Summary
Veel opgereguleerde genen stimuleren de migratie en invasie van tumorcellen, wat leidt tot een slechte prognose. Het is van cruciaal belang om te bepalen welke genen de migratie en invasie van tumorcellen reguleren. Dit protocol presenteert een methode om de effecten van de verhoogde expressie van een gen op de migratie en invasie van tumorcellen in realtime te onderzoeken.
Abstract
Tumorcellen zijn zeer beweeglijk en invasief en vertonen veranderde genexpressiepatronen. Kennis van hoe veranderingen in genexpressie de migratie en invasie van tumorcellen reguleren, is essentieel voor het begrijpen van de mechanismen van tumorcelinfiltratie in naburige gezonde weefsels en metastase. Eerder werd aangetoond dat gen-knockdown, gevolgd door de impedantie-gebaseerde real-time meting van tumorcelmigratie en -invasie, de identificatie van de genen mogelijk maakt die nodig zijn voor tumorcelmigratie en -invasie. Onlangs hebben de mRNA-vaccins tegen SARS-CoV-2 de belangstelling voor het gebruik van synthetisch mRNA voor therapeutische doeleinden vergroot. Hier werd de methode met synthetisch mRNA herzien om het effect van genoverexpressie op de migratie en invasie van tumorcellen te bestuderen. Deze studie toont aan dat verhoogde genexpressie met synthetische mRNA-transfectie gevolgd door impedantie-gebaseerde real-time meting kan helpen bij het identificeren van de genen die de migratie en invasie van tumorcellen stimuleren. Dit methodedocument geeft belangrijke details over de procedures voor het onderzoeken van het effect van veranderde genexpressie op de migratie en invasie van tumorcellen.
Introduction
De beweeglijkheid van tumorcellen speelt een cruciale rol bij metastase 1,2. De verspreiding van tumorcellen naar naburige en afgelegen gezonde weefsels maakt de behandeling van kanker moeilijk en draagt bij aan recidief 3,4. Daarom is het essentieel om de mechanismen van de beweeglijkheid van tumorcellen te begrijpen en relevante therapeutische strategieën te ontwikkelen. Aangezien veel tumorcellen veranderde genexpressieprofielen hebben, is het cruciaal om te begrijpen welke veranderingen in het genexpressieprofiel leiden tot een veranderde beweeglijkheid van de tumorcellen 5,6.
Er zijn verschillende testen ontwikkeld om celmigratie in vitro te meten. Sommige tests bieden slechts beperkte informatie omdat metingen alleen op specifieke tijdstippen mogelijk zijn, terwijl andere uitgebreide informatie bieden over de beweeglijkheid van tumorcellen in realtime7. Hoewel veel van deze tests op het gebied van celmotiliteit kwantitatieve resultaten kunnen opleveren op een bepaald moment of het eindpunt, geven ze onvoldoende gedetailleerde informatie over dynamische veranderingen in de snelheid van celmigratie gedurende de experimentele periode. Bovendien kan het moeilijk zijn om mogelijke veranderingen in de celmigratiesnelheid te onderzoeken, afhankelijk van het experimentele ontwerp, de celtypen en het aantal cellen. Bovendien kunnen de effecten van ongecompliceerde behandelingen worden onderzocht door de eenvoudige kwantificering van traditionele motiliteitstests, maar meer geavanceerde kwantificering kan nodig zijn om de complexe effecten van verschillende gecombineerde behandelingen te bestuderen8.
Er is een instrument ontwikkeld voor het bewaken van de elektrische stroom van een microtiterplaat die goed is bedekt met micro-elektroden9. De hechting van cellen aan het oppervlak van de put belemmert de elektronenstroom en de impedantie correleert met de kwantitatieve en kwalitatieve binding van de cellen. De aanwezigheid van de micro-elektroden op de bodem van de put maakt het mogelijk om de adhesie, verspreiding en proliferatie van cellen te meten. De aanwezigheid van de micro-elektroden onder een microporeus membraan van de bovenste kamer maakt het mogelijk om celmigratie en invasie in de onderste kamer te meten, waarbij de bovenste kamer is gecoat met extracellulaire matrix (ECM)-eiwitten om invasie mogelijk te maken10.
Eerder werd aangetoond dat op impedantie gebaseerde real-time metingen van tumorcelmigratie en -invasie real-time gegevens opleveren tijdens het hele experiment, evenals onmiddellijke vergelijkingen en kwantificeringen onder verschillende experimentele omstandigheden11. In dat methodedocument werd gen-knockdown geïnduceerd om de rol van eiwitten die van belang zijn bij de migratie en invasie van tumorcellen te testen. Aangezien een volwaardig gen-knockdown-effect onder de geteste experimentele omstandigheden 3-4 dagen duurde na elektroporatie met kleine interfererende RNA's (siRNA's)8, werden de cellen na de elektroporatie opnieuw geplateerd en 3 dagen later opnieuw geoogst voor de impedantie-gebaseerde real-time meting van tumorcelmigratie en -invasie.
