Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Biology
Click here for the English version

Biology

Kvantitativ analys av viskoelastiska egenskaper hos röda blodkroppar med hjälp av optisk pincett och defokuseringsmikroskopi

Published: March 25, 2022 doi: 10.3791/63626
Automatic Translation
*1,2, *1,2, 1,2, 1,2, 1,3, 4,5, 6, 1,2, 1,2,3,7
1Centro Nacional de Biologia Estrutural e Bioimagem - CENABIO, Universidade Federal do Rio de Janeiro, 2Instituto de Física, Programa de Pós-graduação Multidisciplinar em Física Aplicada, Universidade Federal do Rio de Janeiro, 3Instituto de Biofísica Carlos Chagas Filho, Programa de Pós-graduação em Ciências Biológicas Biofísica, Universidade Federal do Rio de Janeiro, 4Faculdade de Farmácia, Universidade Federal do Rio de Janeiro - Campus Macaé, 5Faculdade de Medicina, Programa de Pós-Graduação em Endocrinologia, Universidade Federal do Rio de Janeiro, 6Instituto de Ciências Exatas, Departamento de Física, Universidade Federal de Minas Gerais, 7Instituto de Ciências Biomédicas, Universidade Federal do Rio de Janeiro
* These authors contributed equally

Summary

Här beskrivs ett integrerat protokoll baserat på optisk pincett och defokuseringsmikroskopi för att mäta cellernas reologiska egenskaper. Detta protokoll har bred tillämplighet vid studier av erytrocyters viskoelastiska egenskaper under variabla fysiopatologiska förhållanden.

Abstract

De viskoelastiska egenskaperna hos erytrocyter har undersökts med en rad tekniker. De rapporterade experimentella data varierar dock. Detta tillskrivs inte bara cellernas normala variabilitet utan också skillnaderna i metoder och modeller för cellrespons. Här används ett integrerat protokoll som använder optisk pincett och defokuseringsmikroskopi för att erhålla de reologiska egenskaperna hos röda blodkroppar i frekvensområdet 1 Hz till 35 Hz. Medan optiska pincetter används för att mäta den erytrocytkomplexa elastiska konstanten, kan defokuseringsmikroskopi erhålla cellhöjdsprofilen, volymen och dess formfaktor en parameter som möjliggör omvandling av komplex elastisk konstant till komplex skjuvmodul. Genom att tillämpa en mjuk glasartad reologimodell kan skalningsexponenten för båda modulerna erhållas. Den utvecklade metoden gör det möjligt att utforska det mekaniska beteendet hos röda blodkroppar, som karakteriserar deras viskoelastiska parametrar, erhållna under väldefinierade experimentella betingelser, för flera fysiologiska och patologiska tillstånd.

Introduction

Mogna röda blodkroppar (RBC), även kända som erytrocyter, kan sträcka sig mer än dubbelt så stor när de passerar genom de smalaste kapillärerna i människokroppen1. Sådan kapacitet tillskrivs deras unika förmåga att deformeras när de utsätts för yttre belastningar.

Under de senaste åren har olika studier karakteriserat denna funktion i RBC-ytor 2,3. Fysikområdet som beskriver de elastiska och viskösa svaren hos material på grund av yttre belastningar kallas reologi. I allmänhet, när en yttre kraft appliceras, beror den resulterande deformationen på materialets egenskaper och kan delas in i elastiska deformationer, som lagrar energi eller viskösa deformationer, som sprider energi4. Alla celler, inklusive röda blodkroppar, uppvisar ett viskoelastiskt beteende; Med andra ord både lagras och försvinner energi. Det viskoelastiska svaret hos en cell kan således karakteriseras av dess komplexa skjuvmodul G * (ω) = G'(ω) + iG "(ω), där G '(ω) är lagringsmodulen, relaterad till det elastiska beteendet, och G" (ω) är förlustmodulen, relaterad till dess viskositet4. Dessutom har fenomenologiska modeller använts för att beskriva cellsvar, en av de mest använda kallas den mjuka glasartade reologimodellen5, kännetecknad av ett kraftlagsberoende av den komplexa skjuvmodulen med belastningsfrekvensen.

Encellsbaserade metoder har använts för att karakterisera de viskoelastiska egenskaperna hos RBC, genom att applicera kraft och mäta förskjutning som en funktion av den pålagda belastningen 2,3. För den komplexa skjuvmodulen finns dock få resultat i litteraturen. Med hjälp av dynamisk ljusspridning rapporterades värden för RBC-lagring och förlustmoduler som varierade från 0,01-1 Pa, i frekvensområdet 1-100 Hz6. Genom att använda optisk magnetisk vridcytometri erhölls en uppenbar komplex elastisk modul7, och för jämförelseändamål hävdades en multiplikativ faktor för att möjligen klargöra skillnaderna.

Mer nyligen etablerades en ny metod baserad på optisk pincett (OT) tillsammans med defokuseringsmikroskopi (DM), som ett integrerat verktyg för att kvantitativt kartlägga lagring och förlust av skjuvmodul hos humana erytrocyter över tidsberoende belastningar, 8,9. Dessutom användes en mjuk glasartad reologimodell för att passa resultaten och erhålla en effektlagskoefficient som kännetecknar RBC: erna 8,9.

Sammantaget klargör den utvecklade metoden8,9, vars protokoll beskrivs i detalj nedan, tidigare avvikelser genom att använda de uppmätta värdena för formfaktorn, Ff, som relaterar krafter och deformationer till spänningar och töjningar i RBC-ytan och kan användas som en ny diagnostisk metod som kvantitativt kan bestämma de viskoelastiska parametrarna och mjuka glasartade egenskaperna hos RBC erhållna från individer med olika blod Patologier. Sådan karakterisering, med hjälp av protokollet som beskrivs nedan, kan öppna nya möjligheter att förstå beteendet hos RBC ur ett mekanobiologiskt perspektiv.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Mänskliga blodprover tillhandahölls av vuxna män och kvinnor volontärer enligt protokoll godkända av forskningsetikkommittén vid Federal University of Rio de Janeiro (protokoll 2.889.952) och registrerade i Brasilien Platform under CAAE-nummer 88140418.5.0000.5699. En skriftlig form av samtycke utfärdades till och samlades in från alla volontärer. De med någon hemoglobinopati och / eller tar kontrollerad medicinering uteslöts. Hela processen följde de riktlinjer som godkänts av institutets etiska kommitté.

