Summary
Инженерные клапаны требуют встроенной функциональной сосудистой сети. В этом протоколе мы представляем метод изготовления 3D-печатного тканевого лоскута, содержащего иерархическую сосудистую сеть и ее прямые микрохирургические анастомозы к бедренной артерии крысы.
Abstract
Инженерия имплантируемых, функциональных, толстых тканей требует проектирования иерархической сосудистой сети. 3D-биопечать - это технология, используемая для создания тканей путем добавления слоя за слоем печатаемых биоматериалов, называемых биочернилами, и клеток упорядоченным и автоматическим образом, что позволяет создавать очень сложные структуры, которые традиционные методы тканевой инженерии не могут достичь. Таким образом, 3D-биопечать является привлекательным подходом in vitro для имитации сложной структуры нативных сосудов, начиная от миллиметровых сосудов и заканчивая микрососудистыми сетями.
Достижения в области 3D-биопечати в гранулированных гидрогелях позволили экструзию с высоким разрешением биочернил на основе внеклеточной матрицы с низкой вязкостью. В этой работе представлен комбинированный подход к 3D-биопечати и жертвенной печати на основе пресс-форм для изготовления инженерных васкуляризированных тканевых лоскутов. 3D-биопечать эндотелиальных и поддерживающих клеток с использованием рекомбинантного коллаген-метакрилатного биочернила в желатиновой поддерживающей ванне используется для изготовления самосборной капиллярной сети. Это печатное микроциркуляторное русло собрано вокруг мезомасштабного сосудоподобного пористого каркаса, изготовлено с использованием жертвенной 3D-печатной формы и засеяно эндотелиальными клетками.
Эта сборка индуцирует эндотелий мезомасштабного сосуда к анастомозу с окружающей капиллярной сетью, создавая иерархическую сосудистую сеть внутри инженерного тканевого лоскута. Затем инженерный лоскут непосредственно имплантируется хирургическим анастомозом в бедренную артерию крысы с использованием техники манжеты. Описанные способы могут быть расширены для изготовления различных васкуляризированных тканевых лоскутов для использования в реконструкционной хирургии и исследованиях васкуляризации.
Introduction
Тяжелые дефекты тканей вызваны травматическими повреждениями, врожденными дефектами или заболеваниями, и текущий золотой стандарт для лечения этих дефектов заключается в использовании аутологичных трансплантатов, васкуляризированных тканевых лоскутов и микрососудистых свободных лоскутов в качестве заменителей ткани. Однако эти варианты имеют недостатки ограниченной ткани донорского участка и заболеваемости донорского сайта1. Таким образом, растет спрос на альтернативные заменители тканей, которые могут быть использованы для исправления этих дефектов2. Толщина инженерных тканевых конструкций ограничена диффузией питательных веществ и газов к клеткам, и, следовательно, правильная сосудистая сеть необходима для создания больших, толстых и правильно питаемых каркасов.
Для содействия васкуляризации инженерных имплантатов3 было применено несколько подходов, включая рекрутирование in vivo сосудистой поддержки от хозяина, доставку факторов роста и цитокинов в каркасы, преваскуляризацию имплантатов, генерацию перфузируемого ветвящегося микрососудистого слоя с использованием методов микроструктурирования4, использование жертвенных материалов для формирования сосудистых каналов/сетей5 , а также создание каналов в рамках 3D биопечатных конструкций 5,6. Васкуляризация толстых тканей требует включения иерархической сосудистой сети, состоящей из макро- и микрокапиллярных сосудов. Макромасштабные сосуды эффективно распределяют кровь по всей конструкции и позволяют проводить микрохирургические анастомозы с кровеносными сосудами хозяина, в то время как сосуды микрокапиллярного масштаба позволяют диффузию питательных веществ.
Биопечать привлекла большое внимание в последние годы из-за преимуществ, которые она предлагает по сравнению с обычными методами тканевой инженерии. Ткани и органы представляют собой сложные и запутанные 3D-объекты со специфической архитектурой. 3D-биопечать, благодаря своей способности откладывать слои биоматериалов в высоком разрешении, позволяет создавать сложные заменители тканей и органов (например, почки, легкие, печень)7. Для биопечати было адаптировано несколько технологий печати, включая экструзионную струйнуюпечать 8, лазерное осаждение 9,10 и биопечать на основе стереолитографии 11,12. Экструзионные технологии основаны на экструдировании материала через сопло путем применения давления на насыпную поверхность материала, противоположную соплу.
Обратимое встраивание взвешенных гидрогелей свободной формы (FRESH) представляет собой метод биопечати13,14, в котором используется гранулированный опорный материал, в котором экструдированный материал осаждается и фиксируется на месте опорной ванной. Опорная ванна обеспечивает механическую поддержку экструдированного, предварительно сшитого биочернила до его сшивания. Основным преимуществом данной методики является то, что опорная ванна позволяет экструдировать низковязкие материалы, которые не могут сохранять свою форму после экструзии и перед сшиванием15. Это расширяет пул доступных материалов, которые могут быть использованы в качестве биочернил.
В этой статье представлен протокол генерации васкуляризированного лоскута, который сочетает в себе микромасштабные и мезомасштабные сосудистые сосуды. Для достижения этой цели биопечатные, самособирающиеся микрососудистые сети генерируются в рекомбинантном гидрогеле метакрилата коллагена человека (rhCollMA), который затем соединяется с внутренней частью более крупного, имплантируемого сосудистого каркаса, в результате чего образуется полностью спроектированный тканевый лоскут16. Для установления быстрой и прямой перфузии инженерных тканей требуется прямой микрохирургический анастомоз сосудов хозяина. Сосудистый каркас не имеет достаточной прочности удержания шва для анастомозирования с использованием традиционного микрохирургического шва стенки сосуда. Поэтому мы описываем метод «манжеты» 17,18,19 для достижения анастомоза общей бедренной артерией крысы. При этом способе концы сосуда закрепляются кольцевыми швами, без необходимости перфорации стенки сосуда.
Хотя предлагаемый протокол был подготовлен для изучения иерархической сосудистой системы в среде rhCollMA, этот подход может быть расширен и применен к различным новым приложениям. Протокол может быть применен для биопечати различных тканеспецифических клеток в разных биочернилах. Кроме того, геометрия и размер конструкций могут быть легко изменены в соответствии с конкретными требованиями, такими как реконструкция больших тканей или биологические исследования.
Protocol
Все процедуры на животных были одобрены и проведены под наблюдением Управления доклинических исследований Техниона (PCRA Technion, этическое одобрение No 058-05-20). Для этих исследований использовались самцы крыс Sprague-Dawley (275-350 г). В Таблице материалов приведены подробные сведения обо всех материалах, оборудовании и программном обеспечении, используемых в этом протоколе.
1. Изготовление сосудистых каркасов
- Создайте 3D-компьютерную модель желаемой формы сосудистого каркаса с помощью программного обеспечения для автоматизированного проектирования (CAD) или загрузите 3D-файл желаемой сосудистой структуры из онлайн-репозиториев.