CT10-regulator van kinase (Crk) en Crk-like (CrkL) zijn adaptoreiwitten die eiwit-eiwitinteracties stroomafwaarts van verschillende groeifactorreceptorkinaseroutes en niet-receptortyrosinekinaseroutes bemiddelen12. Verhoogde niveaus van Crk- en CrkL-eiwitten dragen bij aan een slechte prognose bij verschillende vormen van kanker bij de mens, waaronder glioblastoom13. Het is echter onduidelijk hoe verhoogde Crk- en CrkL-eiwitten leiden tot een slechte prognose. Daarom is het belangrijk om het effect van Crk- en CrkL-overexpressie op tumorcelfuncties te definiëren. Eerder werd een gen-knockdown-studie uitgevoerd om aan te tonen dat endogene niveaus van Crk- en CrkL-eiwitten nodig zijn voor glioblastoomcelmigratie en -invasie8. Hier is een aangepast testsysteem ontwikkeld om het effect van Crk- en CrkL-overexpressie op de migratie en invasie van tumorcellen aan te pakken.
Onlangs hebben de in vitro synthese van mRNA en de therapeutische toepassingen ervan hernieuwde aandacht getrokken door de ontwikkeling van de mRNA-vaccins tegen SARS-CoV-2 (beoordeeld door Verbeke et al.14). Bovendien is er opmerkelijke vooruitgang geboekt bij het gebruik van synthetisch mRNA bij kanker en andereziekten15,16. De elektroporatie van cellen is een effectieve methode om synthetisch mRNA af te leveren en voorbijgaande genetische modificatie te induceren (beoordeeld door Campillo-Davo et al.17), en het gebruik van synthetisch mRNA maakt snelle en efficiënte genexpressie in onsterfelijke fibroblasten mogelijk 18. Dit methodedocument combineert genoverexpressie met behulp van synthetisch mRNA met real-time celanalyses om migratie en invasie van tumorcellen te bestuderen. Het experimentele schema dat voor siRNA's wordt gebruikt, werkt echter niet met synthetische mRNA-transfectie, omdat het niveau van exogene eiwitten snel toeneemt en geleidelijk afneemt bij synthetische mRNA-transfectie18. Daarom is de methode aangepast om de real-time analyse van celmigratie en -invasie direct na de transfectie uit te voeren zonder de cellen extra te kweken.
Dit methodedocument toont aan dat het combineren van impedantie-gebaseerde real-time metingen met de transfectie van tumorcellen met synthetische mRNA's een snelle en uitgebreide analyse oplevert van de effecten van gen-upregulatie op tumorcelmigratie en -invasie. Dit methodedocument beschrijft gedetailleerde procedures om te meten hoe de migratie en invasie van glioblastoomcellen worden beïnvloed door de overexpressie van Crk en CrkL. Door de concentratie-afhankelijke effecten van synthetisch mRNA op tumorcelmigratie te onderzoeken, beschrijft het artikel duidelijk hoe een toename van eiwitniveaus de migratie van tumorcellen stimuleert. Daarnaast wordt een benadering gepresenteerd om de concentratie van de ECM-gel te variëren om de effecten van veranderingen in genexpressie op tumorcelinvasie te beoordelen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
1. Synthese van mRNA
OPMERKING: Voor de mRNA-synthese moeten alle reagentia en apparatuur speciaal worden behandeld om de RNases vóór gebruik te inactiveren. Zie de materiaaltabel voor meer informatie over alle materialen, instrumenten en reagentia die in dit protocol worden gebruikt.
- Linearisatie van DNA
OPMERKING: Muizen-cDNA's van CrkI en CrkL werden gekloond in de pFLAG-CMV-5a-expressievector om de FLAG-epitooptag toe te voegen aan de C-terminus en gesubkloneerd in de pcDNA3.1/myc-His-vector om de T7-promotor op te nemen, zoals eerder beschreven 18,19.- Voeg 10 μL 10x reactiebuffer, 1,5 μL PmeI (10.000 eenheden/ml) en 10 μg plasmide-DNA toe aan een microcentrifugebuis om het plasmide-DNA te lineariseren met het restrictie-enzym. Voeg nucleasevrij water toe om het reactievolume op 100 μL te brengen.
- Meng door te tikken, draai het naar beneden en incubeer het reactiemengsel een nacht bij 37 °C.
- Draai naar beneden en voeg 5 μL 10% natriumdodecylsulfaat (SDS) en 1 μL proteïnase K (20 mg/ml, RNA-kwaliteit) toe aan het reactiemengsel. Klop door te tikken, draai naar beneden en incubeer gedurende 30 minuten bij 50 °C.
- Voeg onder de zuurkast 100 μL van de onderste fase fenol:chloroform:isoamylalcohol toe aan het plasmidereactiemengsel voor extractie. Vortex, en centrifugeer vervolgens bij 18.800 × g gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur. Verplaats de bovenste fase naar een nieuwe buis.
- Herhaal stap 1.1.4 met chloroform:isoamylalcohol op 24:1.
- Breng in de nieuwe buis het reactievolume op 300 μL door 200 μL nucleasevrij water toe te voegen en voeg vervolgens 30 μL 3 M natriumacetaat en 600 μL 100% ethanol toe.
- Meng door vortexen en plaats vervolgens bij -20 °C gedurende 30-60 minuten voor de ethanolprecipitatie van het DNA.
- Centrifugeer bij 18.800 × g gedurende 20 minuten bij 4 °C, gooi het supernatant weg en spoel de pellet af met 1 ml 70% ethanol. Herhaal de centrifugatie gedurende 10 minuten en verwijder dan het supernatans volledig.
- Droog met de dop open gedurende 2 minuten, voeg 30 μL nucleasevrij water toe en resuspendeer de DNA-pellet.
- Bepaal de DNA-concentratie met behulp van een spectrofotometer.
- Controleer de grootte en hoeveelheid van het gelineariseerde DNA met behulp van agarosegelelektroforese.
- RNA-synthese met behulp van T7 RNA-polymerase
- Voeg 2 μL van elk 10x transcriptiebuffer, ATP, GTP, UTP, CTP en T7 en 1 μg van een gelineariseerd DNA toe aan een microcentrifugebuis. Voeg nucleasevrij water toe om het reactievolume op 20 μL te brengen.
- Meng door te tikken, centrifugeer en incubeer het reactiemengsel gedurende 2 uur bij 37 °C voor RNA-synthese.
- Draai naar beneden, voeg 1 μL DNase (2 E/μL) toe en incubeer gedurende 15 minuten bij 37 °C om het sjabloon-DNA te verwijderen.
- Lithiumchloride precipitatie van het RNA
- Voeg 10 μL lithiumchloride (7,5 M) toe aan het reactiemengsel. Mengen door te tikken, centrifugeren en het reactiemengsel gedurende 30 minuten bij -20 °C incuberen.
- Centrifugeer bij 18.800 × g gedurende 20 minuten bij 4 °C, gooi het supernatant weg en spoel de pellet af met 500 μl 70% ethanol. Herhaal de centrifugatie gedurende 10 minuten en verwijder dan het supernatans volledig.
- Droog met de dop open gedurende 2 minuten, voeg 30 μL nucleasevrij water toe en resuspendeer de RNA-pellet.
- Aftopping
- Verwarm het RNA-monster gedurende 10 minuten bij 65 °C en plaats het vervolgens op ijs om af te koelen.
- Voeg 5 μL elk van 10x afdekbuffer, 10 mM GTP en 1 mM (10x) S-adenosylmethionine (SAM), 2 μL elk van een afdekenzymmix en O-methyltransferase-enzymmix en 1,25 μL RNaseremmer toe. Meng door te tikken, centrifugeer en incubeer het reactiemengsel gedurende 1 uur bij 37 °C.
- Poly(A)-residu
- Draai het monster naar beneden en voeg vervolgens 6 μL nucleasevrij water, 20 μL 5x E-PAP-buffer, 10 μL 25 mM MnCl2, 10 μL 10 mM ATP en 4 μL E-PAP poly(A)-tailing-enzym toe. Mengen door te tikken, centrifugeren en het reactiemengsel gedurende 2 uur bij 37 °C incuberen.
- Lithiumchloride precipitatie en kwantificering van het synthetische mRNA
- Voeg 50 μl lithiumchloride (7,5 M) toe en voer lithiumchlorideprecipitatie uit zoals beschreven in de stappen 1.3.1-1.3.3.
- Meet de concentratie van het mRNA met behulp van een spectrofotometer.
- Controleer de grootte en hoeveelheid mRNA met behulp van formaldehyde (1%-2%), agarose (1%), gelelektroforese.
2. Extracellulaire matrix (ECM) gelcoating van de celinvasie- en migratieplaten (CIM)
OPMERKING: Een CIM-plaat (Cell Invasion and Migration) is een commercieel vervaardigde plaat met 16 putjes voor op impedantie gebaseerde real-time celanalyse. Smeer voor de celinvasietest CIM-platen in met ECM-gel, zoals eerder beschreven, maar met enkele wijzigingen11.
- Haal een hoeveelheid ECM-gelbouillon uit de vriezer en bewaar deze op ijs.
- Verdun de ECM-gel (10 mg/ml) tot een werkconcentratie (100 μg/ml) door 990 μL Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (zonder serum of antibiotica) te mengen met 10 μL ECM-gel in een microcentrifugebuis. Mengen door voorzichtig pipetteren.
- Voeg 60 μL verdunde ECM-gel toe aan elk van de 16 putjes van de bovenste kamer van de CIM-plaat. Pas de omgekeerde pipetteermethode toe en vermijd luchtbellen20,21.
OPMERKING: Optimaliseer de concentratie van de ECM-gel voor elke cellijn. Voor glioblastoomcellijnen werd 0,1 μg/μL tot 1 μg/μL ECM-gel gebruikt voor optimalisatie. - Plaats de bovenste kamer van de CIM-plaat met de plaatafdekking eraf op een beschermende plastic plaat in een CO2 -incubator gedurende ongeveer 4 uur om een gellaag te vormen.
LET OP: Tijdens het coaten van de CIM-plaat met ECM-gel mogen de elektroden van de bovenste kamer van de CIM-plaat geen direct contact hebben met de handen van de onderzoeker of de oppervlakken van de apparatuur, inclusief de bioveiligheidskast of de CO2 - incubator.
3. Voorbereiding van de tumorcellen
OPMERKING: Alle celkweekmaterialen moeten steriel worden bewaard. Oogst en elektropomeer de tumorcellen onder een biologische veiligheidskast met geschikte persoonlijke beschermingsmiddelen (PBM), zoals eerder beschreven, maar met enkele wijzigingen11.
- Kweek van de tumorcellen
- Kweek U-118MG-cellen in 10 ml DMEM met 5% foetaal runderserum (FBS) en 1% antibiotica per 100 mm x 20 mm polystyreen weefselkweekschaaltje bij 37 °C in een 5% CO2 -incubator (kweekconditie).
- Serumuitputting van de tumorcellen
OPMERKING: De blootstelling van de cellen aan de chemo-lokstoffen die aanwezig zijn in FBS moet worden geminimaliseerd vóór de celmigratie- en invasietests door een hoge concentratie FBS te gebruiken.- Verwijder het oude medium en voeg 10 ml voorverwarmde DMEM toe met 0,5% FBS en 1% antibiotica per schaaltje (medium, laag serum).
- Herhaal stap 3.2.1.
- Incubeer de cellen bij 37 °C in een 5% CO2 incubator gedurende 4 uur of langer.
- Oogsten van de tumorcellen
- Verwijder het oude medium, voeg 8 ml voorverwarmde Dulbecco's fosfaatgebufferde zoutoplossing (DPBS) per gerecht toe, verwijder de DPBS, voeg voorverwarmde 0,05% trypsine-EDTA (2 ml/schaaltje) toe om het oppervlak te bedekken en incubeer gedurende 30 s in de CO2 -incubator.
- Zuig de trypsine-EDTA voorzichtig op, voeg medium met een laag serumgehalte (7 ml/schaaltje) toe en verzamel vervolgens cellen in een centrifugebuis van 50 ml of 15 ml.
- Aliquot een klein aantal cellen en gebruik een draagbare geautomatiseerde celteller om de cellen te tellen.
- Bereken het totale aantal cellen en het benodigde volume voor 10.000 cellen/μL.
- Centrifugeer de cellen door ze gedurende 5 minuten bij kamertemperatuur bij 100 × g te centrifugeren, zuig het supernatant op, voeg het berekende volume DMEM met 0,5% FBS (zonder antibiotica) toe en resuspendeer de celpellet voorzichtig.
- Breng voor elke behandeling 110 μl van de celsuspensie, die 1,1 miljoen cellen bevat, over in een microcentrifugebuis.
- Herhaal stap 3.3.6 om de cellen over te brengen naar vier microcentrifugebuisjes voor vier verschillende behandelingen.
OPMERKING: Een CIM-plaat heeft in totaal 16 putjes. Ontwerp vier verschillende behandelingen ter vergelijking, zodat voor elke behandeling vier putjes van de CIM-plaat kunnen worden toegewezen. Gebruik de geëlektropoleerde cellen voor de volgende experimenten: western blot-analyses (0,3 miljoen cellen per weefselkweekschaal van 35 mm), vier putjes met real-time celmigratietesten (0,1 miljoen cellen/putje) en vier putjes met real-time celinvasietesten (0,1 miljoen cellen/putje) voor elke behandeling. Pas het aantal cellen aan dat moet worden geëlektropoleerd als het experimentele ontwerp verandert.
4. Elektroporatie van de tumorcellen
- Om het medium te verwijderen, voegt u 1 ml DPBS toe aan de celsuspensie in elk buisje, draait u de celsuspensie drie keer gedurende 10 seconden en draait u het buisje elke 10 s 180° rond met behulp van een minicentrifuge, en verwijdert u het supernatans met behulp van een micropipet.
OPMERKING: Het is belangrijk om een compacte maar gemakkelijk resuspendeerbare celpellet te vormen. - Voeg 110 μL resuspensiebuffer R toe aan de celpellet om 0,1 miljoen cellen in 10 μL te verkrijgen.
- Voeg synthetisch mRNA toe aan de celpellet om een concentratie van 0,2-20 ng/μL te verkrijgen, afhankelijk van het gewenste expressieniveau. Meng en resuspendeer de celpellet voorzichtig door te tikken of voorzichtig te pipetteren.
OPMERKING: Gebruik verschillende concentraties synthetisch mRNA, onderzoek de eiwitexpressie met behulp van western blot-analyse en bepaal de concentratie synthetisch mRNA die leidt tot het gewenste expressieniveau om de specifieke correlatie tussen de eiwitexpressie en biologische effecten te onderzoeken. - Elektroporeren van 10 μL van de celsuspensie met een elektroporatiesysteem bij 1.350 V gedurende 10 ms met telkens drie pulsen.
- Breng de geëlektropoleerde cellen over in een nieuwe microcentrifugebuis met 1,1 ml DMEM met 0,5% FBS.
- Herhaal de elektroporatie totdat de rest van de celsuspensie is geëlektroporeerd. Combineer de geëlektropoleerde cellen in de microcentrifugebuis om 1,1 miljoen cellen in 1,1 ml te verkrijgen.
OPMERKING: Zowel 100 μL als 10 μL elektroporatietips kunnen worden gebruikt om een groot aantal cellen te elektropoleren, maar de elektroporatietips voor 10 μL en 100 μL zijn inbegrepen in twee afzonderlijke kits en moeten apart worden aangeschaft. Resuspensiebuffer R is inbegrepen in beide kits. - Na voltooiing van alle respectievelijke elektroporaties, resuspendeert u de gepoolde cellen voorzichtig.
- Plaats 0,3 miljoen cellen in een polystyreenkweekschaaltje van 35 mm x 10 mm met 2 ml DMEM met 5% FBS, en kweek de cellen gedurende 1 dag onder de kweekconditie voor totale cellysaatbereiding en western blot-analyses.
- Bewaar de rest van de geëlektropoleerde cellen op kamertemperatuur totdat het real-time celanalysesysteem klaar is.
5. Instellen van de real-time celanalysator, het programma en de CIM-platen
OPMERKING: Bereid de real-time celanalysator en twee CIM-platen voor, zoals eerder beschreven11.
- Evenwicht van de real-time celanalysator
- Verplaats de real-time celanalysator enkele uren voor gebruik naar een CO2 -incubator om het systeem onder de kweekomstandigheden in evenwicht te brengen.
- Opzetten van het analyseprogramma
- Open het analyseprogramma door te dubbelklikken op het pictogram van de real-time celanalysesoftware op het bureaublad.
- Zodra de optie Standaardconfiguratie van het experimentpatroon is geopend, selecteert u de optie om drie experimenten afzonderlijk uit te voeren.
NOTITIE: Elke houder heeft een apart venster. Er zijn verschillende tabbladen om het meetinterval en de meetduur, gegevensanalyse en andere experimentele omstandigheden in te stellen. - Open elke houder door op het tabblad Nummer te klikken.
- Klik op het tabblad Experimentnotities , selecteer de map waarin de gegevens worden opgeslagen en voer de naam van het experiment in.
- Klik op het tabblad Lay-out , stel viervoudige putjes in voor elke behandelingsvoorwaarde door vier putjes tegelijk te selecteren en de voorbeeldinformatie in te voeren, en klik vervolgens op Toepassen.
- Klik op het tabblad Schema | Voeg een stap toe om de tweestapsmodus van de celimpedantiemetingen in te stellen. Klik vervolgens op Toepassen om de eerste stap in te stellen.
- Klik nogmaals op Een stap toevoegen , voer 10 minuten in voor het interval en 48 uur voor de duur voor migratie en invasie en klik op Toepassen om de tweede stap in te stellen.
OPMERKING: De eerste stap omvat een eenmalige nulmeting (één veeg met een interval van 1 minuut). De tweede stap meet de celimpedantie voor het experiment (bijvoorbeeld 289 sweeps met een interval van 10 minuten gedurende 48 uur) bij de wieg. Pas het interval en de duur aan, afhankelijk van het experimentele ontwerp. - Ga naar de volgende houder en stel deze in door stap 5.2.3-5.2.7 te herhalen.
- Voorbereiding van de CIM-platen
- Een uur voordat de celimpedantiemeting begint, vult u de putjes van de onderste kamer van de CIM-plaat met 160 μL DMEM met 10% serum of andere chemo-lokstoffen.
- Monteer de bovenste kamer met de ECM-gelgecoate putten (voor invasie) of ongecoate putten (voor migratie) met de onderste kamer.
- Voeg 50 μL laag-serummedium toe aan de putjes van de bovenste kamer van de CIM-plaat voor de celmigratietest en plaats de CIM-plaat in de houder van het systeem.
- Klik op het tabblad Bericht en zorg ervoor dat het bericht Verbindingen ok wordt weergegeven. De CIM-plaat is nu klaar voor het experiment.
- Pre-incubeer de geassembleerde CIM-plaat in de CO2 -incubator gedurende 30-60 minuten vóór de real-time celanalyse om de CIM-plaat te laten wennen aan de kweekconditie.
6. Real-time celanalyse en gegevensexport
OPMERKING: Voer een basislijnmeting, celzaaiing, celimpedantiemeting en gegevensexport uit zoals eerder beschreven11.
- Basislijn meting
NOTITIE: De basislijn moet worden afgelezen nadat de CIM-plaat is geacclimatiseerd en voordat de cellen worden toegevoegd aan de putjes van de bovenste kamer.- Klik op de Start-knop voor elke houder. Wanneer het venster Opslaan als wordt weergegeven, slaat u het experimentele bestand op om de basislijnmeting uit te voeren.
- Cel zaaien
- Haal de CIM-plaat uit de houder en plaats deze in de bioveiligheidskast op de plaathouder.
- Voeg 100 μL (met 100.000 cellen) geëlektropoleerde cellen toe aan de putjes van de bovenste kamer van de CIM-plaat volgens het programma in de besturingseenheid. Pas de omgekeerde pipetteermethode toe en vermijd luchtbellen.
- Laat de CIM-plaat 30 minuten onder de bioveiligheidskast op kamertemperatuur staan om ervoor te zorgen dat de cellen zich gelijkmatig over de bodem van de put verspreiden.
- Meting van de celimpedantie
- Verplaats de volledig geassembleerde CIM-plaat terug naar de betreffende houder. Klik op de startknop van de houder om de celimpedantiemeting voor de tweede stap te starten.
- Klik op het tabblad Plot , klik vervolgens op de knop Alles toevoegen en selecteer de vakjes Gemiddelde en STD DEV om de gegevens in realtime te visualiseren.
OPMERKING: De standaard plotoptie is Tijd voor de x-as en Celindex voor de y-as. In de sectie Plotselectie kan de gebruiker alternatieve opties voor de y-as selecteren: Normalized Cell Index of Delta Cell Index. Zodra de laatste sweep is uitgevoerd, is het experiment voltooid en worden de resultaten automatisch opgeslagen.
- Export van de gegevens voor analyse
- Klik op het tabblad Plot en selecteer de vakjes Gemiddelde en STD DEV om de gegevens voor elk putje afzonderlijk te kopiëren.
- Klik met de rechtermuisknop op het tekengebied en selecteer Gegevens kopiëren in lijstindeling.
- Open een leeg spreadsheetbestand, plak de gegevens en sla het bestand op.
- Ga terug naar het analyseprogramma, klik op het tabblad Plaat voor elke houder en selecteer Loslaten om het experiment voor de houder te sluiten.
- Ga terug naar het spreadsheetbestand en pas de tijd van de onbewerkte gegevens aan, zodat de starttijd bij de tweede stap de werkelijke starttijd voor de meting wordt.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Crk- en CrkL-eiwitten spelen een belangrijke rol in de beweeglijkheid van veel celtypen, waaronder neuronen22, T-cellen23, fibroblasten 18,19 en een verscheidenheid aan tumorcellen13. Aangezien is gemeld dat Crk- en CrkL-eiwitten verhoogd zijn in glioblastoom24,25,26, werden de effecten van de overexpressie van CrkI, een splice-variant van Crk, op de migratie van glioblastoomcellen in dit werk bestudeerd. U-118MG-cellen werden geëlektropoleerd met verschillende concentraties synthetisch CrkI-mRNA en geanalyseerd op eiwitniveaus en celmigratie. De elektroporatie van U-118MG glioblastoomcellen met variërende concentraties synthetisch CrkI-mRNA resulteerde in een concentratie-afhankelijke toename van FLAG-gelabeld CrkI-eiwit 1 dag na transfectie (Figuur 1A). Terwijl 0,2 ng/μL en 2 ng/μL mRNA leidden tot een niet-detecteerbare of bescheiden expressie van het exogene CrkI-eiwit, resulteerde 20 ng/μL mRNA in een veel hoger expressieniveau dan het endogene CrkI-eiwit.
De resultaten van de celmigratietest met behulp van het real-time celanalysesysteem gaven aan dat de elektroporatie met 0,2 ng/μL of 2 ng/μL CrkI-mRNA geen grote invloed had op de celmigratie. Elektroporatie met 20 ng/μL CrkI-mRNA leidde echter tot een duidelijke stimulatie van de celmigratie, waarbij meer cellen migreerden tussen 2 uur en 13 uur (Figuur 1B). Uit de vergelijking tussen het CrkI-eiwitniveau en de celmigratie bleek dat glioblastoomcelmigratie werd gestimuleerd door de toename van het CrkI-eiwitniveau. Het lijkt erop dat het CrkI-eiwitniveau hoger moet zijn dan een bepaalde drempel om een substantiële stimulatie van celmigratie te veroorzaken. Als de celmigratie op verschillende manieren was gemeten om de gemigreerde cellen op specifieke tijdstippen te tellen of te observeren, zou er veel meer inspanning nodig zijn geweest om dit soort veranderingen in celmigratie te identificeren.