1. Beredning av provhållare

  1. Skaffa två täckglas (24 mm x 60 mm och 24 mm x 32 mm; tjocklek = 0,13-0,17 mm) och en gummiring (diameter = 10 mm; tjocklek = 2 mm) för varje provhållare.
  2. Häll silikonfett över gummiringens yta på ett sätt som täcker hela omkretsen.
  3. Placera gummiringen på täckglaset med fettsidan vänd mot täckglaset. Vänta i 5 minuter för korrekt fastsättning, provhållarna är sedan redo att ta emot cellkulturen.
    OBS: Dessutom kan antingen kommersiella eller hemlagade glasbottenfat också användas, som tidigare beskrivits10.

2. Cellodling

OBS: Stegen nedan beskriver hur man får friska röda blodkroppar från humant blod. Det är viktigt att proverna är nyberedda före varje experiment.

  1. Späd 20 μl blod i 250 μl 1x fosfatbuffertsaltlösning (PBS) innehållande 137 mM NaCl, 2,7 mM KCl, 10 mMNa2HPO4, 1,8 mM KH2PO4, 10 mM glukos och kompletterat med 1 mg/ml bovint serumalbumin (BSA).
  2. Efter centrifugering vid 200 x g i 2 minuter vid rumstemperatur, aspirera supernatanten med en pipett och återsuspendera cellpelleten i 1 ml 1x PBS/BSA-lösning. Tvätta cellerna 2x i bufferten.
  3. Beräkna celldensiteten med hjälp av en hematotrer och ymp 50 000 till 100 000 celler i provhållaren som beretts i steg 1. Vänta i 10-15 minuter för ospecifik cellfästning på täckglaset; Väntetiden påverkar inte cellerna.
  4. Tillsätt till provet 0,2 μL av en 10% v / v polystyrensfärlösning (radie = 1,52 ± 0,02 μm) för ytterligare OT-experiment. Bekräfta korrekt blandning genom att titta på proverna under mikroskopet.
  5. Efter cellsådd, placera bara den andra täckglaset ovanför gummiringen (det är inte nödvändigt att tillsätta fett för fastsättning), stäng installationen och avsluta provberedningen. Proverna är klara för mikroskopianalys och manipulering.

3. Optisk pincett mikroskop inställning

OT är verktyg som använder en mycket fokuserad laserstråle för att fånga mikroskopiska föremål och för att mäta krafter i piconewton-området och förskjutningar i nanometerskalan. OT-lasern som används (1064 nm våglängd) måste vara korrekt inriktad, som tidigare beskrivits10.

  1. Kortfattat, med minst två speglar åtskilda av ett avstånd av några centimeter (minst 10-20 cm), rikta en linjärt polariserad laserstråle mot den bakre ingången till ett inverterat mikroskop. Rikta in laserstrålen exakt för att komma in i mikroskopet i en rak linje (figur 1).
  2. Reflektera sedan laserstrålen med hjälp av en dikroisk spegel, installerad i mikroskopet, för att fortsätta parallellt med objektivlinsens axel och gå in i linsen nära mitten av dess bakre ingång. Detta kommer att fokusera lasern för att skapa den optiska fällan (figur 1).
  3. Därefter, för att mäta krafter med OT, kalibrera systemet för att erhålla fällstyvheten (κOT). Se10 för en mer detaljerad beskrivning av OT-kalibreringsproceduren. När κ OT har hittats är OT-systemet redo för reologiexperimenten.

4. DM-inställning

DM är en ljusfältsbaserad optisk mikroskopiteknik som gör att transparenta objekt kan bli synliga om mikroskopet är något ofokuserat11,12. En sådan teknik har tillämpats för att erhålla RBC-formen13. Samma mikroskop som används för OT-systemet kan användas för DM, för att få en höjdprofil genom 3D-rekonstruktioner.

  1. Justera mikroskopbelysningssystemet genom att utföra Köhler-belysningen14 och, för bättre upplösning, öppna kondensormembranet helt för att utföra experimenten.
  2. Använd ett piezoelektriskt positioneringssystem för att förskjuta provet i alla koordinater, med nanometrisk precision i z-axeln. Utför autokalibreringen av det piezoelektriska systemet på alla axlar. När alla procedurer har utförts är mikroskopsystemet redo för DM-experiment.

5. OT-baserat reologiexperiment och analys

OBS: Reologiexperimentet består av att observera cellens svar på små svängningar med varierande frekvenser.

