Summary
Konstruierte Klappen erfordern ein integriertes funktionelles Gefäßnetzwerk. In diesem Protokoll stellen wir eine Methode zur Herstellung einer 3D-gedruckten Gewebeklappe vor, die ein hierarchisches Gefäßnetzwerk und seine direkten mikrochirurgischen Anastomosen an der Oberschenkelarterie der Ratte enthält.
Abstract
Die Entwicklung implantierbarer, funktioneller, dicker Gewebe erfordert die Entwicklung eines hierarchischen Gefäßnetzwerks. 3D-Bioprinting ist eine Technologie, die verwendet wird, um Gewebe zu erzeugen, indem Schicht für Schicht druckbare Biomaterialien, sogenannte Biotinten, und Zellen in geordneter und automatischer Weise hinzugefügt werden, was es ermöglicht, hochkomplizierte Strukturen zu schaffen, die traditionelle Tissue-Engineering-Techniken nicht erreichen können. Daher ist der 3D-Bioprinting ein ansprechender In-vitro-Ansatz , um die Struktur des nativen Gefäßkomplexes nachzuahmen, der von millimetermetrischen Gefäßen bis hin zu mikrovaskulären Netzwerken reicht.
Fortschritte beim 3D-Bioprinting in granularen Hydrogelen ermöglichten die hochauflösende Extrusion von niedrigviskosen extrazellulären Matrix-basierten Bioinks. Diese Arbeit präsentiert einen kombinierten 3D-Bioprinting- und Schimmelpilz-basierten 3D-Druckansatz zur Herstellung von vaskularisierten Gewebeklappen. Das 3D-Bioprinting von Endothel- und Stützzellen unter Verwendung von rekombinanter Kollagen-Methacrylat-Biotinte in einem Gelatine-Stützbad wird zur Herstellung eines selbstorganisierten Kapillarnetzwerks verwendet. Diese gedruckte Mikrovaskulatur ist um ein mesoskaliges gefäßartiges poröses Gerüst herum aufgebaut, das mit einer 3D-gedruckten Opferform hergestellt und mit Endothelzellen ausgesät ist.
Diese Anordnung induziert das Endothel des mesoskaligen Gefäßes, mit dem umgebenden Kapillarnetzwerk zu anastomosieren und ein hierarchisches Gefäßnetzwerk innerhalb einer künstlichen Gewebeklappe zu bilden. Der konstruierte Lappen wird dann direkt durch chirurgische Anastomose in eine Ratten-Oberschenkelarterie implantiert, wobei eine Manschettentechnik verwendet wird. Die beschriebenen Methoden können für die Herstellung verschiedener vaskularisierter Gewebeklappen für den Einsatz in der Rekonstruktionschirurgie und in Vaskularisationsstudien erweitert werden.
Introduction
Schwere Gewebedefekte werden durch traumatische Verletzungen, angeborene Defekte oder Krankheiten verursacht, und der aktuelle Goldstandard für die Behandlung dieser Defekte ist die Verwendung von autologen Transplantaten, vaskularisierten Gewebelappen und mikrovaskulären freien Lappen als Gewebeersatz. Diese Optionen haben jedoch die Nachteile eines begrenzten Gewebes an der Spenderstelle und der Morbidität an der Spenderstelle1. Daher besteht eine wachsende Nachfrage nach alternativen Gewebeersatzstoffen, mit denen diese Defekte behoben werden können2. Die Dicke der konstruierten Gewebekonstrukte ist durch die Diffusion von Nährstoffen und Gasen in Richtung der Zellen begrenzt, und daher ist ein geeignetes Gefäßnetzwerk für die Erzeugung großer, dicker und richtig genährter Gerüste unerlässlich.
Mehrere Ansätze wurden angewendet, um die Vaskularisierung von technisch hergestellten Implantatenzu fördern 3, einschließlich der In-vivo-Rekrutierung von Gefäßunterstützung durch den Wirt, der Abgabe von Wachstumsfaktoren und Zytokinen innerhalb der Gerüste, der Prävaskularisierung von Implantaten, der Erzeugung eines durchlässigen verzweigten Mikrogefäßbetts unter Verwendung von Mikrostrukturierungstechniken4, der Verwendung von Opfermaterialien für die Bildung von Gefäßkanälen / Netzwerken5 sowie die Erstellung von Kanälen innerhalb der 3D-biogedruckten Konstrukte 5,6. Die Vaskularisierung dicker Gewebe erfordert die Einbeziehung eines hierarchischen Gefäßnetzwerks, das aus Gefäßen auf Makro- und Mikrokapillarebene besteht. Die Gefäße auf Makroebene verteilen das Blut effektiv im gesamten Konstrukt und ermöglichen mikrochirurgische Anastomosen mit den Blutgefäßen des Wirts, während die mikrokapillarschuppigen Gefäße eine Nährstoffdiffusion ermöglichen.
Bioprinting hat in den letzten Jahren aufgrund der Vorteile, die es gegenüber herkömmlichen Tissue-Engineering-Methoden bietet, große Aufmerksamkeit erregt. Gewebe und Organe sind komplexe und komplizierte 3D-Objekte mit einer bestimmten Architektur. Das 3D-Bioprinting mit seiner Fähigkeit, Schichten von Biomaterialien in hoher Auflösung abzuscheiden, ermöglicht die Herstellung komplexer Gewebe- und Organersatzstoffe (z. B. Niere, Lunge, Leber)7. Mehrere Drucktechnologien wurden für das Bioprinting angepasst, darunter extrusionsbasiertes,inkjet-8, lasergestütztes Deposition9,10 und stereolithographiebasiertes11,12-Bioprinting. Die extrusionsbasierten Technologien beruhen auf dem Extrudieren des Materials durch eine Düse, indem Druck auf die der Düse gegenüberliegende Materialoberfläche ausgeübt wird.
Freiform-reversible Einbettung von suspendierten Hydrogelen (FRESH) ist eine Bioprinting-Technik13,14, bei der ein körniges Trägermaterial verwendet wird, in dem das extrudierte Material durch das Stützbad abgeschieden und fixiert wird. Das Stützbad unterstützt die extrudierte, vorvernetzte Biotinte mechanisch bis zur Vernetzung. Der Hauptvorteil dieser Technik besteht darin, dass das Stützbad das Extrudieren von niedrigviskosen Materialien ermöglicht, die ihre Form nach der Extrusion und vor der Vernetzungnicht beibehalten können 15. Dies erweitert den Pool der verfügbaren Materialien, die als Biotinten verwendet werden können.
Dieses Papier stellt ein Protokoll für die Erzeugung eines vaskularisierten Lappens vor, der mikroskalige und mesoskalige Vaskulaturen kombiniert. Um dies zu erreichen, werden biogedruckte, selbstassemblierende, mikrovaskuläre Netzwerke in rekombinantem humanem Kollagenmethacrylat (rhCollMA) -Hydrogel erzeugt, das sich dann mit dem Inneren eines größeren, implantierbaren Gefäßgerüsts verbindet, was zu einem vollständig entwickelten Gewebelappen16 führt. Um eine schnelle und direkte Durchblutung von künstlich hergestelltem Gewebe herzustellen, ist eine direkte mikrochirurgische Anastomose der Wirtsgefäße erforderlich. Das Gefäßgestell hat keine ausreichende Nahtretentionsfestigkeit, um mit herkömmlicher mikrochirurgischer Gefäßwandnähte anastomosiert zu werden. Daher beschreiben wir eine "Manschette"17,18,19 Methode, um eine Anastomose mit der gemeinsamen Oberschenkelarterie einer Ratte zu erreichen. Bei dieser Methode werden die Gefäßenden mit umlaufenden Nähten gesichert, ohne dass die Gefäßwand perforiert werden muss.
Obwohl das vorgeschlagene Protokoll zur Untersuchung der hierarchischen Vaskulatur in der rhCollMA-Umgebung erstellt wurde, kann dieser Ansatz erweitert und auf eine Vielzahl neuer Anwendungen angewendet werden. Das Protokoll kann auf das Bioprinting verschiedener gewebespezifischer Zellen in verschiedenen Biotinten angewendet werden. Darüber hinaus können die Geometrie und Größe der Konstrukte leicht an spezifische Anforderungen angepasst werden, z. B. große Geweberekonstruktionen oder biologische Studien.