- Создайте цилиндр с внутренним диаметром 0,9 мм, наружным диаметром 2 мм и высотой 18 мм. Добавьте радиальные фенестрации диаметром 0,22 мм рядом со стенкой цилиндра.
- Создайте форму для каркаса с помощью программного обеспечения для 3D-проектирования и экспортируйте ее как . STL-файл. Затем добавьте воронку в конструкцию, чтобы облегчить заполнение формы позже.
- Импортируйте платформу . Файл STL в программном обеспечении для нарезки для 3D-принтера моделирования плавленого осаждения (FDM). Нарежьте модель с высотой слоя 0,1 мм и экспортируйте ее в формате .gcode или отправьте непосредственно на 3D-принтер.
- 3D-печать пресс-формы на FDM 3D-принтере, оснащенном соплом 0,25 мм, с использованием водорастворимой бутен-диол виниловой спиртовой сополимера (BVOH). Храните печатные формы в вакуумной камере до использования.
ВНИМАНИЕ: Избегайте обращения с нитью BVOH голыми руками, так как она чувствительна к влаге. Кроме того, рекомендуется хранить нить накаливания в вакуумной камере, чтобы избежать воздействия влаги. - Готовят полимерный раствор из смеси 1:1 поли-L-молочной кислоты (PLLA) и полимолочно-согликолевой кислоты (PLGA) в 1,4-диоксане.
- Взвесьте 350 мг PLLA и 350 мг PLGA и переведите в стеклянный флакон объемом 20 мл.
- Отмерьте 10 мл 1,4-диоксана и переложите в стеклянный флакон с помощью стеклянной пипетки. Добавьте небольшой магнитный перемешивание в стеклянный флакон.
ВНИМАНИЕ: 1,4-диоксан является опасным органическим растворителем. Используйте соответствующие средства индивидуальной безопасности и работайте внутри вытяжного шкафа. - Поместите стеклянный флакон внутрь ванны с горячей водой, нагретой до 70 °C, и перемешайте содержимое в течение ночи, пока все полимеры полностью не растворятся. Храните раствор в герметичном стеклянном контейнере до использования.
- Заполните формы BVOH раствором PLLA:PLGA.
- Используя пипетку с положительным смещением, отмерьте 30 мкл раствора полимера и заполните форму.
ПРИМЕЧАНИЕ: Объем, необходимый для заполнения формы, будет изменяться в зависимости от объема проектируемого сосуда. Продолжайте добавлять раствор полимера до тех пор, пока воронка формы не будет полностью заполнена. - Центрифугируйте форму при 100 × г в течение 2 мин. Залейте форму еще 20 мкл раствора полимера, чтобы обеспечить полное заполнение.
- Используя пипетку с положительным смещением, отмерьте 30 мкл раствора полимера и заполните форму.
- Заморозьте заполненные формы при -80 °C в течение не менее 30 минут, чтобы убедиться, что весь полимерный раствор замерзает. Удалите растворитель из форм, лиофилизируя их на ночь.
ПРИМЕЧАНИЕ: Цвет полимера в пресс-форме должен превратиться из прозрачного в белый после процесса сублимационной сушки. - Чтобы удалить жертвенный материал формы, перенесите формы после процесса сублимационной сушки на деионизированную водную баню объемом 5 л при мягком перемешивании. Замените воду в ванне, когда она помутнеет. Когда все BVOH растворится, высушите каркасы на воздухе и храните их в вакуумной камере до использования.
2. Покрытие сосудистого каркаса фибронектином
- Дезинфицируйте сосудистые каркасы PLLA:PLGA, погружая их в 70% этанол на 30 минут.
- Мойте каркасы 3x 5 мин с PBS.
- Приготовьте разведение 50 мкг/мл фибронектина человека в PBS и покройте каркасы.
- Смешайте 500 мкл исходного раствора фибронектина (1 мг/мл) с 9,5 мл PBS.
- Погрузите дезинфицированные сосудистые каркасы в этот раствор фибронектина и инкубируйте их при 37 °C в течение 60 мин, чтобы обеспечить адсорбцию белка.
- После инкубации промойте каркасы PBS, чтобы удалить несвязанный фибронектин. Храните эти покрытые каркасами при температуре 4 °C в течение 1 недели.
3. Препарат биочернила rhCollMA
- Подготовьте фосфатный буфер для нейтрализации кислого сырья rhCollMA.
- Приготовьте 10-кратный запас фосфатного буфера, растворив 5,495 г Na2HPO4, 1,55 г2PO4 и 30 мг NaCl в 50 мл деионизированной воды.
- Приготовьте 10-кратное разбавление 10-кратного запасного фосфатного буфера, объединив 1 часть 10-кратного фосфатного буфера с 9 частями деионизированной воды.
- Смешайте 900 мкл запасного раствора rhCollMA со 100 мкл 10x фосфатного буфера для нейтрализации кислого раствора rhCollMA.
- Разбавляют нейтрализованный раствор rhCollMA до желаемой концентрации 10 мг/мл, смешивая его с необходимым количеством 1x фосфатного буфера.
ПРИМЕЧАНИЕ: Биржевая концентрация rhCollMA варьируется между лотами. Поэтому объем 1x фосфатного буфера, необходимый для достижения желаемой концентрации, будет варьироваться. - Готовят раствор пороген-фотоинициатора (PEO-LAP) для сочетания с разбавленным нейтральным rhCollMA.
- Готовят 1,6% (мас./об.) раствор поли(этиленоксида) (ПЭО) в фенольной ДМЭМ без красного цвета, растворяя 160 мг ПЭО в 10 мл ДМЭМ.
- Добавляют 20 мг лития фенил-2,4,6-триметилбензоилфосфината (LAP) к этому раствору для получения 0,2% (мас./об.) LAP в растворе. С этого момента накройте раствор алюминиевой фольгой или держите его в темном месте, чтобы защитить его от света.
- Стерилизуйте раствор PEO-LAP, пропуская его через фильтр 0,22 мкм. Хранить этот раствор при температуре 4 °C до 1 недели.
- Перед биопечатью смешайте разбавленный нейтральный раствор rhCollMA с раствором PEO-LAP в соотношении 1:1 для получения окончательного раствора биочернила. Используйте пипетку, а не вихрь, чтобы смешивать растворы, избегая пузырьков воздуха.
- Если в раствор вводится много пузырьков, центрифугируйте его при 2000 × г в течение 30 с. После центрифугирования снова смешайте раствор биочернила для обеспечения однородности.
4. Подготовка гранулированной поддерживающей ванны
- Приготовьте желатиновый гранулированный вспомогательный материал.
- В шкафу биологической безопасности разделите содержимое одной пробирки 2 г лиофилизированного поддерживающего материала на две стерильные конические трубки объемом 50 мл, каждая из которых содержит приблизительно 1 г.
- Добавьте 40 мл холодного (4 °C) фенол-красного свободного DMEM в каждую трубку и энергично вихрьте, пока весь лиофилизированный поддерживающий материал не растворится.
