,23.
Den enzymatiska dissociationsmetoden för mushjärna i protokollet har visat sig lämplig för encelligt RNA-seq23. Även om enzymerna i protokollet är milda har Marsh m.fl. funnit att olika enzymatiska hydrolysprotokoll vid 37 °C kan förändra transkriptomet för microglia24 avsevärt. Att ställa in en hälsosam kontroll i experimentet för jämförelse kan hjälpa till att identifiera de differentiellt uttryckta generna av demyelinering, vilket eliminerar det onormala transkriptionssvaret i protokollet. Under tiden, för att förhindra detta onormala transkriptionstillstånd efter enzymatisk matsmältning, kan protokollet optimeras genom att tillsätta olika transkriptions- och translationshämmare såsom aktinomycin D, triptolid och anisomycin i olika steg. Användningen av dessa hämmare kan avslöja det verkliga genuttrycket av microglia in vivo utan att ställa in en kontroll. Därför kan tillsatsen av dessa hämmare till protokollet minska antalet djur eller prover som krävs i experimentet och är mer ekonomiskt för nedströmsanalys. Det bör dock noteras att vissa gener av mikroglia kommer att moduleras av dessa hämmare, vilket kan begränsa användningen av dessa hämmare för framtida arbete24. Användning av det specialiserade dissociatorinstrumentet efter tillsats av enzymblandning 1 och enzymblandning 2 för vävnadsdissociation kan också begränsa transkriptionella svar i protokollsteg 323.
Detta protokoll har vissa begränsningar. Renheten hos microglia är endast cirka 85% i protokollet, vilket inte omfattar mer än 90% av alla enskilda celler som liknar andra litteraturer19,22. Ersättning av LS-kolonn med MS-kolonn, frånvaron av filtren och kvaliteten på mikrober kan vara de potentiella orsakerna. Om renheten hos den isolerade mikroglia inte uppfyller kraven, kommer förlängning av den magnetiska inkubationstiden eller överföring av de sorterade cellerna genom en andra magnetisk kolonn att förbättra renheten (kompletterande figur S1). Om antalet celler är lågt bör vävnad skördas från fler möss och cellförlust på grund av slarvig aspiration undviks. Om cellviabiliteten är låg kan ersättning av PBS i laddningsbufferten med RPMI 1640-medium avsevärt förbättra cellviabiliteten. Det är också fördelaktigt för cellviabiliteten att se till att alla lösningar som används i protokollet är färska och protokollet är klart så snart som möjligt. Det är viktigt för användarna att balansera renheten och antalet mikroglia som erhållits med hjälp av detta protokoll.
Protokollet använder bindningen av mikroglia med CD11b-pärlor och anrikningen i ett magnetfält för att rena mikroglia. Därför innehåller renad mikroglia förorening av myeloida celler, vilket är oundvikligt i detta protokoll. Till skillnad från FACS - guldstandarden för sortering av celler - är renheten hos mikroglia isolerad av MACS inte tillräckligt hög för vissa detaljerade applikationer som djup sekvensering, vilket begränsar dess utbredda användning. Dessutom kan FACS för sortering av mikroglia eliminera föroreningen av myeloida celler. MACS är dock en mildare metod, behåller mer ursprungliga morfologiska egenskaper hos gliaceller, särskilt astrocyter, tar mindre tid för att isolera mikroglia och har ett högre cellutbyte än FACS, vilket tyder på att det kan minska antalet möss som ska offras och kan vara mer lämpligt för tidskänsliga experiment19,25 . Samtidigt är MACS mer kostnadseffektivt och allmänt tillgängligt och har lägre tekniska krav för experimenter. MACS har visat sig vara den mest pålitliga och konsekventa metoden för att isolera microglia. Morfologisk analys visade att mikroglia inte skulle aktiveras av MACS, och RNA-seq har visat att mikroglia isolerad med denna metod upprätthåller ett vilotillstånd19,26.
Sammantaget är protokollet viktigt för undersökning av mikroglia vid demyeliniserande sjukdomar, och mikroglia isolerad av detta protokoll kan användas för olika nedströmsapplikationer såsom kvantitativ RT-PCR och RNA-seq. Protokollet använder neutralt rött färgämne för att lokalisera demyeliniserande lesioner, vilket säkerställer noggrannheten hos lesionsplatser och minskar eventuell förvirring med normal vävnad under provtagning. Noggrann lokalisering av lesioner kan hjälpa till att fokusera på effekterna av sjukdomar och studera de unika molekylära fenotyperna och funktionella egenskaperna hos mikroglia vid demyeliniserande sjukdomar. Detta kommer att ge en grund för att studera mekanismen för mikroglia vid demyeliniserande sjukdomar. Denna metod för att isolera mikroglia med hjälp av magnetiska CD11b-pärlor kan rena mikroglia med hög cellviabilitet och utbyte på kort tid, med minimala krav på experimentella förhållanden, vilket möjliggör utbredd användning för att studera mikroglia under olika förhållanden.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har förklarat att det inte finns några konkurrerande intressen.