Protocol
Alle Tierverfahren wurden unter der Aufsicht der Technion Pre-Clinical Research Authority (PCRA Technion, Ethikgenehmigung Nr. 058-05-20) genehmigt und durchgeführt. Für diese Studien wurden männliche Sprague-Dawley-Ratten (275-350 g) verwendet. In der Materialtabelle finden Sie Details zu allen Materialien, Geräten und Software, die in diesem Protokoll verwendet werden.
1. Herstellung von Gefäßgerüsten
- Erstellen Sie ein 3D-Computermodell der gewünschten Gefäßgerüstform mit CAD-Software (Computer Aided Design) oder laden Sie eine 3D-Datei einer gewünschten Gefäßstruktur aus Online-Repositories herunter.
- Erstellen Sie einen Zylinder mit einem Innendurchmesser von 0,9 mm, einem Außendurchmesser von 2 mm und einer Höhe von 18 mm. Fügen Sie radiale Fensteröffnungen mit einem Durchmesser von 0,22 mm entlang der Zylinderwand hinzu.
- Erstellen Sie mit der 3D-Konstruktionssoftware eine Form für das Gerüst und exportieren Sie sie als . STL-Datei. Als nächstes fügen Sie dem Design einen Trichter hinzu, um das Füllen der Form später zu erleichtern.
- Importieren Sie die . STL-Datei in die Slicing-Software für den 3D-Drucker Fused Deposition Modeling (FDM). Schneiden Sie das Modell mit einer Ebenenhöhe von 0,1 mm und exportieren Sie es als .gcode oder senden Sie es direkt an den 3D-Drucker.
- 3D-Druck der Form auf einem FDM-3D-Drucker, der mit einer 0,25-mm-Düse ausgestattet ist, wobei wasserlösliches Buten-Diol-Vinylalkohol-Copolymer (BVOH) -Filament verwendet wird. Lagern Sie die bedruckten Formen bis zur Verwendung in einer Vakuumkammer.
ACHTUNG: Vermeiden Sie es, das BVOH-Filament mit bloßen Händen zu handhaben, da es feuchtigkeitsempfindlich ist. Darüber hinaus wird empfohlen, das Filament in einer Vakuumkammer zu lagern, um Feuchtigkeit zu vermeiden. - Es wird eine Polymerlösung aus einer 1:1-Mischung aus Poly-L-Milchsäure (PLLA) und Polymilch-Co-Glykolsäure (PLGA) in 1,4-Dioxan hergestellt.
- Wiegen Sie 350 mg PLLA und 350 mg PLGA und geben Sie sie in eine 20 ml Glasdurchstechflasche um.
- 10 ml 1,4-Dioxan messen und mit einer Glaspipette auf die Glasdurchstechflasche übertragen. Fügen Sie der Glasdurchstechflasche eine kleine magnetische Rührstange hinzu.
ACHTUNG: 1,4-Dioxan ist ein gefährliches organisches Lösungsmittel. Verwenden Sie geeignete persönliche Sicherheitsausrüstung und arbeiten Sie in einem Abzug. - Stellen Sie die Durchstechflasche aus Glas in ein auf 70 °C beheiztes Warmwasserbad und mischen Sie den Inhalt über Nacht, bis sich alle Polymere vollständig aufgelöst haben. Lagern Sie die Lösung bis zur Verwendung in einem luftdichten Glasbehälter.
- Füllen Sie die BVOH-Formen mit der PLLA:PLGA-Lösung.
- Mit einer Verdrängerpipette messen Sie 30 μL der Polymerlösung und füllen Sie die Form ein.
HINWEIS: Das Volumen, das zum Befüllen der Form benötigt wird, ändert sich je nach Volumen des entworfenen Gefäßes. Fügen Sie die Polymerlösung so lange hinzu, bis der Trichter der Form vollständig gefüllt ist. - Zentrifen Sie die Form bei 100 × g für 2 min. Füllen Sie die Form mit weiteren 20 μL der Polymerlösung, um eine vollständige Füllung zu gewährleisten.
- Mit einer Verdrängerpipette messen Sie 30 μL der Polymerlösung und füllen Sie die Form ein.
- Frieren Sie die gefüllten Formen bei -80 °C für mindestens 30 Minuten ein, um sicherzustellen, dass die gesamte Polymerlösung einfriert. Entfernen Sie das Lösungsmittel aus den Schimmelpilzen, indem Sie sie über Nacht lyophilisieren.
HINWEIS: Die Farbe des Polymers in der Form sollte sich nach dem Gefriertrocknungsprozess von klar nach weiß verfärben. - Um das Opferformmaterial zu entfernen, geben Sie die Formen nach dem Gefriertrocknungsprozess unter sanftem Rühren in ein 5 L deionisiertes Wasserbad. Ersetzen Sie das Wasser im Bad, wenn es trüb wird. Wenn sich alle BVOH aufgelöst haben, trocknen Sie die Gerüste an der Luft und lagern Sie sie bis zur Verwendung in einer Vakuumkammer.
2. Beschichten des Gefäßgerüsts mit Fibronektin
- Desinfizieren Sie die PLLA:PLGA Gefäßgerüste, indem Sie sie 30 min lang in 70% Ethanol tauchen.
- Waschen Sie die Gerüste 3x 5 min mit PBS.
- Bereiten Sie eine Verdünnung von 50 μg / ml humanem Fibronektin in PBS vor und beschichten Sie die Gerüste.
- Mischen Sie 500 μL Stammfibronektinlösung (1 mg/ml) mit 9,5 ml PBS.
- Tauchen Sie die desinfizierten Gefäßgestelle in diese Fibronektinlösung ein und inkubieren Sie sie bei 37 ° C für 60 Minuten, um eine Proteinadsorption zu ermöglichen.
- Nach der Inkubation spülen Sie die Gerüste mit PBS, um das ungebundene Fibronektin zu entfernen. Lagern Sie diese beschichteten Gerüste bis zu 1 Woche bei 4 °C.
3. rhCollMA Bioink Zubereitung
- Bereiten Sie einen Phosphatpuffer zur Neutralisation des sauren rhCollMA-Bioink-Bestands vor.
- Bereiten Sie einen 10-fachen Vorrat an Phosphatpuffer vor, indem Sie 5,495 g Na2 HPO 4, 1,55 g NaH2PO 4 und 30 mg NaCl in 50 ml deionisiertem Wasser auflösen.
- Bereiten Sie eine 10-fache Verdünnung des 10-fachen Vorratsphosphatpuffers vor, indem Sie 1 Teil des 10-fachen Phosphatpuffers mit 9 Teilen deionisiertem Wasser kombinieren.
- Kombinieren Sie 900 μL Stamm-rhCollMA-Lösung mit 100 μL 10x Phosphatpuffer, um die saure rhCollMA-Lösung zu neutralisieren.
- Verdünnen Sie die neutralisierte rhCollMA-Lösung auf die gewünschte Konzentration von 10 mg/ml, indem Sie sie mit der erforderlichen Menge an 1x Phosphatpuffer mischen.
HINWEIS: Die Lagerkonzentration von rhCollMA variiert zwischen den Partien. Daher variiert das Volumen von 1x Phosphatpuffer, das benötigt wird, um die gewünschte Konzentration zu erreichen. - Bereiten Sie die Porogen-Photoinitiator-Lösung (PEO-LAP) für die Kombination mit dem verdünnten neutralen rhCollMA vor.
- Bereiten Sie eine 1,6% (w/v) ige Lösung von Polyethylenoxid) (PEO) in phenolrotfreiem DMEM vor, indem Sie 160 mg PEO in 10 ml DMEM auflösen.
- 20 mg Lithiumphenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinat (LAP) in diese Lösung geben, um 0,2% (w/v) LAP in der Lösung zu erhalten. Decken Sie die Lösung ab diesem Zeitpunkt mit Aluminiumfolie ab oder bewahren Sie sie an einem dunklen Ort auf, um sie vor Licht zu schützen.
- Sterilisieren Sie die PEO-LAP-Lösung, indem Sie sie durch einen 0,22-μm-Filter führen. Lagern Sie diese Lösung bei 4 °C für bis zu 1 Woche.
- Mischen Sie vor dem Bioprinting die verdünnte neutrale rhCollMA-Lösung mit der PEO-LAP-Lösung im Verhältnis 1:1, um die endgültige Bioink-Lösung zu erhalten. Verwenden Sie Pipettieren anstelle eines Wirbels, um die Lösungen zu mischen und gleichzeitig Luftblasen zu vermeiden.
- Wenn viele Blasen in die Lösung eingebracht werden, zentrifugieren Sie sie bei 2.000 × g für 30 s. Nach der Zentrifugation die Bioink-Lösung erneut mischen, um eine Homogenität zu gewährleisten.