- Пусть полученная суспензия находится при температуре 4 °C, чтобы обеспечить регидратацию опорного материала.
- Дегазировать опорный материал в вакуумной камере в течение 30 мин для уменьшения пузырьков.
- Центрифугировать опорный материал при 2 000 × г в течение 5 мин. Убедитесь, что материал находится в нижней части трубки, а супернатант прозрачный.
- Аспирируйте супернатант, при этом стараясь не аспирировать опорный материал внизу.
ПРИМЕЧАНИЕ: Опорный материал не должен течь при наклоне трубки после удаления супернатанта. Если материал течет, центрифугируйте его снова, используя те же настройки, но без добавления нового супернатанта.
- Перенесите приблизительно 4 мл подготовленного, уплотненного опорного материала в каждую скважину 12-луночной плиты с помощью пипетки с положительным смещением. Постучите пластиной колодца по твердой поверхности, чтобы заставить опорный материал равномерно распределяться в колодце.
ПРИМЕЧАНИЕ: Минимальный рекомендуемый объем вспомогательного материала в 3 раза превышает объем конструкции, которая будет напечатана в нем. - Поместите пластину скважины с опорным материалом на охлажденную ступень биопринтера или при 4 °C до ее использования, чтобы предотвратить плавление частиц желатина.
5. Включение эндотелиальных клеток и поддерживающих клеток с биочернилом
- Готовят эндотелиально-клеточную среду в соответствии с инструкциями производителя, смешивая базальную среду с соответствующим компонентом набора среды, включая раствор антибиотика, сыворотку крупного рогатого скота плода и добавки для роста эндотелиальных клеток.
- Готовят среду стволовых клеток пульпы зубов, комбинируя 500 мл низкоглюкообразного DMEM, 58 мл фетальной бычьей сыворотки, 5,8 мл заменимых аминокислот (NEAA), 5,8 мл заменителя глутамина, 5,8 мл 1 M HEPES и 5,8 мл раствора пенициллина-стрептомицин-нистатина.
- Готовят суспензию, содержащую 2 × 106 ZsGreen1-экспрессирующих микрососудистых эндотелиальных клеток человека (HAMEC-ZsGreen1) и 6 × 106 стволовых клеток пульпы зубов (ДПСК) в 10 мл эндотелиальной клеточной среды.
- Центрифугируют клеточную суспензию при 200 × г в течение 4 мин с получением клеточной гранулы. Аспирировать надосадочную среду.
- Повторно суспендируют клеточную гранулу в 1 мл биочернила rhCollMA, приготовленного ранее (содержащего PEO-LAP), с получением биочернила с общей клеточной концентрацией 8 × 106 клеток на 1 мл биочернила.
ВНИМАНИЕ: После объединения биочернил с клетками немедленно переходите к следующему шагу. Если клетки оставить в суспензии на длительное время, клетки опустятся на дно трубки, и их жизнеспособность ухудшится. Для экспериментов, не связанных с клетками, либо пропустите шаги 5.1-5.5, либо включите флуоресцентные шарики с биочернилом вместо клеток для улучшенной микроскопической визуализации напечатанных конструкций. - Перенесите смесь клеток-биочернил в картриджи.
- Установите иглу внутреннего диаметра 0,22 мм на картридж янтаря объемом 3 мл и поместите картридж в коническую трубку объемом 50 мл.
- Переложите 1 мл клеточно-биочернилой смеси на картридж, заполнив его сверху, используя пипетку с положительным смещением для уменьшения пузырьков.
- Установите картридж в соответствующий инструмент на биопринтере.
6. Биопечать микрососудистых сетей с использованием биочернила rhCollMA
- Создайте 3D CAD дизайн для биопечатной микрососудистой сети.
- Набросайте 2D-рисунок квадрата толщиной 4 мм, содержащего в центре круглый канал диаметром 2 мм. Выдавите эскиз на 4 мм, чтобы получить куб размером 4 мм x 4 мм x 4 мм с центральным каналом. Экспортируйте этот объект как файл . STL-файл.
- Импортируйте 12-луночную пластину. Шаблон STL на вкладку твердотельного моделирования в программном обеспечении для нарезки биопринтера и поместите его в назначенную область виртуального печатного ложа.
- Импортируйте платформу . STL-файл формы куба на вкладке моделирования твердого тела в программном обеспечении для нарезки биопринтера. Установите флажок Использовать внешний срез | настроить срез в разделе свойств объекта. Во всплывающем окне выберите прямолинейный узор для шаблона заливки и введите плотность заливки 30 %. Нажмите кнопку Принять.
- Поместите копию фигуры куба в каждый нужный виртуальный колодец, щелкнув по кубу и переместив его с помощью мыши.
- Создайте новые настройки материала для rhCollMA bioink на вкладке материалов программного обеспечения для нарезки биопринтера, нажав кнопку добавления материала . Выберите настройки материала для печати. Для параметра давления введите 2 psi в соответствующем поле. Для обозначения скорости введите 20 мм/с в соответствующем поле.
ПРИМЕЧАНИЕ: Каждый материал биочернил имеет свои собственные настройки печати, которые могут быть сохранены в списке материалов в приложении. - Присвойте значения ширине и высоте строки 0,24 мм, а значению ускорения 400 мм/с2, введя эти значения в соответствующие поля.
- На вкладке «Твердотельное моделирование » щелкните объект куба, а затем щелкните материал rhCollMA из раздела «Материалы», чтобы назначить его форме куба. На вкладке «Биосборка » нажмите кнопку «Отправить задание печати », чтобы отправить задание печати на биопринтер.
- Загрузите картридж, загруженный клеточным биочернилом, в пневматический дозирующий инструмент объемом 3 мл биопринтера на основе экструзии.
- Установите температуру печатного слоя на 4 °C, нажав на кнопку охлаждения под вкладкой Control-Heating/Cooling на экране интерфейса биопринтера. Загрузите пластину с опорной ванной на кровать принтера.
ПРИМЕЧАНИЕ: Настройки материала для давления и скорости печати могут изменяться из-за различий в температуре окружающей среды или изменчивости партии биочернил. Например, в более холодные дни для экструзии того же количества материала требуется более высокое давление или более медленная скорость. - На вкладке «Печать» на экране интерфейса биопринтера щелкните задание печати, отправленное на шаге 6.7. и нажмите кнопку Пуск | перейти к началу задания печати.
- После печати подвергайте пластину воздействию источника света 405 нм с интенсивностью 3 мВт/см2 в течение 30 с, чтобы инициировать сшивание биочернила rhCollMA.
- После сшивки инкубируют пластину скважины при 37 °C и 5% CO2 в течение не менее 20 мин, пока вся опорная ванна не расплавится.
- Аккуратно аспирируйте сжиженную опорную ванну и замените ее эндотелиальной клеточной средой. Инкубируйте конструкции при 37 °C и 5% CO2 до дальнейшего использования.