  1. Experimenterande
    1. Använd OT-systemet, fånga sfären med OT-lasern och fäst den sedan på en RBC genom att trycka sfären mot cellytan nära den övre ytan och nära cellkanten. Använd mikroskopet för detta steg. Fäll sedan en annan sfär och upprepa samma fästprocedur men fäst den nu på täckglaset, nära cellen. Sfären som är fäst vid täckglaset är referenssträngen (figur 2), som är nödvändig för att följa piezoförskjutningen och jämföra med RBC-sfären.
    2. Se till att den valda cellen är väl fäst vid täckglaset och att RBC- och referenssfärerna har fastnat på RBC-ytan respektive täckglaset innan mätningen påbörjas. Visuellt identifiera de icke-vidhäftade cellerna eftersom de kommer att röra sig över tiden, trots den höga vidhäftningshastigheten (cirka 80% -90%).
    3. Lägg till en sinusformad funktion av amplitud, ξ 0 = 0,500 ± 0,001 μm och varierande frekvenser på 1 Hz, 7 Hz, 14 Hz, 21 Hz, 28 Hz och 35 Hz, med respektive vinkelfrekvenser, ω, på 6,3 rad/s, 169 rad/s, 88 rad/s, 132 rad/s, 176 rad/s och 220 rad/s, till den piezoelektriska scenprogramvaran, med hjälp av den piezoelektriska programvaran, som tidigare visats 8,9.
    4. Använd det piezoelektriska steget, tryck på startknappen för att tillåta den piezoelektriska förskjutningen och håll RBC-sfären i fällan, skicka provet till en rörelsecykel med hjälp av sinusformad funktion som tidigare ställts in. Använd en kamera som kan producera bilder med 790 bilder / s eller högre för att spela in provrörelsen. En schematisk bild av experimentet visas i figur 2.
    5. Medan provet skickas till sinusformade rörelser, aktivera OT för att fånga sfären fäst vid RBC-ytan. Oavsett vilken temperatur som valts för att utföra experimenten, rumstemperatur, 37 °C eller annan temperatur, övervaka temperaturen noggrant för att undvika variationer under mätningarna. Den infraröda (1064 nm) lasern som används för att skapa OT orsakar nästan ingen skada eller uppvärmning av cellerna.
  2. Analys
    1. Analysera bilderna som erhållits under sinusformade rörelser med hjälp av ImageJ för att hitta centrum för masspositionen för var och en av sfärerna över tiden.
      OBS: Dessa data gör det möjligt att generera diagram som kan visa fas- och amplitudskillnader mellan båda sfärerna. Sådan information är avgörande för att erhålla det viskoelastiska svaret hos röda blodkroppar.
    2. För att få masscentrum för var och en av sfärerna, öppna ImageJ-programvaran. Importera hela filmen som erhållits under sinusformade rörelser.
    3. På fliken Bild klickar du på Justera och väljer sedan Tröskelvärde. Tröskelfönstret öppnas. Välj B&W. Detta gör bakgrunden vit och sfärerna svarta.
    4. Justera tröskelvärdet med båda rullningslisterna under histogrammet så att båda sfärerna visas med maximalt antal pixlar.
    5. Välj referenssfär genom att klicka på Arkiv > rektangel. Rita en rektangel för att markera sfären. När du har valt referenssfären i en bild kontrollerar du att rektangeln också markerar samma sfär korrekt i alla andra bilder i filmen.
    6. Klicka sedan på fliken Analysera och välj alternativet Masscentrum.
    7. Klicka igen på fliken Analysera och välj Analysera partiklar. Ett nytt fönster öppnas. Definiera storlek och cirkularitet (beroende på sfärradie). Markera följande rutor: Visa resultat och Rensa resultat. Klicka slutligen på OK för att bearbeta alla bilder.
    8. Ett nytt fönster som innehåller en tabell med xy-koordinater för mitten av massan visas. Spara dessa koordinatvärden som en .txt fil. Upprepa proceduren för den andra sfären, fäst vid RBC-ytan.
    9. För att få amplituden och skillnaderna i fas för båda sfärerna, öppna analysprogramvaran. Importera de .txt filer som erhållits tidigare.
    10. Skapa en ny tabell med tre kolumner. I den första kolumnen (c0) lägger du till antalet ramar, i den andra kolumnen (c1) lägger du till x-koordinaterna för referenssfären och i den tredje kolumnen (c2) x-koordinaterna för sfären som är fäst vid RBC-ytan.
      OBS: I det här exemplet, eftersom sinusformade rörelser endast utfördes i x-axeln, är det bara nödvändigt att använda x-koordinaterna för båda sfärerna.
    11. Korrelera sedan ramarna med tiden. Klicka på Windows > Formula Entry. Ett nytt fönster som heter formelpost öppnas. I det här fönstret är det möjligt att ställa in åtta olika ekvationer, var och en av dem i en specifik nyckel (från F1 till F8).
    12. Välj F1, skriv följande formel:
      c 3 = c0 / (kamera fps)
      Klicka på Kör. Detta skapar en ny kolumn för en tid i tabellen (kolumn 4).
    13. Subtrahera x-koordinatvärdet för varje bildruta med dess respektive medelvärde. Det gör du genom att ange två nycklar i formelposten och skriva följande ekvationer för varje nyckel:
      c 4 = (c 1 - medelvärde (c 1)) och c 5 = (c 2 - medelvärde (c2))
      Klicka på knappen Kör . Resultaten visas i kolumnerna 5 och 6 för referenssfärer respektive RBC-sfärer.
    14. Konvertera mitten av massvärden från pixlar till mikrometer. För detta, använd en annan nyckel på formelposten och skriv följande ekvation:
      c 4 = c 4 / omvandlingsnummer
      Upprepa samma process för kolumn 5.
      OBS: Konvertering förvärvas med hjälp av en mikrometerskala / linjal och erhåller sin bild med samma mikroskopinställning som används för mätningarna (inklusive samma objektivlins). Denna procedur kan utföras under mikroskopkalibreringen. En pixel/mikrometerrelation erhålls således.
    15. Generera ett diagram med masscentrum för båda sfärerna på y-axeln och tiden på x-axeln. För detta, klicka på Galleri > Linear och Scatter. Ett nytt fönster öppnas. Välj tidskolumnen för x-axeln och välj kolumnerna i masscentrum i mikrometer i y-axeln för både referens- och RBC-sfärer.
    16. I diagrammet väljer du endast data relaterade till den första vinkelfrekvensen (6,3 rad/s). Använd verktygen som anges i figur 3.
    17. Definiera ekvationen som justerar datakurvan för referenssfären. För detta, klicka på Kurvpassning > Allmänt och Fit1, markera rutan med data relaterade till referenssfärens position och klicka sedan på Definiera. Ett nytt fönster öppnas för att definiera ekvationen. Referenssfärens position ξ(t) beskrivs enligt följande:
      ξ(t) = ξ0cos(ωt)
      där ξ är provets sinusformade rörelse, ω är vinkelfrekvensen och t är tiden i s. Genom att överföra denna ekvation till analysprogramvaran kommer den att se ut som följer:
      Equation 1, där m1 är ξ, m2 är f, m0 är tiden t och m3 är fasen av cosinusfunktionen för t = 0.
    18. Uppskatta värdena för m1, m2 och m3 från diagrammet. När du har definierat ekvationen klickar du på OK. Data kommer att anpassas baserat på ekvationen och en kurva tillsammans med en liten kvadrat kommer att visas i diagrammet med värdena m1, m2 och m3.
    19. Definiera ekvationen som justerar datakurvan för RBC-sfären. För detta klickar du på Kurvpassning > Allmänt och definierar ekvationen som justerar kurvan för data. RBC-sfärens position ρ(t) ges av:
      Equation 2
      där ξ' är ur fasamplituden och φ är ur fasvinkeln. Genom att överföra denna formel till analysprogramvaran kommer den att se ut som följer:
      Equation 3, där m1, m2 och m3 är de värden som erhålls i referenssfärens kurvpassning. m4 är ξ' och m5 är φ.
    20. Uppskatta värdena för m4 och m5 från diagrammet. När du har definierat formeln klickar du på OK. Data kommer att anpassas baserat på ekvationen, och en kurva tillsammans med en liten kvadrat kommer att visas i diagrammet med värdena m4 och m5.
    21. Skapa sedan en ny tabell för att lägga till data som erhållits från kurvpassningen i respektive kolumner. Definiera fem olika kolumner för följande parametrar: vinkelfrekvens, amplitud (referenssfär), initialtid, amplitud (RBC-sfär) och utfasningsvinkel. Utför samma procedur för alla andra frekvenser.
    22. Använd följande ekvationer för att hitta lagringskonstanterna (K') och förlustkonstanterna (K"):
      Equation 4
      Equation 5
      där κ OT är OT-elastisk konstant och β är Stokes dragkoefficient. Transponera ekvationerna till analysprogramvaran kommer det att se ut som följer:
      Equation 6och

       Equation 7, där β och κOT måste ersättas med de värden som finns i systemet.
    23. Rita upp resultaten i ett diagram med x-axeln för K " och y-axeln för K' (figur 4).

