Waiting
로그인 처리 중...

Trial ends in Request Full Access Tell Your Colleague About Jove
JoVE Journal Neuroscience
Click here for the English version

Neuroscience

Serbestçe Hareket Eden Farelerde Bağırsak Kaynaklı Mikrobiyal Metabolitlerin İntraserebroventriküler Verilmesi

Published: June 2, 2022 doi: 10.3791/63972
Automatic Translation
*1,2, *2, 1,2
1Institute of Basic Medical Sciences, College of Medicine, National Cheng Kung University, 2Department of Physiology, College of Medicine, National Cheng Kung University
* These authors contributed equally

Summary

Bağırsak kaynaklı mikrobiyal metabolitler, hayvanlarda karmaşık davranışlara yol açan çok yönlü etkilere sahiptir. Bağırsak kaynaklı mikrobiyal metabolitlerin beyindeki etkilerini bir rehber kanül aracılığıyla intraserebroventriküler yolla tanımlamak için adım adım bir yöntem sunmayı amaçlıyoruz.

Abstract

Bağırsak mikrobiyotasının ve metabolitlerinin konakçı fizyolojisi ve davranışı üzerindeki etkisi bu on yılda kapsamlı bir şekilde araştırılmıştır. Çok sayıda çalışma, bağırsak mikrobiyotasından türetilmiş metabolitlerin, konakçıdaki karmaşık bağırsak-beyin yolları aracılığıyla beyin aracılı fizyolojik fonksiyonları modüle ettiğini ortaya koymuştur. Kısa zincirli yağ asitleri (SCFA'lar), bağırsak mikrobiyomu tarafından diyet lifi fermantasyonu sırasında üretilen başlıca bakteri kaynaklı metabolitlerdir. Bağırsaktan salgılanan SCFA'lar, SCFA reseptörlerinin geniş dağılımı nedeniyle bağışıklık, endokrin ve nöral yanıtları etkileyerek, periferdeki birden fazla bölgede hareket edebilir. Bu nedenle, SCFA'ların oral ve intraperitoneal uygulaması yoluyla SCFA'ların merkezi ve periferik etkilerini ayırt etmek zordur. Bu makale, SCFA'ların beyindeki işlevsel rolünü, serbestçe hareket eden farelerde bir rehber kanül aracılığıyla sorgulamak için video tabanlı bir yöntem sunmaktadır. Beyindeki SCFA'ların miktarı ve türü, infüzyon hacmi ve hızı kontrol edilerek ayarlanabilir. Bu yöntem, bilim insanlarına bağırsaktan türetilmiş metabolitlerin beyindeki rolünü takdir etmenin bir yolunu sağlayabilir.

Introduction

İnsan gastrointestinal sistemi, konakçıyı etkileyen çeşitli mikroorganizmaları barındırır 1,2,3. Bu bağırsak bakterileri, konakçıtarafından tüketilen diyet bileşenlerinin kullanımı sırasında bağırsak kaynaklı metabolitleri salgılayabilir 4,5. İlginçtir ki, çevrede metabolize edilmeyen bağırsak metabolitleri, dolaşım yoluyla diğer organlarataşınabilir6. Not olarak, bu salgılanan metabolitler, merkezi sinir sistemi ile bağırsak arasındaki çift yönlü iletişim olarak tanımlanan bağırsak-beyin ekseni için aracılar olarak hizmet edebilir7. Önceki çalışmalar, bağırsak kaynaklı metabolitlerin hayvanlarda karmaşık davranış ve duyguları modüle edebileceğini göstermiştir 8,9,10,11.

Kısa zincirli yağ asitleri (SCFA'lar), diyet lifi ve sindirilemeyen karbonhidratların fermantasyonu sırasında bağırsak mikrobiyotası tarafından üretilen ana metabolitlerdir6. Asetat, propiyonat ve bütirat, bağırsaktaki en bol SCFA'lardır12. SCFA'lar gastrointestinal sistemdeki hücreler için enerji kaynağı görevi görür. Bağırsaktaki metabolize edilmemiş SCFA'lar portal ven yoluyla beyne taşınabilir, böylece beyin ve davranışmodüle edilir 6,12. Önceki çalışmalar, SCFA'ların nöropsikiyatrik bozukluklarda kritik bir rol oynayabileceğini öne sürmüştür 6,12. Örneğin, otizm spektrum bozukluğunun (ASD) bir hayvan modeli olan BTBR T + Itpr3tf / J (BTBR) farelerinde intraperitoneal bütirat enjeksiyonu, sosyal eksikliklerini kurtardı13. Depresif deneklerden mikrobiyota alan antibiyotik tedavisi görmüş sıçanlar, anksiyete benzeri davranışlarda ve dışkı SCFA'larında bir artış göstermiştir14. Klinik olarak, OSB'li kişilerde fekal SCFA düzeylerindeki değişiklikler, tipik olarak gelişmekte olan kontrollere kıyaslagözlenmiştir 15,16. Depresyonu olan kişiler, sağlıklı deneklerden daha düşük dışkı SCFA seviyelerine sahiptir17,18. Bu çalışmalar, SCFA'ların hayvanlardaki ve insanlardaki davranışları çeşitli yollarla değiştirebileceğini öne sürdü.

Mikrobiyal metabolitler, gastrointestinal sistem, vagus siniri ve sempatik sinir dahil olmak üzere konakçı fizyolojisini ve davranışlarını 4,19 etkileyerek vücudun birçok bölgesi üzerinde çeşitli etkiler gösterir. Metabolitleri periferik yollarla uygularken bağırsaktan türetilmiş metabolitlerin beyindeki kesin rolünü belirlemek zordur. Bu makale, serbestçe hareket eden bir farenin beynindeki bağırsak kaynaklı metabolitlerin etkilerini araştırmak için video tabanlı bir protokol sunmaktadır (Şekil 1). SCFA'ların davranış testleri sırasında rehber kanül yoluyla akut olarak verilebileceğini gösterdik. Metabolitlerin tipi, hacmi ve infüzyon hızı amaca bağlı olarak değiştirilebilir. Kanülizasyon bölgesi, bağırsak metabolitlerinin belirli bir beyin bölgesindeki etkisini araştırmak için ayarlanabilir. Bilim insanlarına, bağırsaktan türetilmiş mikrobiyal metabolitlerin beyin ve davranış üzerindeki potansiyel etkisini araştırmak için bir yöntem sunmayı amaçlıyoruz.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Protocol

Tüm deneysel protokoller ve hayvanların bakımı, Ulusal Cheng Kung Üniversitesi (NCKU) Kurumsal Hayvan Bakımı ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır.

1. Deney hayvanına hazırlık

  1. Bir satıcıdan 6-8 haftalık vahşi tip C57BL/6JNarl erkek fareleri edinin.
  2. Fareleri standart fare chow ve sterilize edilmiş su ad libitum ile standart bir fare kafesinde barındırın.
    NOT: NCKU Laboratuvar Hayvanları Merkezi için barınma koşulları 22 ± 1 °C sıcaklık, %55 ± %10 nem ve 13 saat/11 saat açık/karanlık döngüsüdür.