4. Granulare Stützbadvorbereitung
- Bereiten Sie gelatinekörniges Trägermaterial vor.
- Teilen Sie in einer biologischen Sicherheitswerkbank den Inhalt eines 2-g-Röhrchens mit lyophilisiertem Trägermaterial in zwei sterile konische 50-ml-Röhrchen auf, die jeweils etwa 1 g enthalten.
- Fügen Sie 40 ml kaltes (4 ° C) phenolrotfreies DMEM zu jeder Röhre hinzu und wirbeln Sie kräftig vor, bis sich das gesamte lyophilisierte Stützmaterial auflöst.
- Lassen Sie die resultierende Aufschlämmung bei 4 ° C sitzen, damit das Trägermaterial rehydrieren kann.
- Entgasen Sie das Trägermaterial in einer Vakuumkammer für 30 Minuten, um Blasen zu reduzieren.
- Zentrifen Sie das Trägermaterial bei 2.000 × g für 5 min. Stellen Sie sicher, dass sich das Material am Boden des Rohrs befindet und der Überstand klar ist.
- Saugen Sie den Überstand ab, während Sie darauf achten, das Stützmaterial unten nicht abzusaugen.
HINWEIS: Das Stützmaterial sollte nach dem Entfernen des Überstands nicht fließen, während das Rohr geneigt wird. Wenn das Material fließt, zentrifugieren Sie es erneut mit den gleichen Einstellungen, aber ohne neuen Überstand hinzuzufügen.
- Übertragen Sie etwa 4 ml des vorbereiteten, verdichteten Stützmaterials in jede Vertiefung einer 12-Well-Platte mit einer Verdrängungspipette. Klopfen Sie auf die Bohrlochplatte auf eine harte Oberfläche, um das Stützmaterial zu zwingen, sich gleichmäßig im Bohrloch zu verteilen.
HINWEIS: Das minimale empfohlene Volumen an Trägermaterial beträgt das 3-fache des Volumens des Konstrukts, das darin gedruckt wird. - Stellen Sie die Vertiefungsplatte mit dem Trägermaterial auf eine gekühlte Bioprinter-Stufe oder bei 4 °C, bis sie verwendet wird, um das Schmelzen der Gelatinepartikel zu verhindern.
5. Einbau von Endothelzellen und Stützzellen mit der Bioink
- Bereiten Sie das Endothelzellmedium gemäß den Anweisungen des Herstellers vor, indem Sie das Basalmedium mit der entsprechenden Medium-Kit-Komponente, einschließlich einer Antibiotikalösung, eines fetalen Rinderserums und Endothelzellwachstumsergänzungen, mischen.
- Bereiten Sie das Stammzellmedium der Zahnpulpa vor, indem Sie 500 ml glukosearmes DMEM, 58 ml fetales Rinderserum, 5,8 ml nicht-essentielle Aminosäuren (NEAA), 5,8 ml Glutaminersatz, 5,8 ml 1 M HEPES und 5,8 ml Penicillin-Streptomycin-Nystatin-Lösung kombinieren.
- Bereiten Sie eine Suspension vor, die 2 × 10 6 ZsGreen1-exprimierende humane mikrovaskuläre Endothelzellen (HAMEC-ZsGreen1) und 6 ×10 6 Zahnpulpastammzellen (DPSCs) in 10 ml Endothelzellmedium enthält.
- Zentrifugieren Sie die Zellsuspension bei 200 × g für 4 Minuten, um ein Zellpellet zu erhalten. Aspirieren Sie das überstehende Medium.
- Resuspendiert das Zellpellet in 1 ml rhCollMA-Biotinte, die zuvor hergestellt wurde (PEO-LAP enthaltend), um eine Biotinte mit einer Gesamtzellkonzentration von 8 × 106 Zellen pro 1 ml Biotinte zu erhalten.
ACHTUNG: Nachdem Sie die Biotinte mit den Zellen kombiniert haben, fahren Sie sofort mit dem nächsten Schritt fort. Wenn Zellen lange Zeit in der Suspension verbleiben, sinken die Zellen auf den Boden der Röhre und ihre Lebensfähigkeit verschlechtert sich. Für Experimente, an denen keine Zellen beteiligt sind, überspringen Sie entweder die Schritte 5.1-5.5 oder integrieren Sie fluoreszierende Perlen anstelle von Zellen in die Biotinte, um die mikroskopische Visualisierung der gedruckten Konstrukte zu verbessern. - Übertragen Sie das Zell-Bioink-Gemisch in Druckpatronen.
- Bringen Sie eine Nadel mit einem Innendurchmesser von 0,22 mm an eine 3 ml Bernsteindruckpatrone an und legen Sie die Patrone in ein konisches 50-ml-Rohr.
- Übertragen Sie 1 ml der Zell-Bioink-Mischung auf die Druckpatrone, indem Sie sie von oben füllen und eine Verdrängungspipette verwenden, um Blasen zu reduzieren.
- Setzen Sie die Druckpatrone in das entsprechende Werkzeug am Bioprinter ein.
6. Bioprinting mikrovaskuläre Netzwerke mit rhCollMA Bioink
- Erstellen Sie ein 3D-CAD-Design für das biogedruckte mikrovaskuläre Netzwerk.
- Skizzieren Sie ein 2D-Muster eines 4-mm-Quadrats, das einen kreisförmigen Kanal mit einem Durchmesser von 2 mm in der Mitte enthält. Extrudieren Sie die Skizze um 4 mm, um einen 4 mm x 4 mm x 4 mm großen Würfel mit einem zentralen Kanal zu erhalten. Exportieren Sie dieses Objekt als . STL-Datei.
- Importieren Sie eine 12-Well-Platte. STL-Vorlage in die Registerkarte Volumenmodellierung in der Bioprinter-Slicing-Software und platzieren Sie sie im dafür vorgesehenen Bereich des virtuellen Druckbetts.
- Importieren Sie die . STL-Datei der Würfelform in die Registerkarte Volumenmodellierung in der Bioprinter-Slicing-Software. Klicken Sie auf das Kontrollkästchen Externen Datenschnitt verwenden | Konfigurieren Sie den Datenschnitt im Abschnitt Objekteigenschaften . Wählen Sie im Popup-Fenster ein geradliniges Muster für das Füllmuster aus und geben Sie 30% in die Fülldichte ein. Klicken Sie auf Akzeptieren.
- Legen Sie eine Kopie der Würfelform in jeden gewünschten virtuellen Brunnen, indem Sie auf den Würfel klicken und ihn mit der Maus verschieben.
- Erstellen Sie neue Materialeinstellungen für rhCollMA bioink auf der Registerkarte Materialien der Bioprinter-Schneidesoftware, indem Sie auf die Schaltfläche Material hinzufügen klicken. Wählen Sie die Einstellungen des Materials für den Druck aus. Für den Druck geben Sie 2 psi in das entsprechende Feld ein. Für die Geschwindigkeit geben Sie 20 mm/s in das entsprechende Feld ein.
HINWEIS: Jedes Bioink-Material hat seine eigenen unterschiedlichen Druckeinstellungen, die in der Materialliste in der Anwendung gespeichert werden können. - Weisen Sie die Werte für Linienbreite und Linienhöhe 0,24 mm und den Beschleunigungswert 400 mm/s2 zu, indem Sie diese Werte in die entsprechenden Felder eingeben.
- Klicken Sie auf der Registerkarte Volumenmodellierung auf das Würfelobjekt, und klicken Sie dann im Abschnitt Materialien auf das rhCollMA-Material, um es der Würfelform zuzuweisen. Klicken Sie auf der Registerkarte Bioassembly auf die Schaltfläche Druckauftrag senden, um den Druckauftrag an den Bioprinter zu senden.
- Legen Sie die mit der Zellbiotinte beladene Druckpatrone in das 3-ml-Umgebungspneumatik-Dosierwerkzeug des 3D-Extrusions-basierten Bioprinters ein.
- Stellen Sie die Druckbetttemperatur auf 4 °C ein, indem Sie auf die Schaltfläche Kühlung unter der Registerkarte Steuerung-Heizung/Kühlung im Bildschirm der Bioprinter-Benutzeroberfläche klicken. Beladen Sie die Platte mit dem Stützbad auf das Druckerbett.