6. DM-experiment och analys för att erhålla den totala cellformfaktorn

  1. Videoupptagning
    1. Flytta det piezoelektriska steget i xy-riktningen med hjälp av programvaran för att söka efter en isolerad cell fäst vid täckglaset. Fäll och fäst en polystyrensfär med känd diameter på RBC-ytan. Använd det piezoelektriska steget, flytta den fångade pärlan, som också är fäst vid RBC-ytan, för att deformera cellen och fäst sedan pärlan på täckglaset.
      OBS: Det är också möjligt att använda samma cell från OT-mätningarna.
    2. Ändra z-axelns position för att hitta den fokuserade bilden, där fokusplanet är i mitten av den valda cellen. Den här bilden visar den mindre kontrasten med grånivån i mitten av cellen lika med grånivån utanför cellen (bakgrunden).
    3. När positionen är fast använder du kameraprogramvaran för att skapa en film av hela cellen med cirka 5 000 bilder vid 8-bitars och 256 pixlar x 256 pixlar, med en bildhastighet på 25 fps. Flytta sedan z-axelns position 2 μm nedåt eller uppåt för att få en ofokuserad bild för den valda cellen. Upprepa parametrarna för att skapa en film för den här situationen.
    4. Slutligen, utan att ändra z-axelns position, sök efter ett område utan celler för att upprepa samma procedur och skapa en film av bildbakgrunden.
  2. Kontrastbildinsamling
    1. Konvertera var och en av de tre filmerna till tre genomsnittliga bilder. Använd ImageJ, välj en av filmerna, klicka på Image > Stacks > Z-projekt och välj alternativet Genomsnittlig intensitet . Upprepa proceduren för de andra filmerna för att få sina respektive bilder.
    2. Ändra alla erhållna bilder från 8 bitar till flyttal 32 bitar. Använd ImageJ, klicka på Bild > skriv > 32-bitar. Klicka sedan på Analysera > Ställ in mätningar och välj alternativet Genomsnittligt grått värde . Klicka slutligen igen på Analysera > mått.
    3. Klicka sedan på Process > Image Calculator och dela den fokuserade bilden med bakgrundsbilden. Till detta resultat multiplicerar du medelvärdet för den fokuserade bildens grånivå. Hämta medelvärdet genom att klicka på Process > Math > Multiply.
    4. För att få medelvärdet, välj den fokuserade bilden och klicka sedan på Analysera > mått. För den representativa bilden är medelvärdet för grånivån 69 199. Upprepa ovanstående procedurer för den oskarpa bilden. I detta fall är medelvärdet för grånivån 69 231. Figur 5 visar de fokuserade och oskarpa bilderna före och efter proceduren.
    5. Bilder kan förlora visuell kontrast under användning. För att bättre visualisera bilderna, klicka på Bild > Justera > ljusstyrka / kontrast och välj alternativet Auto .
    6. Använd sedan följande relation för att hitta bildkontrasten:
      Equation 8, där N Img är cellens grånivå, N0 är grånivån utanför cellen och är en konstant parameter som motsvarar grånivån för noll ljusintensitet som beror på kameran.
    7. För att hitta värdet B, använd en effektmätare för att mäta ljusintensiteten. För varje ljusintensitetsvärde måste en video spelas in; Således kan olika intensitetsvärden relateras till olika nivåer av grått. Slutligen få en linjär passform och relatera B till nollljusintensiteten15.
    8. Hitta värdet på N0, klicka på Polygonmarkeringsikonen och rita en polygon som den i figur 6. Klicka sedan på fliken Analysera och välj Mät för att hitta den genomsnittliga grånivån för det valda området. Varje bild bildas av en uppsättning pixlar och varje pixel har en viss grånivå. Uppsättningen av alla grånivåer på grund av alla pixlar som utgör bilden motsvarar NImg.
    9. Använd kontrastekvationen för att bestämma N Img - No och kör detta genom att välja Process > Math > Subtrahera. Dela resultatet med N0 - B. Slutligen, hitta kontrasten för den fokuserade (C 0) och oskarpa bilden (C1).
  3. Hämta höjdprofilen
    1. För att få höjdprofilen, använd den redan beskrivna metoden13. I korthet, använd Hartley-transformen (FHT) för att erhålla RBC-tjockleken. I ImageJ klickar du på Process > FFT > FFT-alternativ och väljer sedan FHT.
    2. Subtrahera bilderna C0 och C1 i ImageJ med Process > Math > Subtrahera för att hämta bilden för följande procedur, C = C0 - C1.
    3. För bild C, klicka på Process > FFT > FFT-alternativ och välj sedan FHT för att utföra Hartley-transformen av bilden. Dela sedan med den rumsliga frekvensen q2 med hjälp av det skräddarsydda pluginet DivideQ2. Klicka på Plugin > DivideQ2.
      Filen DivideQ2.class måste kopieras i plugin-katalogen där ImageJ är installerad. Insticksprogrammet tillhandahålls som en .class fil (tilläggsfil 1) som ska inkluderas i plugin-mappen i ImageJ.
    4. Utför sedan den omvända transformen FHT med Process > FFT > FFT för att få en bild med en grånivå som är proportionell mot cellens höjd.
    5. Klicka slutligen på Process > Math > Multiply för att multiplicera den resulterande bilden med följande konstant:
      Equation 9
      som definieras baserat på egenskaperna hos bilderna, provet och experimentuppställningen13. Här är n = 1,51 oljebrytningsindexet, p = 0,0721 μm är förhållandet mellan mikrometer och pixlar i bilderna, Δ n = 0,058 är skillnaden mellan RBC och de vattenhaltiga medelbrytningsindexen, avståndet mellan fokuserings- och defokuseringsbilderna (Z f1 - Z f2) = 2μm och storleken på bilderna, N 2 = 256 pxl2.
    6. Använd den resulterande bilden för att få höjdprofilen (figur 7). Den resulterande bilden används i ImageJ för att observera olika höjdprofiler. Det beror på var i cellen den gula vertikala linjen placeras, till exempel i figur 7 erhålls en höjdprofil begränsad av den vertikala linjen, observera detta genom att trycka på Ctrl + K.
  4. Formfaktor
    1. När du har hittat bilden som innehåller RBC-höjdprofilen använder du 2 μm oskarp kontrast för att skapa en uppsättning med två bilder i ImageJ. Klicka på Bild > staplar och välj sedan alternativet Bilder att stapla. Om du vill hitta formfaktorn använder du ett anpassat ImageJ-makro för att analysera stacken. Det anpassade ImageJ-makrot kan laddas ner som tilläggsfil 2.
      Programmet använder oskärpebilden för att bestämma cellkanterna. Den bestämmer sedan omkretsen, med hjälp av bilden som innehåller höjdprofilen, för varje horisontell position. Förutom kanterna bestämmer den omkretsen, liksom inversen av omkretsen. Summan av de inversa omkretsvärdena, multiplicerad med pixeltjockleken, motsvarar inversen av formfaktorn.
    2. Sätt in pixel/mikrometer-relationen i programmet. Hämta detta värde från mikroskopets objektivkalibreringsexperiment. I det använda exemplet är värdet 13,87 pixel/μm.
    3. Välj den horisontella startpositionen för att placera den gula linjen i den första bilden av stapeln. Starta linjen före cellens början och dra den bortom cellens vertikala gränser. I exemplet har den gula linjen 153 pixlar längd och den ursprungliga positionen är mellan i = 70, y1 = 80 och i = 70 och y2 = 195. Flytta sedan den gula linjen horisontellt tills den slutliga positionen är f = 245, y1 = 80 och f = 245 och y2 = 195.
    4. Slutligen, för att hitta cellkanterna, omkretsen och inversen av omkretsen, välj fliken Makro och klicka på Kör makro. Makrot levererar en tabell med kantpositionen, omkretsen och inversen av omkretsen och en bild av den analyserade cellen. Kontrollera om kanterna på den här bilden liknar kanterna på figur 7, annars upprepar du proceduren.
    5. Använd summan av inversen av omkretsen för att hitta formfaktorn8.