2. Stereotaksik cerrahi

  1. Stereotaksik aleti, cerrahi aletleri ve ilgili öğeleri hazırlayın ve sterilize edin.
    NOT: Cerrahi bölgeye doğrudan temas edecek tüm eşyalar enfeksiyondan kaçınmak için sterilize edilmelidir.
  2. Fareyi oksijende% 1-5% izofluran ile Pleksiglas kafesine yerleştirerek anestezi yapın.
    NOT: Solunum hızının saniyede yaklaşık bir nefeste tutulduğundan emin olmak için fareyi yakından gözlemleyin.
  3. Fareyi anestezi odasından çıkarın. Cerrahi bölgeyi (fare kafası) evcil hayvan düzeltici ile tıraş edin. Fare kesici dişlerini stereotaksik kesici tutucudaki kesici çubuğun üzerine sabitleyerek fareyi stereotaksik çerçevenin üzerine yerleştirin. Burun, burun konisi maskesi ile örtün.
  4. Stereotaksik cerrahi boyunca fareyi oksijende %1-%2,5 izofluran ile uyuşturun. Farenin ayak parmağı sıkışma refleksi ile nosiseptyonunu değerlendirin ve cerrahi bölgeyi kesmeden önce sabit bir solunum hızı sağlayın.
  5. Ameliyat sırasında vücut ısısını korumak için stereotaksik çerçevedeki farenin altına bir ısıtma yastığı (37.0 ° C) yerleştirin. Alternatif olarak, programlanmış ısıtıcıyı ve ısıtma yastığını birbirine bağlayan rektal termal prob yardımıyla çekirdek sıcaklığını koruyun.
  6. Yapışkan bant kullanarak kafadaki kesilmiş kürkü çıkarın. Ağrıyı hafifletmek için fareye analjezik Ketoprofen (5 mg / kg) deri altından enjekte edin. Kuru gözlerden kaçınmak için göz merhemi uygulayın.
  7. Kafayı sabitlemek için sivri uçlu kulak çubuğunu kulak kanalına yerleştirin.
  8. Kulak çubuğunun ölçeğini ayarlayarak kafayı ortalayın.
  9. Dikey hareketi önlemek için kesici tutucu üzerindeki burun kelepçesini sıkın. Başın sabit olup olmadığını kontrol etmek ve sonraki ameliyat sırasında başın gevşemesini önlemek için kafaya hafifçe bastırın.
  10. Bir pamuklu çubuk kullanarak kafa derisini üç alternatif klorheksidin ovma ile dezenfekte edin. Her fırçalamayı ortadan dış tarafa doğru başlatın (en dezenfekte edilen merkezi alandan en az dezenfekte edilen alana).
    NOT: Ortadan dışarıya doğru fırçalamaların kullanılması, bilim adamlarının kürkten kaynaklanan enfeksiyonu ve kontaminasyonu en aza indirmelerine yardımcı olabilir. Dış alan, hala çok miktarda kürk içeren ve iyice dezenfekte edilmesi kolay olmayan tıraşsız baş bölgesine yakındır.
  11. Cerrahi bir bıçak kullanarak kafa derisini anterior/posterior şekilde (<1 cm) kesin. Kesini açın ve kafatasını mikrodisseksiyon forsepsleri tarafından tutulan pamuklu bir çubukla silin.
    NOT: Mikrodisseke forseps, cerrahi bıçak ve pamuklu çubuklar ameliyattan önce otoklavlama ile sterilize edilmelidir. Cerrahi işlem sırasında, her hayvandan önce ve sonra en az 5 s boyunca bir cam boncuk sterilizatörü (150 ° C) kullanarak tüm cerrahi ekipmanı sterilize edin. Cerrahi işlem sırasında ve hayvanlar arasında cerrahi bıçağı ve forsepsleri tutmak için sterilize edilmiş bir beher hazırlayın.
  12. Kafatasındaki Bregma ve Lambda'yı tanımlayın. İlgilenilen bölgeyi bulmak için Bregma'yı referans olarak kullanın.
    1. İsteğe bağlı: Stereotaksik matkabı stereotaksik matkap tutucusuna monte edin ve Bregma'yı referans olarak göstermek için matkabın ucunu kullanın. Cam boncuk sterilizatörünü (150 °C) kullanarak stereotaksik matkabı en az 5 saniye boyunca sterilize edin.
  13. Bregma/Lambda ile düz kafatası yatay düzlemini sol/sağ ve ön/arka düzlemlerde kalibre edin ve hizalayın.
    NOT: Doğru yatay düzlemde değilse, fareyi stereotaksik aygıtın üzerine yeniden takın.

3. Ticari özelleştirilmiş kılavuz kanül implantasyonu

  1. Stereotaksik koordinatlara göre sağ lateral ventrikülün konumunu tanımlayın ve etiketleyin: Bregma'ya uzaklık, anterior/posterior (A/P): 0,26 mm, medial/lateral (M/L): -1,0 mm, dorsal/ventral (D/V): -2,0 mm20.
    NOT: Koordinatlar, ilgilenilen bölgeye göre değiştirilebilir. Lateral ventrikülün koordinatları, ağırlık aralığı 26-30 g olan yetişkin C57BL / 6J farelere dayanıyordu. Daha genç fareler kullanılıyorsa, tartışmaya bakın.
  2. Ticari bir kılavuz kanülünün implantasyonu için stereotaksik bir matkap kullanarak etiketli bölgedeki kafatasından bir delik (çap = 1,5 mm) açın.
  3. Paslanmaz çelik vidaların montajı için stereotaksik bir matkap kullanarak kafatası üzerinde iki ila dört delik daha (çap = 1,5 mm) delin.
    NOT: Stereotaksik matkabı, her hayvandan önce ve sonra en az 5 s boyunca bir cam boncuk sterilizatörü (150 °C) kullanarak sterilize edin.
  4. Kemik artıklarını silin ve pamuklu çubukla kanamayı durdurun.
  5. Lokal anestezik, antipruritik ve ağrı kesici etkiler için pamuklu çubukla kafatasını Lidokain (1 mg / kg) ile silin. Sondajdan sonra kanama durmazsa, hemostaz için deliğe yavaşça bir pamuklu çubuk yerleştirin.
  6. Diş akrilik için ankraj sağlamak üzere deliklere iki ila dört paslanmaz vida monte edin.
  7. Ticari kılavuz kanülü stereotaksik kanül tutucuya yerleştirin ve cam boncuk sterilizatörü (150 °C) ile dezenfekte edin.
    NOT: Ticari kılavuz kanül, ticari kukla ve ticari enjektör (Şekil 2A), Malzeme Tablosunda gösterilen özelliklerle özelleştirilmiştir.
  8. Stereotaksik kanül tutucuyu lateral ventrikül için açılan deliğe hareket ettirin ve ticari kılavuz kanülü istenen derinliğe (2,5 mm) kadar yavaşça deliğe yerleştirin.
    NOT: Dorsal / ventral koordinat, uç deliğe zar zor yerleştirildiğinde ticari kılavuz kanülün ucu referans olarak ayarlanarak tanımlanabilir.
  9. Ticari kılavuz kanülünü delinmiş deliğe sabitlemek için 10 μL n-bütil siyanoakrilat yapıştırıcı (doku yapıştırıcı yapıştırıcısı) uygulayın ve 3-4 dakika bekleyin. Ticari kılavuz kanülü stereotaksik kanül tutucudan yavaşça serbest bırakın ve tutucuyu uzaklaştırın.
  10. Ticari kılavuz kanülünü sabitlemek için diş akriliğini kesilmiş kafa derisine uygulayın ve en az 5 dakika bekleyin. Kanülün kan veya vücut sıvısı tarafından tıkanmasını önlemek için ticari mankeni ticari rehber kanüle implante edin (Şekil 2B).
  11. Kulak çubuğunu kulak kanalından çıkarın ve fareyi stereotaksik çerçeveden çıkarın.
  12. Anesteziden kurtulmak için fareyi altında bir ısıtma yastığı bulunan yeni bir kafese yerleştirin ve fare tamamen uyanana kadar sürekli gözlemleyin.
    NOT: Sternal yatışmayı sürdürmek için yeterli bilinci yeniden kazanana kadar hayvanı gözetimsiz bırakmayın. Ameliyat geçiren bir hayvan, tamamen iyileşene kadar diğer hayvanların şirketine geri dönmemelidir.
  13. Kurumsal IACUC protokolüne ve deneysel tasarıma bağlı olarak fareyi tek muhafazaya veya grup muhafazasına döndürün. Grup konutu için, istenmeyen yaralanmaları veya kanülün ayrılmasını en aza indirmek için bir kafese daha az farenin yerleştirildiğinden emin olun.
  14. Ameliyat sonrası bakım için içme suyunda Ibuprofen (0.2 mg / mL) uygulayın ve en az 3 gün boyunca ağrı ve sıkıntı belirtileri için günde iki kez izleyin.
    1. Postoperatif bakım sırasında, farelerde iltihaplanma ve enfeksiyonu önlemek için cildin etrafına roksitromisin merhem uygulayın.
    2. Hayvanın durumunu izlemeye devam edin ve yeterli enerji sağlamak için% 5 glikoz veya% 0.9 sodyum klorür zamanında intraperitoneal enjeksiyon yapın.
    3. Ağrı, sıkıntı veya enfeksiyon durumu sürekli olarak kötüleşirse, fareyi CO2 inhalasyonu ile ötenazi yapın.
  15. Farenin SCFA'ların intraserebroventriküler doğumuna ve davranışsal testlere hazır olması için ameliyattan 1 hafta sonra bekleyin.

4. SCFA'ların hazırlanması

  1. Sodyum asetat, sodyum bütirat ve sodyum propiyonatı yapay beyin omurilik sıvısında (ACSF) çözün ( bkz.
  2. Kimyasalların tamamen çözündüğünden emin olun, ardından pH'ı 7,4'e ayarlayın ve SCFA karışımını sterilizasyon için 0,22 μm'lik bir filtreden süzün.

5. Davranışsal testler sırasında SCFA'ların intraserebroventriküler olarak verilmesi için infüzyon sistemini kurun

  1. Davranışı kaydetmek için bir tavan kamerası takın. Video kayıt yazılımını kontrol etmek için fotoğraf makinesini bir bilgisayara bağlayın (Şekil 3).
  2. 10 μL'lik bir şırıngayı damıtılmış suyla doldurun.
    NOT: Mikrolitre şırıngadaki hava kabarcıklarından kaçının.
  3. Mikroenjeksiyon kontrol cihazına bir mikroenjeksiyon pompası bağlayın.
  4. Mikrolitre şırıngayı mikroenjeksiyon pompasına monte edin. Şırıngayı monte etmek için, kelepçeyi gevşetmek ve şırıngayı karşılık gelen konuma monte etmek için düğmeye basın. Kelepçeyi kapatın ve mikroenjeksiyon pompası üzerindeki piston tutma vidasını sıkın (Şekil 4A).
  5. Ticari enjektörü polietilen tüpe yerleştirin (Şekil 2A).
  6. Polietilen tüpü test alanının üzerindeki tavan kamerasına asın.
  7. Polietilen tüpü bir insülin şırıngası kullanarak damıtılmış suyla doldurun. Mikrolitre şırıngayı asılı polietilen tüpe bağlayın.
    NOT: Polietilen tüpün, farenin test alanı boyunca serbestçe hareket etmesine izin verecek kadar uzun olduğundan emin olun.

