Summary
CAM-Delam-analysen för att utvärdera cancercellernas metastatiska kapacitet är relativt snabb, enkel och billig. Metoden kan användas för att reda ut de molekylära mekanismer som reglerar metastaseringsbildning och för läkemedelsscreening. En optimerad analys för analys av humana tumörprover kan vara en klinisk metod för personlig cancerbehandling.
Abstract
Den främsta orsaken till cancerrelaterade dödsfall är metastasering (dvs. när cancerceller sprider sig från den primära tumören till avlägsna organ och bildar sekundära tumörer). Delaminering, definierad som nedbrytningen av basallamina och källarmembran, är den initiala processen som underlättar transmigration och spridning av cancerceller till andra vävnader och organ. Att poängsätta cancercellernas delamineringskapacitet skulle indikera den metastatiska potentialen hos dessa celler.
Vi har utvecklat en standardiserad metod, ex ovo CAM-Delam-analysen, för att visualisera och kvantifiera cancercellers förmåga att delaminera och invadera och därigenom kunna bedöma metastatisk aggressivitet. Kortfattat inkluderar CAM-Delam-metoden sådd av cancerceller i silikonringar på chick chorioallantoic membranet (CAM) vid embryonal dag 10, följt av inkubation från timmar till några dagar. CAM-Delam-analysen inkluderar användning av en inre fuktad kammare under inkubation av kycklingembryon. Detta nya tillvägagångssätt ökade embryoöverlevnaden från 10% -50% till 80% -90%, vilket löste tidigare tekniska problem med låg embryoöverlevnad i olika CAM-analyser.
Därefter isolerades, fixerades och frystes CAM-proverna med associerade cancercellkluster. Slutligen visualiserades och analyserades kryostatsektionerade prover för källarmembranskador och cancercellsinvasion med hjälp av immunhistokemi. Genom att utvärdera olika kända metastatiska och icke-metastatiska cancercellinjer utformade för att uttrycka grönt fluorescerande protein (GFP) visade CAM-Delam kvantitativa resultat att delamineringskapacitetsmönstren återspeglar metastatisk aggressivitet och kan poängsättas i fyra kategorier. Framtida användning av denna analys, förutom att kvantifiera delamineringskapacitet som en indikation på metastatisk aggressivitet, är att avslöja de molekylära mekanismerna som styr delaminering, invasion, bildandet av mikrometastaser och förändringar i tumörmikromiljön.
Introduction
Cirka 90% av dödligheten hos cancerpatienter orsakas av konsekvenserna av cancermetastaser, vilket är bildandet av sekundära tumörer i andra delar av kroppen varifrån cancern ursprungligen härstammar1. Det är därför av vikt att identifiera metastatiska relaterade mekanismer för att hitta potentiella mål för att undertrycka bildandet av tumörmetastaser. Därefter finns det ett behov av modellsystem där den metastatiska processen kan utvärderas.
Under metastasering genomgår cancerceller epitelial-till-mesenkymal övergång (EMT), en normal cellulär process där epitelceller förlorar sin vidhäftning och polaritetsegenskaper och istället förvärvar en invasiv mesenkymal karaktär2. Delaminering är en del av EMT-processen och involverar nedbrytning av laminin i källarmembranet, vilket är en förutsättning för cancerceller att lämna den primära tumören och invadera andra vävnader. De viktigaste faktorerna som uppregleras under metastaseringsbildning inkluderar matrismetalloproteinaser (MMP), ADAM (ett disintergin och metalloproteinas), ADAMTS (ADAM med trombospondinmotiv) och MMP av membrantyp (MT-MMP)3,4. Dessa faktorer bryter ner molekyler som laminin, som uttrycks i alla källarmembran, för att underlätta cellmigration och invasion.
Det korioallantoiska membranet (CAM) hos ett befruktat kycklingägg är en typ av källarmembran. Befruktade kycklingägg har använts som metastatiska modeller, där cancerceller har såtts på den extraembryoniska CAM och senare metastaseringsbildning som observerats i kycklingembryon5. Dessutom används ofta in vivo musmetastatiska modeller, där cancerceller implanteras i mössen och metastaser i olika organ analyseras6. Detta tillvägagångssätt är tidskrävande, dyrt och kan orsaka obehag för djuren. För att ta itu med detta har vi utvecklat CAM-Delam-analysen, en snabbare och billigare modell för att utvärdera cancercellernas metastatiska aggressivitet. I denna modell kombineras cancercellernas förmåga att bryta ner kycklingen CAM (t.ex. delamineringskapaciteten) med potentiell cancercellsinvasion i mesenkymet och används som ett mått på metastatisk aggressivitet.
Den här artikeln, baserad på en tidigare publikation7, beskriver CAM-Delam-analysen i detalj, från hantering av befruktade kycklingägg, cancercellodling och sådd, dissektion och analyser av CAM-prover, till poängsättning av cancercellernas delamineringskapacitet i fyra kategorier: intakt, förändrad, skadad och invasion. Vi ger också exempel på hur denna analys kan användas för att bestämma de molekylära mekanismer som reglerar delamineringsprocessen.
Protocol
I korthet sammanfattar figur 1 de övergripande stegen i CAM-Delam-analysen. Nedanstående protokoll är baserat på 30 odlade befruktade kycklingägg och användningen av två olika cancercellinjer sådda separat i tre ringar / ägg och analyserade vid fyra tidpunkter.