7. Mjuk glasartad reologimodell och experimentell analys

  1. Ordna experimentella data i en tabell
    1. Skapa en ny tabell i analysprogrammet genom att klicka på fliken Arkiv . Bestäm 10 olika kolumner (från c0 till c9) för följande parametrar: använda vinkelfrekvenser (rad/s): c0; K'- värden (pN/μm) erhållna för varje vinkelfrekvens: c1; Fel: c2; K" (pN/μm)-värden erhållna för varje vinkelfrekvens: c3; Fel": c4; G'(Pa)-värden erhållna för varje vinkelfrekvens: c5; ErrG': c6; G" (Pa)-värden erhållna för varje vinkelfrekvens: c7; ErrG": c8 och Ff med respektive fel: c9 (figur 8). Använd följande formel för att fylla i följande kolumner:
      c5 = (3 x c1) / (8 x 1,28 x 0,087)
      c6 = (3 / (8 x 0,087 x 1,28)) x sqrt (c2 ^ 2 + (c1 x 0,01 / 1,28) ^ 2 + (c1 x 0,008 / 0,087) ^ 2)
      c7 = (3 x c3) / (8 x 1,28 x 0,087)
      c8 = (3 / (8 x 0,087 x c4)) x sqrt (c4 ^ 2 + (c3 x 0,01 / 1,28) ^ 2 + (c3 x 0,008 / 0,087) ^ 2)
  2. Plottningskurva G' (ω) kontra G" (ω)
    1. För att generera kurvan G' (ω) kontra G" (ω) i analysprogramvaran, använd data från föregående tabell. Klicka på Galleri > linjär och välj formatet Scatter Plot.
    2. Ett nytt fönster öppnas. Välj kolumnen G" som x-axel och G-kolumnen som y-axel . Klicka slutligen på Plot-knappen för att få grafen.
    3. För att lägga till felstaplarna i diagrammet, klicka på Plot-fönstret och klicka sedan på Plot > Error Bars. Ett nytt fönster öppnas. Markera först alternativet Y Err . Ett annat fönster, kallat Inställningar för felfält , öppnas.
    4. Klicka på % av värde, välj Datakolumn och klicka sedan på kolumnen ErrG'. Klicka slutligen på OK > Plot, felstaplarna för y-värdena visas. Upprepa samma procedur för x-axelvärden genom att nu välja X Err-kvadraten och rätt kolumn för ErrG". Det slutliga diagrammet kommer att likna det som visas i figur 9.
  3. Anpassning av parametrarna till den mjuka glasartade reologimodellen
    OBS: Dataanalysen är uppdelad i två delar: 1) kurva som passar G' (ω) kontra G "(ω) -diagrammet för att erhålla parametrarna Γ och Gm; 2) kurva som passar G' (ω) och G" (ω) som en funktion av frekvensen ω, för att erhålla effektlagsexponenten α.
    1. Kurva som passar G' (ω) kontra G" (ω) för att erhålla parametrarna Γ och Gm.
      1. Klicka på fliken Kurvpassning , välj Anpassa 1. Ett nytt fönster öppnas. Välj torget och klicka på knappen Definiera . Ett fönster som heter allmän kurvpassningsdefinition visas. Skriv följande ekvation:
        m1 + m0/m2
        där m1 = 61,576; m2 = 1, med tillåtet fel på 1 x 10-5. Här representerar m0 G ", m1 representerar Gm och m2 representerar Γ.
        Anmärkning: För m1 och m2 är det nödvändigt att uppskatta deras respektive värden under definitionen av kurvanpassning. Uppskattningarna ovan baserades på exempelexperimentet som visades. I experimenten uppskattar du siffrorna enligt de värden som observerats i diagrammet.
      2. Klicka på OK-knappen i båda fönstren och beslaget visas, som visas i figur 10 - en svart kurva. Kontrollera de korrekta värdena för m1 och m2, listade i kurvpassningstabellen som visades med diagrammet.
    2. Kurvanpassning G ' och G" som en funktion av vinkelfrekvensen ω
      1. Skapa sedan två andra tomter, nämligen G' som en funktion av ω och G' som en funktion av ω. Placera felstaplarna endast på y-axeln, som tidigare visats.
      2. Upprepa kurvpassningsproceduren men nu i alternativet Kurvpassningsval, välj G" och skriv sedan följande ekvation i Allmän passform > kurvdefinition:
        Equation 10
        I detta fall uppskattades m1 vara värdet på G" (ω) = 23,683 Pa, när ω = 6,3 rad/s; m2 uppskattades till 0,5 (kom ihåg att m2 är exponenten α och varierar mellan 0 och 1). Infoga värdet för Γ = 2,0293, enligt resultatet av m2 i figur 10.
      3. Markera alternativet Viktdata. Efter alla dessa procedurer klickar du på OK och en kurva som passar den i figur 11 - en blå kurva visas. Värdena för α, α = 0,63 ± 0,02 och G 0, G 0 = (3,7 ± 0,3)Pa visas. Använd dessa värden för att passa nästa kurva, G' (ω).
      4. Klicka på nästa kurva, upprepa kurvpassningsproceduren men skriv nu följande ekvation i General Fit Curve Definition:
        Equation 11
        I detta fall är m3 bara ett uppskattat värde på α för att bekräfta det tidigare erhållna värdet. Använd värdena för G 0 = 3,703 och G' (ω) = 23,683 Pa när ω = 6,3 rad/s.
      5. Återigen, lägg till 1 x 10-5 som tillåtet fel och markera alternativet Viktdata. Efter alla dessa procedurer klickar du på OK och en kurva som passar den i figur 11 - en grön kurva visas.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Figur 1 visar schemat för OT-systemet som används för reologimätningarna. Figur 2 visar schemat för mikroreologiexperimentet med båda sfärerna och en representativ RBC visas också. Figur 3 visar en typisk kurva för amplituderna för båda sfärerna som en funktion av tiden när sinusformade rörelser produceras av det piezoelektriska steget. Medan referenssfären (figur 3 - röd kurva) svänger efter scenrörelsen, svänger RBC-sfären (figur 3 - en blå kurva) med en annan amplitud och fas. Genom att mäta dessa parametrar är det möjligt att bestämma den komplexa elastiska konstanten K* (ω) för olika röda blodkroppar i provet. Figur 4 visar ett typiskt diagram för den elastiska lagringskonstanten K' (ω) som en funktion av den förlustelastiska konstanten K" (ω). Det observerade linjära beroendet visar att RBC-ytan kan betraktas som ett mjukt glasartat material. För att erhålla den totala cellformfaktorn, Ff, krävs sedan ett DM-förfarande och figur 5, figur 6 och figur 7 innehåller några av de steg som krävs för ändamålet. För att omvandla krafter och deformationer till spänningar och töjningar är det nödvändigt att förvandla K* (ω) till G* (ω).