6. Mikroenjeksiyon denetleyicisinin sistem ayarları

  1. Mikroenjeksiyon denetleyicisini açın ve Komut ekranına erişmek için Tüm Kanalları Görüntüle düğmesine basın (Şekil 4C). Configuration (Yapılandırma) düğmesine basın ve Volume Target'ı 9.800 nL'ye, Delivery Rate değerini ise 100 nL/sn olarak ayarlayın. Mikrolitre şırıngaya bağlı polietilen tüpten 9.800 nL damıtılmış su demleyin (Infuse moduna geçmek için Yön tuşuna basın ve RUN tuşuna basın) (Şekil 4C'nin Komut ekranındaki kırmızı karelere bakın).
  2. Configuration (Yapılandırma) düğmesine basın ve Volume Target'ı 3.000 nL'ye, Delivery Rate değerini ise 100 nL/sn olarak ayarlayın. 3.000 nL mineral yağ çekin (Para Çekme moduna geçmek için Yön tuşuna basın ve ÇALIŞTIR tuşuna basın) (Şekil 4C'nin Komut ekranındaki kırmızı karelere bakın).
    NOT: Polietilen tüp üzerinde berrak bir yağ-su fazı ayrımı gözlenmelidir.
  3. Polietilen tüpü mikrolitre şırınga iğnesinden sökün. Mikrolitre şırınga iğnesinden 3.000 nL damıtılmış su tükürün ( Infuse moduna geçmek için Yön tuşuna basın ve RUN tuşuna basın).
  4. Mikrolitre şırıngayı tekrar polietilen tüpe yerleştirin. Configuration (Yapılandırma) düğmesine basın ve Volume Target'ı 9.500 nL'ye, Delivery Rate değerini ise 100 nL/sn olarak ayarlayın. 9.500 nL SCFA çekin (Para Çekme moduna geçmek için Yön tuşuna basın ve ÇALIŞTIR tuşuna basın). SCFA'ların başarıyla aşılanıp aşılanmadığını doğrulamak için yağ-SCFA'lar fazını etiketleyin.
  5. Configuration (Yapılandırma) düğmesine basın ve Teslim Hızı ile istediğiniz Birim Hedefini 7 nL/sn olarak ayarlayın. Demleme moduna geçmek için Yön'e basın (Şekil 4C'nin Komut ekranındaki kırmızı karelere bakın).
    NOT: İnfüzyon süresine göre hacmi belirleyin. Örneğin, infüzyon süresi 7 nL / s doğum oranı için 3 dakika ise, hedef hacim = 1.260 nL.
  6. SCFA'ların enjeksiyonu için enjektörü kanüle sokmadan önce mikrolitre şırıngayı ticari enjektörün ön ucunda sıvı çıkana kadar ileri doğru inflemek için RUN tuşuna basın.

7. SCFA'ların serbestçe hareket eden farede ticari kılavuz kanül aracılığıyla lateral ventriküle infüzyonu

  1. Fareyi oksijende% 1-5% izofluran ile Pleksiglas kafesine yerleştirerek anestezi yapın.
    NOT: Solunum hızının saniyede yaklaşık bir nefeste tutulduğundan emin olmak için fareyi yakından gözlemleyin.
  2. Fareyi fırçalayın ve ticari enjektörü ticari kılavuz kanülüne yerleştirin (Şekil 4B).
    NOT: Ticari kılavuz kanülü kan veya vücut sıvısı ile tıkanmışsa, cımbızla hafifçe tıkanmasını açın.
  3. Davranış testinden önce farenin anesteziden 15 dakika boyunca bir kafeste iyileşmesine izin verin.
  4. Temel hareket testi için, fareyi yeni bir kafese yerleştirin ve 35 dakika boyunca serbestçe keşfetmesine izin verin. SCFA'ları ilk 5 dakikada 2.100 nL'lik bir hedef hacim için 7 nL/sn Teslim Hızı kullanarak aşılayın (Demleme moduna Yön tuşuna basın ve ÇALIŞTIR tuşuna basın).
    NOT: Yeni kafesteki hareket, hayvan davranışı video izleme yazılımı21,22 kullanılarak analiz edilebilir.
  5. Fareyi anestezi altına alın (tekrarlayan adım 7.1) ve ticari enjektörü ticari kılavuz kanülünden çıkarın.
    NOT: Fareye, önceki enjeksiyonu yıkamak için uygun süre verildikten sonra tekrar tekrar farklı kontroller/metabolitler enjekte edilebilir. Kanül fare kafasına sabitlendiği sürece, fare farklı metabolitlerle tekrar tekrar test edilebilir.

8. Mikroenjeksiyon sisteminin restorasyonu

  1. Polietilen tüpü mikrolitre şırıngadan sökün.
  2. Polietilen tüpteki damıtılmış suyu atmak için insülin şırıngasını kullanarak tüpe hava enjekte edin. Mikrolitre şırıngayı boşaltın.
  3. Şırınga Durdurma Tanımı ekranını açmak için Yapılandırma ekranındaki Pozları Sıfırla düğmesine basın (Şekil 4C).
  4. Mikroenjeksiyon pompasını tamamen çekilmiş konuma sıfırlamak için bir bip sesi gelene kadar Geri Çek'e basın (Şekil 4C).
  5. Komut ekranına dönün ve bu ekranda **END REACHED** işareti varsa mikroenjeksiyon denetleyicisini kapatın (Şekil 4C).

9. İsteğe bağlı: İntraserebroventriküler enjeksiyonun nöral izleyici ile doğrulanması

  1. İnfüzyon bölgesini doğrulamak için nöral izleyicinin 2.100 nL'sini 7 nL / s Doğum Hızı ile infüze edin.
    NOT: Geri akışı önlemek için enjektörü kılavuz kanülde 5 dakika bekletin.
  2. Fareyi, nöral izleyicinin infüzyonundan 30 dakika sonra aşırı dozda izofluran (% 5) ile anestezi yapın.
  3. Anestezi uygulanan farede solunum hızını ve kuyruk/pençe sıkışma refleksini kontrol edin.
    NOT: Bir sonraki adımdan önce farelerin yanıt vermemesi gerekir.
  4. Göğüs kafesinin altındaki deri, kas ve karın duvarından 4-5 cm'lik bir kesi yapın.
  5. Karaciğeri diyaframdan dikkatlice hafifçe uzaklaştırın.
  6. Farenin kalbini ortaya çıkarmak için diyaframı kesin.
  7. PBS'de fosfat tamponlu salin (PBS) ve buz gibi soğuk% 4 paraformaldehit ile fareyi kalpten geçirin.
  8. Farenin kafasını kesin ve tüm beyni çıkarmak için mikrodisseke forseps ve mikrodisseksiyon makası ile beyni dikkatlice disseke edin23. Beyin örneklerini 3-4 gün boyunca PBS'de buz gibi soğuk% 4 paraformaldehit içine yerleştirin ve PBS ile 3 x 5 dakika yıkayın.
  9. Fare beyin dilimi tutucusunun sekizinci kesiminde (1 mm / bölüm) beyni önden arkaya doğru iki parçaya bölün. Beyni gömme kalıbına yerleştirin ve beyin örneklerini düşük erime noktası agarozuna gömün (PBS'de% 4).
  10. Agaroza gömülü beyni süper yapıştırıcı kullanarak vibratomun sahnesine yapıştırın. Beyni vibratomu kullanarak koronal olarak 50 μm beyin dilimlerine bölün.
  11. Beyin dilimlerini, oda sıcaklığında gece boyunca bloke edici tamponda (1:1.000 seyreltme) seyreltilmiş nöral izleyiciyi hedef alan antikorda inkübe edin.
    NOT: Blokaj tamponu %10 at serumu, %0,1 Triton X-100 ve %0,02 sodyum azid içeriyordu.
  12. Dilimleri PBST ile 3 x 5 dakika yıkayın (%0,1 triton X-100 ile PBS).
  13. Beyin dilimlerini, oda sıcaklığında 2 saat boyunca bloke edici tamponda (1:500 seyreltme) seyreltilmiş floresan boya konjuge sekonder antikorunda inkübe edin.
  14. Dilimleri PBS ile 3 x 5 dakika yıkayın.
  15. Beyin dilimlerini slayta 4',6-diamidino-2-fenilindol (DAPI) içeren bir montaj ortamı ile monte edin.
  16. Slaytı mikroskop kapağı ile örtün.
  17. Montaj ortamının sızmasını önlemek için kızak kenarına oje uygulayın.
  18. Oda sıcaklığında, ışıktan korunan gece boyunca inkübasyondan sonra, bir floresan mikroskobu kullanarak infüzyon bölgesindeki floresan sinyalini görüntüleyin.