ПРИМЕЧАНИЕ: Из-за сжатия конструкции после печати рекомендуется выполнить шаг сборки 7 в тот же день, что и шаг 6.
7. Сборка биопечатной микрососудистой сети с сосудистым каркасом для получения инженерного васкуляризированного лоскута
- Сразу после удаления поддерживающего материала из биопечатной микрососудистой сети поместите фибронектиновый сосудистый каркас PLLA:PLGA в основной канал биопечатной структуры.
- Инкубируйте собранные конструкции при 37 °C и 5% CO2 в течение 2 дней.
- Выровнять просвет сосудистого каркаса эндотелиальными клетками.
- Готовят клеточную суспензию tdTomato-экспрессирующих микрососудистых эндотелиальных клеток человека (HAMEC-tdTomato) в концентрации 1 × 107 клеток/мл.
- Поместите каплю этой клеточной суспензии объемом 20 мкл на гидрофобную поверхность (т.е. на чашку безтканевой культуры [nonTC] 10 см).
- Аккуратно поместите сосудистые каркасы поверх капли, чтобы просвет каркаса на одном конце соприкасался с каплей клетки.
- Аспирируйте каплю с противоположного конца каркаса (т. е. конца, который не контактирует с каплей), заполняя ее просвет клеточной суспензией.
- Поместите засеянный каркас в микроцентрифужную трубку и поместите его в ротатор внутри в увлажненном инкубаторе на 60 минут. Затем переложите каркас в 12-луночную пластину и добавьте 2 мл эндотелиальной клеточной среды.
- Культивируйте инженерные лоскуты в течение 7 дней, заменяя среду каждые 2 дня свежей средой эндотелиальных клеток.
8. Конфокальная микроскопия и иммунофлуоресцентное окрашивание инженерных лоскутов
- После 4 дней и 7 дней посева выполните визуализацию живых клеток собранных каркасов с помощью конфокального лазерно-сканирующего микроскопа.
- Определите каналы флуоресценции для флуоресцентных белков ZsGreen1 и tdTomato в программном обеспечении для получения изображений микроскопа.
- Выберите объектив 5x/0.16 с 0,5-кратным зумом (размер пикселя 5 мкм) и определите Z-стек с 22 срезами толщиной 41 мкм каждый.
- Определите сканирование плитки размером 3 x 2 для создания изображения и захвата всей конструкции.
- Отрегулируйте интенсивность лазера и значения усиления для получения четкого флуоресцентного сигнала без насыщенности и минимального фона и получите изображения.
- Выполните проекцию максимальной интенсивности полученного Z-стека для получения одного 2D-изображения с помощью программного обеспечения для сбора изображений микроскопа или аналогичного программного обеспечения для анализа изображений.
- Выполняйте визуализацию с более высоким увеличением интересующей области.
- Переключитесь на объектив 10x/0.3 с зумом 0,5 (размер пикселя 1,25 мкм) и определите Z-стек с 9 срезами толщиной 41 мкм.
- Выполните шаги 8.2.-8.3.
- После 7 дней посева зафиксируйте инженерные лоскуты, погружая их в 4% параформальдегид на 20 мин.
- Мойте конструкции 3x 5 минут с PBS.
- Добавьте 0,3% (v/v) Triton-X в PBS к конструкциям и инкубируйте в течение 15 мин при комнатной температуре для пропитки клеток.
- Мойте конструкции 3x 5 минут с PBS.
- Готовят блокирующий раствор путем растворения 5% (мас./об.) бычьего сывороточного альбумина (BSA) в PBS. Добавьте блокирующий раствор в инженерные клапаны и инкубируйте в течение 1 ч при комнатной температуре.
- Готовят первичный раствор антител путем разбавления мышиного анти-гладкомышечного актина (анти-СМА) антитела 1:50 в 5% растворе BSA, приготовленном ранее для окрашивания SMA-экспрессирующих поддерживающих клеток.
- Инкубируют каркасы в растворе первичного антитела в течение ночи при 4 °C.
- Стирайте 3x 5 мин с PBS.
- Получают раствор вторичного антитела путем разбавления Cy3-конъюгированного козьего антимышечного антитела IgG 1:400 и 4',6-диамидино-2-фенилиндола (DAPI, 2,5 мкг/мл) в PBS.
- Применяют раствор вторичных антител к каркасам и инкубируют в течение 3 ч при комнатной температуре.
- Стирайте 3x 5 мин с PBS.
- Храните конструкции при температуре 4 °C в PBS до 1 месяца.
- Визуализируйте окрашенные каркасы с помощью конфокального лазерного сканирующего микроскопа.
- Определите три канала флуоресценции (DAPI, ZsGreen и Cy3) в программном обеспечении для получения изображений микроскопа.
- Определите Z-стек с толщиной сечения 2 мкм общей толщиной 50 мкм. Затем определите сканирование плитки для отображения больших областей конструкции.
- Настройте параметры сбора для получения четкого флуоресцентного сигнала без насыщенности и минимального фона.
- Получайте изображения с помощью объектива 20x/0.8 с 1,0-кратным зумом (размер пикселя 0,31 мкм).
- Выполните проекцию максимальной интенсивности полученного Z-стека для получения одного 2D-изображения с помощью программного обеспечения для сбора изображений микроскопа или аналогичного программного обеспечения для анализа изображений.
9. Анастомозирование сконструированного лоскута непосредственно к бедренной артерии крысы с использованием манжеты
- Подготовьте и стерилизуйте (автоклав) следующие хирургические инструменты: скальпель No 15, пару мелкозубчатых щипцов и небольшую пару ножниц с кольцевой ручкой. Кроме того, подготовьте и стерилизуйте следующие микрохирургические инструменты: прямые тонкоконечные ювелирные щипцы No3, угловые ювелирные щипцы, держатель игл с круглой ручкой с изогнутыми челюстями, пара расширителей сосудов, рассекающие ножницы, ножницы адвентиции, а также зажимы сосудов с их аппликатором.
- Готовят раствор из 100 МЕ/мл гепаринизированного физиологического раствора путем разбавления 5 мл исходного раствора гепарина 195 мл физиологического раствора.
- Нарежьте и стерилизуйте полиимидные манжеты.
- Вырежьте 2,5 мм секции полиимидной трубки под рассекающим микроскопом.
- На одном конце каждой секции сделайте продольный разрез 1,25 мм в стенке трубки, чтобы получить ручку манжеты. Сделайте угловой разрез на другом конце трубки, чтобы облегчить выворот сосуда.
- Погрузите манжеты в 70% этанол с последующей двумя промывками гепаринизированным физиологическим раствором.
- Подготовьте самца крысы Sprague-Dawley (275-350 г) к операции.
- За семь дней до операции начните введение подкожной суточной дозы циклоспорина (10 мг кг-1) для достижения подавления иммунитета.
- Перед операцией обезболивайте животное, используя 3% ингаляцию изофлурана в соответствии с институциональной СОП с использованием индукционной камеры. Проверьте глубокую анестезию, зажав обе ноги и проверив рефлексы.