Den komplexa RBC-elastiska konstanten definieras som K * (ω) = K '(ω) + iK "(ω). Dessutom är K * (ω) relaterad till RBC-komplexskjuvmodulen G * (ω) = G '(ω) + iG" (ω). G' (ω) och G" (ω) är RBC-skjuvlagrings- respektive förlustmodulerna. Förhållandet mellan K* (ω) och G* (ω) ges av:

Equation 12

där Ff är en formfaktor som beror på RBC-geometrin, som tidigare nämnts, och ζ är RBC-membrantjockleken, tidigare bestämd som ζ = (0,087 ± 0,009)μm 8,15.

Dessutom är lagringsmodulerna G' (ω) och G" (ω) förlustskjuvning relaterade till de elastiska konstanterna K' (ω) respektive förlust K" (ω) genom ekvationerna 8,9

Equation 13 och Equation 14

För att hitta standardfelen för G' (ω) och G" (ω), Err G' respektive Err G", använd utbredningen av osäkerhetitetsekvationer med resultaten av K ' (ω) och K" (ω), enligt följande ekvationer 8,9:

Equation 15
Equation 16.

Enligt den mjuka glasartade reologiteorin beter sig RBC: erna som viskoelastiska material såsom emulsioner, pastor och uppslamningar 8,9 och deras lagrings- och förlustmoduler följer följande ekvationer:
Equation 17

Således, där G m är cellmembranskjuvmodulen, G 0 är lågfrekvent lagringsmodul, Γ är förhållandet Equation 19, α är kraftlagsexponenten för mjuk glasartad reologimodell och ω 0 = 1 rad / s 8,9Equation 18. 

De värden som hittades för F f och även RBC-yttjockleken ζ användes (uppskattad till 87 ± 8 nm 8,9,15). Resultaten visas i figur 8, figur 9 och figur 10. Återigen är det linjära beroendet mellan G 'och G" i linje med hypotesen att RBC-ytor kan modelleras som mjuka glasartade material. Från den linjära passformen i denna plot kan värdet på G m också erhållas, och genom att införa detta värde till den mjuka glasartade reologikurvan för G "bestäms värdena på G0 och α (Figur 11 - en blå kurva). Dessutom, efter att ha använt det erhållna resultatet för G 0 och lagt till det i den mjuka glasartade reologikurvan för G ', härleds samma värde för exponenten inom felstaplar (figur 11 - en grön kurva).