10. İsteğe bağlı: Metabolitlerin farelerde lateral ventrikülde özelleştirilmiş bir paslanmaz çelik kılavuz kanül yoluyla infüzyonu

  1. Protokol bölümleri 1-8'i izleyin ve kimyasalları faredeki paslanmaz çelik bir enjektörden geçirmek için ticari kılavuz kanülü paslanmaz çelik bir kılavuz kanülü ile değiştirin.
    NOT: Farklı ticari ve paslanmaz çelik kanüllerin artıları ve eksileri tartışma bölümünde detaylandırılmıştır.
  2. Cerrahi protokolü, protokol bölüm 2 ve 3'te açıklandığı gibi uygulayın, ancak ticari kılavuz kanülü paslanmaz çelik bir kılavuz kanülü ile değiştirmeyi unutmayın (Şekil 5B).
    NOT: Paslanmaz çelik kılavuz kanül, paslanmaz çelik kukla ve paslanmaz çelik enjektör (Şekil 5A), Malzeme Tablosunda gösterilen özelliklere göre özelleştirilmiştir. Özelleştirilmiş paslanmaz çelik kılavuz kanülü istenen derinliğe (2,0 mm) kadar deliğe yerleştirin.
  3. SCFA'ları, mikroenjeksiyon kontrolörü ve mikroenjeksiyon pompasından oluşan mikroenjeksiyon sistemini kullanarak paslanmaz çelik kılavuz kanül aracılığıyla infüze edin (Şekil 4B) (protokol bölümleri 4-7 ile aynıdır). Paslanmaz çelik kılavuz kanülün paslanmaz çelik mankeni için, paslanmaz çelik enjektörün bir tarafını, diğer tarafın ucu paslanmaz çelik kılavuz kanülünden 1 mm daha uzun olana kadar hafifçe bükün.
  4. Nöral izleyicinin 2.100 nL'sini paslanmaz çelik kılavuz kanülden farelerde lateral ventriküle aşılayın (protokol bölüm 9 ile aynı).
  5. Nöral izleyici infüzyonundan sonra 30 dakika boyunca numuneyi toplayın (protokol bölüm 9 ile aynı).
  6. Nöral izleyici infüzyonlu beyin dilimlerinde görüntü yakalama gerçekleştirin (protokol bölüm 9 ile aynı).

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Representative Results

Fare, yeni bir kafeste lokomotor aktiviteyi değerlendirmek için kılavuz kanül implantasyonundan kurtulduktan 1 hafta sonra SCFA'larla aşılandı. Fare yeni bir kafese yerleştirildi ve beynin lateral ventrikülüne implante edilen ticari kılavuz kanül aracılığıyla beyne ilk 5 dakikada (7 nL / s teslimat oranı) 2.100 nL SCFA veya ACSF ile aşılandı. Yeni bir kafesteki lokomotor aktivite, infüzyondan sonra 30 dakika daha kaydedildi. SCFA'ların infüzyonu ile ACSF arasındaki yeni kafesteki lokomotor aktivitede fark gözlenmedi (Şekil 6) (n = grup başına 2 fare; veriler ortalama ± s.e.m. olarak gösterildi ve iki yönlü ANOVA ile analiz edildi).

Kılavuz kanülün beyin bölgelerine implantasyonunun doğruluğunu doğrulamak için, SCFA'larla aynı hacimde ve dağıtım hızında kılavuz kanül yoluyla farelere floresan bir nöral izleyici enjekte edildi (5 dakikada 2.100 nL; 7 nL / s). Beyinler 30 dakika sonra histoloji için toplandı. Floresan boya lateral ventrikülde ve fare beyninin çevresindeki bölgelerde tespit edildi (Şekil 7A). Aynı koşullar altında nöral izleyicinin infüzyonu için beynin lateral ventrikülüne paslanmaz çelik bir kılavuz kanül implante edildi. Kılavuz kanüle benzer şekilde, sonuçlar, paslanmaz çelik kılavuz kanülden infüzyondan sonra bile lateral ventrikülde ve fare beyninin çevresindeki bölgelerde floresan bir boya sinyalinin tespit edildiğini göstermiştir (Şekil 7B).

Figure 1
Şekil 1: Serbestçe hareket eden farelerde intraserebroventriküler infüzyon prosedürü. Serbestçe hareket eden farelerde bağırsak kaynaklı mikrobiyal metabolitlerin intraserebroventriküler iletimi için akış şeması. Kısaltma: SCFA'lar = kısa zincirli yağ asitleri. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 2
Şekil 2: Ticari rehber kanülün farelere implantasyonu . (A) Ticari rehber kanül, kukla ve enjektörün temsili görüntüsü. (B) Diş akrilik ile sabitlenerek farelerin beynine implante edilen ticari rehber kanül ve mankenin temsili görüntüsü. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 3
Şekil 3: Davranış testi için intraserebroventriküler infüzyon teçhizatı. Mikroenjeksiyon sistemi, video kayıt sistemi ve davranışsal cihazların diyagramı. Kısaltma: SCFA'lar = kısa zincirli yağ asitleri. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 4
Şekil 4: Mikroenjeksiyon sistemi. (A) Mikrolitre şırınganın mikroenjeksiyon pompası kullanılarak montajı. (B) Polietilen tüp ile bağlanmış ticari enjektörün ticari kılavuz kanülüne yerleştirilmesi (C) Mikroenjeksiyon kontrolörünün dokunmatik ekranı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 5
Şekil 5: Farelerin lateral ventrikülüne paslanmaz çelik kılavuz kanülün implantasyonu . (A) Paslanmaz çelik kılavuz kanül, kukla ve enjektörün temsili görüntüsü. (B) Diş akrilik ile sabitlenerek farelerin beynine implante edilen paslanmaz çelik kılavuz kanül ve kuklanın temsili görüntüsü. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 6
Şekil 6: Yeni kafeste SCFA'larla aşılanmış farelerin lokomotor aktivitesi . (A) ACSF veya SCFA'ların infüzyonu üzerine kılavuz kanül implantasyonu ve yeni kafes lokomotifinin zaman çizelgesi şeması. (B) İnfüzyon şırıngası, infüzyon penceresi (mavi gölge) ve yeni kafes davranış testinin yerleştirilmesi için zaman çizelgesi şeması. (C) ACSF ve SCFA'larla aşılanmış fareler tarafından yeni bir kafeste 35 dakika boyunca taşınan toplam mesafe. İnfüzyon için zaman penceresi mavi gölge (0-5 dakika) ile gösterilir. (D) Yeni bir kafeste ACSF ve SCFA'larla aşılanmış fareler için yörüngelerin temsili görüntüleri. n = Grup başına 2 fare. Ortalama ± olarak gösterilen veriler s.e.m. ve iki yönlü ANOVA ile analiz edilmiştir. ns: önemli değil. Kısaltmalar: SCFA'lar = kısa zincirli yağ asitleri; ACSF = yapay beyin omurilik sıvısı. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Figure 7
Şekil 7: Beyin kaynaklı floresan boyanın histolojisi. Farelerin lateral ventrikülüne (LV) implante edilen özelleştirilmiş (A) ticari ve (B) paslanmaz çelik kılavuz kanül yoluyla infüzyon. Ölçek çubukları = 1 mm (solda) ve 500 μm (sağda). Mavi: DAPI boyama; Yeşil: Anti-Floresan Altın etiketleme. Kısaltmalar: LV = lateral ventrikül; AC = anterior komissür; CPu = kaudat putamen; LS = lateral septum; MS = medial septum. Bu şeklin daha büyük bir versiyonunu görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Discussion

Bağırsak kaynaklı metabolitler, kısmen vücuttaki çoklu bağlanma bölgelerinden dolayı, çok kesin bir mekanizma olmadan, beyin aracılı hastalıklarla ilişkilendirilmiştir 6,12,24. Önceki raporlar, SCFA'ların G proteinine bağlı reseptörler, epigenetik düzenleyiciler ve vücudun birden fazla bölgesinde enerji üretimi için kaynaklar için ligandlar olarak hizmet edebileceğini gösterdi 6,12. Çevreden kaynaklanan kafa karıştırıcı faktörleri (bağışıklık hücreleri, hormonlar ve otonom sinir sistemi gibi) atlamak için, SCFA'ların serbestçe hareket eden farelerde bir rehber kanül aracılığıyla beyne intraserebroventriküler enjeksiyonu benimseyerek bir yöntem geliştirilmiştir. Ek olarak, kanülizasyon ve infüzyon bölgeleri, SCFA'lardan potansiyel olarak etkilenen beyin bölgelerini keşfetmek için doğrulandı. Toplamda, bu makale bağırsak-beyin ekseni araştırması için bağırsaktan türetilmiş metabolitleri beyne iletmek için hassas, titiz ve doğrulanmış bir yöntem sunmaktadır.

İlaçların ve kimyasalların bir rehber kanül yoluyla hayvanlara intraserebroventriküler olarak verilmesi, çeşitli ilaç testleri 29, hastalık modellemesi 26,28 ve davranışsal testlerin spesifik tasarımı için 25,26,27,28,29 iyi bir şekilde kurulmuştur 27 . En önemlisi, birkaç çalışma bağırsak mikrobiyal metabolitlerini intraserebroventriküler enjeksiyon yoluyla beyne ulaştırmış ve fizyolojik fonksiyonlar üzerindeki etkilerini test etmiştir30,31,32,33. Bu protokol, bağırsak metabolitlerinin beyne gerçek zamanlı olarak akut bir şekilde uygulanmasında bir eklenti özelliği sağlar; bu, bilim adamlarının bağırsak metabolitlerinin beyin ve davranış üzerindeki dinamik etkilerini anlamalarını sağlar.

