Summary
Denne protokollen beskriver en standardisert reseksjon av hjernesvulster hos gnagere gjennom en minimal invasiv tilnærming med et integrert vevsbevaringssystem. Denne teknikken har implikasjoner for nøyaktig speiling av omsorgsstandarden i gnagere og andre dyremodeller.
Abstract
Denne protokollen beskriver et standardisert paradigme for reseksjon av hjernesvulst hos gnagere og vevsbevaring. I klinisk praksis er maksimal tumorreseksjon standardbehandling for de fleste hjernesvulster. Imidlertid inkluderer de fleste tilgjengelige prekliniske hjernesvulstmodeller enten ikke reseksjon, eller benytter kirurgiske reseksjonsmodeller som er tidkrevende og fører til signifikant postoperativ morbiditet, dødelighet eller eksperimentell variabilitet. I tillegg kan det være skremmende å utføre reseksjon hos gnagere av flere grunner, inkludert mangel på klinisk sammenlignbare kirurgiske verktøy eller protokoller og fraværet av en etablert plattform for standardisert vevsinnsamling. Denne protokollen fremhever bruken av en multifunksjonell, ikke-ablativ reseksjonsanordning og et integrert vevsbevaringssystem tilpasset den kliniske versjonen av enheten. Enheten som ble brukt i denne studien kombinerer tunable sug og et sylindrisk blad ved blenderåpningen for å nøyaktig sonde, kutte og sugevev. Den minimalt invasive reseksjonsanordningen utfører sine funksjoner via det samme burrhullet som brukes til den første tumorimplantasjonen. Denne tilnærmingen minimerer endringer i regional anatomi under biopsi eller reseksjonsoperasjoner og reduserer risikoen for betydelig blodtap. Disse faktorene reduserte operasjonstiden signifikant (<2 min/dyr), forbedret postoperativ dyreoverlevelse, lavere variabilitet i eksperimentelle grupper og resulterer i høy levedyktighet av resektert vev og celler for fremtidige analyser. Denne prosessen forenkles av en bladhastighet på ~ 1,400 sykluser / min, noe som gjør det mulig å høste vev i et sterilt lukket system som kan fylles med en fysiologisk løsning av valg. Gitt den nye betydningen av å studere og nøyaktig modellere virkningen av kirurgi, bevaring og streng komparativ analyse av regionaliserte tumorreseksjonsprøver og intra-hulromsleverte terapier, vil denne unike protokollen utvide mulighetene for å utforske ubesvarte spørsmål om perioperativ ledelse og terapeutisk oppdagelse for hjernesvulstpasienter.
Introduction
Glioblastom (GBM) er den vanligste og mest aggressive primære hjernesvulsten hos voksne. Til tross for nylige fremskritt innen nevrokirurgi, målrettet medisinutvikling og strålebehandling, er den 5-årige overlevelsesraten for GBM-pasienter mindre enn 5%, en statistikk som ikke har forbedret seg betydelig på over tre tiår1. Derfor er det behov for mer effektive behandlingsstrategier.
For å utvikle nye terapier blir det stadig tydeligere at undersøkelsesprotokoller må (1) bruke oversettbare prekliniske modeller som nøyaktig rekapitulerer tumor heterogenitet og mikromiljø, (2) speile standard terapeutisk regime som brukes hos pasienter med GBM, som for tiden inkluderer kirurgi, strålebehandling og kjemoterapi, og (3) redegjøre for forskjellen mellom resektert kjerne og resterende, invasivt tumorvev 2,3,4,5. Imidlertid implementerer de fleste av de tilgjengelige prekliniske hjernesvulstmodellene enten ikke kirurgisk reseksjon eller bruker kirurgiske reseksjonsmodeller som er relativt tidkrevende, noe som fører til en betydelig mengde blodtap eller mangel på standardisering. Videre kan det være utfordrende å utføre reseksjon av hjernesvulster hos gnagere på grunn av mangel på klinisk sammenlignbare kirurgiske verktøy eller protokoller og fravær av en etablert plattform6 for systematisk vevsinnsamling (tab 1).
Denne protokollen tar sikte på å beskrive et standardisert paradigme for reseksjon av hjernesvulster og vevsbevaring ved hjelp av et multifunksjonelt ikke-ablativt minimalt invasivt reseksjonssystem (MIRS) og et integrert vevsbevaringssystem (TPS) (figur 1). Det forventes at denne unike teknikken vil gi en standardisert plattform som kan brukes i ulike studier i preklinisk forskning for GBM og andre typer hjernesvulstmodeller. Forskere som undersøker terapeutiske eller diagnostiske modaliteter for hjernesvulster, kan implementere denne protokollen for å oppnå en standardisert reseksjon i sine studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alle dyreforsøk ble godkjent av University of Maryland og Johns Hopkins University Institutional Animal Care and Use Committee. C57BL/6 hunnmus, 6-8 ukers alder, ble brukt i denne studien. Musene ble hentet fra kommersielle kilder (se materialtabell). Alle forskrifter om biosikkerhetsnivå 2 (BSL-2) ble fulgt, inkludert bruk av masker, hansker og kjoler.
1. Initial intrakraniell tumorimplantasjon
- I den innledende fasen av studien injiseres hver mus intrakranielt med 100 000 celler (GL261 murine gliomcellelinje) suspendert i 4 μL fosfatbufret saltvann (1x PBS) til en dybde på 2,5 mm etter den tidligere publiserte rapporten7.
- Kvantifiser tumorsignalet i hver mus ved hjelp av in vivo bildebehandlingssystem8 9 dager etter tumorimplantasjon.
MERK: Lag om nødvendig musene i to grupper basert på tumorbelastning. I denne studien var de to gruppene: (1) mus med relativt liten tumorbelastning (gjennomsnittlig bioluminescerende signal = 5,5e + 006 ± 0,1e + 006 fotoner / s, n = 10) og (2) mus med relativt stor tumorbelastning (gjennomsnittlig bioluminescerende signal = 1,69e + 007 ± 0,2e + 007 fotoner / s, n = 10), (p < 0,05, Mann-Whitney test) 9. - Del hver gruppe i to sammenlignbare undergrupper.
MERK: I denne studien var de to undergruppene: ubehandlede mus (n = 5) og mus med svulster som gjennomgikk kirurgisk reseksjon ved bruk av MIRS (n = 5), (p > 0,05, Mann-Whitney-test)9. - Fra og med dagen for reseksjonen, spor tumorprogresjonen ved hjelp av in vivo bildebehandlingssystem med en frekvens basert på tumorvekstmønsteret.
MERK: For GL261-cellelinjen, spor tumorprogresjonen på dagen for reseksjonen og deretter hver 3-6 dag.
2. Tumor reseksjon ved hjelp av MIRS
- Bedøv musen ved hjelp av en isofluran-O2 gassblanding i et induksjonskammer eller intraperitoneal injeksjon av xylazin / ketaminoppløsning.
- Hvis du bruker gassbedøvelsen, sett gasstrømningshastigheten til 1,0 ml / min og fordamperen til 2,0% for anestesiinduksjon, som vanligvis krever 3-5 minutter i kammeret (se materialtabell).
- Hvis du bruker den injiserbare bedøvelsen, bedøves musene ved å injisere 0,2 ml bedøvelsesoppløsning (80-100 mg / kg ketamin og 10-12,5 mg / kg xylazin, se Materialtabell) intraperitonealt.
- Vurder dyret for tilstrekkelig sedasjon ved å klemme tåen. Påfør oftalmisk salve på øynene for å unngå tørrhet i hornhinnen. Administrer et smertestillende middel (0,03-0,06 mg/kg buprenorfin subkutant) før inngrepet.
- Plasser musen på den stereotaktiske rammen (se Materialfortegnelse) når full sedasjon er bekreftet.
MERK: Hvis du bruker gassbedøvelsen, plasser musens nese i en nesekjegle hvor den vil fortsette å motta isofluran-O2-blandingen under prosedyren (1,5%). - Fjern den forrige stiften, og fjern deretter håret enten med en hårfjerningskrem eller ved barbering. Desinfiser huden med vekslende sykluser av klorhexidin / betadinbasert skrubb og alkohol. Deretter bruker du en steril skalpell til å lage et 1 cm langsgående midtlinjesnitt langs forrige kirurgiske arr.
- Fest MIRS-håndstykket til den stereotaktiske armen gjennom sceneadapteren/håndstykkeholderen for økt stabilitet og presisjon.
- Konfigurer MIRS-maskinen (se Materialfortegnelse) med følgende innstillinger (figur 1).
- Sett strømledningen på bakpanelet inn i strømledningskontakten. Slå strømmen til systemet på eller av ved å veksle (1 = PÅ, 0 = AV).
- Sett den ene enden av nitrogenslangen (som følger med konsollen) inn i den mannlige tilpasningen på konsollens bakpanel. Roter tilkoblingsmutteren med klokken for å stramme tilkoblingen.
MERK: Den motsatte enden av slangen må kobles til nitrogentilførselen. - Før du fester slangen til nitrogentilførselen, må du bekrefte at tilførselstrykket ikke overstiger 100 psig, som er inngangsforsyningstrykket som anbefales for konsollen.
MERK: Konsollen vil generere sin egen aspirasjon når den aktiveres av fotpedalen når nitrogenet er tilført konsollen. - Fest lokket på vakuumporten og forsegl det for å unngå lekkasje i vakuumsystemet. Eventuelle lekkasjer i aspirasjonssystemet vil påvirke ytelsen til MIRS-konsollen.
- Hvis aspirasjonen er under 17 under oppsett eller klargjøring, må du kontrollere at aspirasjonsknappen foran på konsollen er satt til maksimumsnivået (100), sørge for at det ikke er lekkasje i aspirasjonssystemet, og bekrefte at nitrogentilførselstrykket er riktig.
- For å koble fotpedalen til konsollen, sett den grå fotpedalkontakten inn i den grå kontakten til den klikker og passer på plass.
MERK: Fotpedalkontakten kobles til konsollen i én retning, og den tastes inn. - For å koble håndstykket til konsollen, sett den blå håndstykkekontakten inn i den blå kontakten til den klikker og passer på plass.
MERK: Håndstykkekontakten kobles til konsollen i én retning, og den er tastet. - Prime hvert håndstykke før du bruker systemet ved å aspirere steril væske fra en liten bolle inn i blenderåpningen, gjennom slangen og håndstykket, og deretter inn i beholderen for å sikre at innsiden av slangen og håndstykket smøres for å redusere vevsokklusjonene.
- Forbered deg på aspirasjon alene eller aspirasjon med skjæring ved å velge riktig modus på konsollens frontpanel. Start med fotpedalen.
- Sett 23 G MIRS-kanylen inn i burrhullet til en dybde på 2,5 mm.
- Start reseksjonsprosessen ved å trykke ned fotpedalen som er koblet til kanylen. Utfør en full syklus (360°) eller mer reseksjon ved hjelp av kontrollknappen i håndstykket.
MERK: Jo flere sykluser som utføres, jo mer volum av tumorvev resektert. - Når reseksjonsprosessen er fullført, trekk ut 23 G MIRS-kanylen fra burrhullet og bruk 5 ml 1x PBS til å skylle slangen og løsne restrester.
- Fjern musen fra den stereotaktiske rammen og lukk såret med en stiftemaskin eller 4-0 sutureringsmateriale (se Materialfortegnelse).
- Plasser musen på en varmepute eller under et varmende lys under gjenoppretting fra anestesi før du returnerer den til buret.
- Etter at eksperimentet er fullført, rens kanylen via spyling. Alterner med kjølte medier og luft for å "skyve" alt det resekterte vevet tilbake til oppsamlingsbeholderen. Fjern oppsamlingsbeholderen fra systemet og korken av med den medfølgende hetten.
- Etter å ha fullført trinn 2.12, plasser den distale spissen av kanylen i 3% H2 O2 og påfør sug ved 24-25 i Hg for å fylle sugeledningen tilbake til sugeoppsamlingsbeholderen og la stå i 60-90 s. Skyll med sterile medier som pulserer luft og medier periodisk.
- Overvåk musene for eventuelle nevrologiske tegn (unormale uregelmessige bevegelser eller anfall) etter prosedyren.
- Avliv musene med alvorlige nevrologiske funksjonsnedsettelser (blir sløv, har et avmagret utseende, bøyd rygg eller har uberegnelige bevegelser).
MERK: For denne studien ble 200 mg/kg av en kommersielt tilgjengelig eutanasiløsning (se materialfortegnelse) brukt til å avlive hver mus.
3. Vevsinnsamling via TPS
- Senk tumorprøven i en vevskulturskål som inneholder et RBC-lysismedium (se materialtabell) i 5 minutter ved romtemperatur.
MERK: Vevet høstet fra MIRS inn i TPS vil primært være i form av enkeltceller sammen med små biter av vev. - Plasser et 70 μm filter (se Materialtabell) på et 50 ml konisk rør og bruk et stempel på en 5 ml sprøyte for å sende tumorprøven gjennom filteret.
- Med en overføringspipette, bruk RPMI-1640-mediet for å lette passering av celler og eventuell vevmasse gjennom filteret.
- Sentrifuge ved 428 x g i 5 minutter ved 4 °C. Kast supernatanten med en pipette.
- Resuspender hver prøve i 5 ml tilberedt RPMI-1640 medium.
- For å øke vevets levedyktighet, spesielt hvis store vevsbiter visualiseres ved første inntrykk, legg til de nødvendige volumene av enzymcocktailen (som inneholder DNAse I, kollagenase IV, dispase, Papain og EDTA, se Tabell over materialer) til hver prøve. Bruk virvelen til å blande løsningene.
MERK: Trinn 3.6 er valgfritt. Sammensetningen av enzymcocktailen (for et totalt volum på 5 ml / prøve): 300 μL DNAse I grad II, 150 μL kollagenase / dispase (spalter fibronektin, kollagenase IV, I og ikke-polare aminosyrer), 250 μL papain (ikke-spesifikk protease) og 6 μL 0,5 M EDTA. - Plasser prøvene i en shakerinkubator satt ved 200 o / min, 37 ° C i 20 min.
- Etter 20 minutter spinner du prøvene ved 428 x g i 5 minutter ved 4 °C. Kast supernatanten.
- Filtrer enkeltceller gjennom en cellesil på 70 μm og spinn ned ved 274 x g i 3 minutter ved 4 °C. Utfør celle levedyktighetsanalyse10 med Trypan Blue og Hemocytometer (se Materialfortegnelse).
MERK: Dag 0 levedyktighet varierer fra 30% -70% og øker betydelig innen 2-3 dager. - Fortsett til trinn 4, 5 eller 6, avhengig av levedyktighetstesten som trengs.
4. Voksende celler i tilhengerkultur
- I en sertifisert laminær strømningshette, resuspender pelleten i serumholdig adherent medium (som DMEM, 10% føtalt bovint serum (FBS) og 1% penicillin / streptomycin (P / S) løsning) og plateceller i en adherent cellekolbe.
- Oppretthold cellene i et kontrollert inkubert miljø (37 °C, 5 % CO2).
5. Voksende celler i suspensjonskultur (nevrosfærer)
- I en sertifisert laminær strømningshette resuspenderer du pelleten i serumfri komplett stamcellemedium11 og plate i en suspensjonskolbe.
- Oppretthold cellene i et kontrollert inkubert miljø (37 ° C, 5% CO 2) i2-3 dager for å tillate nevrosfæredannelse.
- Etter visualisering av nevrosfærene i kulturmediet, bruk Trypsin-EDTA eller Accutase (se Materialtabell) for å oppnå enkeltcellesuspensjoner for passaging.
MERK: Så lenge spesiell forsiktighet er tatt under høsting og passende medier som støtter nevrale stamceller brukes, må stamcellene i det høstede vevet danne nevrosfærer innen få dager.
6. Forbereder celler for reimplantasjon
- Resuspend pelleten i en konsentrasjon på 100.000 levende celler per 4 μL av 1x PBS.
- Injiser umiddelbart i naive mus ved hjelp av intrakraniell tumorimplantasjonsmetode (trinn 1).
7. Histologisk analyse
- Umiddelbart etter reseksjon, trekk ut og fikse hjernen i 4% paraformaldehyd (PFA) i 24 timer12.
- Overfør hjernen til en 30% sukroseløsning til de er mettet med sukrose (nedsunket ned til bunnen av beholderen).
- Overfør hjernen til en 70% etanolløsning.
- Utfør parafinblokkinnbygging, seksjonering og standard hematoksylin og eosin (H&E) farging etter tidligere publisert rapport13.
MERK: Tykkelsen på hver seksjon tatt for farging var 10 μm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kirurgisk reseksjon ved hjelp av MIRS resulterer i en signifikant reduksjon i tumorbyrden
I gruppen med mindre tumorbelastning var gjennomsnittlig bioluminescerende signal ved baseline 5,5e+006 fotoner/s ± 0,2e+006 i undergruppen som gjennomgikk reseksjon. Etter reseksjon ble det gjennomsnittlige bioluminescerende signalet redusert til 3,09e + 006 fotoner / s ± 0,3e + 006, (p <0,0001, Mann-Whitney-test) 9 (figur 2). Det bioluminescerende signalet økte i de følgende dagene til musene ble avlivet. Tilsvarende, i gruppen med større tumorbelastning, var gjennomsnittlig baseline bioluminescerende signal 1,68e + 007 fotoner / s ± 0,1e + 007 i undergruppen som gjennomgikk reseksjon. Etter reseksjon ble det gjennomsnittlige bioluminescerende signalet redusert til 5,19e+006 fotoner/s ± 0,2e+006, (p <0,0001, Mann-Whitney-test)9. Det bioluminescerende signalet økte i de følgende dagene til musene ble avlivet.
Reseksjon ved bruk av MIRS kan justeres for ønsket reseksjonsvolum
Ved prereseksjonsavbildning av syngeneiske CT2A-svulster kan svulsten generelt identifiseres som en heterogen masse på inokulasjonsstedet med forstyrret parenkymal arkitektur og peritumorødem og blødning indikert ved heterogene områder med T2-vektet (T2w) hypo- og hyperintensitet. Nålesporet som brukes til stereotaktisk tumorcelleinjeksjon kan identifiseres på T2w MR-skanning14.
Reseksjonshulen kan identifiseres ved MR-undersøkelse etter reseksjon T2w som et stort rundt hypointenst område på tumorinokulasjonsstedet (figur 3). Reseksjonsprosedyren forårsaket ikke signifikant blodtap eller forstyrrelse av den omkringliggende hjernearkitekturen. I noen tilfeller akkumuleres væske i reseksjonshulen. Som vist i figur 4 økte reseksjonsvolumet signifikant fra 9,4 mm 3 for en rotasjon av skjæreåpningen til 23,2 mm3 for to rotasjoner (p = 0,0117), noe som gjorde det mulig å justere volumreseksjonen for å optimalisere for en kjent tumorbelastning.
Tumorreseksjon ved bruk av MIRS fører til en 7-dagers forlengelse i median overlevelse av tumorbærende mus uten å indusere noen nevrologiske tegn
Som vist i figur 5, var det en forlengelse i overlevelsen av mus som gjennomgikk kirurgisk reseksjon i begge grupper med små (6 dager) og store (7 dager) svulster. I gruppen med mindre tumorbelastning var median overlevelse for kontrollundergruppen 16 dager, mens median overlevelse for reseksjonsundergruppen var 22 dager (p = 0,0044). Tilsvarende var median overlevelse for kontrollundergruppen 12 dager i gruppen med større tumorbelastning, mens median overlevelse for subgruppen reseksjon var 19 dager (p = 0,0043). I tillegg viste ingen av musene som gjennomgikk reseksjon ved hjelp av MIRS noen tegn på nevrologisk skade etter inngrepet. Dette indikerer at MIRS kan oppnå sikker reseksjon.
Det resekterte vevet som bruker MIRS har høy levedyktighet in vitro og in vivo
Celler ekstrahert fra resektert vev ble filtrert, kvantifisert og resuspendert i riktig medium (figur 6) før de ble utført in vitro eller in vivo levedyktighetseksperimenter. For å undersøke cellens levedyktighet in vitro og for å bekrefte reseksjon av svulsten og ikke normal hjerneparenkym, ble celler dyrket i suspensjonskultur. Nevrosfæredannelse, en indikator for tumorinitieringspotensial, forekom med minimal vevsbehandling etter reseksjon. Dette antydet at MIRS-plattformen høstet godt dissosiert vev og hadde minimal innvirkning på helsen og levedyktigheten til det resekterte vevet. Prøver tatt rett fra TPS til lysmikroskopi syntes å være primært i form av enkeltceller sammen med tilstedeværelsen av noen få små biter av vev. Dag 0 levedyktighet varierte fra 30% -70% (dette representerer levedyktigheten etter å ha passert prøven gjennom et 70 μm filter og før plating). Reseksjonsanordningen har en skjæreåpning som kan rotere 360 ° på reseksjonssondens akse, noe som muliggjør reseksjon av konsentriske vevsvolumer. I gjennomsnitt kan 2-3 millioner celler høstes med en 360 ° omdreining av skjæreåpningen, omtrent 7 millioner celler med to omdreininger, og totalt 12-14 millioner celler kan oppnås med tre 360 ° svinger av skjæreåpningen. Etter plating i suspensjonsflasker som inneholdt serumfritt komplett stamcellemedium, ble nevrosfærene synlige ved lysmikroskopi dag 2 og med det blotte øye ved dag 7 (figur 7).
For å undersøke in vivo levedyktighet ble ekstraherte celler intrakranielt implantert i naive C57BL/6 mus (n = 8 mus, 100 000 levende celler/mus). Tumorvekst ble bekreftet ved hjelp av in vivo bildebehandlingssystem. Tumorsignalet fortsatte å øke inntil alle dyrene ble avlivet innen dag 14 etter tumorimplantasjon (median overlevelse på 11 dager).
Det representative H&E-vevssnittet (figur 3B) inneholder et klart, sirkulært reseksjonshulrom med blodproduktkant (dyprosa), inflammasjon og resttumorceller (mørk lilla celler). Makroskopisk er de resterende tumorcellene mesenkymale i naturen og infiltrative, og utviser omfattende perivaskulær invasjon og spredning. Mikroskopisk ble det identifisert merkede nukleære atypier og mitotiske figurer. Tumorassosierte makrofager ble også identifisert rundt områder med infarkt vev og mikroblødninger. Vevsarkitekturen i det omkringliggende hjerneparenkymet så ikke ut til å være forstyrret.
Figur 1: MIRS-systemoppsett . (A) Minimalt invasivt reseksjonssystem (MIRS) for hjernesvulst i gnagermodeller med integrert vevsbevaringssystem. (B) Frontpanel på MIRS-konsollen. 1 = Systemkraft, 2 = fotpedal, 3 = primærknapp, 4 = Aspirasjon, 5 = Aspirasjonsnivåkontrollhjul, 6 = Aspirasjonsnivåindikator, 7 = Håndstykke, 8 = Aktiveringsknapp for kutter. (C) Bakpanel på MIRS-konsollen. 1 = Strømledningskontakt, 2 = Effektbryter, 3 = Nitrogenforsyningsinngang. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 2: Endringer i gjennomsnittlig tumorbelastning hos mus med ubehandlede svulster versus mus som gjennomgår reseksjon av svulster av MIRS. (A) Mus med liten baseline tumorbelastning og (B) mus med stor baseline tumorbelastning (p < 0,0001, SD ≤0,3e + 006 i alle grupper på hvert tidspunkt og for liten til å vises på grafen). Dyr enten bukket under for tumorbyrde eller ble avlivet. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 3: MR- og H&E-analyse. (A) Pre- og postreseksjon T2-vektede MR-bilder av hjernen og (B) en representativ H&E-farget koronal hjerneseksjon som viser et klart, sirkulært reseksjonshulrom med en kant av blodprodukter (dyprosa), betennelse og gjenværende tumorceller (mørke lilla celler). MR-bilder og H&E-snitt ble tatt umiddelbart etter reseksjon. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 4: Bestemmelse av tumorreseksjonsvolum. Gjennomsnittlig volum beregnet ut fra MR-bilder av reseksjonskrom opprettet med en vs. to rotasjoner av skjæreåpningen, n = 4 per gruppe. p = 0,01, tosidig T-test. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 5: Kaplan-Meier-kurver hos mus med ubehandlede svulster versus mus som gjennomgår reseksjon av svulster ved MIRS . (A) Mus med liten tumorbelastning ved baseline. (B) Mus med stor baseline tumorbelastning. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 6: Levedyktighetstest av de resekterte tumorcellene . (A) Representative lysmikroskopibilder av vev høstet med MIRS på dag 0 ved 20x. (B) Kaplan-Meier-kurve som beskriver overlevelse av mus etter intrakraniell implantasjon av celler høstet fra resektert vev. Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.
Figur 7: Dannelse av nevrosfærer. Representative lysmikroskopibilder av nevrosfærer generert fra resektert vev på dag 2 etter reseksjon ved (A) 20x og (B) 10x, og på dag 7 etter reseksjon ved (C) 20x og (D) 10x. Vennligst klikk her for å se en større versjon av denne figuren.
| Minimalt invasivt reseksjonssystem | Historisk reseksjon | |||
| Operativ tid og ferdigheter | Minimal operativ tid (<2 min for hvert dyr). Minimale ferdigheter som trengs. | Operasjonstiden er ikke standardisert og kirurgisk erfaring med små dyr og mikrokirurgi er gunstig. | ||
| Blodtap | Minimal | Uforutsigbar | ||
| Standardisert reseksjonsvolum | Volumet av reseksjon bestemt/justert av antall rotasjoner i reseksjonsverktøyet | Volumet varierer sterkt mellom forsøkspersonene | ||
Tabell 1: Sammenlikning mellom minimalt invasivt reseksjonssystem (MIRS) og historiske kirurgiske reseksjonsmodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tumorreseksjon er en hjørnestein i nevrokirurgiske onkologiske behandlingsplaner for både lavgradige og høyverdige hjernesvulster. Cytoreduksjon og debulking av svulsten korrelerer med forbedret nevrologisk funksjon og total overlevelse hos pasienter med hjernesvulster 1,2,5,6. Selv om protokoller for kirurgisk reseksjon tidligere er beskrevet i gnagermodeller, har disse protokollene lidd av flere begrensninger som kan forvirre de genererte resultatene og den generelle oversettbarheten til den prekliniske modellen. For eksempel har tidligere rapporterte kirurgiske reseksjonsprotokoller inkludert en kraniotomi med 3-4 små burrhull for å skape en beinklaff og deretter dyktig skille og differensiering av svulstens farge og konsistens sammenlignet med normalt hjernevev6. Disse protokollene er tidkrevende og krever at forskningspersonalet har avanserte ferdigheter i å utnytte det kirurgiske mikroskopet, håndtere kirurgiske instrumenter, identifisere tumorgrensene angående det omkringliggende normale hjernevevet og oppnå tilstrekkelig homeostase. Slike prosedyrer fører ofte til betydelig blodtap og dyredød. I tillegg kan det være utfordrende å oppnå standardisert reseksjon med sammenlignbare volumer av tumorvev resektert på tvers av forskjellige dyr i samme forsøk. Denne kontinuiteten og ensartetheten blir mer utfordrende med flere personell som utfører prosedyren.
MIRS-protokollen som er beskrevet her, fjerner derimot disse begrensningene (tabell 1). Den nåværende protokollen krever en minimal invasiv tilnærming gjennom det samme burrhullet som brukes til innledende tumorimplantasjon. Som beskrevet i protokolldelen, kan reseksjonsverktøyet installeres på en stereotaktisk ramme som muliggjør nøyaktig innføring av kanylen i tumorhulen. Bladets hastighet og antall utførte reseksjonssykluser kan enkelt justeres gjennom et håndstykke som brukes av forskningspersonalet for å kontrollere volumet av tumor resektert på en standardisert måte uten å forårsake en betydelig mengde blodtap.
Som nevnt i resultatene, viste musene som gjennomgikk reseksjon med MIRS-enheten langvarig overlevelse sammenlignet med kohorten av mus med inoperative svulster. Dette, sammen med dataene, viser at tumorbelastningen ble signifikant redusert i den resekterte gruppen sammenlignet med den resekterte kontrollgruppen, noe som indikerer at MIRS-enheten effektivt debulkerer svulsten med minimal forstyrrelse av omgivende sunt hjernevev. Videre, i dagene etter reseksjon, utviklet tumorbyrden seg jevnt på grunn av tilstedeværelsen av en gjenværende tumor og den infiltrative karakteren av CT-2A-tumorcellelinjen. MIRS-modellen kan dermed replikere debulkingprosessen av infiltrative tumortyper, som kan følges med kjemoterapeutikk eller strålebehandling for å speile behandlingsregimet i humane hjernesvulstbehandlingsprotokoller15,16,17.
Som tilfellet er med alle sugeanordninger, kan tilstopping av aspirasjonsslangen være en av begrensningene i MIRS-systemet. Dette kan oppstå på grunn av akkumulering av tørt vev eller blod under eller etter bruk av maskinen. For å unngå dette, umiddelbart på slutten av hver økt med reseksjoner, anbefales det å rense håndstykkekanylen ved å skylle med kjølte medier som veksler med luft for å "skyve" alt det resekterte vevet til oppsamlingsbeholderen, etterfulgt av spyling med 3% H2 O2. Dette vil fange opp alt vevet som er oppnådd under reseksjonen og sikre at ingen forblir i kanylen eller slangen. Videre, hvis systemet ikke aspirerer/kutter, kan dette skyldes at håndstykket ikke er koblet til, reseksjonskanykutteren ikke er slått på, aspirasjonslinjen fra konsollen ikke er koblet til beholderen, beholderlokket ikke er stramt, eller fotpedalen er ikke koblet til.
I tillegg, mens vi har vist at MIRS kan brukes til effektiv og standardisert reseksjon med høy in vitro og in vivo levedyktighet av resektert vev, oppfordres fremtidige studier til å undersøke andre fasetter av implementering av slike systemer i hjernesvulstforskning. Disse inkluderer å undersøke virkningen av reseksjonsprosessen på de molekylære og cellulære komponentene i tumormassen og tumormikromiljøet. I tillegg er det nødvendig med studier for å bekrefte at det resekterte vevet ved hjelp av MIRS-enheten rekapitulerer foreldretumoren15.
Avslutningsvis beskrives en protokoll med en minimal invasiv tilnærming for standardisert kirurgisk reseksjon i en gnagerhjernesvulstmodell som er kombinert med et integrert og automatisert vevsbevaringssystem. Denne protokollen baner veien mot å etablere svært translasjonelle og prediktive prekliniske hjernesvulstforskningsmodeller. Fremtidige anvendelser av denne protokollen kan potensielt omfatte prekliniske studier som undersøker ulike terapeutiske eller diagnostiske modaliteter for hjernesvulster som kan implementere denne protokollen for å oppnå en standardisert reseksjon.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
BT har forskningsmidler fra NIH og er medeier i Accelerating Combination Therapies*, og Ashvattha Therapeutics Inc. har lisensiert et av hennes patenter. GW har NIH-finansiering (R01NS107813). HB er en betalt konsulent for Insightec og styreleder i selskapets Medical Advisory Board. Denne ordningen har blitt gjennomgått og godkjent av Johns Hopkins University etter sin interessekonfliktpolitikk. HB har forskningsfinansiering fra NIH, Johns Hopkins University og filantropi og er konsulent for CraniUS, Candel Therepeutics, Inc., Accelerating Combination Therapies *, Catalio Nexus Fund II, LLC *, LikeMinds, Inc *, Galen Robotics, Inc.* og Nurami Medical *. (*inkluderer egenkapital eller opsjoner).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringes | BD | 309628 | |
| 15 mL conical tubes | Corning | 430052 | |
| 200 proof ethanol | PharmCo | 111000200 | |
| 5 mL pipettes | CoStar | 4487 | |
| 70 micron filter | Fisher | 08-771-2 | |
| Accutase | Millipore Sigma | SIG-SCR005 | |
| Anased (Xylazine injection, 100 mg/mL) | Covetrus | 33198 | |
| Anesthesia System | Patterson Scientific | 78935903 | |
| Anesthesic Gas Waste Container | Patterson Scientific | 78909457 | |
| Bench protector underpad | Covidien | 10328 | |
| C57Bl/6, 6-8 week old mice | Charles River Laboratories | Strain Code 027 | |
| ChroMini Pro | Moser | Type 1591-Q | |
| Collagenase-Dispase | Roche | #10269638001 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher | ||
| Countess II FL Hemacytometer | Thermo Fisher | A25750 | |
| Debris Removal Solution | Miltenyi Biotech | #130-109-398 | |
| D-Luciferin | Goldbio | LUCK-1G | |
| DMEM F12 media | Corning | 10-090-CV | |
| DMEM media | Corning | 10-013-CV | |
| DNAse I | Sigma Aldrich | #10104159001 | |
| Eppendorf tubes | Posi-Click | 1149K01 | |
| Euthanasia solution | Henry Schein | 71073 | |
| FBS | Millipore Sigma | F4135 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 10437-028 | |
| Formalin | Invitrogen | INV-28906 | |
| Gauze | Henry Schein | 101-4336 | |
| hEGF | PeproTech EC | 100-15 | |
| Heparin | Sigma | H-3149 | |
| hFGF-b | PeproTech EC | 1001-18B | |
| Induction Chamber | Patterson Scientific | 78933388 | |
| Isoflurane | Covetrus | 11695-6777-2 | |