- Вводят подкожную дозу анальгетического бупренорфина (0,03 мг кг-1) и антикоагулятивного гепарина (200 МЕ кг-1).
- Нанесите смазывающую глазную мазь на глаза животного, чтобы предотвратить обезвоживание.
- Побрейте хирургическую область крысы и продезинфицируйте участок йодом, а затем 70% этанолом. Прикрепите конечности животного к столу с помощью клейкой ленты.
- Обнажают и изолируют общую бедренную артерию.
- Сделайте косой разрез длиной 2 см через кожу, вдоль вогнутости между ногой и животом.
- Используя щипцы и тупые ножницы, освободите кожу от подлежащей ткани, чтобы визуализировать паховую жировую подушку.
- С помощью ножниц и щипцов прорежьте жировую подушку вокруг верхнего, медиального и нижнего краев. Обратите внимание на то, чтобы не разрезать большие сосуды под жировой подушкой.
- Отразите жировую подушку сбоку, оставив эпигастральные сосуды нетронутыми. Поместите влажную марлю на отраженную жировую подушку, чтобы предотвратить высыхание, и зафиксируйте ее на месте. Убедитесь, что общие бедренные сосуды видны.
ПРИМЕЧАНИЕ: Жировая подушка будет позже использоваться для оказания мягкого давления на анастомозы. - Обнажите бедренную артерию от паховой связки проксимально к точке ветвления эпигастральной артерии дистально, извлекая ее из оболочки.
ВНИМАНИЕ: Обычно под ним проходит ветвь бедренной артерии, обычно называемая ветвью Мерфи. Обратите внимание на то, чтобы не повредить эту трудноразглядную ветку. - Разделите ветвь Мерфи, перевязав ее, а затем перевяжите бедренную артерию двумя лигатурами в середине артерии, расположенными на расстоянии 1 мм друг от друга. Держите один конец лигатурного шва длинным, чтобы использовать позже, чтобы вытянуть конец сосуда через манжету.
- Перережьте артерию между двумя лигатурами с помощью адвентитивных ножниц.
ВНИМАНИЕ: При выполнении этого разреза не должно быть кровотечения. Если артериальный конец кровоточит, пережмите артерию и повторно нанесите лигатуру. - Используя длинный конец лигатурного шва, вставьте каждый конец сосуда в полиимидную манжету, подготовленную на предыдущем этапе, так, чтобы ручки двух манжет указывали друг от друга.
- После вставки нанесите зажим одновременно на манжетную ручку и сосуд, закрепив манжету на месте.
- Приготовьте гепаринизированный солевой раствор в шприце, оснащенном иглой 27 г.
- Потяните за перевязанный конец сосуда и отрежьте его близко к лигатуре. Немедленно тщательно промыть конец сосуда гепаринизированным физиологическим раствором до тех пор, пока в просвете не будет видно крови.
ВНИМАНИЕ: Убедитесь, что конец сосуда хорошо промыт, так как любая кровь, оставшаяся внутри, образует сгусток, который будет введен в кровоток после завершения процедуры. Это может привести к окклюзии сосуда и потере перфузии для ноги. - Расширьте просвет сосуда, удерживая его за оболочку одной рукой и расширяя его просвет расширителем сосуда другой рукой.
- Поместите свободный 6-0 полипропиленовый окружной шов вокруг тела манжеты. Закрепите конец сосуда с помощью двух расширителей сосуда над корпусом манжеты и закрепите его на месте, затянув окружной шов.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если во время манипуляций через зажатый сосуд течет кровь, тщательно промыть просвет гепаринизированным физиологическим раствором. - Промыть инженерный лоскут гепаринизированным физиологическим раствором, а затем вставить облицованную сосудами манжету в просвет сосудистого каркаса. Закрепите каркас на месте, поместив окружной полипропиленовый шов 6-0 вокруг каркаса и тела манжеты. Сделайте этот шаг для обеих сторон сосудистого каркаса.
- Оберните мембранный фильтр из полистирола 0,2 мкм вокруг участка анастомозов, чтобы изолировать инженерный лоскут от окружающих тканей.
- Сначала отпустите дистальный зажим; затем отпустите проксимальный зажим, чтобы восстановить кровоток через сосуд.
- Чтобы остановить любое кровотечение через анастомозы, отразите жировую подушку обратно над бедренными сосудами и нанесите мягкое давление, используя стерильную марлю в течение 3 минут.
- Зашить жировую подушку обратно на место с помощью 6-0 полипропилена; затем зашить кожу с помощью 5-0 рассасывающихся швов PGA.
- Очистите раневую область физиологическим раствором и нанесите раствор йода.
- Для послеоперационной боли и лечения животных приготовьте 0,1% (v/v) трамадола в питьевой воде. Кроме того, вводят суточную дозу гепарина (200 МЕ кг-1) и циклоспорина (10 мг кг-1).
- Поместите животное в чистую клетку само по себе, помещенную под нагревательную лампу. Продолжайте наблюдать за животным до тех пор, пока оно не придет в достаточное сознание для поддержания грудинного лежачего состояния.
Representative Results
Этот протокол описывает изготовление инженерного лоскута, состоящего из сосудистого каркаса (рисунок 1Ai) и биопечатного микроциркуляторного русла (рисунок 1Aii), которые были собраны для достижения мезомасштабных и микромасштабных сосудов (рисунок 1Aiii). В соответствии с протоколом, формы BVOH сосудистых каркасов были спроектированы и напечатаны на 3D-принтере (рисунок 1B, C). Полученные печатные структуры визуально проверяли на наличие небольших нитей BVOH, которые можно было найти в пустых пространствах пресс-форм (рисунок 1D). Эти пряди обычно указывают на неправильные настройки материала или на то, что BVOH впитал влагу. Эти нити должны быть удалены, так как они могут привести к неполному заполнению формы и структурным дефектам в полученном сосудистом каркасе. Затем формы заполняли раствором PLLA:PLGA, за которым следовал процесс сублимационной сушки и этапы промывки, как описано в протоколе. Полученный сосудистый каркас PLLA:PLGA был визуально осмотрен для проверки целостности стенки сосуда и проходимости просвета (рисунок 1E).
Нейтрализованный биочернило rhCollMA в концентрации 10 мг/мл готовили и комбинировали в соотношении 1:1 с раствором PEO:LAP. Человеческие микрососудистые эндотелиальные клетки, помеченные Zs-Green1, и стволовые клетки пульпы зубов были повторно суспендированы биочернилом rhCollMA, и раствор был загружен в картридж и на принтер. Коробчатые формы с центральным каналом с прямолинейным рисунком (рисунок 1D) были биопечатаны внутри желатиновой поддерживающей ванны. После печати конструкции были сшиты, а опорная ванна растворена и вымыта. После 4 дней культивирования конструкции были изображены вживую, чтобы проверить самосборку микрососудистой сети. На рисунке 1D показан пример высокоразвитой микрососудистой сети HAMEC-ZsGreen1 в биопечатной конструкции.