Metabolit infüzyonunun doğum hızı, beyin ventriküllerindeki beyin omurilik sıvısının akışını simüle etmek için çok önemlidir. Bir çalışma, farelerde beyin omurilik sıvısı üretim hızının 5.3 nL / s34 olduğunu göstermiştir. Serbestçe hareket eden farelerde SCFA'ların akış hızını doğal olarak kontrol etmek için, bu mikroenjeksiyon sisteminin akış hızını değerlendirdik (Şekil 3 ve Şekil 4). SCFA'lar, SCFA'ları serbestçe hareket eden bir fareye aşılamak için 350 cm uzunluğundaki polietilen tüp kullanıldığında bile fazla direnç olmadan sorunsuz bir şekilde aşılanabilir. Polietilen tüpteki sıvı direncini azaltmak için damıtılmış su ve mineral yağın doldurulmasıyla (protokol bölümleri 5 ve 6'ya bakınız), akış hızı 100 nL / s'den 7 nL / s'ye düşürülebilir. SCFA'ların veya ACSF'nin 7 nL / s'lik bir akış hızında demlenmesi, farelerin anormal davranışlarına neden olmadı.

İntraserebroventriküler enjeksiyon için bağırsak kaynaklı metabolitlerin miktarı ve dozu kritiktir. Çeşitli beyin bölgelerindeki bağırsak kaynaklı metabolitlerin mutlak seviyelerini kapsamlı bir şekilde analiz etmek zor olmaya devam etmektedir. Örneğin, çok az sayıda çalışma beyindeki SCFA'ların fizyolojik seviyelerinin tespitini göstermiştir35,36. Bir çalışma, farelerin beyinlerindeki asetat, propiyonat ve bütirat konsantrasyonlarının sırasıyla yaklaşık 1640.6-3281.2 μg / g, 288.18-384.24 μg / g ve 44.036-66.054 μg / golduğunu göstermiştir. Bununla birlikte, başka bir çalışmada beyinde daha düşük SCFA seviyeleri bildirilmiştir (asetat 128.1 μg / g, propiyonat 0.3883 μg / g ve bütirat 0.1640 μg / g)35. Bu protokolde kabul edilen infüzyon asetat, propiyonat ve bütirat miktarları sırasıyla 5.81385 μg / g, 4.62378 μg / g ve 2.6124 μg / g idi. Bu nedenle, bu protokolde infüze edilen SCFA'ların konsantrasyonları fizyolojik konsantrasyonlarla karşılaştırılabilir. Bununla birlikte, SCFA'ların konsantrasyonlarının farklı beyin bölgelerinde değişebileceği olasılığını dışlayamadık. Birçok çalışma, intraserebroventriküler enjeksiyonla (1 dakikada 0.26 M propiyonik asidin 4 μL'si; yaklaşık 249.756 μg / g) beyin ventrikülüne propiyonat verilmesinin sıçanlarda sosyal davranış ve bilişi bozduğunu göstermiştir30,31. İnfüze edilen propiyonatın dozajı ve akış hızı, fareler35 ve sıçanlar37'de bildirildiği gibi nispeten yüksekti. Bu nedenle, beyinde ve çevrede metabolit analizi ve metabolomik profillemedeki ilerlemeler, araştırmacıların bağırsak kaynaklı metabolitlerdeki mekansal ve zamansal dinamik değişiklikleri daha iyi anlamalarına yardımcı olacaktır.

Bu protokolde farelerde intraserebroventriküler enjeksiyon için iki tip kılavuz kanül sunulmuştur - ticari bir kılavuz kanül ve paslanmaz çelik bir kılavuz kanül. Ticari rehber kanül ve kukla implantasyon için iyi tasarlanmıştır. Farelerin kapak nedeniyle özelleştirilmiş mankeni çıkarması kolay değildir. Aksine, paslanmaz çelik manken, 1 haftalık iyileşme sırasında fareler tarafından paslanmaz çelik kılavuz kanülünden kolayca çıkarılabilir ve kanülde kan / beyin omurilik sıvısının pıhtılaşmasına neden olur. Bununla birlikte, ticari özelleştirilmiş kanül 64 mg'dır ve bu kanülün mankeni 86 mg'dır. Böylece, ticari özelleştirilmiş kanül ve kuklanın toplam ağırlığı 150 mg'dır. Buna karşılık, özelleştirilmiş paslanmaz çelik kılavuz kanül 18.3 mg'dır ve bu kanülün mankeni 8.5 mg'dır. Böylece, özelleştirilmiş paslanmaz çelik kılavuz kanülün toplam ağırlığı 26.8 mg'dır. Teorik olarak, paslanmaz çelik kılavuz kanül setinin düşük ağırlığı, kanülün hayvanın hareketi ve beyin üzerindeki etkisini en aza indirecektir. Ayrıca, ticari kılavuz kanülün maliyeti, paslanmaz çelik kılavuz kanülü ve enjektörden daha yüksektir. Bu nedenle, farelerde stereotaksik cerrahi yapan deneyimsiz araştırmacılar için paslanmaz çelik kılavuz kanülü öneriyoruz.

İmplante edilen kanül, beyin hasarı nedeniyle kan ve beyin omurilik sıvısı ile tıkanabilir. Kanülün bu tıkanması, paslanmaz çelik kanülde ticari kanül üzerinde daha sık meydana gelebilir. Kukla, ticari kanülü güvenli bir şekilde sıkmak için dişli olabilir (Şekil 2A), ancak paslanmaz çelik kanül için değil (Şekil 5A). Bu nedenle, iyileşme döneminde mankenin takılmasını sağlamak, kanülün tıkanmasını en aza indirecektir. 1 haftalık iyileşme sırasında ayrılma meydana gelirse yeni bir kukla yerleştirilmelidir. Ayrıca, polietilen tüpü bağlayan enjektörü monte etmeden önce kanülün tıkanıklığını açmak için tek kullanımlık sterilize edilmiş bir enjektör birkaç kez yerleştirilmelidir.

Anestezik ilaçların seçimi cerrahi ve davranış testini oldukça etkileyecektir. Burada, inhalasyon anestezik izofluran, enjekte edilen anestezikler üzerinde seçilmiştir, çünkü iyileşme süresi daha kısadır ve insancıl nedenlerden dolayı hayvanlara daha az zararlıdır. Bununla birlikte, izofluran inhalasyonu için dozaj, farenin durumuna ve vücut ağırlığına bağlı olarak değişebilir. Bu nedenle, anestezinin durumu tüm cerrahi prosedür boyunca yakından izlenmeli ve izofluran buharlaştırıcı buna göre ayarlanmalıdır. Optimize edilmiş solunum hızı, tüm prosedürler sırasında saniyede bir nefes olmalıdır. Ayrıca, aktif karbon ile doldurulmuş gaz filtresi kabı, çalışma alanındaki izofluran ve egzoz gazı kirliliğini ortadan kaldırmak için anestezi odasına ve burun konisi maskesine bağlanmalıdır. Bu, cerrahı izofluran'ın toksik etkisinden koruyacaktır.

Temsili sonuçlar, SCFA'ların infüzyonunun yeni bir kafesteki hareket üzerinde dramatik bir etki yaratmadığını göstermiştir. Bunun nedeni, bu sonucu elde etmek için az sayıda hayvanın kullanılmış olması olabilir (Şekil 6). Dahası, SCFA'ları sadece yeni kafes hareket davranış testinin ilk 5 dakikası için aşıladık, ancak tüm testi yapmadık, çünkü davranışın çoğu kısa bir süre içinde (5-15 dakika) test edildi. Bağırsaktan türetilmiş mikrobiyal metabolitler için zaman penceresi, araştırmacıların hipotezine dayanarak ayarlanmalıdır.

Anestezi zamanı ve anesteziden bilincin yeniden kazanılması davranışsal testler için kritik öneme sahiptir. Burada, fareler enjektör implantasyonu ve SCFA'ların infüzyonu için kısaca anestezi altına alındı ve 15 dakika sonra davranış testi yapıldı. İnhalasyon anestezisinin kesilmesinden sonra iyileşme süresi daha önceki bir çalışmaya dayanarak belirlendi38. Bir pilot çalışma, farelerin aktif, serbestçe hareket etmelerini ve anesteziden 15 dakika sonra rahatsız edilmemelerini sağladı. Enjektörün montajı için anestezi adımını aşağıdaki nedenlerden dolayı uygulamaya koyduk. İlk olarak, enjektör göstergesi 33 G'dir; hayvan aktif olarak hareket ederken kanüle böyle hassas bir enjektör yerleştirmek çok zordur. Ek olarak, bilinçli farelerin parçalanması, fareler üzerinde stres yaratabilir39 ve davranışsal sonuçları karıştırabilir. İkincisi, kanül bazen kan / beyin omurilik sıvısının pıhtılaşması nedeniyle tıkanır. Enjektörü monte etmeden önce kanülün tıkanmasını nazikçe açmak, metabolit infüzyonu için ideal olacaktır. Bu iki nedene dayanarak, enjektörün montajı için farelerin kısaca anestezi altına alınması önerilir. Araştırmacılar, hayvanın inhalasyon anestezisinden iyileşmesiyle ilgili herhangi bir endişe varsa, daha uzun süre (30 dakika) bekleyebilirler. Ayrıca, deneyleri hızlandırmak için polietilen tüpü birbirine bağlayan ayrı bir infüzyon-enjektör seti ayarlanabilir.