1. Ägginkubation
- Använd befruktade kycklingägg från ett lokalt kläckeri, vilket garanterar över 90% befruktning
OBS: Äggen bör inte ha förvarats i mer än 4 dagar vid rumstemperatur (RT). I Sverige krävs etiskt tillstånd för experimentell användning av embryonala kycklingar först från och med dag (E) 14 och framåt. - Torka försiktigt av smuts eller fjädrar på äggen mekaniskt med en torr pappershandduk eller våt i vatten.
- Rengör och sterilisera ägginkubatorn med 70% etanol före användning (varje gång).
- Placera önskat antal ägg i äggbrickor och inkubera kycklingäggen horisontellt i en ägginkubator vid 37,5-38 °C med 70 % luftfuktighet. Betrakta detta som inkubationsdag 0 (figur 1A).
2. Förberedelse av vägningsbåt, plastlådor och dissektionsinstrument
- Använd 70% etanol för att sterilisera 30 vägningsbåtar och 30 små plastlådor (~ 0,4 L) med transparenta lock.
- Torka vägningsbåtarna och lådorna i en laminär huva över natten (ON) och förvara i en sluten plastlåda tills vidare användning på inkubationsdag 3.
- Sterilisera 2 liter destillerat eller avjoniseratH2Oper 30 inkuberade ägg.
- Sterilisera två par saxar och tre par pincett genom att spruta 70% etanol. Lufttorka instrumenten och förvara dem sedan i en steriliserad låda fram till inkubationsdag 3.
OBS: Dessa åtgärder (steg 2.1-2.4) kan göras vilken dag som helst före inkubationsdag 3. Använd handskar för att undvika kontaminering.
3. Öppna äggen och överför till den inre fuktade kammaren
OBS: Använd handskar och ansiktsmask för att undvika kontaminering.
- Tillsätt cirka 50 ml steriliseradH2Otill de steriliserade plastlådorna. Förvara de vattenfyllda lådorna med stängda lock, för att undvika kontaminering, vid RT tills de används.
- På inkubationsdag 3, spricka äggskalet med den skarpa delen av saxen och skär en rak öppning i skalet.
- Bryt upp äggskalet manuellt över en vägningsbåt och samla äggvitan, äggulan och dess fästa friska embryo i vägningsbåten (figur 1B). Leta efter ett intakt embryo med ett bultande hjärta, intakt äggula och utvecklade blodkärl för experimentet (>95% av de inkuberade äggen). Kassera ägg med ett missbildat embryo, ett embryo utan ett bultande hjärta, en trasig äggula eller skadade äggula blodkärl.
- Överför försiktigt vägningsbåten till en inre fuktad kammare.
OBS: För steg 3.2.-3.4., arbeta så snabbt som möjligt för att undvika kontaminering och använd om möjligt en laminär huva. - Inkubera den inre fuktade kammaren i ägginkubatorn (figur 1C).
- Odla de skallösa äggen från dag 3 till dag 10 i ägginkubatorn innan de används (se steg 3.6.), och tillsätt vid behov vatten till inkubatorn för att bibehålla 70% luftfuktighet.
- Kontrollera de inre fuktade kamrarna genom det genomskinliga plastlocket för döda embryon eller förorenade skallösa ägg varje dag och ta bort dem från inkubatorn.
4. Beredning av silikonringar
- För att förbereda silikonringar, skär ett silikonrör med en inre och yttre diameter på 4 mm respektive 5 mm i ~ 1 mm tjocklek, helst med en pappersskärare (figur 1D).
- Överför silikonringarna till små glasflaskor (figur 1D), täck med metallfolie och sterilisera dem med en autoklav eller liknande.
OBS: Undvik upprepad autoklavering av oanvända silikonringar som kan vara förorenade, eftersom sådan behandling minskar silikonringarnas kapacitet att fästa vid membranet, med efterföljande läckage av cancercellen / kollagen / RPMI-lösningen utanför ringarna. - Förvara de sterila silikonringarna på RT.
OBS: Detta steg kan göras vilken dag som helst före inkubationsdag 10.
5. Beredning av cancerceller
OBS: Lösningar som cellodlingsmedium, trypsin och 1x PBS förvaras vid 4 °C och bör värmas upp till 37 °C i ett vattenbad innan de tillsätts till cellerna. Skölj flaskorna i 70% etanol efter uppvärmning och torka före användning.
- Odla de cancercellinjer som är av intresse för det relevanta odlingsmediet i en cellodlingsinkubator vid 37 °C i närvaro av 5 % (v/v)CO2.
OBS: Här odlades U251-GFP glioblastom och PC-3U-GFP prostatacancerceller i komplett RPMI medium-RPMI-medium kompletterat med 10% (v / v) fetalt bovint serum (FBS) och 1% (v / v) penicillin-streptomycin (PS). - Planera odlingen av cancerceller så att cirka 50 × 106 cancerceller är redo för skörd på inkubationsdag 10 i CAM-Delam-analysen.
- Byt cellodlingsmedium var 2-3: e dag, eller när medelfärgen ändras från rosa till orange / gul.
- Valfritt: Inducera hypoxi genom att behandla cancercellerna med CoCl2 för att undersöka de molekylära mekanistiska effekterna på delaminering 1 dag före cellskörd.
VARNING: CoCl2 har måttlig toxicitet. Hantera försiktigt i en dragskåp och följ tillverkarens instruktioner.- Förbered färsk 20 mM CoCl2-stamlösning genom att lösa upp 0,0258 g i 10 ml steriliserad destillerad H20 i ett 15 ml koniskt rör insvept med aluminiumfolie för att skydda mot ljus.