HINWEIS: Die Materialeinstellungen für Druckdruck und -geschwindigkeit können sich aufgrund von Unterschieden in der Umgebungstemperatur oder der Variabilität der Bioink-Charge ändern. Zum Beispiel ist an kälteren Tagen ein höherer Druck oder eine langsamere Geschwindigkeit erforderlich, um die gleiche Menge an Material zu extrudieren. - Klicken Sie auf der Registerkarte Drucken auf dem Bildschirm der Bioprinter-Schnittstelle auf den Druckauftrag , der in Schritt 6.7 gesendet wurde. und klicken Sie auf Start | gehen Sie, um den Druckauftrag zu starten.
- Nach dem Drucken belichten Sie die Well-Plate einer 405 nm Lichtquelle mit einer Intensität von 3 mW/cm2 für 30 s, um die Vernetzung der rhCollMA Bioink einzuleiten.
- Nach der Vernetzung die Bohrlochplatte bei 37 °C und 5% CO2 für mindestens 20 min inkubieren, bis das gesamte Stützbad schmilzt.
- Saugen Sie das verflüssigte Stützbad vorsichtig ab und ersetzen Sie es durch Endothelzellmedium. Inkubieren Sie die Konstrukte bei 37 °C und 5% CO2 bis zur Verwendung in weiteren Schritten.
HINWEIS: Aufgrund der Kontraktion des Konstrukts nach dem Drucken wird empfohlen, die Montage Schritt 7 am selben Tag wie Schritt 6 durchzuführen.
7. Zusammenbau des biogedruckten mikrovaskulären Netzwerks mit dem Gefäßgerüst, um die technisch hergestellte vaskularisierte Klappe zu erhalten
- Unmittelbar nach der Entfernung des Stützmaterials des biogedruckten mikrovaskulären Netzwerks legen Sie ein mit Fibronektin beschichtetes PLLA:PLGA-Gefäßgerüst in den Hauptkanal der biogedruckten Struktur.
- Inkubieren Sie die montierten Konstrukte bei 37 °C und 5% CO 2 für2 Tage.
- Legen Sie das Lumen des Gefäßgerüsts mit Endothelzellen aus.
- Herstellung einer Zellsuspension von tdTomato-exprimierenden humanen mikrovaskulären Endothelzellen (HAMEC-tdTomato) in einer Konzentration von 1 × 107 Zellen/ml.
- Legen Sie ein 20 μL Tröpfchen dieser Zellsuspension auf eine hydrophobe Oberfläche (d. h. eine 10-cm-Schale ohne Gewebekultur).
- Platzieren Sie die Gefäßgerüste vorsichtig auf dem Tröpfchen, so dass das Lumen des Gerüsts an einem Ende mit dem Zelltröpfchen in Kontakt kommt.
- Saugen Sie das Tröpfchen vom gegenüberliegenden Ende des Gerüsts ab (dh dem Ende, das das Tröpfchen nicht berührt) und füllen Sie sein Lumen mit der Zellsuspension.
- Legen Sie das ausgesäte Gerüst in ein Mikrozentrifugenröhrchen und legen Sie es für 60 Minuten in einen Rotator in einem befeuchteten Inkubator. Als nächstes übertragen Sie das Gerüst in eine 12-Well-Platte und fügen Sie 2 ml Endothelzellmedium hinzu.
- Die technischen Klappen werden 7 Tage lang kultiviert, während das Medium alle 2 Tage durch frisches Endothelzellmedium ersetzt wird.
8. Konfokale Mikroskopie und Immunfluoreszenzfärbung der technischen Lappen
- Nach 4 Tagen und 7 Tagen Kultur führen Sie eine Live-Cell-Bildgebung der montierten Gerüste mit einem konfokalen Laser-Scanning-Mikroskop durch.
- Definieren Sie die Fluoreszenzkanäle für ZsGreen1 und tdTomato fluoreszierende Proteine in der Mikroskop-Bildaufnahmesoftware.
- Wählen Sie ein 5x/0,16 Objektiv mit 0,5-fachem Zoom (Pixelgröße 5 μm) und definieren Sie einen Z-Stack mit 22 Scheiben mit einer Dicke von jeweils 41 μm.
- Definieren Sie einen 3 x 2-Kachelscan, um das gesamte Konstrukt abzubilden und zu erfassen.
- Passen Sie die Laserintensität und die Verstärkungswerte an, um ein klares Fluoreszenzsignal ohne Sättigung und minimalen Hintergrund zu erhalten, und erfassen Sie die Bilder.
- Führen Sie eine Projektion des aufgenommenen Z-Stacks mit maximaler Intensität durch, um ein einzelnes 2D-Bild mit der Mikroskop-Bildaufnahmesoftware oder einer ähnlichen Bildanalysesoftware zu erhalten.
- Führen Sie eine Bildgebung mit höherer Vergrößerung einer Region von Interesse durch.
- Wechseln Sie zu einem 10x/0,3 Objektiv mit 0,5 Zoom (Pixelgröße 1,25 μm) und definieren Sie einen Z-Stack mit 9 Scheiben Dicke von 41 μm.
- Führen Sie die Schritte 8.2.-8.3 aus.
- Fixieren Sie nach 7 Tagen Kultur die technischen Klappen, indem Sie sie 20 Minuten lang in 4% Paraformaldehyd tauchen.
- Waschen Sie die Konstrukte 3x 5 min mit PBS.
- Fügen Sie 0,3% (v/v) Triton-X in PBS zu den Konstrukten hinzu und inkubieren Sie für 15 min bei Raumtemperatur, um die Zellen zu permeabilisieren.
- Waschen Sie die Konstrukte 3x 5 min mit PBS.
- Bereiten Sie eine blockierende Lösung vor, indem Sie 5% (w/v) Rinderserumalbumin (BSA) in PBS auflösen. Fügen Sie die Blockierlösung zu den technischen Klappen hinzu und inkubieren Sie für 1 Stunde bei Raumtemperatur.
- Bereiten Sie die primäre Antikörperlösung vor, indem Sie den 1:50-Antikörper des Anti-Glatte-Muskel-Aktins (Anti-SMA) der Maus in der 5% igen BSA-Lösung verdünnen, die zuvor zur Färbung der SMA-exprimierenden Stützzellen hergestellt wurde.
- Die Gerüste in der primären Antikörperlösung über Nacht bei 4 °C inkubieren.
- Waschen Sie 3x 5 min mit PBS.
- Bereiten Sie die sekundäre Antikörperlösung vor, indem Sie Cy3-konjugierten Ziegen-Anti-Maus-Antikörper IgG 1:400 und 4',6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI, 2,5 μg/ml) in PBS verdünnen.
- Die sekundäre Antikörperlösung auf die Gerüste auftragen und 3 h bei Raumtemperatur inkubieren.
- Waschen Sie 3x 5 min mit PBS.
- Lagern Sie die Konstrukte bis zu 1 Monat bei 4 °C in PBS.
- Stellen Sie die gefärbten Gerüste mit einem konfokalen Laser-Rastermikroskop ab.
- Definieren Sie die drei Fluoreszenzkanäle (DAPI, ZsGreen und Cy3) in der Mikroskop-Bildaufnahmesoftware.
- Definieren Sie einen Z-Stack mit einer Schnittdicke von 2 μm über eine Gesamtdicke von 50 μm. Definieren Sie als Nächstes einen Kachelscan, um größere Bereiche des Konstrukts abzubilden.
- Passen Sie die Erfassungsparameter an, um ein klares Fluoreszenzsignal ohne Sättigung und minimalen Hintergrund zu erhalten.
- Erfassen Sie die Bilder mit einem 20-fachen/0,8-Objektiv mit 1,0-fachem Zoom (Pixelgröße 0,31 μm).
- Führen Sie eine Projektion des aufgenommenen Z-Stacks mit maximaler Intensität durch, um ein einzelnes 2D-Bild mit der Mikroskop-Bildaufnahmesoftware oder einer ähnlichen Bildanalysesoftware zu erhalten.
9. Anastomosieren der technischen Klappe direkt an der Oberschenkelarterie einer Ratte mit einer Manschettentechnik
- Bereiten Sie die folgenden chirurgischen Werkzeuge vor und sterilisieren Sie sie (Autoklav): Skalpell Nr. 15, eine feine Pinzette und eine kleine Schere mit Ringgriff. Bereiten Sie außerdem die folgenden mikrochirurgischen Werkzeuge vor und sterilisieren Sie sie: eine gerade feinspitze Juwelierzange Nr. 3, eine abgewinkelte Juwelierzange, einen Nadelhalter mit Rundgriff und gebogenen Backen, ein Paar Gefäßdilatatoren, eine Sezierschere, eine Adventitia-Schere sowie Gefäßklemmen mit ihrem Applikator.