Bu protokolün birkaç sınırlaması vardır. İlk olarak, kılavuz kanülün ve bağlantı polietilen tüpünün implantasyonu, optogenetik ve fiber fotometri için optik fiberlerin aynı koordinata, çevredeki alana ve hatta beynin aynı yarımküresine implante edilmesi için cerrahi alanı sınırlayacaktır. İmplante edilmiş kılavuz kanül ile birlikte fare kafasına mikroendoskopi için lens implante etmek daha da zor olacaktır. İkincisi, kılavuz kanülün implantasyonu fare kafasında önemli bir ağırlık oluşturabilir. Özelleştirilmiş bir kanül setinin toplam ağırlığı 26.8-150 mg, bir vida ~ 48 mg ve monte edilen diş akriliği 450-500 mg'dır. Tüm kurulum seti farelerin hareketlerini kısıtlayabilir. Bununla birlikte, son çalışmalar serbestçe hareket eden farelerde kalsiyum sinyallerini izlemek için bir miniskop implante edilmiştir40,41. Miniskopun ağırlığı, vidalar ve diş akriliği hariç, 1,6 g ila 4,5 g arasında değişmektedir. Bu nedenle, kılavuz kanülün ağırlığı, fare davranış testi için nispeten kabul edilebilir olarak kabul edilebilir. Üçüncüsü, infüzyon için bağlanan polietilen tüp ~ 350 cm uzunluğundadır ve bu da davranış testi sırasında farelerin hareketini sınırlayabilir. Bu endişeyi gidermek için, bağlantı polietilen tüpünün fare motor fonksiyonu üzerindeki etkisini değerlendirmek için açık alan testinde hareket için ön test yapılması gerekebilir. Dördüncüsü, diş akrili fareler üzerinde nörotoksik bir etki yaratabilir. Bununla birlikte, test süresi boyunca kılavuz kanülün fare kafasına takılması gerekir. Dental akriliğin fareler üzerindeki potansiyel nörotoksik etkisini azaltmak için, operatörler diş akriliğinin kullanımına aşina olmalıdır. Dental akrilik, dental akrilik karışımı (toz ve sıvı), dental akrilik sıvısının beyne nüfuz etmesini azaltmak için hafifçe katılaştığında daha iyi uygulanır.

Mikrobiyota ve metabolitleri, farklı gelişim kilometre taşlarındaki davranış fonksiyonu ile ilişkilidir. Bu protokol, vücut ağırlıkları 26 g ila 30 g arasında değişen yetişkin C57BL / 6 farelere dayanmasına rağmen, farklı yaş ve boyutlardaki farelere de uygulanabilir. Önceki çalışmalar genç farelerde stereotaksik cerrahiyi benimsemiştir42,43,44,45. Bununla birlikte, beyin bölgeleri için koordinatlar, farelerin büyüklüğüne ve yaşına bağlı olarak değişebilir. Yaşa karşılık gelen atlasa veya çevrimiçi kaynağa (http://mouse.brain-map.org/static/atlas) başvurmanızı öneririz. Ayrıca, koordinatlar, genç cüruf farelerine tripan mavisi veya floresan boya enjekte edilerek doğrulanmalı, böylece deneysel fareler üzerinde uygulanmadan önce yöntem optimize edilmelidir. Bu protokolde kullanılan kılavuz kanüllerin tümü özelleştirilmiştir ve farklı boyutlardaki fareler için koordinatları doğruladıktan sonra ayarlanabilir.

Bu protokol, çok fazla değişiklik yapmadan aparatın üstünde açık bir arena ile çoğu kemirgen davranış testi ile uyumlu olacaktır. Kemirgen davranış testleri, açık alan testi, yükseltilmiş artı / sıfır labirent, adım aşağı testi, doğrudan sosyal etkileşim, yetişkin ultrasonik seslendirme, zorla yüzme testi, kuyruk süspansiyonu, su labirenti, T veya Y labirenti, yeni nesne tanıma, mermer gömme, kendi kendine tımar testi, kiriş geçişi dahil olmak üzere herhangi bir engel olmaksızın fare kafasının üstünde bir polietilen tüp kablolama ile gerçekleştirilebilir. kutup testi ve sudan kaçınma stresine maruz kalma. Kapalı odalar veya tüpler kullanan testlerin, polietilen tüpün farelerle birlikte serbestçe hareket etmesine izin verecek şekilde modifiye edilmesi gerekecektir; üç odacıklı sosyal test, açık-karanlık kutu, korku koşullandırma, sakkaroz tercihi, kısıtlama stresi, irkilme testi ve ön darbe-nabız inhibisyonu gibi. Testten önce cull fareleri üzerindeki polietilen tüp için gereken uzunluğu önceden test etmenizi ve tahmin etmenizi öneririz.

Bağırsak mikrobiyal metabolitlerinin konakçı davranışlarını etkilediği gösterilmiştir 8,46,47,48,49. Bilim adamları, bağırsak mikrobiyotasından türetilmiş metabolitlerin beyin üzerindeki zamansal ve mekansal etkilerini ve farelerdeki davranışları doğrudan araştırmak için bu yöntemi benimseyebilirler. Örneğin, mikrobiyal metabolit 4-etilfenil sülfat (4EPS), ASD'nin klinik öncesi fare modellerinde ve ASD 46,48,49'lu kişilerde artmıştır. 4EPS enjeksiyonu ve 4EPS üreten bakterilerin kolonizasyonu, farelerde talamusun (PVT) paraventriküler çekirdeğinde anksiyete benzeri davranışı ve bozulmuş oligodendrosit olgunlaşmasını arttırdı46,48. Anksiyete benzeri davranış testi sırasında 4EPS'nin farelerin PVT'si üzerindeki doğrudan etkisini değerlendirmek büyüleyici olacaktır. Bununla birlikte, PVT'deki 4EPS'nin mutlak konsantrasyonu hala bilinmemektedir. Bu nedenle, PVT'de yeterli 4EPS seviyelerini belirlemek için bir doz-yanıt testi kritik olabilir. Benzer bir kavram, diğer mikrobiyal metabolitlerin beyin ve davranış üzerindeki etkileri için de benimsenebilir.

Optogenetik, kemogenetik ve in vivo kalsiyum görüntüleme gibi devre tabanlı nöroteknolojiler, bilim adamlarının davranışın kontrolündeki nöral devreyi anlamalarını sağlayan kritik yöntemlerdir50,51,52. Bağırsak-beyin ekseni, bağırsak mikropları ve metabolitlerinin konakçı davranışına aracılık etmesi için kritik öneme sahip karmaşık bir bağlantıdır. Giderek artan sayıda çalışma, bağırsak ve beyin arasındaki ilgi çekici çapraz konuşmayı anlamak için devre tabanlı nöroteknolojileri kullanmıştır33,53,54,55,56,57,58,59. Bu protokol, bağırsak metabolitlerinin neden olduğu davranışların beyin bölgesine dayalı kontrolünü anlamak için alternatif bir yol sağlayacaktır. Bu protokolü devre tabanlı nöroteknolojilerle birleştirmek, araştırmacıların bağırsak metabolitlerinin katkıda bulunduğu davranış ve beyin aktivitesinin devre tabanlı kontrolü hakkında fikir edinmelerini sağlayacaktır.

Sonuç olarak, bağırsak-beyin ekseni kavramı bilimsel toplulukta iyi kabul görmektedir ve nöropsikiyatrik bozukluklarda bağırsak kaynaklı metabolitlerin dahil olma olasılığını teşvik etmektedir 11,13,60,61,62,63,64,65 . Bağırsaktan türetilen metabolitlerin farelerin beynini ve davranışlarını nasıl ve ne şekilde etkilediğini sorgulamak için, alanda kapsamlı ve fizyolojik temelli bir metodolojiye ihtiyaç duyulacaktır. Bu makale, bağırsaktan türetilmiş metabolitleri doğrudan beyne iletmek için adım adım bir protokol sağlar, en önemlisi, serbestçe hareket eden bir farede. Bu tasarım, bağırsaktan türetilmiş metabolitlerin çeşitli beyin bölgelerine verilmesiyle bölgeye özgü etkileri araştırmak için daha da uyarlanabilir.

Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.

Disclosures

Yazarların bu çalışma ile ilgili çıkar çatışması yoktur.