Затем сосудистый каркас с фибронектиновым покрытием вставляли в центральный канал печатной конструкции (рисунок 2А). Собранные конструкции культивировали в течение 2 дней, в течение которых клетки сжимали гель, прочно прикрепляя его к сосудистому каркасу. Затем сосудистый каркас был выстлан HAMEC, экспрессирующим tdTomato, в соответствии с протоколом. После 7 дней культуры конструкции были зафиксированы и изображены. На фиг.2В показан вид сбоку собранных конструкций, где эндотелиальные клетки в биопечатном микроциркуляторном русле изображены зеленым цветом, а эндотелиальная облицовка сосудистого каркаса изображена красным цветом. На изображении показана зеленая микрососудистая самосборка в биопечатном геле, в то время как сосудистый каркас выстлан красными эндотелиальными клетками. При более высоком увеличении ростки, происходящие из красной эндотелиальной подкладки, прорастают и анастомозируются с помощью биопечатной микрососудистой сети (рисунок 2C). Затем конструкции были окрашены для α гладкомышечного актина (СМА) в качестве маркера для стволовых клеток пульпы зуба. После иммуноокрашивания конструкции были визуализированы с помощью лазерно-сканирующего конфокального микроскопа (рисунок 2D).
Наконец, после 7 дней культивирования сконструированные лоскуты были микрохирургически анастомозированы в бедренную артерию крысы, как описано в протоколе. Видео репрезентативной процедуры можно посмотреть в Дополнительном видео S1. На рисунке 2E показано репрезентативное изображение завершенных анастомозов до снятия зажима, а на рисунке 2F показано репрезентативное изображение места анастомозов после снятия зажима и гемостаза. Не должно быть никаких кровотечений, видимых до закрытия раны.
Рисунок 1: Репрезентативные изображения изготовленных мезо- и микромасштабных сосудов. (A) Схематический обзор этапов протокола. Воспроизводится с разрешения16. (B) Конструкция САПР для жертвенной формы сосудистого каркаса. (C) Вид сбоку репрезентативной 3D-печатной жертвенной формы (шкала = 0,5 мм). (D) Вид сверху жертвенной формы (шкала = 0,5 мм) (E) Репрезентативный сосудистый каркас, изготовленный с использованием протокола описания (шкала = 5 мм). (F) Проектирование САПР для 3D-биопечатной микрососудистой сети rhCollMA. Линии сетки = 1 мм. (G) Репрезентативное изображение высокоразвитой биопечатной сосудистой сети, показывающее HAMEC-ZsGreen1 зеленым цветом. Шкала бара = 200 мкм. Сокращения: CAD = автоматизированное проектирование; rhCollMA = рекомбинантный метакрилат коллагена человека; HAMEC = микрососудистые эндотелиальные клетки жировой части человека; PLLA = поли-L-молочная кислота; PLGA = полимолочная согликолевая кислота. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Репрезентативные изображения собранного васкуляризированного лоскута. (A) Фотография репрезентативной сборки биопечатного микроциркуляторного русла и сосудистого каркаса. Шкала = 1 мм. (B) Вид сбоку репрезентативного инженерного лоскута, изображенного через 4 дня после эндотелиальной выстилки сосудистого каркаса. Биопечатное микроциркуляторное русло показано зеленым цветом (HAMEC-ZsGreen1), в то время как эндотелиальная подкладка показана красным цветом (HAMEC-tdTomato). Шкала = 1 мм. (C) Репрезентативное изображение анастомозов между биопечатной сосудистой системой зеленого цвета и эндотелиальной подкладкой красного цвета. Шкала бара = 200 мкм. (D) Репрезентативное изображение иммуноокрашивания гладкомышечных актинов (красный), ядер (синий) и эндотелиальных клеток (зеленый) после 7 дней инкубации. Шкала стержня = 0,1 мм. (E) Репрезентативное изображение завершенных анастомозов инженерного лоскута с бедренной артерией крысы до снятия зажима и (F) после снятия зажима. Сокращения: HAMEC = микрососудистые эндотелиальные клетки жировой части человека; СМА = актин гладкой мускулатуры; DAPI = 4',6-диамидино-2-фенилиндол. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительное видео S1: Репрезентативная микрохирургическая процедура анастомозирования сосудистого каркаса к бедренной артерии крысы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить это видео.
Discussion
Инженерия васкуляризированных тканей является одной из основных задач тканевой инженерии20. Современные методы создания инженерной сосудистой ткани сосредоточены на создании самособранного микроциркуляторного русла 21,22,23 или изготовлении мезомасштабных сосудистых каркасов24,25, а не на воссоздании системы иерархической сосудистой системы, которая может быть перфузирована сразу и непосредственно после имплантации26 . В этой работе мы описываем протокол, который использует две модальности 3D-печати для создания иерархической сети сосудов, состоящей из микромасштабных и мезомасштабных сосудов. Протокол сочетает в себе 3D-биопечатную, самособранную микрососудистую сеть с мезомасштабным сосудистым каркасом, достигая имплантируемого, васкуляризированного лоскута. Кроме того, в этой статье представлен протокол для непосредственного анастомозирования этого лоскута в бедренную артерию крысы.
3D-биопечать приобрела интерес в последние годы из-за ее универсальности по сравнению с традиционными методами тканевой инженерии. Хотя этот протокол описывает генерацию микрососудистой сети в биочерниле rhCollMA, используемые методы могут быть применены с небольшими изменениями ко многим другим биочерням из множества изученных и новых биочернил и поддерживающих ванн27,28. Мы решили использовать rhCollMA в качестве биочернила из-за обилия коллагена типа I в ECM человека, обеспечивая подходящую среду для прикрепления клеток. Кроме того, он производится рекомбинантно в растениях и дополнительно модифицируется метакрилатными группами, что позволяет проводить фотополимеризацию и образование стабильных 3D гидрогелей29,30. Фотокроссылка была достигнута путем добавления фотоинициатора LAP, который, как было показано, не токсичен и активируется воздействием синего света 405 нм, уменьшая возможную фототоксичность ультрафиолетового света. Однако использование светочувствительных биочернил требует использования фенольной питательной среды без красного цвета для приготовления биочернила и поддерживающего материала. Кроме того, протокол описывает использование желатинового опорного материала, который обеспечивает высокоточную экструзию биочернил, таких как rhCollMA. Таким образом, крайне важно обеспечить использование холодной среды во время ее приготовления и охлаждения принтера. Чрезмерный нагрев может произойти из-за источника света, используемого для сшивания, или от повышенных температур окружающей среды.
Биопринтер на основе экструзии был использован здесь для создания биопечатной микрососудистой сети, и в настоящее время существует много коммерчески доступных биопринтеров, которые могут генерировать подобные конструкции. Кроме того, предложенные методы могут быть легко модифицированы и применены для изучения различных геометрий, размеров и закономерностей заполнения. В этой работе был выбран прямолинейный рисунок заполнения для создания взаимосвязанных пор, и его можно напечатать относительно быстро с высокой точностью.