- Bereiten Sie eine Lösung von 100 IE/ml heparinisierter Kochsalzlösung vor, indem Sie 5 ml Stammheparinlösung mit 195 ml Kochsalzlösung verdünnen.
- Schneiden und sterilisieren Sie Polyimid-Manschetten.
- Schneiden Sie 2,5 mm Abschnitte eines Polyimidrohrs unter einem Seziermikroskop.
- Machen Sie an einem Ende jedes Abschnitts einen 1,25 mm langen Schnitt in die Wand des Rohres, um einen Manschettengriff zu erhalten. Machen Sie einen abgewinkelten Schnitt am anderen Ende des Rohres, um die Gefäßeversion zu erleichtern.
- Tauchen Sie die Manschetten in 70% Ethanol, gefolgt von zwei Waschungen mit heparinisierter Kochsalzlösung.
- Bereiten Sie eine männliche Sprague-Dawley-Ratte (275-350 g) für die Operation vor.
- Beginnen Sie sieben Tage vor der Operation mit der Verabreichung einer subkutanen Tagesdosis Cyclosporin (10 mg kg-1), um eine Immunsuppression zu erreichen.
- Vor der Operation das Tier mit 3% Isofluran-Inhalation gemäß institutioneller SOP mit einer Induktionskammer betäuben. Überprüfen Sie die Tiefenanästhesie, indem Sie beide Füße kneifen und nach Reflexen suchen.
- Verabreichen Sie eine subkutane Dosis des Analgetikums Buprenorphin (0,03 mg kg-1) und des gerinnungshemmenden Heparins (200 IE kg-1).
- Tragen Sie eine schmierende Augensalbe auf die Augen des Tieres auf, um Austrocknung zu verhindern.
- Rasieren Sie den chirurgischen Bereich der Ratte und desinfizieren Sie die Stelle mit Jod und dann 70% Ethanol. Befestigen Sie die Gliedmaßen des Tieres mit Klebeband am Tisch.
- Legen Sie die Arteria femoralis frei und isolieren Sie sie.
- Machen Sie einen 2 cm langen, schrägen Schnitt durch die Haut, entlang der Konkavität zwischen Bein und Bauch.
- Lassen Sie mit einer Pinzette und einer stumpfen Schere die Haut aus dem darunter liegenden Gewebe frei, um das Leistenfettpolster sichtbar zu machen.
- Schneiden Sie mit einer Schere und einer Pinzette direkt durch das Fettpolster um den oberen, medialen und unteren Rand. Achten Sie darauf, keine großen Gefäße unter dem Fettpolster zu schneiden.
- Reflektieren Sie das Fettpolster seitlich und lassen Sie die Magengefäße intakt. Legen Sie eine nasse Gaze auf das reflektierte Fettpolster, um ein Austrocknen zu verhindern, und befestigen Sie es. Stellen Sie sicher, dass die gemeinsamen Oberschenkelgefäße sichtbar sind.
HINWEIS: Das Fettpolster wird später verwendet, um sanften Druck auf die Anastomosen auszuüben. - Legen Sie die Oberschenkelarterie vom Leistenband proximal zum Verzweigungspunkt der Magenarteria distal frei, indem Sie sie aus ihrer Hülle extrahieren.
VORSICHT: Es gibt normalerweise einen Ast der Oberschenkelarterie, der darunter verläuft, allgemein als Murphys Ast bezeichnet. Achten Sie darauf, diesen schwer sichtbaren Zweig nicht zu beschädigen. - Teilen Sie den Zweig des Murphys, indem Sie ihn ligieren, und ligrieren Sie dann die Oberschenkelarterie mit zwei Ligaturen in der Mitte der Arterie, die 1 mm voneinander entfernt sind. Halten Sie ein Ende der Ligaturnaht lang, um später das Gefäßende durch die Manschette zu ziehen.
- Durchtrennen Sie die Arterie zwischen den beiden Ligaturen mit einer Adventitia-Schere.
ACHTUNG: Bei der Durchführung dieses Schnitts sollte es keine Blutungen geben. Wenn das arterielle Ende blutet, klemmen Sie die Arterie fest und wenden Sie erneut eine Ligatur an. - Verwenden Sie das lange Ende der Ligaturnaht, indem Sie jedes Gefäßende in eine Polyimidmanschette einführen, wie im vorherigen Schritt vorbereitet, so dass die Griffe der beiden Manschetten voneinander wegzeigen.
- Wenden Sie nach dem Einsetzen gleichzeitig eine Klemme am Manschettengriff und am Gefäß an und sichern Sie die Manschette an Ort und Stelle.
- Bereiten Sie eine heparinisierte Kochsalzlösung in einer Spritze vor, die mit einer 27-G-Nadel ausgestattet ist.
- Ziehen Sie am ligierten Gefäßende und schneiden Sie es in der Nähe der Ligatur ab. Waschen Sie das Gefäßende sofort gründlich mit der heparinisierten Kochsalzlösung, bis kein Blut im Lumen sichtbar ist.
VORSICHT: Stellen Sie sicher, dass das Gefäßende gut gewaschen wird, da das im Inneren verbleibende Blut ein Gerinnsel bildet, das nach Abschluss des Eingriffs in den Blutkreislauf eingeführt wird. Dies kann zu einem Verschluss des Gefäßes und einem Verlust der Durchblutung des Beines führen. - Erweitern Sie das Lumen des Gefäßes, indem Sie es mit einer Hand an seiner Hülle halten und sein Lumen mit dem Gefäßdilatator mit der anderen Hand erweitern.
- Legen Sie eine lose 6-0 Polypropylen-Umfangsnaht um den Manschettenkörper. Jedes Gefäß endet mit zwei Gefäßdilatatoren über dem Manschettenkörper und befestigt es an Ort und Stelle, indem man die umlaufende Naht festzieht.
HINWEIS: Wenn während der Manipulationen Blut durch das geklemmte Gefäß austritt, waschen Sie das Lumen gründlich mit heparinisierter Kochsalzlösung. - Spülen Sie die technische Klappe mit heparinisierter Kochsalzlösung aus und führen Sie dann die mit Gefäßen ausgekleidete Manschette in das Lumen des Gefäßgerüsts ein. Befestigen Sie das Gerüst, indem Sie eine umlaufende 6-0-Polypropylennaht um das Gerüst und den Manschettenkörper legen. Führen Sie diesen Schritt für beide Seiten des Gefäßgerüsts durch.
- Wickeln Sie einen 0,2 μm Polystyrol-Membranfilter um die Anastomosenstelle, um die technische Klappe vom umgebenden Gewebe zu isolieren.
- Lassen Sie zuerst die distale Klemme los; Lassen Sie dann die proximale Klemme los, um den Blutfluss durch das Gefäß wiederherzustellen.
- Um Blutungen durch die Anastomosen zu stoppen, reflektieren Sie das Fettpolster zurück über die Oberschenkelgefäße und üben Sie mit einer sterilen Gaze für 3 min sanften Druck aus.
- Nähen Sie das Fettpolster mit 6-0 Polypropylen wieder an Ort und Stelle; Dann nähen Sie die Haut mit 5-0 PGA resorbierbaren Nähten.
- Reinigen Sie den Wundbereich mit Kochsalzlösung und tragen Sie Jodlösung auf.
- Für postoperative Schmerzen und Tierbehandlung bereiten Sie 0,1% (v/v) Tramadol im Trinkwasser vor. Darüber hinaus eine tägliche Dosis Heparin (200 IE kg-1) und Cyclosporin (10 mg kg-1) verabreichen.
- Legen Sie das Tier in einen sauberen Käfig, der selbst unter einer Heizlampe platziert ist. Überwachen Sie das Tier weiter, bis es wieder genügend Bewusstsein erlangt, um die sternale Liege aufrechtzuerhalten.