Acknowledgments

Ulusal Cheng Kung Üniversitesi'ndeki (NCKU) Laboratuvar Hayvanları Merkezi personeline hayvanlara baktıkları için teşekkür ederiz. Bu çalışma, CHENG-HSING Tıp Vakfı'nın Prof. Kun-Yen Huang Eğitim Fonu'ndan C.-W.L.'ye verilen bursla desteklenmiştir; Tayvan'daki Bilim ve Teknoloji Bakanlığı'ndan (MOST) gelen fonlar: (Lisans Araştırması MOST 109-2813-C-006-095-B) T.-H.Y.'ye; (ÇOĞU 107-2320-B-006-072-MY3; 109-2314-B-006-046; 110-2314-B-006-114; 110-2320-B-006-018-MY3) W.-L.W.'ye; ve Yüksek Öğrenim Filizi Projesi, Eğitim Bakanlığı'ndan NCKU'daki Üniversite İlerleme Merkezi'ne W.-L.W.'ye

Materials

Name Company Catalog Number Comments
Material
Advil Liqui-Gels Solubilized Ibuprofen A2:D41 Pfizer n/a
Alexa Fluor 488 donkey anti-rabbit ThermoFisher Scientific A-21206
Anti-Fluorescent Gold (rabbit polyclonal) Millipore AB153-I
Bottle Top Vacuum Filter, 500 mL, 0.22 μm, PES, Sterile NEST 121921LA01
CaCl2  Sigma-Aldrich C1016 ACSF: 0.14 g/L
Chlorhexidine scrub 2% Phoenix NDC 57319-611-09
Chlorhexidine solution Phoenix NDC 57319-599-09
Commercial dummy RWD Life Science 62004 Single_OD 0.20 mm/ M3.5/G = 0.5 mm
Commercial guide cannul RWD Life Science 62104 Single_OD 0.41 mm-27G/ M3.5/C = 2.5 mm 
Commercial injector RWD Life Science 62204 Single_OD 0.21 mm-33G/ Mates with M3.5/C = 3.5 mm/G = 0.5 mm
D-(+)-Glucose Sigma-Aldrich G8270 ACSF: 0.61 g/L
Dental acrylic HYGENIC n/a
Fixing screws RWD Life Science 62521
Fluoroshield mounting medium with DAPI Abcam AB104139
Horse serum ThermoFisher Scientific 16050130
Insulin syringes BBraun XG-LBB-9151133S-1BX 1 mL
Isoflurane  Panion & BF biotech DG-4900-250D
KCl  Sigma-Aldrich P3911 ACSF: 0.19 g/L
Ketoprofen  Swiss Pharmaceutical n/a
Lidocaine  AstraZeneca n/a
Low melting point agarose Invitrogen 16520
MgCl2  Sigma-Aldrich M8266 ACSF: 0.19 g/L
Microscope cover slips MARIENFELD 101242
Microscope slides ThermoFisher Scientific 4951PLUS-001E
Mineral oil light, white NF Macron Fine Chemicals MA-6358-04
NaCl  Sigma-Aldrich S9888 ACSF: 7.46 g/L
NaH2PO4  Sigma-Aldrich S8282 ACSF: 0.18 g/L
NaHCO3  Sigma-Aldrich S5761 ACSF: 1.76 g/L
n-butyl cyanoacrylate adhesive (tissue adhesive glue) 3M 1469SB 3M Vetbond
Neural tracer  Santa Cruz SC-358883 FluoroGold
Paraformaldehyde Sigma-Aldrich P6148
Polyethylene tube RWD Life Science 62329 OD 1.50, I.D 0.50 mm and OD 1.09, I.D 0.38 mm
Puralube Vet (eye) Ointment Dechra  12920060
Sodium acetate  Sigma-Aldrich S2889 SCFAs: 13.5 mM
Sodium azide  Sigma-Aldrich S2002
Sodium butyrate  Sigma-Aldrich B5887 SCFAs: 8 mM
Sodium propionate  Sigma-Aldrich P1880 SCFAs: 5.18 mM
Stainless guide cannula Chun Ta stainless steel enterprise CO., LTD. n/a OD 0.63 mm; Local vendor
Stainless injector Chun Ta stainless steel enterprise CO., LTD. n/a OD 0.3 mm; dummy is made from injector; local vendor
Superglue Krazy Glue KG94548R
Triton X-100 Merck 1.08603.1000
Equipment
Cannula holder RWD Life Science B485-68217
Ceiling camera FOSCAM R2
Digital stereotaxic instruments Stoelting 51730D
Dissecting microscope INNOVIEW SEM-HT/TW
Glass Bead Sterilizer RWD Life Science RS1501
Heating pad Stoelting 53800M
Leica microscope  Leica DM2500
Micro Dissecting Forceps ROBOZ RS-5136 Serrated, Slight Curve; Extra Delicate; 0.5mm Tip Width; 4" Length 
Micro Dissecting Scissors ROBOZ RS-5918 4.5" Angled Sharp
Microinjection controller World Precision Instruments (WPI) MICRO2T SMARTouch Controller
Microinjection syringe pump World Precision Instruments (WPI) UMP3T-1 UltraMicroPump3  
Microliter syringe Hamilton 80014 10 µL
Optical Fiber Cold Light with double Fiber Step LGY-150 Local vendor
Pet trimmer WAHL 09962-2018
Vaporiser for Isoflurane Step AS-01 Local vendor
Vibratome Leica VT1000S
Software
Animal behavior video tracking software Noldus EthoVision Version: 15.0.1416
Leica Application Suite X software Leica LASX Version: 3.7.2.22383