- Blanda 250 μl av 20 mMCoCl 2-stamlösningen i 25 ml RPMI-medium kompletterat med 1% (v / v) PS (men utan FBS) per cellodlingsskål med en diameter på 50 ml. Vortex försiktigt.
- Ta bort hela RPMI-mediet från cellodlingsskålarna.
- Tvätta cellerna med steriliserad 1x PBS 2x.
- Tillsätt 25 ml RPMI-medium med 200 μM CoCl 2-cellstrypsinisering (se steg 5.6).
- På ägginkubationsdag 10, förbered 1 ml av en kollagen / RPMI-blandning (förhållande 1: 3), innehållande 250 μL kollagen av typ I (5 mg / ml) och 750 μL cellodling RPMI-medium kompletterat med 10% FBS och 1% (v / v) PS. Förvara kollagen / RPMI-blandningen på is.
- Trypsinisera cancercellerna för att isolera cellerna genom att först ta bort cellodlingsmediet och tvätta 2x med 1x PBS.
- Tillsätt 3 ml trypsinlösning (0,05%) per cellodlingsskål med en diameter på 15 cm och inkubera i 2-3 minuter i en cellodlingsinkubator tills cellerna lossnar. Använd ett bordsskiva, inverterat mikroskop för att se de fristående cellerna. Om det behövs, knacka försiktigt på sidan av kolven för att lossa återstående klustrade eller fästa celler.
- Inaktivera trypsin genom att tillsätta 5 ml komplett RPMI-medium till varje cellodlingsskål och samla cellsuspensionen från alla cellodlingsrätter i ett 50 ml rör.
- Räkna cancercellerna med Trypan Blue-uteslutningsmetoden för att skilja levande från döda celler med hjälp av en cellräknare. Tillsätt 10 μL av cellsuspensionen till 10 μL 0,4% trypanblå fläck. Blanda provet genom att pipettera upp och ner några gånger och ladda sedan 10 μL av cellblandningen per kammare i provglaset i cellräknaren. Upprepa cellräkning 3x för att verifiera cellnumret / ml.
- Beräkna och centrifugera rätt volymcellodlingssuspension innehållande 50 x 106 levande cancerceller i ett 50 ml rör vid 500 × g i 5 min.
- Kassera supernatanten och blanda cellpelleten med 1 ml kollagen/RPMI-blandning. Eftersom kollagen är ett gelatinöst material, blanda cellerna mycket långsamt och försiktigt med en 1 ml pipett för att undvika att förlora celler vid bildandet av bubblor.
- Förvara den beredda cellsuspensionen på is och ta den till äggets arbetsområde.
OBS: Undvik att hålla de beredda cancercellerna på is för länge. De beredda cancercellerna måste placeras på CAM inom 15-25 minuter.
6. Sådd av cancercellerna på CAM
OBS: Använd handskar och ansiktsmask för att undvika kontaminering.
- Vid inkubationsdag 10, ta ut de inre fuktade kamrarna med de inkuberade skallösa äggen från inkubatorn.
OBS: Cirka 90% av det ursprungliga antalet inkuberade ägg kan användas; Se figur 2. - Öppna den inre fuktade kammaren och placera upp till sex silikonringar på CAM med steriliserade pincett.
OBS: Undvik att placera silikonringarna nära varandra eller nära större blodkärl. - Blanda cancercellsuspensionen genom pipettering för att få en jämn fördelning av cancerceller och tillsätt 20 μL (1 × 106 celler) av den beredda cancercellsuspensionen inuti en silikonring (figur 1E). När du lägger till cellerna, håll pipettspetsen ovanför CAM för att se till att inte skada membranet.
OBS: Enligt tidigare fynd7 kan olika cancerceller sås i separata ringar på samma CAM. - Stäng den inre fuktade kammaren och lägg den i ägginkubatorn.
7. Isolering av CAM med associerade cancerceller
- Efter 14 timmar, 1,5 dagar, 2,5 dagar och 3,5 dagars inkubation, ta ut cirka sju inre fuktade kamrar och öppna locken en i taget.
- Dissekera med en sax de odlade cancercellerna som är fästa vid CAM (så kallade CAM-Delam-prover) genom att skära utanför silikonringen (figur 1F).
- Överför omedelbart det isolerade CAM-Delam-provet med pincett till 4% paraformaldehyd (PFA) i 0,1 M fosfatbuffert (PB) i en petriskål för fixering av vävnaden. Förvaras på is eller vid 4 °C i 1 timme.
OBS: Förvara 4% PFA-lösning vid 4 °C i högst 5 dagar. VARNING: PFA är giftigt. Vid hantering av PFA-pulver och PFA-lösningar, använd dragskåp och använd ansiktsmask och handskar. Undvik att andas in pulver eller lösningsångor. Följ tillverkarens instruktioner. - Halshugga kycklingembryon och kassera som biologiskt avfall i specifika behållare.
- Ta bort 4% PFA-lösningen och tillsätt 30% sackaros i 0,1 M PB till CAM-Delam-proverna och balansera vid 4 °C i 1 timme.
- Under ett dissektionsmikroskop, ta försiktigt bort silikonringen med pincett. Skär CAM-Delam-provet med en sax i rektangulär form med cancercellerna i mitten (figur 1G).
- Överför CAM-Delam-proverna med ett par pincett till fryst sektionsmedium i en petriskål för att ta bort överflödig sackaros och sedan till inbäddningsformar i fryst sektionsmedium.