Representative Results
Dieses Protokoll beschreibt die Herstellung einer technischen Lappe, die aus einem Gefäßgestell (Abbildung 1Ai) und einer biogedruckten Mikrovaskulatur (Abbildung 1Aii) besteht, die zusammengesetzt wurden, um mesoskalige und mikroskalige Vaskulaturen zu erreichen (Abbildung 1Aiii). Nach dem Protokoll wurden BVOH-Formen des Gefäßgerüsts entworfen und in 3D gedruckt (Abbildung 1B, C). Die erhaltenen gedruckten Strukturen wurden visuell auf kleine BVOH-Stränge untersucht, die sich in den leeren Räumen der Formen befinden könnten (Abbildung 1D). Diese Stränge weisen in der Regel auf falsche Materialeinstellungen hin oder darauf, dass der BVOH Feuchtigkeit aufgenommen hat. Diese Stränge sollten entfernt werden, da sie zu einer unvollständigen Füllung der Form und zu strukturellen Defekten im resultierenden Gefäßgerüst führen können. Als nächstes wurden die Formen mit PLLA: PLGA-Lösung gefüllt, gefolgt von der Gefriertrocknung und den Waschschritten, wie im Protokoll beschrieben. Das erhaltene PLLA:PLGA-Gefäßgerüst wurde visuell inspiziert, um die Integrität der Gefäßwand und die Durchgängigkeit des Lumens zu überprüfen (Abbildung 1E).
Eine neutralisierte rhCollMA-Biotinte in einer Konzentration von 10 mg/ml wurde hergestellt und im Verhältnis 1:1 mit der PEO:LAP-Lösung kombiniert. Menschliche fette mikrovaskuläre Endothelzellen, die mit Zs-Green1 markiert waren, und Stammzellen der Zahnpulpa wurden mit der rhCollMA-Biotinte resuspendiert, und die Lösung wurde in eine Druckpatrone und auf den Drucker geladen. Kastenformen mit einem zentralen Kanal mit einem geradlinigen Muster (Abbildung 1D) wurden im Gelatineträgerbad biobedruckt. Nach dem Druck wurden die Konstrukte vernetzt, das Stützbad aufgelöst und gewaschen. Nach 4 Tagen Kultur wurden die Konstrukte live fotografiert, um die Selbstorganisation des mikrovaskulären Netzwerks zu überprüfen. Abbildung 1D zeigt ein Beispiel für ein hochentwickeltes mikrovaskuläres HAMEC-ZsGreen1-Netzwerk im biogedruckten Konstrukt.
Als nächstes wurde ein mit Fibronektin beschichtetes Gefäßgerüst in den zentralen Kanal des gedruckten Konstrukts eingeführt (Abbildung 2A). Die zusammengesetzten Konstrukte wurden 2 Tage lang kultiviert, wobei die Zellen das Gel zusammenziehen und es fest am Gefäßgerüst befestigen. Dann wurde das Gefäßgerüst mit HAMECs ausgekleidet, die gemäß dem Protokoll tdTomato exprimierten. Nach 7 Tagen Kultur wurden die Konstrukte fixiert und abgebildet. Abbildung 2B zeigt eine Seitenansicht der zusammengesetzten Konstrukte, in der die Endothelzellen in der biogedruckten Mikrovaskulatur grün dargestellt sind, während die Endothelauskleidung des Gefäßgerüsts rot dargestellt ist. Das Bild zeigt eine grüne mikrovaskuläre Selbstorganisation im biogedruckten Gel, während das Gefäßgestell mit roten Endothelzellen ausgekleidet ist. Bei höherer Vergrößerung werden Sprossen aus der roten Endothelauskleidung gesehen, die mit dem biogedruckten mikrovaskulären Netzwerk sprießen und anastomosieren (Abbildung 2C). Als nächstes wurden die Konstrukte für α-glattes Muskelaktin (SMA) als Marker für die Stammzellen der Zahnpulpa gefärbt. Nach der Immunfärbung wurden die Konstrukte mit einem konfokalen Laser-Rastermikroskop abgebildet (Abbildung 2D).
Schließlich, nach 7 Tagen Kultur, wurden die technischen Klappen mikrochirurgisch an der Oberschenkelarterie einer Ratte anastomosiert, wie im Protokoll beschrieben. Ein Video eines repräsentativen Verfahrens ist im Supplemental Video S1 zu sehen. Abbildung 2E zeigt ein repräsentatives Bild einer abgeschlossenen Anastomose vor dem Entfernen der Klemme, und Abbildung 2F zeigt ein repräsentatives Bild der Anastomosenstelle nach der Klemmentfernung und Hämostase. Vor dem Wundverschluss sollten keine Blutungen sichtbar sein.
Abbildung 1: Repräsentative Bilder der hergestellten meso- und mikroskaligen Gefäße. (A) Schematischer Überblick über die Schritte des Protokolls. Nachdruck mit freundlicher Genehmigung16. (B) CAD-Konstruktion für die Opferform des Gefäßgerüsts. (C) Seitenansicht einer repräsentativen 3D-gedruckten Opferform (Maßstabsleiste = 0,5 mm). (D) Draufsicht der Opferform (Maßstabsleiste = 0,5 mm) (E) Repräsentatives Gefäßgefäßgefäß, das nach dem Beschreibungsprotokoll hergestellt wird (Maßstabsleiste = 5 mm). (F) CAD-Konstruktion für das 3D-biogedruckte mikrovaskuläre Netzwerk rhCollMA. Rasterlinien = 1 mm. (G) Repräsentatives Bild eines hochentwickelten biogedruckten Gefäßnetzwerks, das HAMEC-ZsGreen1 in Grün zeigt. Maßstabsleiste = 200 μm. Abkürzungen: CAD = Computer-Aided Design; rhCollMA = rekombinantes humanes Kollagenmethacrylat; HAMEC = humane adipe mikrovaskuläre Endothelzellen; PLLA = Poly-L-Milchsäure; PLGA = Polymilch-Co-Glykolsäure. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Abbildung 2: Repräsentative Bilder der zusammengesetzten vaskularisierten Klappe . (A) Ein Foto einer repräsentativen Montage von biogedruckten Mikrovaskulaturen und dem Gefäßgerüst. Maßstabsleiste = 1 mm. (B) Seitenansicht einer repräsentativen technischen Lappe, die 4 Tage nach der Endothelauskleidung des Gefäßgerüsts aufgenommen wurde. Die biogedruckte Mikrovaskulatur ist grün dargestellt (HAMEC-ZsGreen1), während die Endothelauskleidung rot dargestellt ist (HAMEC-tdTomato). Maßstabsleiste = 1 mm. (C) Repräsentatives Bild von Anastomosen zwischen der biogedruckten Vaskulatur in Grün und der Endothelauskleidung in Rot. Maßstabsleiste = 200 μm. (D) Repräsentatives Bild der Immunfärbung für glattes Muskelaktin (rot), Kerne (blau) und Endothelzellen (grün) nach 7 Tagen Inkubation. Maßstabsleiste = 0,1 mm. (E) Repräsentatives Bild einer abgeschlossenen Anastomose der technischen Klappe mit der Oberschenkelarterie einer Ratte vor dem Entfernen der Klemme und (F) nach der Klemmentfernung. Abkürzungen: HAMEC = Human adipose microvascular endothelial cells; SMA = Smooth Muscle Actin; DAPI = 4',6-Diamidino-2-phenylindol. Bitte klicken Sie hier, um eine größere Version dieser Abbildung zu sehen.
Ergänzendes Video S1: Repräsentatives mikrochirurgisches Verfahren zur Anastomosion des Gefäßmusters an der Oberschenkelarterie einer Ratte. Bitte klicken Sie hier, um dieses Video herunterzuladen.
Discussion
Die Entwicklung vaskularisierter Gewebe ist eine der größten Herausforderungen des Tissue Engineering20. Aktuelle Methoden zur Herstellung von technischem Gefäßgewebe konzentrieren sich auf die Schaffung einer selbstorganisierten Mikrovaskulatur 21,22,23 oder die Herstellung von mesoskaligen Gefäßgerüsten 24,25 und nicht auf die Wiederherstellung eines Systems hierarchischer Gefäße, das sofort und direkt bei der Implantation durchblutet werden kann 26 . In dieser Arbeit beschreiben wir ein Protokoll, das zwei 3D-Druckmodalitäten verwendet, um ein hierarchisches Gefäßnetzwerk herzustellen, das aus mikroskaligen und mesoskaligen Vaskulaturen besteht. Das Protokoll kombiniert ein 3D-biogedrucktes, selbstorganisiertes mikrovaskuläres Netzwerk mit einem mesoskaligen Gefäßgefäßskelett, wodurch eine implantierbare, vaskularisierte Klappe entsteht. Darüber hinaus wird in diesem Artikel ein Protokoll für die direkte Anastomosion dieser Klappe an der Oberschenkelarterie einer Ratte vorgestellt.