Пузырьки воздуха создают значительную проблему в экструзионной биопечати, особенно внутри вспомогательных материалов. Поэтому крайне важно свести к минимуму наличие и образование этих пузырьков за счет использования пипеток с положительным смещением для переноса опорного материала, приготовления биочернило-клеточной суспензии и переноса их на картриджи.
В этой работе эндотелиальные клетки, полученные из жировой ткани человека, и стволовые клетки пульпы зубов использовались в качестве поддерживающих клеток из-за их относительно легкой изоляции от пациентов. Кроме того, была выбрана общая концентрация клеток 8 х 106 клеток/мл, поскольку было показано, что эта концентрация создает наиболее развитые сосудистые сети16. Хотя этот протокол может быть использован для создания микроциркуляторного русла с использованием различных типов клеток и источников, а также различных биочернил, калибровка концентрации клеток должна быть выполнена для установления наилучших условий для развития микрососудистой сети. Кроме того, тканеспецифические клетки (т.е. миобласты или остеобласты) могут быть включены в биочернило для достижения тканеспецифических васкуляризированных лоскутов.
Форма для пористого сосудистого каркаса была изготовлена с использованием 3D-печатного водорастворимого материала на коммерчески доступном экструзионном 3D-принтере. Это приводит к экономически эффективному методу, основанному на платформах быстрого прототипирования, так что многие различные геометрии и размеры сосудистых каркасов могут быть изучены и быстро проверены31. Тем не менее, ограничением этого метода является предел разрешения большинства 3D-принтеров32. Однако с быстро развивающейся отраслью, связанной с аддитивным производством, эти ограничения, как ожидается, со временем улучшатся. Использование органических растворителей для процесса изготовления является еще одним ограничением протокола, так как большинство органических растворителей токсичны для клеток, предотвращая возможность сочетания процедуры биопечати с процессом изготовления сосудистого каркаса.
Описанный способ посева просвета каркаса с использованием аспирации в отличие от выталкивания клеточной суспензии оказывает значительное влияние на локализацию засеянных клеток. Использование отрицательного давления позволяет проводить эндотелизацию внутреннего просвета каркаса при минимизации любого разлива клеточной суспензии через перфорации на стенкекаркаса 16.
Описанный «манжетный» способ для микрохирургических анастомозов может быть легко модифицирован и адаптирован к различным материалам или размерам сосудистых каркасов, а также к различным артериям и венам в широком масштабе животных моделей. Адаптация к протоколу будет включать в себя различные размеры полиимидных трубок и размеры швов. Этот метод не требует перфорации стенки каркаса, что может привести к развитию дефектов. Эта работа представляет собой протокол, который может быть расширен на многие приложения. Критические аспекты этого протокола, которые включают изготовление мезо- и микромасштабных сосудов и их сборку и имплантацию, представляют собой критические аспекты инженерных лоскутов как для реконструктивных применений, так и для сосудистых и других тканевых инженерных исследований.
Disclosures
У авторов нет конфликта интересов для раскрытия.
Acknowledgments
Этот проект получил финансирование от Европейского исследовательского совета (ERC) в рамках Программы исследований и инноваций Европейского союза Horizon 2020 (грантовое соглашение No 818808). rhCollMA была щедро предоставлена CollPlant (Реховот, Израиль). Авторы благодарят Управление доклинических исследований Техниона за помощь в уходе за животными, а также Джанетт Завин, Галию Бен Давид и Идана Реденски.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1,4-Dioxane | Biosolve Chemical | 42405 | |
| 27 G x 0.5" blunt tip dispensing needles | CML supply | 901-27-050 | |
| 3cc amber syringe barrel & piston set | Nordson EFD | 7012085 | Amber syringes used to block light and prevent premature crosslinking |
| 5-0 AssuCryl PGA absorbale suture | Assut Sutures | Absorbable sutures used for skin wound closure | |
| 6-0 polypropelene sutures | Assut Sutures | 9351 | |
| Acland clamps | S&T | B-1V | |
| Adventitia scissors | S&T | SAS-15 | |
| Angled no.3 jeweler's forceps | S&T | JFAL-3-18 | |
| BioAssemblyBot 400 3D Bioprinter | Advanced Solutions | a 6-axis 3D bioprinter | |
| Bovine albumin serum Probumin | Millipore | 82-045-1 | |
| Buprenorphine | vetmarket | B15100 | |
| BVOH filament | Verbatim | 55903 | a water-soluble 1.75 mm diameter filament |
| Clamp applying forceps | S&T | CAF-4 | |
| Dental pulp stem cells | Lonza | PT-5025 | |
| Dietrich bulldog clamps | Fine Science Tools (FST) | 18039-45 | |
| di-Sodium hydrogen phosphate (Na2HPO4) | Carlo Erba Reagents | 480141 | |
| Dissection scissors | S&T | 18039-45 | |
| DMEM, High Glucose, No Phenol Red | Sartorius | 01-053-1A | |
| Duratears | Alcon | DJ03 | |
| ECM media + bullet kit | Sciencell | #1001 | |
| Ethanol 96% | Gadot-Group | 64-17-5 | |
| GlutaMAX | Gibco | 35050061 | glutamine substitute |
| Goat anti-mouse Cy3 antibody | Jackson | 115-166-072 | |
| Heparin Sodium 5,000 I.U./mL | Panpharma | - | |
| Human adipose microvascular cells | Sciencell | #7200 | |
| Human fibronectin | Sigma | F0895-5MG | A stock concentration of 1 mg/mL |
| Isoflurane, USP Terrell | Piramal Critical Care | NDC 66794-011-25 | |
| LifeSupport | Advanced Biomatrix | 5244 | a gelatin support slurry for FRESH 3D bioprinting |
| Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) | Sigma-Aldrich | 900889 | |
| Low-glucose DMEM | Biological Industries | 01-050-1A | |
| MICROMAN E M1000E, 100-1,000 µL | Gilson | FD10006 | |
| Mouse anti-SMA antibody | Dako | M0851 | |
| NEAA | Gibco | 11140068 | |
| Needle holder | Fine Science Tools (FST) | 12500-12 | |
| Paraformaldehyde solution 4% in PBS | ChemCruz | SC-281692 | |
| Penicillin-Streptomycin-Nystatin Solution | Biological Industries | 03-032-1B | |
| Phospate buffered saline (PBS) | Sigma | P5368-10PAK | |
| Poly(ethylene oxide), M.W. 250,000 to 400,000 | Acros Organics | 178602500 | |
| Poly(L-lactic acid), IV 5.0 dl/g (PLLA) | Polysciencse, Inc. | 18582-10 | |
| Polyimide tubing, ID: 0.0249", OD: 0.0273" | Cole-Parmer | 95820-05 | A thin-walled tube used to fabricate cuffs for microsurgical anastomoses |
| Prusa I3 MK2.5 3D Printer | Prusa Research | http://www.prusa3d.com/ | a popular commercial 3D printer |
| Resomer RG 503 H, Poly(D,L-lactide-co-glycolide) (PLGA) | Evonik Industries | 719870 | |
| rhCollMA | CollPlant | https://collplant.com/ | generously provided by CollPlant (Rehovot, Israel) |
| round-handled needle holder | S&T | B-15-8 | |
| Scalpel handle - #3 | Fine Science Tools (FST) | 10003-12 | |
| small fine straight scissors | Fine Science Tools (FST) | 14090-09 | |
| Sodium Chloride | Biosolve Chemical | 19030591 | |
| Sodium Phosphate dibasic (NaH2PO4) | Riedel-de Haen | 4276 | |
| Solidworks | Dassault Systems | CAD software | |
| Straight no.3 jeweler's forceps | S&T | JF-3-18 | |
| Straight serrated forceps | Fine Science Tools (FST) | 11050-10 | |
| Surgical Scalpel Blade No.15 | Swann-Morton Limited | 305 | |
| Triton-X 100 | BioLab LTD | 57836 | |
| TSIM | Advanced Solutions | 3D slicing and design software for the BioAssembly Bot | |
| Vessel dilator | S&T | D-5a.1 | |
| Zeiss Tivato 700 surgical microscope | Zeiss |
References
- Wallace, C. G., Wei, F. -C. C. The current status, evolution and future of facial reconstruction. Chang Gung Medical Journal. 31 (5), 441-449 (2008).