| Isoflurane Vaporizer | Patterson Scientific | 78916954 | |
| Ketamine | Covetrus | 11695-0703-1 | |
| Kopf Stereotactic frame | Kopf Instruments | 5001 | |
| Lightfield Microscope | BioTek | Cytation 5 | |
| Microinjection Unit | Kopf | 5001 | |
| Micromotor drill | Foredom | F210418 | |
| MRI system | Bruker | 7T Biospec Avance III MRI Scanner | |
| NICO Myriad System | NICO Corporation | ||
| Ophthalmic ointment | Puralube vet ointment | ||
| Papain | Sigma Aldrich | #P4762 | |
| PBS | Invitrogen | #14190250 | |
| PenStrep | Millipore Sigma | N1638 | |
| Percoll solution | Sigma Aldrich | #P4937 | |
| Pipette controller | Falcon | A07260 | |
| Povidone-iodine solution | Aplicare | 52380-1905-08 | |
| Progesterone | Sigma | P-8783 | |
| Putrescine | Sigma | P-5780 | |
| RPMI Media | Invitrogen | INV-72400120 | |
| Scalpel blade | Covetrus | 7319 | |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 91003-12 | |
| Skin marker | Time Out | D538,851 | |
| Staple remover | MikRon | ACR9MM | |
| Stapler | MikRon | ACA9MM | |
| Staples | Clay Adams | 427631 | |
| Stereotactic Frame | Kopf Instruments | 5000 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S9378 | |
| Suture, vicryl 4-0 | Ethicon | J494H | |
| T-75 culture flask | Sarstedt | 83-3911-002 | |
| TheraPEAKTM ACK Lysing Buffer (1x) | Lonza | BP10-548E | |
| Trypsin-EDTA | Corning | MDT-25-053-CI |
References
- Mineo, J. F., et al. Prognosis factors of survival time in patients with glioblastoma multiforme: a multivariate analysis of 340 patients. Acta Neurochirurgica. 149 (3), 245-252 (2007).
- Miyai, M., et al. Current trends in mouse models of glioblastoma. Journal of Neuro-Oncology. 135 (3), 423-432 (2017).
- Raj, D., Agrawal, P., Gaitsch, H., Wicks, E., Tyler, B. Pharmacological strategies for improving the prognosis of glioblastoma. Expert Opinion on Pharmacotherapy. 22 (15), 2019-2031 (2021).
- Alomari, S., et al. Drug repurposing for Glioblastoma and current advances in drug delivery-a comprehensive review of the literature. Biomolecules. 11 (12), 1870 (2021).
- Serra, R., et al. Combined intracranial Acriflavine, temozolomide and radiation extends survival in a rat glioma model. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics : Official Journal of Arbeitsgemeinschaft fur Pharmazeutische Verfahrenstechnik eV. 170, 179-186 (2022).
- Tang, B., Foss, K., Lichtor, T., Phillips, H., Roy, E.
- Ozawa, T., James, C. D. Establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging. Journal of Visualized Experiments. (41), e1986 (2010).
- Poussard, A., et al. In vivo imaging systems (IVIS) detection of a neuro-invasive encephalitic virus. Journal of Visualized Experiments. (70), e4429 (2012).
- Lachin, J. M.
- Louis, K. S., Siegel, A. C. Cell viability analysis using trypan blue: manual and automated methods. Methods in Molecular Biology. 740, 7-12 (2011).
- Spina, R., Voss, D. M., Asnaghi, L., Sloan, A., Bar, E. E. Flow cytometry-based drug screening system for the identification of small molecules that promote cellular differentiation of Glioblastoma stem cells. Journal of Visualized Experiments. (131), e56176 (2018).
- Rodgers, G., et al. Virtual histology of an entire mouse brain from formalin fixation to paraffin embedding. Part 2: Volumetric strain fields and local contrast changes. Journal of Neuroscience Methods. 365, 109385 (2022).
- Connolly, N. P., et al. Elevated fibroblast growth factor-inducible 14 expression transforms proneural-like gliomas into more aggressive and lethal brain cancer. GLIA. 69 (9), 2199-2214 (2021).
- Stall, B., et al. Comparison of T2 and FLAIR imaging for target delineation in high grade gliomas. Radiation Oncology. 5, 5 (2010).
- Das, A., et al. Establishing a standardized method for the effective intraoperative collection and biological preservation of brain tumor tissue samples using a novel tissue preservation system: a pilot study. World Neurosurgery. , (2022).
- Zusman, E., et al. Tissues harvested using an automated surgical approach confirm molecular heterogeneity of Glioblastoma and enhance specimen's translational research value. Frontiers in Oncology. 9, (2019).
- McLaughlin, N., et al. Side-cutting aspiration device for endoscopic and microscopic tumor removal. Journal of Neurological Surgery Part B. 73 (1), 11-20 (2012).