3D-Bioprinting hat in den letzten Jahren aufgrund seiner Vielseitigkeit gegenüber traditionellen Tissue-Engineering-Techniken an Interesse gewonnen. Während dieses Protokoll die Erzeugung eines mikrovaskulären Netzwerks in rhCollMA-Bioink beschreibt, können die verwendeten Methoden mit wenigen Modifikationen auf viele andere Biotinten aus der Fülle von untersuchten und neuartigen Biotinten und Stützbädernangewendet werden 27,28. Wir haben uns aufgrund der Fülle von Typ-I-Kollagen im menschlichen EZM für die Verwendung von rhCollMA als Bioink entschieden, was eine geeignete Umgebung für die Zellanbindung bietet. Darüber hinaus wird es rekombinant in Pflanzen hergestellt und mit Methacrylatgruppen weiter modifiziert, was eine Photopolymerisation und die Bildung stabiler 3D-Hydrogele ermöglicht29,30. Die Photovernetzung wurde durch die Zugabe des Photoinitiators LAP erreicht, der sich als ungiftig erwiesen hat und durch Einwirkung von 405 nm blauem Licht aktiviert wird, wodurch die mögliche Phototoxizität von UV-Licht reduziert wird. Die Verwendung von lichtempfindlichen Biotinten erfordert jedoch die Verwendung eines phenolrotfreien Kulturmediums für die Herstellung der Biotinte und des Trägermaterials. Darüber hinaus beschreibt das Protokoll die Verwendung von Gelatineträgermaterial, das die High-Fidelity-Extrusion von Biotinten wie rhCollMA ermöglicht. Daher ist es wichtig, die Verwendung von kaltem Medium während der Vorbereitung und der Kühlung des Druckerbetts sicherzustellen. Eine übermäßige Erwärmung kann aufgrund der für die Vernetzung verwendeten Lichtquelle oder durch erhöhte Umgebungstemperaturen auftreten.
Ein extrusionsbasierter Bioprinter wurde hier verwendet, um das biogedruckte Mikrovaskulärnetzwerk zu erstellen, und es gibt derzeit viele kommerziell erhältliche Bioprinter, die ähnliche Konstrukte erzeugen können. Darüber hinaus können die vorgeschlagenen Methoden leicht modifiziert und angewendet werden, um verschiedene Geometrien, Größen und Infill-Muster zu untersuchen. In dieser Arbeit wurde ein geradliniges Infill-Muster gewählt, um miteinander verbundene Poren zu erzeugen, und dieses kann relativ schnell mit hoher Wiedergabetreue gedruckt werden.
Luftblasen stellen eine große Herausforderung im Extrusions-Bioprinting dar, insbesondere in Trägermaterialien. Daher ist es wichtig, das Vorhandensein und die Bildung dieser Blasen zu minimieren, indem positive Verdrängungspipetten für den Transfer des Trägermaterials, die Vorbereitung der Bioink-Zellsuspension und deren Übertragung auf die Druckpatronen verwendet werden.
In dieser Arbeit wurden humane aus Fett gewonnene Endothelzellen und Stammzellen der Zahnpulpa aufgrund ihrer relativ einfachen Isolierung von Patienten als Stützzellen verwendet. Darüber hinaus wurde eine Gesamtzellkonzentration von 8 x 106 Zellen/ml gewählt, da diese Konzentration nachweislich die am weitesten entwickelten Gefäßnetzwerke etabliert16. Während dieses Protokoll verwendet werden kann, um Mikrovaskulatur unter Verwendung verschiedener Zelltypen und -quellen sowie verschiedener Biotinten zu erzeugen, muss eine Kalibrierung der Zellkonzentration durchgeführt werden, um die besten Bedingungen für die Entwicklung des mikrovaskulären Netzwerks zu schaffen. Darüber hinaus können gewebespezifische Zellen (d.h. Myoblasten oder Osteoblasten) in die Biotinte eingebaut werden, um gewebespezifische vaskularisierte Lappen zu erhalten.
Die Form für das poröse Gefäßgerüst wurde aus 3D-gedrucktem wasserlöslichem Material auf einem handelsüblichen Extrusions-3D-Drucker hergestellt. Dies führt zu einer kostengünstigen Technik, die auf Rapid-Prototyping-Plattformen basiert, so dass viele verschiedene Geometrien und Größen von Gefäßgerüsten schnell untersucht und gescreentwerden können 31. Eine Einschränkung dieser Methode ist jedoch die Auflösungsgrenze der meisten 3D-Drucker32. Mit der sich schnell entwickelnden Industrie rund um die additive Fertigung wird jedoch erwartet, dass sich diese Grenzwerte im Laufe der Zeit verbessern werden. Die Verwendung von organischen Lösungsmitteln für den Herstellungsprozess ist eine weitere Einschränkung des Protokolls, da die meisten organischen Lösungsmittel für Zellen toxisch sind und die Möglichkeit verhindern, das Bioprinting-Verfahren mit dem Herstellungsprozess für Gefäßgerüste zu kombinieren.
Die beschriebene Methode der Aussaat des Lumens des Gerüsts mittels Aspiration im Gegensatz zum Drücken der Zellsuspension hat große Auswirkungen auf die Lokalisation der ausgesäten Zellen. Die Verwendung von Unterdruck ermöglicht eine Endothelisierung des inneren Lumens des Gerüsts und minimiert gleichzeitig das Verschütten der Zellsuspension durch die Perforationen an der Wand des Gerüsts16.
Die beschriebene "Manschettenmethode" für mikrochirurgische Anastomosen kann leicht modifiziert und an verschiedene Gefäßgerüstmaterialien oder -größen sowie an verschiedene Arterien und Venen in einem breiten Maßstab von Tiermodellen angepasst werden. Die Anpassungen des Protokolls würden verschiedene Polyimidrohrgrößen und Nahtgrößen umfassen. Diese Methode erfordert keine Perforation der Gerüstwand, was zur Entwicklung von Defekten führen kann. Diese Arbeit stellt ein Protokoll dar, das auf viele Anwendungen erweitert werden kann. Die kritischen Aspekte dieses Protokolls, zu denen die Herstellung von Meso- und Mikrovaskulatur und deren Montage und Implantation gehören, stellen kritische Aspekte von technischen Klappen sowohl für rekonstruktive Anwendungen als auch für vaskuläre und andere Tissue-Engineering-Studien dar.
Disclosures
Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offenzulegen.