- Atala, A., Kasper, F. K., Mikos, A. G.
- Duan, B. State-of-the-art review of 3D bioprinting for cardiovascular tissue engineering. Annals of Biomedical Engineering. 45 (1), 195-209 (2017).
- Kim, J. J., Hou, L., Huang, N. F. Vascularization of three-dimensional engineered tissues for regenerative medicine applications. Acta Biomaterialia. 41, 17-26 (2016).
- Ouyang, L., Armstrong, J. P. K., Chen, Q., Lin, Y., Stevens, M. M. Void-free 3D bioprinting for in situ endothelialization and microfluidic perfusion. Advanced Functional Materials. 30 (1), 1908349 (2020).
- Baltazar, T., et al. Three dimensional bioprinting of a vascularized and perfusable skin graft using human keratinocytes, fibroblasts, pericytes, and endothelial cells. Tissue Engineering - Part A. 26 (5-6), 227-238 (2020).
- Chia, H. N., Wu, B. M. Recent advances in 3D printing of biomaterials. Journal of Biological Engineering. 9 (1), 4 (2015).
- Murphy, S. V., Atala, A. 3D bioprinting of tissues and organs. Nature Biotechnology. 32 (8), 773-785 (2014).
- Guillotin, B., et al. Laser assisted bioprinting of engineered tissue with high cell density and microscale organization. Biomaterials. 31 (28), 7250-7256 (2010).
- Catros, S., et al. Laser-assisted bioprinting for creating on-demand patterns of human osteoprogenitor cells and nano-hydroxyapatite. Biofabrication. 3 (2), (2011).
- Ronca, A., Ambrosio, L., Grijpma, D. W. Preparation of designed poly(d,l-lactide)/nanosized hydroxyapatite composite structures by stereolithography. Acta Biomaterialia. 9 (4), 5989-5996 (2013).
- Lan, P. X., Lee, J. W., Seol, Y. J., Cho, D. W. Development of 3D PPF/DEF scaffolds using micro-stereolithography and surface modification. Journal of Materials Science: Materials in Medicine. 20 (1), 271-279 (2009).
- Hinton, T. J., et al. Three-dimensional printing of complex biological structures by freeform reversible embedding of suspended hydrogels. Science Advances. 1 (9), (2015).
- Lee, A., et al. 3D bioprinting of collagen to rebuild components of the human heart. Science. 365 (6452), 482-487 (2019).
- Bhattacharjee, T., et al.
- Szklanny, A. A., et al. 3D bioprinting of engineered tissue flaps with hierarchical vessel networks (VesselNet) for direct host-to-implant perfusion. Advanced Materials. 33 (42), 2102661 (2021).
- Schleimer, K., et al. Training a sophisticated microsurgical technique: interposition of external jugular vein graft in the common carotid artery in rats. Journal of Visualized Experiments JoVE. (69), (2012).
- Sucher, R., et al. Mouse hind limb transplantation: A new composite tissue allotransplantation model using nonsuture supermicrosurgery. Transplantation. 90 (12), 1374-1380 (2010).
- Fensterer, T. F., Miller, C. J., Perez-Abadia, G., Maldonado, C. Novel cuff design to facilitate anastomosis of small vessels during cervical heterotopic heart transplantation in rats. Comparative Medicine. 64 (4), (2014).
- Novosel, E. C., Kleinhans, C., Kluger, P. J. Vascularization is the key challenge in tissue engineering. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (4-5), 300-311 (2011).
- Landau, S., et al. Tropoelastin coated PLLA-PLGA scaffolds promote vascular network formation. Biomaterials. 122, 72-82 (2017).
- Szklanny, A. A., et al. High-throughput scaffold system for studying the effect of local geometry and topology on the development and orientation of sprouting blood vessels. Advanced Functional Materials. 1901335, 1-13 (2019).
- Song, W., et al. Engineering transferrable microvascular meshes for subcutaneous islet transplantation. Nature Communications. 10 (1), 1-12 (2019).
- Luo, Y., Lode, A., Gelinsky, M. Direct plotting of three-dimensional hollow fiber scaffolds based on concentrated alginate pastes for tissue engineering. Advanced Healthcare Materials. 2 (6), 777-783 (2013).
- Ying, G. L., et al. Aqueous two-phase emulsion bioink-enabled 3D bioprinting of porous hydrogels. Advanced Materials. 30 (50), 1-9 (2018).
- Rouwkema, J., Khademhosseini, A. Vascularization and angiogenesis in tissue engineering: beyond creating static networks. Trends in Biotechnology. 34 (9), 733-745 (2016).
- Jang, J., Park, J. Y., Gao, G., Cho, D. W. Biomaterials-based 3D cell printing for next-generation therapeutics and diagnostics. Biomaterials. 156, 88-106 (2018).
- Suntornnond, R., An, J., Chua, C. K. Roles of support materials in 3D bioprinting - present and future. International Journal of Bioprinting. 3 (1), 83-86 (2017).
- Shoseyov, O., Posen, Y., Grynspan, F. Human recombinant type I collagen produced in plants. Tissue Engineering - Part A. 19 (13-14), 1527-1533 (2013).
- Stein, H., et al. Production of bioactive, post-translationally modified, heterotrimeric, human recombinant type-I collagen in transgenic tobacco. Biomacromolecules. 10 (9), 2640-2645 (2009).
- Kaplan, B., et al. Rapid prototyping fabrication of precision polyester scaffolds for axonal guidance. Biomaterials. , 120062 (2020).
- Karakurt, I., Lin, L. 3D printing technologies: techniques, materials, and post-processing. Current Opinion in Chemical Engineering. 28, 134-143 (2020).