- Under ett dissektionsmikroskop placerar du CAM-Delam-provet i en U-form i vertikal riktning i inbäddningsformarna med valfritt nålliknande instrument (figur 1G).
- Frys in och förvara CAM-Delam-proverna vid −80 °C.
8. Sektionering av CAM-Delam-prover
- Sektionera de frysta CAM-Delam-proverna vid 10 μm på 5-6 på varandra följande bilder med kryosektionering.
- Förvara diabilderna med sektioner vid −80 °C eller använd direkt för färgning av immunhistokemi.
9. Färgning av immunhistokemi
- Ta ut diabilderna från −80 °C till RT i 5 minuter innan du startar immunoprotokolet.
- Gör en linje med en hydrofob markör på bilderna där sektionerna slutar. Låt dem torka i några minuter.
- Placera objektglasen i en fuktad (H2O) kammare och täck sektionerna med ~ 200-500 μL blockerande lösning (10% fetalt kalvserum och 0,1% natriumazid i Tris-buffrad saltlösning med 0,1% Triton X-100 [TBST]) och inkubera i 15-30 min.
OBS: Från och med detta steg, låt inte bilderna torka när som helst. - Häll av blockeringslösningen och ersätt den med 100–150 μl av den primära antikroppen utspädd i blockeringslösningen och inkubera ON vid 4 °C. Använd helst kanin-anti-laminin-111-antikropp för att definiera basallamina tillsammans med en cancercellmarkör, om du inte använder GFP eller andra fluorescerande taggade cancercellinjer.
OBS: Här användes också en kanin-anti-von Willebrand Factor för att upptäcka blodkärl i CAM. - Förbered tre glaskuvetter fyllda med TBST-buffert.
- Häll av den primära antikroppslösningen, överför bilderna till glaskuvetterna och tvätta minst 3x i 5 minuter vardera i TBST.
- Ta bort överflödig TBST från bilden och från det hydrofoba barriärområdet med en mjuk pappersvävnad.
- Täck utstrykningsglaset med 100–150 μl av en lämplig sekundär fluorescerande antikropp utspädd i blockerande lösning i kombination med 4',6-diamidino-2-fenylindol, dihydroklorid (DAPI) och inkubera i mörker vid RT i 1 timme.
- Häll av den sekundära antikroppslösningen, överför bilderna till glaskuvetterna och tvätta minst 3x i 5 minuter vardera i TBST.
- Ta bort överflödig TBST från bilden och från det hydrofoba barriärområdet med en mjuk pappersvävnad.
- Montera bilderna genom att sätta 1-2 droppar fluorescerande monteringsmedium på bilden och placera försiktigt ett glasöverdrag och undvik luftbubblor.
- Låt objektglasen torka i minst 1 timme vid 4 °C innan du analyserar och förvara objektsglasen 4 °C.
10. Mikroskopiavbildning och delamineringspoäng
- Fotografera sektionerna med ett epifluorescensmikroskop utrustat med en digitalkamera, helst med 10x förstoring (figur 1H).
- Analysera avsnitten med hjälp av följande CAM-Delam-poängkategorier (bild 3):
- Leta efter intakt basal lamina utan synliga förändringar.
- Leta efter förändrad men oskadad basal lamina.
- Leta efter skadad basal lamina utan cellinvasion.
- Leta efter skadad basal lamina med cellinvasion.
Representative Results
I figur 1 visas viktiga steg i CAM-Delam-analysen7. Användningen av inre fuktade kammare (figur 1C) förbättrade signifikant överlevnadsgraden för kycklingembryon från <50% upp till 90% vid inkubationsdag 10 och från ~ 15% upp till 80% vid inkubationsdag 13 (figur 2).
Figur 1: Viktiga steg i CAM-Delam-analysen (A) Inkubera befruktade kycklingägg horisontellt utan rotation. (B,C) På dag 3 av inkubationen, knäcka äggen och placera dem i sterila vägningsbåtar (B) och placera båtarna i en inre fuktad kammare för ytterligare inkubation (C). (D) Förbered silikonringar. (E) På dag 10 av inkubationen, placera silikonringarna på CAM och frö 1 x 106 cancerceller inuti ringarna med hjälp av en pipett. (F,G) Vid olika tidpunkter (timmar till dagar), dissekera CAM med bifogade cancerceller, (F) fixa i PFA, behandla med sackaros, placera i fruset sektionsmedium, (G) och frys i −80 ° C. (H) Ett exempel på en snittad CAM med tillhörande GFP + cancerceller (grön) och lamininimmunhistokemi färgning (röd). Skalstänger = 2 mm (E,F), 1 mm (G) och 100 μm (H). Denna siffra är från Palaniappan et al.7. Förkortningar: CAM = korioallantoiskt membran; PFA = paraformaldehyd; GFP = grönt fluorescerande protein. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Kycklingembryons överlevnad i förhållande till inkubationsmetoden (A,B) På inkubationsdag 10 fördubblades kycklingembryons överlevnad i inre HC (medelvärde 89,33; N = 105) jämfört med inkubation i petriskålar (A; medelvärde 40; N = 64) och icke-fuktiga kamrar (B; medelvärde 48,67; N = 46). (C,D) På inkubationsdag 13 observerades fortfarande en hög överlevnad med användning av HC (medelvärde 81,67; N = 105), medan en stor minskning av embryoöverlevnaden noterades med PD (C; medelvärde 11,33; N = 64) och N-HC (D; medelvärde 18,33; N = 46). Statistisk signifikans testades med hjälp av ett oparat tvåsidigt t-test. Felstaplarna anger standardavvikelsen. *p < 0,05, **p < 0,01, ***p < 0,001. Denna siffra modifierades från Palaniappan et al.7. Förkortningar: HC = fuktad kammare; PD = Petriskålar; N-HC = icke-fuktad kammare; E X = Inkubationsdag X. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Analyser av olika cancercellinjer som uttrycker GFP (U251 glioblastom, PC-3U prostata, SW620 kolon och A549 lunga) med hjälp av detta protokoll rapporterades tidigare av Palaniappan et al.7. Resultaten från CAM-Delam-analysen inkluderar skillnader i morfologi hos basallamina, detekterad av laminin, och cancercellsinvasion, definierad som celler som har korsat chick basal lamina-skiktet i chick mesodermalskiktet (Figur 3). Dessa resultat visar att cancercellernas förmåga att bryta ner basal lamina och invadera mesenkymet kan poängsättas i en av fyra kategorier: 1) intakt basal lamina utan synliga förändringar (figur 3B), 2) förändrad men oskadad basal lamina (figur 3C), 3) skadad basal lamina utan cellinvasion (figur 3D) och 4) skadad basal lamina med cellinvasion (figur 3E ). En annan observation var att när cancerceller orsakade en förändrad eller skadad basal lamina, förtjockades CAM också med en ökning av blodkärlsbildning, definierad av antikroppsfärgning mot von Willebrands faktor, som syntetiseras i blodkärl8 (figur 4C-H). Dessa två fenotyper, en förtjockad CAM och ökad bildning av blodkärl, observerades inte när CAM var intakt (figur 4A,B).
(A-E) Ett CAM-Delam-poängexempel baserat på integriteten hos CAM-basallamina, visualiserad av anti-laminin (röd) och potentiell invasion av GFP-uttryckande cancerceller (grön). (A) Kontrollera CAM utan cancerceller. (B-E) I svaren på cancerceller kan fyra kategorier som beskriver morfologin hos basallamina poängsättas: (B) intakt laminin, (C) förändrat men oskadat laminin (indikerat med en asterisk), (D) skadat laminin men utan cancercellsinvasion (pilar), skadat laminin med cellinvasion (pilspetsar). Skalstreck = 100 μm (A-E). Denna siffra är från Palaniappan et al.7. Förkortningar: CAM = korioallantoiskt membran; GFP = grönt fluorescerande protein. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Utvärdering av CAM-förtjockning och blodkärlsbildning. (A-H) Ett exempel på visualisering av CAM-förtjockning och blodkärlsbildning, detekterad av anti-Von Willebrand Factor (röd), som svar på lamina av olika cancercelltyper. (A,B) Kontrollera CAM utan cancerceller. (C,D) Som svar på en icke-metastaserad cancercellinje (poängsatt som Intakt) upptäcktes ingen uppenbar förtjockning av mesenkymet eller ökad blodkärlsbildning. (E-H) Som svar på metastaserande cancerceller som resulterade i förändrat eller skadat Laminin förtjockades mesenkymet (indikerat med dubbla pilspetsar) och ökad blodkärlsbildning observerades (indikerad med pilar). Skalstreck = 100 μm. Denna siffra modifierades från Palaniappan et al.7. Förkortningar: CAM = korioallantoiskt membran; GFP = grönt fluorescerande protein. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
U251 glioblastom och PC-3U prostatacancerceller är två exempel på cancercellinjer med helt olika delamineringskapacitet (figur 5). PC-3U-celler inducerade skadat laminin efter 1,5 dagar, med tydlig invasion efter 2,5 dagar (figur 5A). Däremot inducerade U251-celler endast mindre förändringar av laminin efter 1,5-3,5 dagar men orsakade aldrig någon synlig skada på laminin (figur 5B).
Figur 5: Visualisering av delamineringskapaciteten hos prostatacancer (PC-3U) och glioblastom (U251) cancerceller. (B) U251-celler orsakade mindre förändring av laminin efter 1,5-3,5 dagar. De högra panelerna visar grafer som representerar CAM-Delam-poängen. Y-axeln anger antalet prover och x-axeln anger kulturens tidpunkter. Skalstreck = 100 μm (A,B). Denna siffra modifierades från Palaniappan et al.7. Förkortningar: CAM = korioallantoiskt membran; GFP = grönt fluorescerande protein. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
CAM-Delam-analysen kan användas för att definiera molekylära mekanismer som reglerar delamineringsprocessen. Ett exempel är användningen av CoCl2-behandling för att inducera hypoxi med eller utan kombinationen av hämmande matrismetalloproteinaser (MMP) med användning av den breda MMP-hämmaren GM6001 (figur 6). Efter Behandling med CoCl2 förvärvade U251 icke-metastatiska cancerceller förmågan att inducera delaminering och invasiva celler, vilket undertrycktes när CoCl2-behandling kombinerades med MMP-hämmaren GM6001 (figur 6). Således kan CAM-Delam-analysen vara användbar när man definierar molekyler och molekylära vägar som påverkar delamineringsprocessen.