Acknowledgments
Dieses Projekt wurde vom Europäischen Forschungsrat (ERC) im Rahmen des Forschungs- und Innovationsprogramms Horizon 2020 der Europäischen Union (Finanzhilfevereinbarung Nr. 818808) gefördert. rhCollMA wurde großzügig von CollPlant (Rehovot, Israel) zur Verfügung gestellt. Die Autoren danken der Pre-Clinical Research Authority des Technion für die Unterstützung bei der Tierpflege sowie Janette Zavin, Galia Ben David und Idan Redenski.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-Dioxane | Biosolve Chemical | 42405 | |
| 27 G x 0.5" blunt tip dispensing needles | CML supply | 901-27-050 | |
| 3cc amber syringe barrel & piston set | Nordson EFD | 7012085 | Amber syringes used to block light and prevent premature crosslinking |
| 5-0 AssuCryl PGA absorbale suture | Assut Sutures | Absorbable sutures used for skin wound closure | |
| 6-0 polypropelene sutures | Assut Sutures | 9351 | |
| Acland clamps | S&T | B-1V | |
| Adventitia scissors | S&T | SAS-15 | |
| Angled no.3 jeweler's forceps | S&T | JFAL-3-18 | |
| BioAssemblyBot 400 3D Bioprinter | Advanced Solutions | a 6-axis 3D bioprinter | |
| Bovine albumin serum Probumin | Millipore | 82-045-1 | |
| Buprenorphine | vetmarket | B15100 | |
| BVOH filament | Verbatim | 55903 | a water-soluble 1.75 mm diameter filament |
| Clamp applying forceps | S&T | CAF-4 | |
| Dental pulp stem cells | Lonza | PT-5025 | |
| Dietrich bulldog clamps | Fine Science Tools (FST) | 18039-45 | |
| di-Sodium hydrogen phosphate (Na2HPO4) | Carlo Erba Reagents | 480141 | |
| Dissection scissors | S&T | 18039-45 | |
| DMEM, High Glucose, No Phenol Red | Sartorius | 01-053-1A | |
| Duratears | Alcon | DJ03 | |
| ECM media + bullet kit | Sciencell | #1001 | |
| Ethanol 96% | Gadot-Group | 64-17-5 | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | glutamine substitute |
| Goat anti-mouse Cy3 antibody | Jackson | 115-166-072 | |
| Heparin Sodium 5,000 I.U./mL | Panpharma | - | |
| Human adipose microvascular cells | Sciencell | #7200 | |
| Human fibronectin | Sigma | F0895-5MG | A stock concentration of 1 mg/mL |
| Isoflurane, USP Terrell | Piramal Critical Care | NDC 66794-011-25 | |
| LifeSupport | Advanced Biomatrix | 5244 | a gelatin support slurry for FRESH 3D bioprinting |
| Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) | Sigma-Aldrich | 900889 | |
| Low-glucose DMEM | Biological Industries | 01-050-1A | |
| MICROMAN E M1000E, 100-1,000 µL | Gilson | FD10006 | |
| Mouse anti-SMA antibody | Dako | M0851 | |
| NEAA | Gibco | 11140068 | |
| Needle holder | Fine Science Tools (FST) | 12500-12 | |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS | ChemCruz | SC-281692 | |
| Penicillin-Streptomycin-Nystatin Solution | Biological Industries | 03-032-1B | |
| Phospate buffered saline (PBS) | Sigma | P5368-10PAK | |
| Poly(ethylene oxide), M.W. 250,000 to 400,000 | Acros Organics | 178602500 | |
| Poly(L-lactic acid), IV 5.0 dl/g (PLLA) | Polysciencse, Inc. | 18582-10 | |
| Polyimide tubing, ID: 0.0249", OD: 0.0273" | Cole-Parmer | 95820-05 | A thin-walled tube used to fabricate cuffs for microsurgical anastomoses |
| Prusa I3 MK2.5 3D Printer | Prusa Research | http://www.prusa3d.com/ | a popular commercial 3D printer |
| Resomer RG 503 H, Poly(D,L-lactide-co-glycolide) (PLGA) | Evonik Industries | 719870 | |
| rhCollMA | CollPlant | https://collplant.com/ | generously provided by CollPlant (Rehovot, Israel) |
| round-handled needle holder | S&T | B-15-8 | |
| Scalpel handle - #3 | Fine Science Tools (FST) | 10003-12 | |
| small fine straight scissors | Fine Science Tools (FST) | 14090-09 | |
| Sodium Chloride | Biosolve Chemical | 19030591 | |
| Sodium Phosphate dibasic (NaH2PO4) | Riedel-de Haen | 4276 | |
| Solidworks | Dassault Systems | CAD software | |
| Straight no.3 jeweler's forceps | S&T | JF-3-18 | |
| Straight serrated forceps | Fine Science Tools (FST) | 11050-10 | |
| Surgical Scalpel Blade No.15 | Swann-Morton Limited | 305 | |
| Triton-X 100 | BioLab LTD | 57836 | |
| TSIM | Advanced Solutions | 3D slicing and design software for the BioAssembly Bot | |
| Vessel dilator | S&T | D-5a.1 | |
| Zeiss Tivato 700 surgical microscope | Zeiss |
References
- Wallace, C. G., Wei, F. -C. C. The current status, evolution and future of facial reconstruction. Chang Gung Medical Journal. 31 (5), 441-449 (2008).
- Atala, A., Kasper, F. K., Mikos, A. G.
- Duan, B. State-of-the-art review of 3D bioprinting for cardiovascular tissue engineering. Annals of Biomedical Engineering. 45 (1), 195-209 (2017).
- Kim, J. J., Hou, L., Huang, N. F. Vascularization of three-dimensional engineered tissues for regenerative medicine applications. Acta Biomaterialia. 41, 17-26 (2016).
- Ouyang, L., Armstrong, J. P. K., Chen, Q., Lin, Y., Stevens, M. M. Void-free 3D bioprinting for in situ endothelialization and microfluidic perfusion. Advanced Functional Materials. 30 (1), 1908349 (2020).
- Baltazar, T., et al. Three dimensional bioprinting of a vascularized and perfusable skin graft using human keratinocytes, fibroblasts, pericytes, and endothelial cells. Tissue Engineering - Part A. 26 (5-6), 227-238 (2020).
- Chia, H. N., Wu, B. M. Recent advances in 3D printing of biomaterials. Journal of Biological Engineering. 9 (1), 4 (2015).
- Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Nature Biotechnology. 32 (8), 773-785 (2014).
- Guillotin, B., et al. Laser assisted bioprinting of engineered tissue with high cell density and microscale organization. Biomaterials. 31 (28), 7250-7256 (2010).
- Catros, S., et al. Laser-assisted bioprinting for creating on-demand patterns of human osteoprogenitor cells and nano-hydroxyapatite. Biofabrication. 3 (2), (2011).
- Ronca, A., Ambrosio, L., Grijpma, D. W. Preparation of designed poly(d,l-lactide)/nanosized hydroxyapatite composite structures by stereolithography. Acta Biomaterialia. 9 (4), 5989-5996 (2013).
- Lan, P. X., Lee, J. W., Seol, Y. J., Cho, D. W. Development of 3D PPF/DEF scaffolds using micro-stereolithography and surface modification. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 20 (1), 271-279 (2009).
- Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels. Science Advances. 1 (9), (2015).
- Lee, A., et al. 3D bioprinting of collagen to rebuild components of the human heart. Science. 365 (6452), 482-487 (2019).
- Bhattacharjee, T., et al.
- Szklanny, A. A., et al. 3D bioprinting of engineered tissue flaps with hierarchical vessel networks (VesselNet) for direct host-to-implant perfusion. Advanced Materials. 33 (42), 2102661 (2021).
- Schleimer, K., et al. Training a sophisticated microsurgical technique: interposition of external jugular vein graft in the common carotid artery in rats. Journal of Visualized Experiments JoVE. (69), (2012).
- Sucher, R., et al. Mouse hind limb transplantation: A new composite tissue allotransplantation model using nonsuture supermicrosurgery. Transplantation. 90 (12), 1374-1380 (2010).
- Fensterer, T. F., Miller, C. J., Perez-Abadia, G., Maldonado, C. Novel cuff design to facilitate anastomosis of small vessels during cervical heterotopic heart transplantation in rats. Comparative Medicine. 64 (4), (2014).
- Novosel, E. C., Kleinhans, C., Kluger, P. J. Vascularization is the key challenge in tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4-5), 300-311 (2011).
- Landau, S., et al. Tropoelastin coated PLLA-PLGA scaffolds promote vascular network formation. Biomaterials. 122, 72-82 (2017).
- Szklanny, A. A., et al. High-throughput scaffold system for studying the effect of local geometry and topology on the development and orientation of sprouting blood vessels. Advanced Functional Materials. 1901335, 1-13 (2019).
- Song, W., et al. Engineering transferrable microvascular meshes for subcutaneous islet transplantation. Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).
- Luo, Y., Lode, A., Gelinsky, M. Direct plotting of three-dimensional hollow fiber scaffolds based on concentrated alginate pastes for tissue engineering. Advanced Healthcare Materials. 2 (6), 777-783 (2013).
- Ying, G. L., et al. Aqueous two-phase emulsion bioink-enabled 3D bioprinting of porous hydrogels. Advanced Materials. 30 (50), 1-9 (2018).
- Rouwkema, J., Khademhosseini, A. Vascularization and angiogenesis in tissue engineering: beyond creating static networks. Trends in Biotechnology. 34 (9), 733-745 (2016).
- Jang, J., Park, J. Y., Gao, G., Cho, D. W. Biomaterials-based 3D cell printing for next-generation therapeutics and diagnostics. Biomaterials. 156, 88-106 (2018).
- Suntornnond, R., An, J., Chua, C. K. Roles of support materials in 3D bioprinting - present and future. International Journal of Bioprinting. 3 (1), 83-86 (2017).
- Shoseyov, O., Posen, Y., Grynspan, F. Human recombinant type I collagen produced in plants. Tissue Engineering - Part A. 19 (13-14), 1527-1533 (2013).
- Stein, H., et al. Production of bioactive, post-translationally modified, heterotrimeric, human recombinant type-I collagen in transgenic tobacco. Biomacromolecules. 10 (9), 2640-2645 (2009).
- Kaplan, B., et al. Rapid prototyping fabrication of precision polyester scaffolds for axonal guidance. Biomaterials. , 120062 (2020).
- Karakurt, I., Lin, L. 3D printing technologies: techniques, materials, and post-processing. Current Opinion in Chemical Engineering. 28, 134-143 (2020).