Figure 1
Figur 1: Schematisk representation av OT-mikroskopet. Hela systemet är byggt på ett vibrationsdämpande bord. Lasern riktas in med minst två olika dikroiska speglar (vita) och riktas mot mikroskopets objektivlins bakre ingång med hjälp av en annan dikroisk spegel (ljusblå). En piezoelektrisk scen och en digital vetenskaplig kamera ansluten till en dator är också nödvändiga. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 2
Figur 2: Scheman över mikroreologiexperimentet. Referenssfären (mörkgrå) är fäst vid täckglaset och RBC-sfären (blå) är fäst vid erytrocytytan (röd) och fångas av OT (indikeras av persikatrianglar när lasern är på). ρ är RBC-sfärens jämviktsposition i fällan, ξ är provets sinusformade rörelse och x är celldeformationen. Den schematiska bilden skapades i Biorender. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 3
Figur 3: Diagram som illustrerar amplituderna (μm) för båda sfärerna över tid (er) när sinusformade rörelser produceras av det piezoelektriska steget. Referenssfären (röd kurva) svänger efter scenrörelsen, medan RBC-sfären (blå kurva) svänger med en annan amplitud och fas. Den gröna pilen till höger anger datamarkeringsverktyget medan den gula pilen anger zoommarkeringsverktyget. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 4
Figur 4: RBC-mikroreologiska resultat. Lagra elastisk konstant som en funktion av förlustelastisk konstant för olika röda blodkroppar i provet (n = 10 olika celler från tre olika prover). Datapunkter representerar medelvärdena för både K ' (y-axeln) och K" (x-axeln) med sina respektive felstaplar (standardmedelfel), erhållna för varje vinkelfrekvens som används i experimentuppställningen. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 5
Figur 5: DM tillämpad på en RBC . (A) Oskarp bild, storlek = 2 μm. (B) Bild i fokus. (C) Bakgrundsbild. Genom att dela varje bild (A) och (B) med bakgrundsbilden (C) och sedan multiplicera med det genomsnittliga gråvärdet för varje bild är det möjligt att få bilder (D) och (E). Skalstapel: 5 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 6
Figur 6: Bakgrundsgrånivå N0. När du har öppnat den representativa bilden i ImageJ (A) väljer du ett område (gul geometrisk figur runt RBC-cellen) som används för att få medelvärdet för bakgrundsgrånivån och resultatet (B). För att utföra den gula markeringen i A, använd polygonmarkeringsverktyget i bild J (indikeras med en grön pil). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 7
Figur 7: Höjdprofil för den deformerade RBC. Höjdprofil (vänster) representerad längs bildens vertikala gula linje (höger). Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 8
Bild 8: Representativ skärmbild av en typisk resultattabell i analysprogrammet. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 9
Figur 9: Viskoelastiska RBC-parametrar. Lagra skjuvmodul som en funktion av förlustskjuvmodulen för olika RBC i provet (n = 10 olika celler från tre olika prover). Datapunkter representerar medelvärdena för både G ' (y-axeln) och G" (x-axeln), med sina respektive felstaplar (standardmedelfel), erhållna för varje vinkelfrekvens som används i experimenten. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 10
Figur 10: Kurvpassning för G ' (Pa) som en funktion av G" (Pa). Den linjära svarta linjen är kurvan som passar för datapunkterna. N = 10 olika celler från tre olika prover. Felstaplar representerar standardfelet för medelvärdet. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Figure 11
Figur 11: Justera den mjuka glasartade reologimodellen till resultaten. Den komplexa skjuvmodulen (G*) som en funktion av vinkelfrekvensen ω för olika röda blodkroppar i provet. De gröna cirklarna i diagrammet representerar medelvärdena för G', medan de blå cirklarna representerar medelvärdena för G", ritade med sina respektive felstaplar. De kontinuerliga gröna och blå linjerna representerar kurvbeslagen för den mjuka glasartade reologimodellen. Parametrarna m 1, m 2 och m3 anges i diagrammet. Medan m 1 är G0, m2 och m3 är exponenten, α. N = 10 olika celler från tre olika prover. Felstaplar representerar standardfelet för medelvärdet. Klicka här för att se en större version av denna figur.

Kompletterande fil 1: ImageJ-plugin DivideQ2.class. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Kompletterande fil 2: ImageJ anpassade makro för att få formfaktorn. Klicka här för att ladda ner den här filen.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

I detta protokoll presenteras en integrerad metod baserad på optisk pincett och defokuseringsmikroskopi för att kvantitativt kartlägga de viskoelastiska egenskaperna hos RBC. Resultat för lagrings- och förlustskjuvmodulen, tillsammans med skalningsexponenten som kännetecknar den mjuka glasartade reologin hos RBC bestäms. Tillämpning av detta protokoll för olika experimentella betingelser, såsom i fysiologisk situation8 eller längs varje stadium av P. falciparum intraerytrocytisk cykel9 har redan utförts.

Referenser i litteraturen pekar på avvikelser i RBC-reologi, delvis hänförliga till förändringar i cellmorfologi som inte beaktats korrekt vid mätningar 6,7. Med hjälp av dynamisk ljusspridning rapporterades värden för RBC-lagrings- och förlustmodulerna från 0,01-1 Pa, i frekvensområdet 1-100 Hz6. I en annan studie, med användning av optisk magnetisk vridcytometri, bestämdes den uppenbara komplexa elastiska modulen7, men avvek från de dynamiska ljusspridningsvärdena; Således användes en multiplikativ faktor på 84 för jämförande ändamål. Efter de procedurer som beskrivs i detta protokoll klargjordes dessa skillnader8 genom att karakterisera RBC-formfaktorn med hjälp av en icke-invasiv defokuseringsmikroskopiteknik11,12,13. Den komplexa skjuvmodulen, som kännetecknar cellytor, kan endast erhållas om geometrin anses vara16,17 och detta inte alltid utfördes korrekt.

Den integrerade metoden som presenteras i detta protokoll gör det möjligt att utföra båda metoderna (OT-mätning och DM-mätning) för samma enda cell, en efter en. Det gör det också möjligt att utföra OT-mätningar för olika celler i en population och sedan utföra DM-mätningar för andra celler i samma cellpopulation. Det sista alternativet kommer förmodligen att introducera mer variabilitet för båda resultaten, men felen kan spridas i enlighet därmed, på ett sådant sätt att resultaten kommer att korrelera den övergripande RBC-morfologin med de övergripande RBC-viskoelastiska egenskaperna i en given population av celler som motsvarar ett visst experimentellt tillstånd.

Huvudbegränsningen för att utföra detta protokoll är den inneboende svårigheten att utföra själva metoden eftersom det är en integration av optisk pincett och defokuseringsmikroskopi; Således kan tillgången på instrument för att utföra alla beskrivna steg vara en utmaning. Men om man har tillgång till en OT-anläggning är det mycket mer genomförbart att så småningom anpassa anläggningen för att utföra experimenten. Det är där det nuvarande protokollet passar in, inte bara detaljerar varje steg för att utföra mätningar och analys utan också hjälper människor att identifiera och anta dessa OT-system istället för att skapa en installation från grunden.

Dessutom blir RBC-fäste på täckglas en begränsande faktor eftersom de är icke-vidhäftande celler och sådana steg kan medföra svårigheter vid mätningar, eftersom vissa RBC kan lossna. Således är det viktigt att välja en väl vidhäftad RBC. Ett sätt att kontrollera om valet lyckades kan inträffa vid tidpunkten för att förbereda provet för mätningen. När du har placerat den OT-fångade RBC-sfären på cellytan, flytta provet något för att säkerställa att cellen är ordentligt fixerad och inte har ändrat position efter OT-fångad pärla. Om så är fallet, leta efter en annan cell i provet. Framtida förbättringar som användningen av dubbelstrålande OT för att samtidigt fånga RBC och utföra reologimätningarna samtidigt kan också göras.