DOWNLOAD MATERIALS LIST

References

  1. Lynch, J. B., Hsiao, E. Y. Microbiomes as sources of emergent host phenotypes. Science. 365 (6460), 1405-1409 (2019).
  2. Dinan, T. G., Cryan, J. F. The microbiome-gut-brain axis in health and disease. Gastroenterology Clinics of North America. 46 (1), 77-89 (2017).
  3. Sharon, G., Sampson, T. R., Geschwind, D. H., Mazmanian, S. K. The central nervous system and the gut microbiome. Cell. 167 (4), 915-932 (2016).
  4. Krautkramer, K. A., Fan, J., Backhed, F. Gut microbial metabolites as multi-kingdom intermediates. Nature Reviews: Microbiology. 19 (2), 77-94 (2021).
  5. Lavelle, A., Sokol, H. Gut microbiota-derived metabolites as key actors in inflammatory bowel disease. Nature Reviews: Gastroenterology & Hepatology. 17 (4), 223-237 (2020).
  6. Dalile, B., Van Oudenhove, L., Vervliet, B., Verbeke, K. The role of short-chain fatty acids in microbiota-gut-brain communication. Nature Reviews: Gastroenterology & Hepatology. 16 (8), 461-478 (2019).
  7. Morais, L. H., Schreiber, H. L. T., Mazmanian, S. K. The gut microbiota-brain axis in behaviour and brain disorders. Nature Reviews: Microbiology. 19 (4), 241-255 (2021).
  8. Sharon, G., et al. Human gut microbiota from autism spectrum disorder promote behavioral symptoms in mice. Cell. 177 (6), 1600-1618 (2019).
  9. St Laurent, R., O'Brien, L. M., Ahmad, S. T. Sodium butyrate improves locomotor impairment and early mortality in a rotenone-induced Drosophila model of Parkinson's disease. Neuroscience. 246, 382-390 (2013).
  10. Govindarajan, N., Agis-Balboa, R. C., Walter, J., Sananbenesi, F., Fischer, A. Sodium butyrate improves memory function in an Alzheimer's disease mouse model when administered at an advanced stage of disease progression. Journal of Alzheimer's Disease. 26 (1), 187-197 (2011).
  11. Needham, B. D., et al. A gut-derived metabolite alters brain activity and anxiety behaviour in mice. Nature. 602 (7898), 647-653 (2022).
  12. Silva, Y. P., Bernardi, A., Frozza, R. L. The role of short-chain fatty acids from gut microbiota in gut-brain communication. Frontiers in Endocrinology. 11, 25 (2020).
  13. Kratsman, N., Getselter, D., Elliott, E. Sodium butyrate attenuates social behavior deficits and modifies the transcription of inhibitory/excitatory genes in the frontal cortex of an autism model. Neuropharmacology. 102, 136-145 (2016).
  14. Kelly, J. R., et al. Transferring the blues: Depression-associated gut microbiota induces neurobehavioural changes in the rat. Journal of Psychiatric Research. 82, 109-118 (2016).
  15. Wang, L., et al. Elevated fecal short chain fatty acid and ammonia concentrations in children with autism spectrum disorder. Digestive Diseases and Sciences. 57 (8), 2096-2102 (2012).
  16. Adams, J. B., Johansen, L. J., Powell, L. D., Quig, D., Rubin, R. A. Gastrointestinal flora and gastrointestinal status in children with autism--comparisons to typical children and correlation with autism severity. BMC Gastroenterology. 11, 22 (2011).
  17. Skonieczna-Zydecka, K., et al. Faecal short chain fatty acids profile is changed in Polish depressive women. Nutrients. 10 (12), 1939 (2018).
  18. Szczesniak, O., Hestad, K. A., Hanssen, J. F., Rudi, K. Isovaleric acid in stool correlates with human depression. Nutritional Neuroscience. 19 (7), 279-283 (2016).
  19. Martin, A. M., Sun, E. W., Rogers, G. B., Keating, D. J. The influence of the gut microbiome on host metabolism through the regulation of gut hormone release. Frontiers in Physiology. 10, 428 (2019).
  20. Franklin, K. B. J., Paxinos, G. Paxinos and Franklin's The Mouse Brain in Stereotaxic Coordinates. , Academic Press. (2013).
  21. York, J. M., Blevins, N. A., McNeil, L. K., Freund, G. G. Mouse short- and long-term locomotor activity analyzed by video tracking software. Journal of Visualized Experiments. (76), e50252 (2013).
  22. Berg, L., Gerdey, J., Masseck, O. A. Optogenetic manipulation of neuronal activity to modulate behavior in freely moving mice. Journal of Visualized Experiments. (164), e61023 (2020).
  23. Meyerhoff, J., et al. Microdissection of mouse brain into functionally and anatomically different regions. Journal of Visualized Experiments. (168), e61941 (2021).
  24. Needham, B. D., Kaddurah-Daouk, R., Mazmanian, S. K. Gut microbial molecules in behavioural and neurodegenerative conditions. Nature Reviews: Neuroscience. 21 (12), 717-731 (2020).
  25. Geiger, B. M., Frank, L. E., Caldera-Siu, A. D., Pothos, E. N. Survivable stereotaxic surgery in rodents. Journal of Visualized Experiments. (20), e880 (2008).
  26. Xiaoguang, W., et al. Establishment of a valuable mimic of Alzheimer's disease in rat animal model by intracerebroventricular injection of composited amyloid beta protein. Journal of Visualized Experiments. (137), e56157 (2018).
  27. Venniro, M., Shaham, Y. An operant social self-administration and choice model in rats. Nature Protocols. 15 (4), 1542-1559 (2020).
  28. Ucal, M., et al. Rat model of widespread cerebral cortical demyelination induced by an intracerebral injection of pro-inflammatory cytokines. Journal of Visualized Experiments. (175), e57879 (2021).
  29. Oberrauch, S., et al. Intraventricular drug delivery and sampling for pharmacokinetics and pharmacodynamics study. Journal of Visualized Experiments. (181), e63540 (2022).
  30. Shultz, S. R., et al. Intracerebroventricular injections of the enteric bacterial metabolic product propionic acid impair cognition and sensorimotor ability in the Long-Evans rat: further development of a rodent model of autism. Behavioural Brain Research. 200 (1), 33-41 (2009).
  31. Shultz, S. R., et al. Intracerebroventricular injection of propionic acid, an enteric metabolite implicated in autism, induces social abnormalities that do not differ between seizure-prone (FAST) and seizure-resistant (SLOW) rats. Behavioural Brain Research. 278, 542-548 (2015).
  32. Perry, R. J., et al. Acetate mediates a microbiome-brain-beta-cell axis to promote metabolic syndrome. Nature. 534 (7606), 213-217 (2016).
  33. Muller, P. A., et al. Microbiota modulate sympathetic neurons via a gut-brain circuit. Nature. 583 (7816), 441-446 (2020).
  34. Pardridge, W. M. CSF, blood-brain barrier, and brain drug delivery. Expert Opinion on Drug Delivery. 13 (7), 963-975 (2016).
  35. Wu, J. -T., et al. Oral short-chain fatty acids administration regulates innate anxiety in adult microbiome-depleted mice. Neuropharmacology. , (2022).
  36. Lee, J., et al. Gut microbiota-derived short-chain fatty acids promote poststroke recovery in aged mice. Circulation Research. 127 (4), 453-465 (2020).
  37. Chiu, C., et al. Temporal course of cerebrospinal fluid dynamics and amyloid accumulation in the aging rat brain from three to thirty months. Fluids Barriers CNS. 9 (1), 3 (2012).
  38. Schuler, B., Rettich, A., Vogel, J., Gassmann, M., Arras, M. Optimized surgical techniques and postoperative care improve survival rates and permit accurate telemetric recording in exercising mice. BMC Veterinary Research. 5, 28 (2009).
  39. Hurst, J. L., West, R. S. Taming anxiety in laboratory mice. Nature Methods. 7 (10), 825-826 (2010).
  40. Shuman, T., et al. Breakdown of spatial coding and interneuron synchronization in epileptic mice. Nature Neuroscience. 23 (2), 229-238 (2020).
  41. de Groot, A., et al. NINscope, a versatile miniscope for multi-region circuit investigations. Elife. 9, 49987 (2020).
  42. Kim, J. Y., Grunke, S. D., Levites, Y., Golde, T. E., Jankowsky, J. L. Intracerebroventricular viral injection of the neonatal mouse brain for persistent and widespread neuronal transduction. Journal of Visualized Experiments. (91), e51863 (2014).
  43. Wolter, J. M., et al. Cas9 gene therapy for Angelman syndrome traps Ube3a-ATS long non-coding RNA. Nature. 587 (7833), 281-284 (2020).
  44. Graybuck, L. T., et al. Enhancer viruses for combinatorial cell-subclass-specific labeling. Neuron. 109 (9), 1449-1464 (2021).
  45. Xie, M., et al. TREM2 interacts with TDP-43 and mediates microglial neuroprotection against TDP-43-related neurodegeneration. Nature Neuroscience. 25 (1), 26-38 (2022).
  46. Hsiao, E. Y., et al. Microbiota modulate behavioral and physiological abnormalities associated with neurodevelopmental disorders. Cell. 155 (7), 1451-1463 (2013).
  47. Bermudez-Martin, P., et al. The microbial metabolite p-Cresol induces autistic-like behaviors in mice by remodeling the gut microbiota. Microbiome. 9 (1), 157 (2021).
  48. Needham, B. D., et al. A gut-derived metabolite alters brain activity and anxiety behaviour in mice. Nature. 602 (7898), 647-653 (2022).
  49. Stewart Campbell, A., et al. Safety and target engagement of an oral small-molecule sequestrant in adolescents with autism spectrum disorder: an open-label phase 1b/2a trial. Nature Medicine. 28 (3), 528-534 (2022).
  50. Grienberger, C., Konnerth, A. Imaging calcium in neurons. Neuron. 73 (5), 862-885 (2012).
  51. Deisseroth, K. Optogenetics: 10 years of microbial opsins in neuroscience. Nature Neuroscience. 18 (9), 1213-1225 (2015).
  52. Roth, B. L. DREADDs for neuroscientists. Neuron. 89 (4), 683-694 (2016).
  53. Kaelberer, M. M., et al. A gut-brain neural circuit for nutrient sensory transduction. Science. 361 (6408), (2018).
  54. Needham, B. D., Tang, W., Wu, W. L. Searching for the gut microbial contributing factors to social behavior in rodent models of autism spectrum disorder. Developmental Neurobiology. 78 (5), 474-499 (2018).
  55. Schretter, C. E., et al. A gut microbial factor modulates locomotor behaviour in Drosophila. Nature. 563 (7731), 402-406 (2018).
  56. Chu, C., et al. The microbiota regulate neuronal function and fear extinction learning. Nature. 574 (7779), 543-548 (2019).
  57. Wu, W. L., et al. Microbiota regulate social behaviour via stress response neurons in the brain. Nature. 595 (7867), 409-414 (2021).
  58. Buchanan, K. L., et al. The preference for sugar over sweetener depends on a gut sensor cell. Nature Neuroscience. 25 (2), 191-200 (2022).
  59. Han, W., et al. A neural circuit for gut-induced reward. Cell. 175 (3), 665-678 (2018).
  60. Yamawaki, Y., et al. Antidepressant-like effect of sodium butyrate (HDAC inhibitor) and its molecular mechanism of action in the rat hippocampus. World Journal of Biological Psychiatry. 13 (6), 458-467 (2012).
  61. Ho, L., et al. Protective roles of intestinal microbiota derived short chain fatty acids in Alzheimer's disease-type beta-amyloid neuropathological mechanisms. Expert Review of Neurotherapeutics. 18 (1), 83-90 (2018).
  62. Liu, J., et al. Anti-neuroinflammatory effect of short-chain fatty acid acetate against Alzheimer's disease via upregulating GPR41 and inhibiting ERK/JNK/NF-kappaB. Journal of Agricultural and Food Chemistry. 68 (27), 7152-7161 (2020).
  63. van de Wouw, M., et al. Short-chain fatty acids: microbial metabolites that alleviate stress-induced brain-gut axis alterations. Jounal of Physiology. 596 (20), 4923-4944 (2018).
  64. Olson, C. A., et al. The gut microbiota mediates the anti-seizure effects of the ketogenic diet. Cell. 173 (7), 1728-1741 (2018).
  65. Stewart Campbell, A., et al. Safety and target engagement of an oral small-molecule sequestrant in adolescents with autism spectrum disorder: an open-label phase 1b/2a trial. Nature Medicine. 28 (3), 528-534 (2022).

Tags

Nörobilim Sayı 184
Serbestçe Hareket Eden Farelerde Bağırsak Kaynaklı Mikrobiyal Metabolitlerin İntraserebroventriküler Verilmesi
Play Video
PDF DOI DOWNLOAD MATERIALS LIST

Cite this Article

Liou, C. W., Yao, T. H., Wu, W. L.… More

Liou, C. W., Yao, T. H., Wu, W. L. Intracerebroventricular Delivery of Gut-Derived Microbial Metabolites in Freely Moving Mice. J. Vis. Exp. (184), e63972, doi:10.3791/63972 (2022).

Less
Copy Citation Download Citation Reprints and Permissions
View Video

Get cutting-edge science videos from JoVE sent straight to your inbox every month.

Waiting X
Simple Hit Counter