Figur 6: Delamineringsmönster som svar på U251-celler exponerade förCoCl2 ensam eller tillsammans med en MMP-hämmare. (A-C) U251-celler odlade i 3,5 dagar på CAM under olika förhållanden. (A) U251-celler som odlades ensamma inducerade inte någon skada på laminin. (B) Odlade U251-celler preexponerade tillCoCl2 (24 timmar) före tvättning och cellsådd på CAM-inducerad lamininskada och cellinvasion. (C) Förbehandling med en bredspektrum MMP-hämmare GM6001 (i 1 timme), följt av CoCl2-exponering (24 timmar) före tvättning och sådd av U251-celler på CAM, undertryckte effekten av CoCl2-behandlingen och ingen uppenbar lamininskada eller cancercellsinvasion upptäcktes. Skalstreck = 100 μm (A-C). Panelerna (B) och (C) är från Palaniappan et al.7. Förkortningar: CAM = korioallantoiskt membran; GFP = grönt fluorescerande protein; CoCl2 = koboltklorid; MMP = matrismetalloproteinas. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Discussion
Detta papper beskriver CAM-Delam-analysen för att utvärdera cancercellernas metastatiska aggressivitet, bestämd genom att göra basala lamina-modulationer och potentiell cellinvasion i mesenkymet inom en period av timmar till några dagar. Ett tidigare tekniskt problem för olika CAM-analyser har varit den låga överlevnaden av kycklingembryon. Denna fråga löstes genom att införa användningen av en inre fuktad kammare under embryoinkubation, vilket ökade embryoöverlevnaden från 10% -50% till 80% -90%7. Användningen av en inre fuktad kammare kan därför vara värdefull i CAM-analyser i allmänhet, liksom i andra ex ovo chick-experiment.
De presenterade poängtidspunkterna vid 14 timmar, 1,5 dagar, 2,5 dagar och 3,5 dagar efter sådd av 1 x 106 cancerceller på CAM är baserade på rigorös metodutveckling med sex olika cancercellinjer och är tillräckliga för att skilja intervallet från icke-delaminering till delaminering med invasionskapacitet hos cancercellinjer. En minsta användning av fyra ägg med tre ringar i varje per tidpunkt och per cellinje föreslås, och detta bör upprepas minst en gång eller enligt experimentella mönster och statistiska krav. En fördel med CAM-Delam-analysen är att få informativa resultat angående cancercellernas delamineringskapacitet inom några dagar för att uppskatta cancercellernas aggressivitet och potentiella risk för metastaseringsbildning. Den snabba leveransen av resultat underlättas genom att övervaka nedbrytningen av basallamina på grund av de invaderande cancercellerna och de efterföljande mikrotumörerna / tumörknopparna och organmetastaserna. Traditionellt har CAM-modeller använts för att analysera bildandet av organmetastaser, vilket tar cirka 2 veckor att bestämma9. Genom att använda sju olika cancercellinjer har vi tidigare verifierat7 att delamineringspoängen är kopplad till cancercellernas förmåga att bilda metastaser i gnagarmodellerna10,11,12,13,14, vilket stöder det prediktiva värdet av CAM-Delam-analysen. Dessutom kräver musmodeller en ännu längre tid, flera veckor upp till månader, innan metastaser kan undersökas15,16. I korthet är denna utvecklade CAM-Delam-analys, fokuserad på att poängsätta delamineringskapacitet och inte på att undersöka senare tumörbildning i kycklingembryomet, därför ett bra komplement till befintliga kyckling CAM-invasions- och mustumörmodeller.
En begränsning i CAM-Delam-analysen kan vara den oklara visualiseringen av basallamina om cancercellerna själva uttrycker laminin. Om så är fallet kan andra markörer som indikerar basallamina, såsom E-cadherin, användas7. Andra CAM-invasionsstudier har använt kollagen av typ IV för att visualisera CAM och pan-cytokeratin och vimentin för att identifiera invaderande cancerceller och bildandet av mikrotumörer / tumörknoppar17,18.
Delaminering är en normal cellulär process, både under utveckling och senare i livet, vilket gör det möjligt för celler att lämna ett epitel och migrera till andra vävnader. Exempel på delaminerande celler under utveckling är neuralkam och olfaktoriska banbrytande nervceller19,20; senare i livet är sårläkning beroende av delaminering21. Under cancer, denna process är uppreglerad i fel celler och / eller vid fel tidpunkt. Cam-Delam-metoden kan således vara till nytta för att reda ut de molekylära mekanismer som reglerar delaminering, vilket skulle vara av betydelse för både grundläggande biologisk kunskap och sjukdomskunskap. Sådana delamineringsstudier skulle inkludera att lägga till faktorer av intresse för cancercellerna som utsädes på CAM eller studera genetiskt modifierade cancerceller. Ett exempel som presenteras här är CoCl 2-förbehandling av den icke-metastatiska cellinjen U251 för att inducera hypoxi, vilket leder till induktion av en metastatisk aggressiv kapacitet som kan undertryckas av en bredspektrum MMP-hämmare. Att hitta nyckelmolekyler som styr delaminering ökar således möjligheten att utforma hämmare för att undertrycka denna process. I förhållande till detta är en annan potentiell användning för CAM-Delam-protokollet vid läkemedelsscreening för undertryckande av delaminering och cellinvasion. Dessutom är utvärderingen av cancerns svårighetsgrad i kliniken en kritisk komponent för diagnos, planering av behandling och vård. För närvarande är TNM-staging-systemet (T, tumörstorlek; N, nod-om cancern har spridit sig till lymfkörtlarna; M, avlägsen metastasering) används för att utvärdera svårighetsgraden av cancer22. CAM-Delam-analysen definierar ett innovativt tillvägagångssätt för att utvärdera cancercellernas aggressivitet och potentiell risk för metastasering och kan vara ett användbart komplement till TNM-system. Anmärkningsvärt är att TNM-staging baseras på analyser av fasta vävnadsprover, medan en potentiell klinisk CAM-Delam-metod skulle undersöka färsk eller färskfryst vävnad i kombination med tekniker för att återuppliva frysta celler23.
Disclosures
Författarna har inga konkurrerande intressen att avslöja.
Acknowledgments
Vi tackar följande forskare vid Umeå universitet för deras hjälp med relevanta cancercellinjer och antikroppar: L. Carlsson (von Willebrand Factor-antikropp), J. Gilthorpe (U251) och M. Landström (PC-3U). Vi tackar också Hauke Holthusen i Gilthorpe-labbet för genereringen av den stabila cellinjen HEK293-TLR-AAVS1. Arbetet i Gunhagalaboratoriet stöddes av Cancerfonden (18 0463), Umeå Biotech Incubator, Norrlands Cancerforskningsfond, Vetenskapsrådet (2017-01430) och Medicinska fakulteten vid Umeå universitet.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| EQUIPMENT | |||
| Centrifuge | Rotanta 480 R, Hettich zentrifugen | ||
| Countess II FL Automated Cell Counter | Invitrogen | ||
| Cryostat | HM 505 E, Microm | ||
| Digital camera | Nikon DS-Ri1 | ||
| Dissection Microscope | Leica M10 | For CAM-sample dissection and positioning in molds | |
| Egg incubator | Fiem | Many other sources are available. Must be cleaned and sterilized with 70 % ethanol before each use | |
| Epifluorescence microscope | Nikon Eclipse, E800 | Equiped with a digital camera, for scoring delamination and cell invasion. | |
| Fine forceps | Many sources are available | Must be sterilized before use | |
| Freezer -80 °C | Thermo Fisher Scientific | 8600 Series | Model 817CV |
| Inverted microscope | Nikon Eclipse TS100 | For cell culture work | |
| Scissors (small) | Many sources are available | Must be sterilized before use | |
| MATERIALS | |||
| anti-Laminin-111 | Sigma-Aldrich | L9393 | Primary anti-rabbit antibody (1:400) |
| anti-rabbit Cy3 | Jackson Immuno Research | 111-165-003 | Secondary antibody (1:400) |
| anti-von Willebrand Factor | DAKO | P0226 | Primary antibody (1:100) |
Cobalt(II) chloride |
Sigma-Aldrich | 232696-5G | CAUTION: moderate toxicity chemical. Handle with care only in fume hood. Follow manufacturers instructions |
| DAPI | Sigma-Aldrich | D9542-10MG | 4',6-diamidino-2-phenylindole, dihydrochloride (1:400) |
| Fertilized chicken eggs | Strömbäcks Ägg, Vännäs, Sweden | Any local egg supplyer | |
| Fetal bovine serum | Life Technologies | 10500-064 | |
| Fluorescence mounting medium | Allent Technologie | S302380-2 | Avoid bubble formation when mounting. Allow to dry at +4 °C |
| Glass chambers for silicon rings | Many sources are available | We used 15 mL glass chambers. Around 20 silicon rings fit in one chamber. Avoid crowding, since the rings may stick together and aggravate work. | |
| Glass coverslips | VWR International | 631-0165 | |
| GM6001 MMP Inhibitor | Sigma-Aldrich | CC1010 | |
| Microscope slides for immunohistochemistry | Fisher Scientific | 10149870 | |
| NEG-50 frozen medium | Cellab | 6506 | |
| Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | 30525-89-4 | CAUTION: highly toxic. Handle with care only in fume hood, follow manufacturers instructions. Use all protective clothing. |
Peel-A-Way Embedding Molds |
Polysciences | 18985 | |
| Penicillin–streptomycin | Gibco | 15070063 | |
| Petri dishes | Sarstedt | 83.3903 | 15 cm in diameter for cell culture |
| Plastic box | Esclain | ||
| PureCol EZ Gel Collagen | Cellsystems | 5074-35ML | 5 mg/mL. Gelatinous material. Pipette very slowly and carefully to avoid cells being lost in the bubble formations. |
| RPMI medium | Thermo Fisher Scientific | 21875034 | |
| Silicon rings | VWR International | 228-1580 | Inner/outer diameter: 4/5 mm. Should be sterilized before use. Avoid repeated autoclaving of unused rings. |
| Trypan blue | Fisher Scientific | T10282 | |
| Trypsin | Life Technologi | 15400054 | 0.50% |
| Weighing boats | VWR International | 611-0094 | |
| SOLUTIONS | |||
| Collagen-RPMI media mixture (1 mL) | Compelete RPMI Media 750 µL |
||
| PureCol EZ Gel Collagen 250 µL |
|||
| Mix and use immediately | |||
| Complete RPMI media (500 mL) | RPMI Media 445 mL |
||
| FBS 50 mL |
|||
| Penicillin–streptomycin 5mL |
|||
| Store at 4 °C | |||
| PB (0.2 M; 1 000 mL) | Na2HPO4 (MW 141.76) 21.9 g |
||
| NaH2PO4 (MW 137.99) 6.4 g |
|||
| add deionized water up to final volume of 1000ml | |||
| Store in RT | |||
| PFA (4 %) in 0.1 M PB (100 mL) | Deionized water 50 mL |
||
| 0.2 M PB 50 mL |
|||
| Paraformaldehyde (PFA) 4g |
|||
| heat to 60 °C in water bath | |||
| add 5 M NaOH 25 µL |
|||
| Stir to dissolve the PFA powder | |||
| Store at 4 °C | |||
| TBST (1 000 mL) | 50mM Tris pH 7,4 50 mL |
||
| 150mM NaCI 30 mL |
|||
| 0,1% Triton X-100 10 mL |
|||
| H2O (MQ) 900 mL |
|||
| Trypsin (0.05 %; 10 mL) | 1x PBS 9 mL |
||
| 10x Trypsin (0.5 %) 1 mL |
|||
| 10 mL in total, Store at 4 °C |
References
- Vasantharajan, S. S., et al. The epigenetic landscape of circulating tumour cells. Biochimica et Biophysica Acta - Reviews on Cancer. 1875 (2), 188514 (2021).
- Acloque, H., Adams, M. S., Fishwick, K., Bronner-Fraser, M., Nieto, M. A. Epithelial-mesenchymal transitions: the importance of changing cell state in development and disease. Journal of Clinical Investigation. 119 (6), 1438-1449 (2009).
- Itoh, Y. Membrane-type matrix metalloproteinases: their functions and regulations. Matrix Biology. 44-46, 207-223 (2015).
- Przemyslaw, L., Boguslaw, H. A., Elzbieta, S., Malgorzata, S. M. ADAM and ADAMTS family proteins and their role in the colorectal cancer etiopathogenesis. BMB Reports. 46 (3), 139-150 (2013).
- Chu, P. Y., Koh, A. P., Antony, J., Huang, R. Y. Applications of the chick chorioallantoic membrane as an alternative model for cancer studies. Cells Tissues Organs. 211 (2), 222-237 (2021).
- MacDonald, I. C., Groom, A. C., Chambers, A. F. Cancer spread and micrometastasis development: quantitative approaches for in vivo models. Bioessays. 24 (10), 885-893 (2002).
- Palaniappan, T. K., Slekiene, L., Jonasson, A. K., Gilthorpe, J., Gunhaga, L. CAM-Delam: an in vivo approach to visualize and quantify the delamination and invasion capacity of human cancer cells. Scientific Reports. 10 (1), 10472 (2020).
- Carrillo, M., Kim, S., Rajpurohit, S. K., Kulkarni, V., Jagadeeswaran, P.
- Leupold, J. H., Patil, N., Allgayer, H. The chicken egg chorioallantoic membrane (CAM) model as an in vivo method for the investigation of the invasion and metastasis cascade of malignant tumor cells. Methods in Molecular Biology. 2294, 17-26 (2021).
- Jia, Y., et al. Recombinant human endostatin endostar inhibits tumor growth and metastasis in a mouse xenograft model of colon cancer. Pathology and Oncology Research. 18 (2), 315-323 (2012).
- Liu, B., et al. RNAi-mediated inhibition of presenilin 2 inhibits glioma cell growth and invasion and is involved in the regulation of Nrg1/ErbB signaling. Neuro-Oncology. 14 (8), 994-1006 (2012).
- Qin, T., et al. Tumor necrosis factor superfamily 15 promotes lymphatic metastasis via upregulation of vascular endothelial growth factor-C in a mouse model of lung cancer. Cancer Science. 109 (8), 2469-2478 (2018).
- Ren, L., et al. Characterization of the metastatic phenotype of a panel of established osteosarcoma cells. Oncotarget. 6 (30), 29469-29481 (2015).
- Zang, G., Mu, Y., Gao, L., Bergh, A., Landstrom, M. PKCzeta facilitates lymphatic metastatic spread of prostate cancer cells in a mice xenograft model. Oncogene. 38 (22), 4215-4231 (2019).
- Francia, G., Cruz-Munoz, W., Man, S., Xu, P., Kerbel, R. S. Mouse models of advanced spontaneous metastasis for experimental therapeutics. Nature Reviews Cancer. 11 (2), 135-141 (2011).
- Jung, J. Human tumor xenograft models for preclinical assessment of anticancer drug development. Toxicology Research. 30 (1), 1-5 (2014).
- Liu, M., et al. The histone methyltransferase EZH2 mediates tumor progression on the chick chorioallantoic membrane assay, a novel model of head and neck squamous cell carcinoma. Translational Oncology. 6 (3), 273-281 (2013).
- Steinmann, S., et al. DAPK1 loss triggers tumor invasion in colorectal tumor cells. Cell Death & Disease. 10 (12), 895 (2019).
- Andrieu, C., et al. MMP14 is required for delamination of chick neural crest cells independently of its catalytic activity. Development. 147 (7), (2020).
- Palaniappan, T. K., Slekiene, L., Gunhaga, L., Patthey, C. Extensive apoptosis during the formation of the terminal nerve ganglion by olfactory placode-derived cells with distinct molecular markers. Differentiation. 110, 8-16 (2019).
- Thiery, J. P., Acloque, H., Huang, R. Y., Nieto, M. A. Epithelial-mesenchymal transitions in development and disease. Cell. 139 (5), 871-890 (2009).
- Pineros, M., et al. Essential TNM: a registry tool to reduce gaps in cancer staging information. The Lancet Oncology. 20 (2), 103-111 (2019).
- Walsh, A. J., Cook, R. S., Sanders, M. E., Arteaga, C. L., Skala, M. C. Drug response in organoids generated from frozen primary tumor tissues. Scientific Reports. 6, 18889 (2016).