Bortsett från det möjliggör möjligheten att extrahera enstaka cellbaserad kvantitativ viskoelastisk information av RBC en mängd olika applikationer som just börjar utforskas 8,9. Således kan den presenterade metoden utvidgas till karakterisering av RBC-mekaniskt beteende under andra fysiopatologiska tillstånd som järnbristanemi och diabetes eller i genetiska blodsjukdomar såsom sicklecellsjukdom och talassemi, till exempel. Ett sådant integrerat verktyg kan utgöra grunden för utvecklingen av nya diagnostiska metoder som kan korrelera förändringarna i RBC viskoelastiska egenskaper med modifieringar i blodflödet hos individer med olika patologier.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Författarna har inga ekonomiska intressen i de produkter som beskrivs i detta manuskript och har inget annat att avslöja.

Acknowledgments

Författarna vill tacka alla medlemmar i CENABIO avancerade mikroskopianläggning för all viktig hjälp. Detta arbete stöddes av de brasilianska byråerna Conselho Nacional de Desenvolvimento Científico e Tecnológico (CNPq), Coordenação de Aperfeiçoamento de Pessoal de Nível Superior (CAPES) - Financial Code 001, Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado do Rio de Janeiro (FAPERJ) och Instituto Nacional de Ciência e Tecnologia de Fluidos Complexos (INCT-FCx) tillsammans med Fundação de Amparo à Pesquisa do Estado de São Paulo (FAPESP). B.P. stöddes av ett JCNE-bidrag från FAPERJ.

Materials

Name Company Catalog Number Comments
35mm culture dishes Corning 430165
Bovine serum albumin Sigma-Aldrich A9418
Coverslips Knittel Glass VD12460Y1A.01 and VD12432Y1A.01
Glass-bottom dishes MatTek Life Sciences P35G-0-10-C
Glucose Sigma-Aldrich G7021
ImageJ NIH https://imagej.nih.gov/ij/
Immersion oil Nikon MXA22165
Inverted microscope Nikon Eclipse TE300
KaleidaGraph Synergy Software https://www.synergy.com/
KCl Sigma-Aldrich P5405
KH2PO4 Sigma-Aldrich P5655
Microscope camera Hamamatsu C11440-10C
Na2HPO4 Sigma-Aldrich S5136
NaCl Sigma-Aldrich S5886
Neubauer chamber Sigma-Aldrich BR717805-1EA
Objective lens Nikon PLAN APO 100X 1.4 NA DIC H; PLAN APO 60x 1.4 NA DIC H and Plan APO 10x XXNA PH2
Optical table Thorlabs T1020CK
OT laser IPG Photonics YLR-5-1064-LP
Polystyrene microspheres Polysciences 17134-15
rubber ring Forever Seals NBR O-Ring
Silicone grease Dow Corning Z273554
Stage positioning PI P-545.3R8S
Pipette Gilson P1000

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Fowler, V. M. The human erythrocyte plasma membrane: a Rosetta Stone for decoding membrane-cytoskeleton structure. Current Topics in Membranes. 72, 39-88 (2013).
  2. Tomaiuolo, G. Biomechanical properties of red blood cells in health and disease towards microfluidics. Biomicrofluidics. 8 (5), 051501 (2014).
  3. Depond, M., Henry, B., Buffet, P., Ndour, P. A. Methods to investigate the deformability of RBC during malaria. Frontiers in Physiology. 10, 1613 (2019).
  4. Boal, D. Mechanics of the Cell. 2 edn. , Cambridge University Press. (2012).
  5. Balland, M., et al. Power laws in microrheology experiments on living cells: Comparative analysis and modeling. Physical Review E. 74 (2), 021911 (2006).
  6. Amin, M. S., et al. Microrheology of red blood cell membranes using dynamic scattering microscopy. Optics Express. 15 (25), 17001-17009 (2007).
  7. Puig-de-Morales-Marinkovic, M., Turner, K. T., Butler, J. P., Fredberg, J. J., Suresh, S. Viscoelasticity of the human red blood cell. American Journal of Physiology Cell Physiology. 293 (2), 597-605 (2007).
  8. Gomez, F., et al. Effect of cell geometry in the evaluation of erythrocyte viscoelastic properties. Physical Review E. 101 (6-1), 062403 (2020).
  9. Gomez, F., et al. Plasmodium falciparum maturation across the intra-erythrocytic cycle shifts the soft glassy viscoelastic properties of red blood cells from a liquid-like towards a solid-like behavior. Experimental Cell Research. 397 (2), 112370 (2020).
  10. Pompeu, P., et al. Protocol to measure the membrane tension and bending modulus of cells using optical tweezers and scanning electron microscopy. STAR Protocols. 2 (1), 100283 (2021).
  11. Agero, U., Mesquita, L. G., Neves, B. R., Gazzinelli, R. T., Mesquita, O. N. Defocusing microscopy. Microscopy Research and Technique. 65 (3), 159-165 (2004).
  12. Agero, U., Monken, C. H., Ropert, C., Gazzinelli, R. T., Mesquita, O. N. Cell surface fluctuations studied with defocusing microscopy. Physical Review E. 67 (5), 051904 (2003).
  13. Roma, P. M. S., Siman, L., Amaral, F. T., Agero, U., Mesquita, O. N. Total three-dimensional imaging of phase objects using defocusing microscopy: Application to red blood cells. Applied Physics Letters. 104 (25), 251107 (2014).
  14. Köhler, A. New method of illumination for photomicrographical purposes. Journal of the Royal Microscopical Society. 14, 261-262 (1894).
  15. Nans, A., Mohandas, N., Stokes, D. L. Native ultrastructure of the red cell cytoskeleton by cryo-electron tomography. Biophysical Journal. 101 (10), 2341-2350 (2011).
  16. Ayala, Y. A., et al. Rheological properties of cells measured by optical tweezers. BMC Biophysics. 9, 5 (2016).
  17. Ayala, Y. A., et al. Effects of cytoskeletal drugs on actin cortex elasticity. Experimental Cell Research. 351 (2), 173-181 (2017).

Tags

Retraktion utgåva 181 optisk pincett oskärande mikroskopi erytrocyt cellviskoelasticitet lagringsskjuvmodul förlustskjuvmodul mjuk glasartad reologi kraftlagsexponent
Kvantitativ analys av viskoelastiska egenskaper hos röda blodkroppar med hjälp av optisk pincett och defokuseringsmikroskopi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Barreto, L., Gomez, F.,… More

Barreto, L., Gomez, F., Lourenço, P. S., Freitas, D. G., Soares, J., Berto-Junior, C., Agero, U., Viana, N. B., Pontes, B. Quantitative Analysis of Viscoelastic Properties of Red Blood Cells Using Optical Tweezers and Defocusing Microscopy. J. Vis. Exp. (181), e63626, doi:10.3791/63626 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter