Summary
Detta protokoll beskriver en standardiserad resektion av hjärntumörer hos gnagare genom ett minimalt invasivt tillvägagångssätt med ett integrerat vävnadsbevarande system. Denna teknik har konsekvenser för att exakt spegla vårdstandarden hos gnagare och andra djurmodeller.
Abstract
Detta protokoll beskriver ett standardiserat paradigm för resektion av hjärntumörer hos gnagare och vävnadsbevarande. I klinisk praxis är maximal tumörresektion standardbehandlingen för de flesta hjärntumörer. De flesta för närvarande tillgängliga prekliniska hjärntumörmodeller inkluderar dock antingen inte resektion eller använder kirurgiska resektionsmodeller som är tidskrävande och leder till signifikant postoperativ sjuklighet, dödlighet eller experimentell variation. Dessutom kan det vara skrämmande att utföra resektion hos gnagare av flera skäl, inklusive brist på kliniskt jämförbara kirurgiska verktyg eller protokoll och frånvaron av en etablerad plattform för standardiserad vävnadsinsamling. Detta protokoll belyser användningen av en multifunktionell, icke-ablativ resektionsanordning och ett integrerat vävnadsbevarande system anpassat från den kliniska versionen av enheten. Enheten som används i den här studien kombinerar avstämbar sug och ett cylindriskt blad vid bländaren för att exakt sond-, skär- och sugvävnad. Den minimalt invasiva resektionsanordningen utför sina funktioner via samma burrhål som användes för den initiala tumörimplantationen. Detta tillvägagångssätt minimerar förändringar i regional anatomi under biopsi eller resektionsoperationer och minskar risken för signifikant blodförlust. Dessa faktorer minskade signifikant den operativa tiden (<2 min/djur), förbättrade postoperativ djuröverlevnad, lägre variabilitet i experimentella grupper och resulterade i hög viabilitet hos resekterade vävnader och celler för framtida analyser. Denna process underlättas av en bladhastighet på ~ 1 400 cykler / min, vilket möjliggör skörd av vävnader i ett sterilt slutet system som kan fyllas med en fysiologisk lösning som valts. Med tanke på den framväxande betydelsen av att studera och exakt modellera effekterna av kirurgi, bevarande och rigorös jämförande analys av regionaliserade tumörresektionsprover och intra-kavitetslevererade terapier, kommer detta unika protokoll att utöka möjligheterna att utforska obesvarade frågor om perioperativ hantering och terapeutisk upptäckt för hjärntumörpatienter.
Introduction
Glioblastom (GBM) är den vanligaste och aggressiva primära hjärntumören hos vuxna. Trots de senaste framstegen inom neurokirurgi, riktad läkemedelsutveckling och strålbehandling är 5-årsöverlevnaden för GBM-patienter mindre än 5%, en statistik som inte har förbättrats signifikant på över tre decennier1. Därför finns det ett behov av effektivare behandlingsstrategier.
För att utveckla nya terapier blir det alltmer uppenbart att prövningsprotokoll måste (1) använda översättbara prekliniska modeller som exakt rekapitulerar tumörens heterogenitet och mikromiljö, (2) spegla den vanliga terapeutiska regimen som används hos patienter med GBM, som för närvarande inkluderar kirurgi, strålbehandling och kemoterapi, och (3) redogöra för skillnaden mellan resekterad kärna och rest, invasiva tumörvävnader 2,3,4,5. De flesta av de för närvarande tillgängliga prekliniska hjärntumörmodellerna implementerar dock antingen inte kirurgisk resektion eller använder kirurgiska resektionsmodeller som är relativt tidskrävande, vilket leder till en betydande mängd blodförlust eller saknar standardisering. Dessutom kan det vara utmanande att utföra resektion av gnagarhjärntumörer på grund av brist på kliniskt jämförbara kirurgiska verktyg eller protokoll och avsaknaden av en etablerad plattform6 för systematisk vävnadsinsamling (tabell 1).
Detta protokoll syftar till att beskriva ett standardiserat paradigm för resektion av hjärntumörer hos gnagare och vävnadsbevarande med hjälp av ett multifunktionellt icke-ablativ minimalt invasivt resektionssystem (MIRS) och ett integrerat vävnadsbevarande system (TPS) (figur 1). Det förväntas att denna unika teknik kommer att ge en standardiserad plattform som kan användas i olika studier inom preklinisk forskning för GBM och andra typer av hjärntumörmodeller. Forskare som undersöker terapeutiska eller diagnostiska metoder för hjärntumörer kan implementera detta protokoll för att uppnå en standardiserad resektion i sina studier.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla djurstudier godkändes av University of Maryland och Johns Hopkins University Institutional Animal Care and Use Committee. C57BL/6 honmöss, 6-8 veckors ålder, användes för den aktuella studien. Mössen erhölls från kommersiella källor (se Materialförteckning). Alla föreskrifter för biosäkerhetsnivå 2 (BSL-2) följdes, inklusive användning av masker, handskar och klänningar.
1. Initial intrakraniell tumörimplantation
- I den inledande fasen av studien injicerar varje mus intrakraniellt med 100 000 celler (GL261 murin gliomcellinje) suspenderade i 4 μL fosfatbuffrad saltlösning (1x PBS) till ett djup av 2,5 mm efter den tidigare publicerade rapporten7.
- Kvantifiera tumörsignalen i varje mus med hjälp av in vivo-avbildningssystemet8 9 dagar efter tumörimplantation.
OBS: Om det behövs, stratifiera mössen i två grupper baserat på tumörbörda. I den aktuella studien var de två grupperna: (1) möss med relativt liten tumörbörda (genomsnittlig bioluminescerande signal = 5,5e+006 ± 0,1e+006 fotoner/s, n = 10) och (2) möss med relativt stor tumörbörda (genomsnittlig bioluminescerande signal = 1,69e+007 ± 0,2e+007 fotoner/s, n = 10), (p < 0,05, Mann-Whitney-test)9. - Dela upp varje grupp i två jämförbara undergrupper.
OBS: I denna studie var de två undergrupperna: obehandlade möss (n = 5) och möss med tumörer som genomgår kirurgisk resektion med MIRS (n = 5), (p > 0,05, Mann-Whitney-test)9. - Från och med dagen för resektionen, spåra tumörprogressionen med hjälp av in vivo-avbildningssystemet med en frekvens baserad på tumörtillväxtmönstret.
OBS: För GL261-cellinjen, spåra tumörprogressionen på dagen för resektion och sedan var 3-6: e dag.
2. Tumörresektion med MIRS
- Bedöva musen med en isofluran-O 2-gasblandning i en induktionskammare eller intraperitoneal injektion av xylazin/ketaminlösning.
- Om du använder gasbedövningen, ställ in gasflödeshastigheten till 1,0 ml / min och förångaren till 2,0% för anestesiinduktion, vilket vanligtvis kräver 3-5 minuter i kammaren (se materialtabell).
- Om du använder det injicerbara bedövningsmedlet, bedöva mössen genom att injicera 0,2 ml bedövningslösning (80-100 mg/kg ketamin och 10-12,5 mg/kg xylazin, se Materialförteckning) intraperitonealt.
- Bedöm djuret för adekvat sedering genom att klämma på tån. Applicera oftalmisk salva på ögonen för att undvika torrhet i hornhinnan. Administrera ett smärtstillande medel (0,03-0,06 mg/kg buprenorfin subkutant) före ingreppet.
- Placera musen på den stereotaktiska ramen (se Materialförteckning) när fullständig sedering har bekräftats.
OBS: Om du använder gasbedövningen, placera musens näsa i en näskotte där den fortsätter att ta emot isofluran-O2-blandningen under proceduren (1,5%). - Ta bort den tidigare häftklammern och ta sedan bort håret antingen med en hårborttagningskräm eller genom rakning. Desinficera huden med alternerande cykler av en klorhexidin/betadinbaserad skrubb och alkohol. Använd sedan en steril skalpell och skapa ett 1 cm längsgående snitt i mittlinjen längs det tidigare kirurgiska ärret.
- Fäst MIRS-handstycket på den stereotaktiska armen genom scenadaptern/handstyckeshållaren för förbättrad stabilitet och precision.
- Ställ in MIRS-maskinen (se Materialförteckning) med hjälp av följande inställningar (bild 1).
- Sätt i nätsladden på bakpanelen i nätsladduttaget. Slå på eller av strömmen till systemet genom att växla (1 = PÅ, 0 = AV).
- Sätt i ena änden av kväveslangen (medföljer konsolen) i hanfästet på konsolens bakpanel. Vrid anslutningsmuttern medurs för att dra åt anslutningen.
OBS: Den motsatta änden av slangen måste anslutas till kvävetillförseln. - Innan du fäster slangen på kvävetillförseln, bekräfta att matningstrycket inte överstiger 100 psig, vilket är det ingångsmatningstryck som rekommenderas för konsolen.
OBS: Konsolen kommer att generera sin egen aspiration när den aktiveras av fotpedalen när kvävet har levererats till konsolen. - Säkra locket på vakuumporten och täta det för att undvika läckage i vakuumsystemet. Eventuella läckor i aspirationssystemet kommer att påverka MIRS-konsolens prestanda.
- Om aspirationen är under 17 under installationen eller grundningen, kontrollera att aspirationsvredet på konsolens framsida är inställt på maximal nivå (100), se till att det inte finns något läckage i aspirationssystemet och bekräfta att tillförseltrycket för kvävetillförsel är korrekt.
- För att ansluta fotpedalen till konsolen, sätt in den grå fotpedalkontakten i det grå facket tills den klickar och passar på plats.
OBS: Fotpedalkontakten ansluts till konsolen i en riktning och den är knappad. - För att ansluta handstycket till konsolen, sätt in den blå handstyckekontakten i det blå facket tills det klickar och passar på plats.
OBS: Handstyckekontakten ansluts till konsolen i en riktning och den är knappad. - Fyll på varje handstycke innan du använder systemet genom att suga steril vätska från en liten skål i öppningen, genom slangen och handstycket och sedan in i kapseln för att säkerställa att insidan av slangen och handstycket smörjs för att minska vävnadsacklusionerna.
- Förbered dig på aspiration ensam eller aspiration med skärning genom att välja lämpligt läge på konsolens frontpanel. Starta med fotpedalen.
- Sätt i 23 G MIRS-kanylen i burrhålet till ett djup av 2,5 mm.
- Starta resektionsprocessen genom att trycka ner fotpedalen som är ansluten till kanylen. Utför en hel cykel (360 °) eller mer av resektion med hjälp av kontrollratten i handstycket.
OBS: Ju fler cykler som utförs, desto mer volym tumörvävnad resekteras. - När resektionsprocessen är klar, dra ut 23 G MIRS-kanylen från burrhålet och använd 5 ml 1x PBS för att spola slangen och lossa eventuellt kvarvarande skräp.
- Ta bort musen från den stereotaktiska ramen och stäng såret med en häftapparat eller 4-0 sutureringsmaterial (se Materialförteckning).
- Placera musen på en värmedyna eller under ett värmande ljus under återhämtning från anestesi innan du återför den till buret.
- När experimentet är klart, rensa kanylen via spolning. Växla med kylda medier och luft för att "skjuta" all resekterad vävnad tillbaka till uppsamlingsbehållaren. Ta bort uppsamlingsbehållaren från systemet och täck av med det medföljande locket.
- Efter att ha slutfört steg 2.12, placera kanylens distala spets i 3%H2O2och applicera sug vid 24-25 i Hg för att fylla sugledningen tillbaka till suguppsamlingsbehållaren och låt stå i 60-90 s. Spola med sterila medier som pulserar luft och media intermittent.
- Övervaka mössen för eventuella neurologiska tecken (onormala oregelbundna rörelser eller anfall) efter proceduren.
- Avliva mössen med svåra neurologiska funktionsnedsättningar (bli slöa, ha ett snyggt utseende, böjd rygg eller ha oregelbundna rörelser).
OBS: För den aktuella studien användes 200 mg/kg av en kommersiellt tillgänglig dödshjälpslösning (se materialtabell) för att avliva varje mus.
3. Vävnadsinsamling via TPS
- Sänk ner tumörprovet i en vävnadsodlingsskål som innehåller ett RBC-lysmedium (se materialtabell) i 5 minuter vid rumstemperatur.
OBS: Vävnaden som skördas från MIRS till TPS kommer främst att vara i form av enstaka celler tillsammans med små bitar av vävnad. - Placera ett 70 μm filter (se materialtabell) på ett 50 ml koniskt rör och använd en kolv med en 5 ml spruta för att föra tumörprovet genom filtret.
- Använd RPMI-1640-mediet med en överföringspipett för att underlätta passagen av celler och eventuell vävnadsmassa genom filtret.
- Centrifugera vid 428 x g i 5 minuter vid 4 °C. Kassera supernatanten med en pipett.
- Återsuspendera varje prov i 5 ml beredd RPMI-1640-medium.
- För att öka vävnadens livskraft, särskilt om stora vävnadsbitar visualiseras vid första intrycket, lägg till de nödvändiga volymerna av enzymcocktailen (innehållande DNAse I, kollagenas IV, dispase, Papain och EDTA, se materialförteckning) till varje prov. Använd virveln för att blanda lösningarna.
OBS: Steg 3.6 är valfritt. Enzymcocktailens sammansättning (för en total volym på 5 ml/prov): 300 μL DNAse I grad II, 150 μL kollagenas/dispase (klyver fibronektin, kollagenas IV, I och icke-polära aminosyror), 250 μl papain (ospecifikt proteas) och 6 μl 0,5 M EDTA. - Placera proverna i en skakinkubator vid 200 rpm, 37 °C i 20 minuter.
- Efter 20 minuter snurrar du proverna vid 428 x g i 5 min vid 4 °C. Kassera supernatanten.
- Filtrera enstaka celler genom en 70 μm cellsil och snurra ner vid 274 x g i 3 minuter vid 4 °C. Utför cellviabilitetsanalys10 med Trypan Blue och Hemocytometer (se Materialförteckning).
OBS: Dag 0 livskraften varierar från 30% -70% och ökar avsevärt inom 2-3 dagar. - Fortsätt till steg 4, 5 eller 6, beroende på vilket viabilitetstest som behövs.
4. Växande celler i vidhäftande kultur
- I en certifierad laminär flödeshuv, återsuspendera pelleten i seruminnehållande vidhäftande medium (såsom DMEM, 10% fetalt bovint serum (FBS) och 1% penicillin / streptomycin (P / S) lösning) och plattceller i en vidhäftande cellkolv.
- Håll cellerna i en kontrollerad inkuberad miljö (37 °C, 5 %CO2).
5. Växande celler i suspensionsodling (neurosfärer)
- I en certifierad laminär flödeshuv, återsuspendera pelleten i serumfritt komplett stamcellsmedium11 och platta i en suspensionskolv.
- Håll cellerna i en kontrollerad inkuberad miljö (37 °C, 5% CO 2) i2-3 dagar för att möjliggöra neurosfärbildning.
- Efter visualisering av neurosfärerna i odlingsmediet, använd Trypsin-EDTA eller Accutase (se materialtabell) för att erhålla encelliga suspensioner för passering.
OBS: Så länge särskild försiktighet iakttas under skörden och lämpliga medier som stöder neurala stamceller används, måste stamcellerna i den skördade vävnaden bilda neurosfärer inom några dagar.
6. Förbereda celler för reimplantation
- Återsuspendera pelleten i en koncentration av 100 000 levande celler per 4 μl 1x PBS.
- Injicera omedelbart i naiva möss med hjälp av den intrakraniella tumörimplantationsmetoden (steg 1).
7. Histologisk analys
- Omedelbart efter resektion, extrahera och fixera hjärnorna i 4% paraformaldehyd (PFA) i 24 timmar12.
- Överför hjärnan till en 30% sackaroslösning tills de är mättade med sackaros (nedsänkt ner till botten av behållaren).
- Överför hjärnan till en 70% etanollösning.
- Utför paraffinblockinbäddning, sektionering och standardfärgning av hematoxylin och eosin (H&E) efter tidigare publicerad rapport13.
OBS: Tjockleken på varje sektion som togs för färgning var 10 μm.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Kirurgisk resektion med MIRS resulterar i en signifikant minskning av tumörbördan
I gruppen med en mindre tumörbörda var den genomsnittliga bioluminescerande signalen vid baslinjen 5,5e+006 fotoner/s ± 0,2e+006 i undergruppen som genomgick resektion. Efter resektion minskade den genomsnittliga bioluminescerande signalen till 3,09e+006 fotoner/s ± 0,3e+006, (p <0,0001, Mann-Whitney-test)9 (Figur 2). Den bioluminescerande signalen ökade under de följande dagarna tills mössen avlivades. På samma sätt, i gruppen med en större tumörbörda, var den genomsnittliga bioluminescerande signalen vid baslinjen 1,68e+007 fotoner/s ± 0,1e+007 i undergruppen som genomgick resektion. Efter resektion minskade den genomsnittliga bioluminescerande signalen till 5,19e+006 fotoner/s ± 0,2e+006, (p <0,0001, Mann-Whitney-test)9. Den bioluminescerande signalen ökade under de följande dagarna tills mössen avlivades.
Resektion med MIRS kan justeras för önskad resektionsvolym
Vid pre-resektionsavbildning av syngena CT2A-tumörer kan tumören i allmänhet identifieras som en heterogen massa vid inokuleringsstället med störd parenkymal arkitektur och peritumoralt ödem och blödning indikerat av heterogena områden med T2-viktad (T2w) hypo- och hyperintensitet. Nålspåret som används för stereotaktisk tumörcellsinjektion kan identifieras på T2w MR-skanningar14.
Resektionshålan kan identifieras vid T2w MR-skanningar efter resektion som ett stort runt hypoineninområde vid tumörinokuleringsstället (figur 3). Resektionsproceduren orsakade inte signifikant blodförlust eller störning av den omgivande hjärnarkitekturen. I vissa fall ackumuleras vätska i resektionshålan. Som visas i figur 4 ökade resektionsvolymen signifikant från 9,4 mm 3 för en rotation av skäröppningen till 23,2 mm3 för två rotationer (p = 0,0117), vilket möjliggjorde justering av volymresektion för att optimera för en känd tumörbörda.
Tumörresektion med MIRS leder till en 7-dagars förlängning av medianöverlevnaden hos tumörbärande möss utan att inducera några neurologiska tecken
Som visas i figur 5 var det en förlängning av överlevnaden hos möss som genomgick kirurgisk resektion i båda grupperna med små (6 dagar) och stora (7 dagar) tumörer. I gruppen med en mindre tumörbörda var medianöverlevnaden för kontrollundergruppen 16 dagar, medan medianöverlevnaden för undergruppen som genomgick resektion var 22 dagar (p = 0,0044). På samma sätt, i gruppen med en större tumörbörda, var medianöverlevnaden för kontrollundergruppen 12 dagar, medan medianöverlevnaden för undergruppen som genomgick resektion var 19 dagar (p = 0,0043). Dessutom visade ingen av mössen som genomgick resektion med MIRS några tecken på neurologisk skada efter proceduren. Detta indikerar att MIRS kan uppnå säker resektion.
Den resekterade vävnaden som använder MIRS har hög in vitro- och in vivo-viabilitet
Celler som extraherades från den resekterade vävnaden filtrerades, kvantifierades och återsuspenderades i lämpligt medium (figur 6) innan in vitro - eller in vivo-livskraftsexperiment utfördes. För att undersöka cellernas in vitro-livskraft och för att bekräfta resektion av tumören och inte normalt hjärnparenkym odlades celler i suspensionskultur. Neurosfärbildning, en indikator för tumörinitieringspotential, inträffade med minimal vävnadsbehandling efter resektion. Detta föreslog att MIRS-plattformen skördade väl dissocierad vävnad och hade minimal inverkan på hälsan och livskraften hos den resekterade vävnaden. Prover tagna direkt från TPS till ljusmikroskopi verkade främst vara i form av enstaka celler tillsammans med närvaron av några små bitar av vävnad. Dag 0-viabiliteten varierade från 30% -70% (detta representerar livskraften efter att ha passerat provet genom ett 70 μm-filter och före plätering). Resektionsanordningen har en skäröppning som kan rotera 360 ° på resektionssondens axel, vilket möjliggör resektion av koncentriska vävnadsvolymer. I genomsnitt kan 2-3 miljoner celler skördas med en 360 ° vridning av skäröppningen, cirka 7 miljoner celler med två varv och totalt 12-14 miljoner celler kan erhållas med tre 360 ° varv av skäröppningen. Efter plätering i suspensionskolvar innehållande serumfritt komplett stamcellsmedium var neurosfärer synliga genom ljusmikroskopi dag 2 och med blotta ögat vid dag 7 (figur 7).
För att undersöka in vivo-viabiliteten implanterades extraherade celler intrakraniellt i naiva C57BL/6-möss (n = 8 möss, 100 000 levande celler/mus). Tumörtillväxt bekräftades med hjälp av in vivo-avbildningssystemet. Tumörsignalen fortsatte att öka tills alla djur avlivades vid dag 14 efter tumörimplantation (medianöverlevnad på 11 dagar).
Den representativa H&E-vävnadssektionen (figur 3B) innehåller en klar, cirkulär resektionshålighet med en kant av blodprodukter (djuprosa), inflammation och kvarvarande tumörceller (mörklila celler). Makroskopiskt är de kvarvarande tumörcellerna mesenkymala till sin natur och infiltrativa och uppvisar omfattande perivaskulär invasion och spridning. Mikroskopiskt identifierades markerade nukleära atypier och mitotiska figurer. Tumörassocierade makrofager identifierades också runt områden med infarkterad vävnad och mikroblödningar. Vävnadsarkitekturen i det omgivande hjärnparenkymet verkade inte vara störd.
Bild 1: MIRS-systeminställning . (A) Minimalt invasivt resektionssystem (MIRS) för hjärntumör i gnagarmodeller med ett integrerat vävnadsbevarande system. (B) Frontpanelen på MIRS-konsolen. 1 = Systemeffekt, 2 = fotpedal, 3 = Prime Button, 4 = aspiration, 5 = aspirationsnivå kontrollratt, 6 = aspirationsnivåindikator, 7 = handstycke, 8 = skärare aktivera knapp. (C) Bakpanelen på MIRS-konsolen. 1 = Nätsladduttag, 2 = Effektbrytare, 3 = Tillförsel av kväve. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2: Förändringar i genomsnittlig tumörbörda hos möss med obehandlade tumörer jämfört med möss som genomgår resektion av tumörer av MIRS. (A) Möss med liten baslinjetumörbörda och (B) möss med stor baslinjetumörbörda (p < 0,0001, SD ≤0,3e+006 i alla grupper vid varje tidpunkt och för liten för att visas i diagrammet). Djur gav antingen efter för tumörbördan eller avlivades. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3: MR- och H&E-analys. (A) Pre- och post-resektion T2-viktade hjärn-MR-bilder och (B) en representativ H&E-färgad koronal hjärnsektion som visar en klar, cirkulär resektionshålighet med en kant av blodprodukter (djuprosa), inflammation och kvarvarande tumörceller (mörklila celler). MR-bilder och H&E-sektioner erhölls omedelbart efter resektion. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 4: Bestämning av tumörresektionsvolym. De genomsnittliga volymerna beräknade från MR-bilder av resektionshåligheter skapade med en vs. två rotationer av skäröppningen, n = 4 per grupp. p = 0,01, tvåsidigt T-test. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 5: Kaplan-Meier-kurvor hos möss med obehandlade tumörer kontra möss som genomgår resektion av tumörer av MIRS . (A) Möss med liten baslinjetumörbörda. (B) Möss med stor tumörbörda vid baslinjen. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 6: Viabilitetstest av de resekterade tumörcellerna . (A) Representativa ljusmikroskopibilder av vävnad som skördats med MIRS dag 0 vid 20x. (B) Kaplan-Meier-kurvan som beskriver mössens överlevnad efter intrakraniell implantation av celler skördade från resekterad vävnad. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 7: Bildning av neurosfärer. Representativa ljusmikroskopibilder av neurosfärer genererade från resekterad vävnad på dag 2 efter resektion vid (A) 20x och (B) 10x, och på dag 7 efter resektion vid (C) 20x och (D) 10x. Klicka här för att se en större version av denna figur.
| Minimalt invasivt resektionssystem | Historisk resektion | |||
| Operativ tid och färdigheter | Minimal driftstid (<2 min för varje djur). Minimala färdigheter behövs. | Kirurgisk tid är inte standardiserad och kirurgisk erfarenhet av små djur och mikrokirurgi är fördelaktigt. | ||
| Blodförlust | Minimal | Oförutsägbar | ||
| Standardiserad volym av resektion | Resektionsvolymen bestämd/justerad av resektionsverktygets antal rotationer | Volymen varierar kraftigt mellan försökspersonerna | ||
Tabell 1: Jämförelse mellan det minimalt invasiva resektionssystemet (MIRS) och historiska kirurgiska resektionsmodeller.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Tumörresektion är en hörnsten i neurokirurgiska onkologiska behandlingsplaner för både låggradiga och högkvalitativa hjärntumörer. Cytoreduktion och debulking av tumören korrelerar med förbättrad neurologisk funktion och total överlevnad hos patienter med hjärntumörer 1,2,5,6. Även om protokoll för kirurgisk resektion tidigare har beskrivits i gnagarmodeller, har dessa protokoll lidit av flera begränsningar som kan förvirra de genererade resultaten och den övergripande översättningsbarheten för den prekliniska modellen. Till exempel har tidigare rapporterade kirurgiska resektionsprotokoll inkluderat en kraniotomi med 3-4 små burrhål för att skapa en benflik och sedan skicklig distinktion och differentiering av tumörens färg och konsistens jämfört med normal hjärnvävnad6. Dessa protokoll är tidskrävande och kräver att forskningspersonalen har avancerade färdigheter i att använda det kirurgiska mikroskopet, hantera kirurgiska instrument, identifiera tumörgränserna för den omgivande normala hjärnvävnaden och uppnå adekvat homeostas. Sådana förfaranden leder ofta till betydande blodförlust och djurdöd. Dessutom kan det vara utmanande att uppnå standardiserad resektion med jämförbara volymer av tumörvävnad resekterad över olika djur i samma experiment. Denna kontinuitet och enhetlighet blir mer utmanande med flera personal som utför proceduren.
Däremot tar MIRS-protokollet som beskrivs här bort dessa begränsningar (tabell 1). Detta protokoll kräver ett minimalt invasivt tillvägagångssätt genom samma burrhål som används för initial tumörimplantation. Som beskrivs i protokollavsnittet kan resektionsverktyget installeras på en stereotaktisk ram som möjliggör exakt införande av kanylen i tumörhålan. Bladets hastighet och antalet utförda resektionscykler kan enkelt justeras genom ett handstycke som används av forskningspersonalen för att kontrollera volymen av tumör som resekteras på ett standardiserat sätt utan att orsaka en betydande mängd blodförlust.
Som noterats i resultaten visade mössen som genomgick resektion med MIRS-enheten förlängd överlevnad jämfört med kohorten av möss med oresekterade tumörer. Detta, tillsammans med data, visar att tumörbördan minskade signifikant i den resekterade gruppen jämfört med den oresekterade kontrollgruppen, vilket indikerar att MIRS-enheten effektivt debulkar tumören med minimal störning av omgivande friska hjärnvävnader. Vidare, under dagarna efter resektion, utvecklades tumörbördan stadigt på grund av närvaron av en kvarvarande tumör och den infiltrativa karaktären hos CT-2A-tumörcellinjen. MIRS-modellen kan således replikera debulkingprocessen av infiltrativa tumörtyper, som kan följas med kemoterapeutik eller strålbehandling för att närmare spegla behandlingsregimen i humana hjärntumörbehandlingsprotokoll15,16,17.
Som det är fallet med alla suganordningar kan igensättning av aspirationsslangen vara en av begränsningarna i MIRS-systemet. Detta kan uppstå på grund av ansamling av torr vävnad eller blod under eller efter användning av maskinen. För att undvika detta, omedelbart i slutet av varje session med resektioner, rekommenderas att rensa handstyckets kanyl genom att spola med kylda medier alternerande med luft för att "trycka" all resekterad vävnad till uppsamlingsbehållaren, följt av spolning med 3%H2O2. Detta kommer att fånga all vävnad som förvärvats under resektion och säkerställa att ingen finns kvar i kanylen eller slangen. Dessutom, om systemet inte aspirerar / skär, kan det bero på att handstycket inte är inkopplat, resektionskanylskäraren inte är påslagen, aspirationslinjen från konsolen är inte ansluten till kapseln, kapsellocket är inte tätt eller fotpedalen är inte inkopplad.
Dessutom, medan vi har visat att MIRS kan användas för effektiv och standardiserad resektion med hög in vitro - och in vivo-livskraft hos den resekterade vävnaden, uppmuntras framtida studier att ytterligare undersöka andra aspekter av att implementera sådana system i hjärntumörforskning. Dessa inkluderar att undersöka effekten av resektionsprocessen på de molekylära och cellulära komponenterna i tumörmassan och tumörmikromiljön. Dessutom behövs studier för att bekräfta att den resekterade vävnaden med hjälp av MIRS-enheten rekapitulerar föräldratumören15.
Sammanfattningsvis beskrivs ett protokoll för ett minimalt invasivt tillvägagångssätt för standardiserad kirurgisk resektion i en gnagare hjärntumörmodell som är kopplad till ett integrerat och automatiserat vävnadsbevarande system. Detta protokoll banar väg mot att etablera mycket translationella och prediktiva prekliniska hjärntumörforskningsmodeller. Framtida tillämpningar av detta protokoll kan potentiellt inkludera prekliniska studier som undersöker olika terapeutiska eller diagnostiska modaliteter för hjärntumörer som kan implementera detta protokoll för att uppnå en standardiserad resektion.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
BT har forskningsfinansiering från NIH och är delägare i Accelerating Combination Therapies*, och Ashvattha Therapeutics Inc. GW har NIH-finansiering (R01NS107813). HB är betald konsult till Insightec och ordförande i bolagets Medical Advisory Board. Detta arrangemang har granskats och godkänts av Johns Hopkins University i enlighet med dess policy för intressekonflikter. HB har forskningsfinansiering från NIH, Johns Hopkins University och filantropi och är konsult för CraniUS, Candel Therepeutics, Inc., Accelerating Combination Therapies*, Catalio Nexus Fund II, LLC*, LikeMinds, Inc*, Galen Robotics, Inc.* och Nurami Medical*. (*inkluderar eget kapital eller optioner).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1 mL syringes | BD | 309628 | |
| 15 mL conical tubes | Corning | 430052 | |
| 200 proof ethanol | PharmCo | 111000200 | |
| 5 mL pipettes | CoStar | 4487 | |
| 70 micron filter | Fisher | 08-771-2 | |
| Accutase | Millipore Sigma | SIG-SCR005 | |
| Anased (Xylazine injection, 100 mg/mL) | Covetrus | 33198 | |
| Anesthesia System | Patterson Scientific | 78935903 | |
| Anesthesic Gas Waste Container | Patterson Scientific | 78909457 | |
| Bench protector underpad | Covidien | 10328 | |
| C57Bl/6, 6-8 week old mice | Charles River Laboratories | Strain Code 027 | |
| ChroMini Pro | Moser | Type 1591-Q | |
| Collagenase-Dispase | Roche | #10269638001 | |
| Countess II Automated Cell Counter | Thermo Fisher | ||
| Countess II FL Hemacytometer | Thermo Fisher | A25750 | |
| Debris Removal Solution | Miltenyi Biotech | #130-109-398 | |
| D-Luciferin | Goldbio | LUCK-1G | |
| DMEM F12 media | Corning | 10-090-CV | |
| DMEM media | Corning | 10-013-CV | |
| DNAse I | Sigma Aldrich | #10104159001 | |
| Eppendorf tubes | Posi-Click | 1149K01 | |
| Euthanasia solution | Henry Schein | 71073 | |
| FBS | Millipore Sigma | F4135 | |
| Fetal Bovine Serum | Thermo Fisher | 10437-028 | |
| Formalin | Invitrogen | INV-28906 | |
| Gauze | Henry Schein | 101-4336 | |
| hEGF | PeproTech EC | 100-15 | |
| Heparin | Sigma | H-3149 | |
| hFGF-b | PeproTech EC | 1001-18B | |
| Induction Chamber | Patterson Scientific | 78933388 | |
| Isoflurane | Covetrus | 11695-6777-2 | |
| Isoflurane Vaporizer | Patterson Scientific | 78916954 | |
| Ketamine | Covetrus | 11695-0703-1 | |
| Kopf Stereotactic frame | Kopf Instruments | 5001 | |
| Lightfield Microscope | BioTek | Cytation 5 | |
| Microinjection Unit | Kopf | 5001 | |
| Micromotor drill | Foredom | F210418 | |
| MRI system | Bruker | 7T Biospec Avance III MRI Scanner | |
| NICO Myriad System | NICO Corporation | ||
| Ophthalmic ointment | Puralube vet ointment | ||
| Papain | Sigma Aldrich | #P4762 | |
| PBS | Invitrogen | #14190250 | |
| PenStrep | Millipore Sigma | N1638 | |
| Percoll solution | Sigma Aldrich | #P4937 | |
| Pipette controller | Falcon | A07260 | |
| Povidone-iodine solution | Aplicare | 52380-1905-08 | |
| Progesterone | Sigma | P-8783 | |
| Putrescine | Sigma | P-5780 | |
| RPMI Media | Invitrogen | INV-72400120 | |
| Scalpel blade | Covetrus | 7319 | |
| Scalpel handle | Fine Science Tools | 91003-12 | |
| Skin marker | Time Out | D538,851 | |
| Staple remover | MikRon | ACR9MM | |
| Stapler | MikRon | ACA9MM | |
| Staples | Clay Adams | 427631 | |
| Stereotactic Frame | Kopf Instruments | 5000 | |
| Sucrose | Sigma Aldrich | S9378 | |
| Suture, vicryl 4-0 | Ethicon | J494H | |
| T-75 culture flask | Sarstedt | 83-3911-002 | |
| TheraPEAKTM ACK Lysing Buffer (1x) | Lonza | BP10-548E | |
| Trypsin-EDTA | Corning | MDT-25-053-CI |
References
- Mineo, J. F., et al. Prognosis factors of survival time in patients with glioblastoma multiforme: a multivariate analysis of 340 patients. Acta Neurochirurgica. 149 (3), 245-252 (2007).
- Miyai, M., et al. Current trends in mouse models of glioblastoma. Journal of Neuro-Oncology. 135 (3), 423-432 (2017).
- Raj, D., Agrawal, P., Gaitsch, H., Wicks, E., Tyler, B. Pharmacological strategies for improving the prognosis of glioblastoma. Expert Opinion on Pharmacotherapy. 22 (15), 2019-2031 (2021).
- Alomari, S., et al. Drug repurposing for Glioblastoma and current advances in drug delivery-a comprehensive review of the literature. Biomolecules. 11 (12), 1870 (2021).
- Serra, R., et al. Combined intracranial Acriflavine, temozolomide and radiation extends survival in a rat glioma model. European Journal of Pharmaceutics and Biopharmaceutics : Official Journal of Arbeitsgemeinschaft fur Pharmazeutische Verfahrenstechnik eV. 170, 179-186 (2022).
- Tang, B., Foss, K., Lichtor, T., Phillips, H., Roy, E.
- Ozawa, T., James, C. D. Establishing intracranial brain tumor xenografts with subsequent analysis of tumor growth and response to therapy using bioluminescence imaging. Journal of Visualized Experiments. (41), e1986 (2010).
- Poussard, A., et al. In vivo imaging systems (IVIS) detection of a neuro-invasive encephalitic virus. Journal of Visualized Experiments. (70), e4429 (2012).
- Lachin, J. M.
- Louis, K. S., Siegel, A. C. Cell viability analysis using trypan blue: manual and automated methods. Methods in Molecular Biology. 740, 7-12 (2011).
- Spina, R., Voss, D. M., Asnaghi, L., Sloan, A., Bar, E. E. Flow cytometry-based drug screening system for the identification of small molecules that promote cellular differentiation of Glioblastoma stem cells. Journal of Visualized Experiments. (131), e56176 (2018).
- Rodgers, G., et al. Virtual histology of an entire mouse brain from formalin fixation to paraffin embedding. Part 2: Volumetric strain fields and local contrast changes. Journal of Neuroscience Methods. 365, 109385 (2022).
- Connolly, N. P., et al. Elevated fibroblast growth factor-inducible 14 expression transforms proneural-like gliomas into more aggressive and lethal brain cancer. GLIA. 69 (9), 2199-2214 (2021).
- Stall, B., et al. Comparison of T2 and FLAIR imaging for target delineation in high grade gliomas. Radiation Oncology. 5, 5 (2010).
- Das, A., et al. Establishing a standardized method for the effective intraoperative collection and biological preservation of brain tumor tissue samples using a novel tissue preservation system: a pilot study. World Neurosurgery. , (2022).
- Zusman, E., et al. Tissues harvested using an automated surgical approach confirm molecular heterogeneity of Glioblastoma and enhance specimen's translational research value. Frontiers in Oncology. 9, (2019).
- McLaughlin, N., et al. Side-cutting aspiration device for endoscopic and microscopic tumor removal. Journal of Neurological Surgery Part B. 73 (1), 11-20 (2012).