Acknowledgments
Studien stöddes av Tongji Hospital (HUST) Foundation for Excellent Young Scientist (Bidrag nr 2020YQ06).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1.5 mL Micro Centrifuge Tubes | BIOFIL | CFT001015 | |
| 15 mL Centrifuge Tubes | BIOFIL | CFT011150 | |
| 50 mL Centrifuge Tubes | BIOFIL | CFT011500 | |
| 70 µm Filter | Miltenyi Biotec | 130-095-823 | |
| Adult Brain Dissociation Kit, mouse and rat | Miltenyi Biotec | 130-107-677 | |
| C57BL/6J Mice | SJA Labs | ||
| CD11b (Microglia) Beads, human and mouse | Miltenyi Biotec | 130-093-634 | |
| Fetal Bovine Serum | BOSTER | PYG0001 | |
| FlowJo | BD Biosciences | V10 | |
| MACS MultiStand | Miltenyi Biotec | 130-042-303 | |
| MiniMACS Separator | Miltenyi Biotec | 130-042-102 | |
| MS columns | Miltenyi Biotec | 130-042-201 | |
| Neutral Red | Sigma-Aldrich | 1013690025 | |
| NovoCyte Flow Cytometer | Agilent | A system consisting of various parts | |
| NovoExpress | Agilent | 1.4.1 | |
| PBS | BOSTER | PYG0021 | |
| Pentobarbital | Sigma-Aldrich | P-010 | |
| Stereomicroscope | MshOt | MZ62 |
References
- Ginhoux, F., et al. Fate mapping analysis reveals that adult microglia derive from primitive macrophages. Science. 330 (6005), New York, N.Y. 841-845 (2010).
- Schulz, C., et al. A lineage of myeloid cells independent of Myb and hematopoietic stem cells. Science. 336 (6077), New York, N.Y. 86-90 (2012).
- Paolicelli, R. C., et al. Synaptic pruning by microglia is necessary for normal brain development. Science. 333 (6048), New York, N.Y. 1456-1458 (2011).
- Squarzoni, P., et al. Microglia modulate wiring of the embryonic forebrain. Cell Reports. 8 (5), 1271-1279 (2014).
- Ueno, M., et al. Layer V cortical neurons require microglial support for survival during postnatal development. Nature Neuroscience. 16 (5), 543-551 (2013).
- Cunningham, C. L., Martínez-Cerdeño, V., Noctor, S. C. Microglia regulate the number of neural precursor cells in the developing cerebral cortex. The Journal of Neuroscience: The Official Journal of the Society for Neuroscience. 33 (10), 4216-4233 (2013).
- Colonna, M., Butovsky, O. Microglia function in the central nervous system during health and neurodegeneration. Annual Review of Immunology. 35, 441-468 (2017).
- Benmamar-Badel, A., Owens, T., Wlodarczyk, A. Protective microglial subset in development, aging, and disease: Lessons from transcriptomic studies. Frontiers in Immunology. 11, 430 (2020).
- Yıldızhan, K., Nazıroğlu, M. Microglia and its role in neurodegenerative diseases. Journal of Cellular Neuroscience and Oxidative Stress. 11 (2), 861-873 (2019).
- Gutmann, D. H., Kettenmann, H. Microglia/brain macrophages as central drivers of brain tumor pathobiology. Neuron. 104 (3), 442-449 (2019).
- Hammond, T. R., Robinton, D., Stevens, B. Microglia and the brain: Complementary partners in development and disease. Annual Review of Cell and Developmental Biology. 34, 523-544 (2018).
- Menassa, D. A., Gomez-Nicola, D. Microglial dynamics during human brain development. Frontiers in Immunology. 9, 1014 (2018).
- Masuda, T., Sankowski, R., Staszewski, O., Prinz, M.
- Ni, M., Aschner, M. Neonatal rat primary microglia: isolation, culturing, and selected applications. Current Protocols in Toxicology. , Chapter 12, Unit 12.17 (2010).
- Yildizhan, K., Naziroglu, M. Glutathione depletion and parkinsonian neurotoxin MPP(+)-induced TRPM2 channel activation play central roles in oxidative cytotoxicity and inflammation in microglia. Molecular Neurobiology. 57 (8), 3508-3525 (2020).
- Bohlen, C. J., Bennett, F. C., Bennett, M. L.
- Bennett, M. L., et al. New tools for studying microglia in the mouse and human CNS. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (12), 1738-1746 (2016).
- Gordon, R., et al. A simple magnetic separation method for high-yield isolation of pure primary microglia. Journal of Neuroscience Methods. 194 (2), 287-296 (2011).
- Pan, J., Wan, J. Methodological comparison of FACS and MACS isolation of enriched microglia and astrocytes from mouse brain. Journal of Immunological Methods. 486, 112834 (2020).
- Baydyuk, M., et al. Tracking the evolution of CNS remyelinating lesion in mice with neutral red dye. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 116 (28), 14290-14299 (2019).
- Sahel, A., et al. Alteration of synaptic connectivity of oligodendrocyte precursor cells following demyelination. Frontiers in Cell Neuroscience. 9, 77 (2015).
- Schroeter, C. B., et al. One brain-all cells: A comprehensive protocol to isolate all principal CNS-resident cell types from brain and spinal cord of adult healthy and EAE mice. Cells. 10 (3), 651 (2021).
- Liu, L., et al. Dissociation of microdissected mouse brain tissue for artifact free single-cell RNA sequencing. STAR Protocols. 2 (2), 100590 (2021).
- Marsh, S. E., et al. Single cell sequencing reveals glial specific responses to tissue processing & enzymatic dissociation in mice and humans. bioRxiv. , (2020).
- Holt, L. M., Olsen, M. L. Novel applications of magnetic cell sorting to analyze cell-type specific gene and protein expression in the central nervous system. PLoS One. 11 (2), 0150290 (2016).
- He, Y., et al. RNA sequencing analysis reveals quiescent microglia isolation methods from postnatal mouse brains and limitations of BV2 cells. Journal of Neuroinflammation. 15 (1), 153 (2018).