Om te bestuderen hoe CrkL-overexpressie de invasie van glioblastoomcellen beïnvloedt door ECM-gellagen met verschillende concentraties ECM-eiwitten, werden U-118MG-cellen geëlektropoleerd met synthetisch CrkL-mRNA en geanalyseerd in termen van de eiwitniveaus en celinvasie door een ECM-gellaag. De elektroporatie van U-118MG glioblastoomcellen met synthetisch CrkL-mRNA leidde tot een robuuste expressie van FLAG-gelabeld CrkL-eiwit 1 dag na transfectie (Figuur 2A). Naarmate de concentratie van ECM-eiwitten toenam, vertraagde de invasie van de controlecellen (Figuur 2B). Cellen met een overexpressie van CrkL vertoonden ook een ECM-gelconcentratie-afhankelijke afname van celinvasie (Figuur 2C). De vergelijking tussen de controlecellen en CrkL-cellen met overexpressie bij verschillende ECM-gelconcentraties gaf aan dat CrkL-overexpressie over het algemeen de celinvasie door de ECM-gellaag stimuleerde (Figuur 2D-G). Het verschil tussen de twee celpopulaties werd echter duidelijk op verschillende tijdstippen, afhankelijk van de ECM-gelconcentratie.
Voor de 0,1 μg/μL ECM-gel was de CrkL-overexpressie-gemedieerde stimulatie van celinvasie duidelijk tussen 8 uur en 20 uur (Figuur 2D), maar het verschil in celinvasie was verwaarloosbaar na 32 uur. Voor de 0,2 μg/μL ECM-gel was het verschil in celinvasie met en zonder CrkL-overexpressie te allen tijde minimaal (Figuur 2E). Voor de 0,5 μg/μL ECM-gel was het verschil in celinvasie duidelijk tussen 24 uur en 36 uur (Figuur 2F). Voor de 1 μg/μL ECM-gel werd het CrkL-overexpressie-effect op celinvasie na 48 uur enigszins duidelijk (Figuur 2G). De resultaten suggereren dat het venster om het verschil tussen de controlecellen en CrkL-overexpressiecellen te detecteren, verschuift naar latere tijdstippen naarmate de concentratie van de ECM-gel toeneemt. De resultaten suggereren ook dat de twee celpopulaties verschillend werden beïnvloed door de toename van de ECM-gelconcentratie op verschillende tijdstippen. Bijvoorbeeld, na 12 uur vertoonden de CrkL-overexpressiecellen alleen een aanzienlijk hogere invasie bij 0,1 μg/μL ECM-gel (Figuur 2H). Na 24 uur vertoonden de CrkL-overexpressiecellen echter een iets hogere of vergelijkbare invasie bij de geteste ECM-gelconcentraties (Figuur 2I). Daarom is het belangrijk om zowel de tijdsafhankelijke als de ECM-gelconcentratie-afhankelijke verschillen in celinvasie te onderzoeken om een uitgebreid beeld te krijgen van de verschillen tussen de twee celpopulaties met en zonder CrkL-overexpressie. Deze resultaten tonen aan dat het combineren van voorbijgaande overexpressie met behulp van synthetisch mRNA met impedantie-gebaseerde real-time celanalyses een krachtig hulpmiddel biedt voor het analyseren van de mogelijke correlatie tussen genoverexpressie en migratie en invasie van tumorcellen. Het onderzoeken van de effecten van concentratievariaties in het synthetische mRNA en de ECM-gel zou nauwkeurigere en gedetailleerdere informatie opleveren.
Figuur 1: De effecten van CrkI-overexpressie op de migratie van glioblastoomcellen. U-118MG-cellen werden geëlektropoleerd met de aangegeven concentraties (ng/μL) van FLAG-gelabeld CrkI-mRNA . (A) Voor de western blot-analyses werden de geëlektropoleerde cellen gedurende 1 dag vóór de totale celllysaatbereiding gekweekt. De eiwitniveaus bij transfectie met synthetisch CrkI-mRNA werden vergeleken. Anti-Crk en anti-CrkL antilichamen werden gebruikt om zowel de endogene als de FLAG-gelabelde eiwitten te detecteren en om de verhouding tussen de endogene eiwitten en FLAG-gelabelde eiwitten te vergelijken. Vinculine en α-tubuline werden gebruikt als laadcontroles. (B) Voor de celmigratieanalyses werden de geëlektropoleerde cellen zonder verdere kweek op een CIM-plaat geplateerd. Celindexwaarden werden verkregen uit vier putjes voor elk monster en hun gemiddelde ± SD-waarden worden weergegeven. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: Effecten van CrkL-overexpressie op de invasie van glioblastoomcellen. U-118MG-cellen werden geëlektropoleerd met nucleasevrijH2O of 20 ng/μL FLAG-gelabeld CrkL-mRNA. (A) Voor de western blot-analyses werden de geëlektropoleerde cellen gedurende 1 dag vóór de totale celllysaatbereiding gekweekt. De eiwitniveaus bij transfectie met synthetisch CrkL-mRNA werden vergeleken. Anti-Crk en anti-CrkL antilichamen werden gebruikt om zowel de endogene als de FLAG-gelabelde eiwitten te detecteren en om de verhouding tussen de endogene eiwitten en FLAG-gelabelde eiwitten te vergelijken. Vinculine en α-tubuline werden gebruikt als laadcontroles. (B-G) Voor de analyse van de celinvasie werden de geëlektropoleerde cellen zonder verdere kweek op een CIM-plaat met een ECM-gelcoating geplateerd. De celindexwaarden werden verkregen uit vier putjes voor elk monster en hun gemiddelde ± SD-waarden worden weergegeven. (B) De celinvasiegegevens van de controlecellen met verschillende ECM-gelconcentraties werden vergeleken. (C) De celinvasiegegevens van de CrkL-overexpressiecellen met verschillende ECM-gelconcentraties werden vergeleken. (D-G) De celinvasiegegevens tussen de controlecellen en CrkL-overexpressiecellen werden vergeleken voor de aangegeven ECM-gelconcentratie. (H) Een vergelijking van de celinvasie na 12 uur tussen de controlecellen en cellen met een CrkL-overexpressie. (I) Een vergelijking van de celinvasie na 24 uur tussen de controlecellen en cellen met een CrkL-overexpressie. Afkortingen: ECM = extracellulaire matrix; CIM = celinvasie en migratie. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Schematische diagrammen van de experimentele procedures na het uitschakelen van genen of het overexpressie van genen . (A) De experimentele procedure van de real-time celanalyse na de siRNA-transfectie. Aangezien er 3-4 dagen nodig zijn om volledige genuitschakeling te induceren na siRNA-transfectie onder de experimentele omstandigheden, werden de cellen opnieuw verguld en gedurende 3 dagen na de elektroporatie gekweekt voordat ze klaar waren voor real-time celanalyses. (B) De experimentele procedure voor de real-time celanalyse na de synthetische mRNA-transfectie. Omdat de eiwitexpressie van synthetische mRNA-transfectie snel is, werden de geëlektropoleerde cellen dezelfde dag nog gebruikt voor real-time celanalyses. Let op het verschil tussen de twee experimentele procedures; terwijl real-time celanalyse werd uitgevoerd 3 dagen na de elektroporatie voor gen-knockdown met behulp van siRNA's, werd real-time celanalyse uitgevoerd direct na de elektroporatie voor gen-overexpressie met synthetisch mRNA. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Migratie en invasie zijn belangrijke kenmerken van tumorcellen. Het meten van de beweeglijkheid van tumorcellen en het begrijpen van het onderliggende mechanisme dat de beweeglijkheid van tumorcellen regelt, bieden cruciale inzichten in therapeutische interventies 2,27. Er zijn verschillende methoden ontwikkeld om celmigratie te bestuderen7. De wondgenezingstest met behulp van krassen of kweekinzetstukken is een eenvoudige en veelgebruikte methode die contrasterende beelden oplevert van het sluiten van openingen. De individuele celvolgtest vereist monitoring van individuele cellen met time-lapse-beeldvorming, waarvoor de cellen kunnen worden gelabeld met fluorescerende kleurstoffen. Zowel de wondgenezingstest als de individuele celvolgtest meten de spontane beweging van cellen.
Met behulp van time-lapse-beeldvorming en intensieve gegevensverwerking na de aanvraag kunnen beide tests kwantitatieve vergelijkingen tussen monsters opleveren28. Deze testen zijn echter niet geschikt voor het bestuderen van celinvasie door een ECM-eiwitlaag. Daarentegen meten de transwell-migratie- en invasietests gerichte celmigratie door een transwell-insertmembraan met of zonder een ECM-eiwitlaag. Voortdurende monitoring is echter niet haalbaar met deze tests omdat de gemigreerde cellen op een bepaald tijdstip moeten worden verzameld en het transwell niet opnieuw kan worden gebruikt. Al deze tests vergen veel tijd en moeite voor gegevensverwerking of voor praktische experimenten om de cellen te verzamelen en te tellen, wat resulteert in mogelijke operatorgerelateerde variaties. De grootste uitdaging voor deze testen is het maken van geavanceerde kwantitatieve vergelijkingen tussen meerdere, gecombineerde behandelingen op verschillende tijdstippen.
Het gebruik van het real-time celanalysesysteem dat in dit werk wordt gepresenteerd, maakt kwantitatieve, continue en uitgebreide monitoring mogelijk om celmigratie en -invasie te meten, en dit systeem heeft veel voordelen ten opzichte van andere eenvoudige celmotiliteitstests, die resultaten opleveren op beperkte, vaste tijdstippen. Net als bij andere tests moeten de experimentele omstandigheden van de real-time celanalyses voor elke cellijn worden geoptimaliseerd, omdat de migratie en invasie van verschillende cellijnen differentieel kan worden beïnvloed door het celnummer. Bovendien neemt de snelheid van celinvasie af naarmate de concentratie van de ECM-gel toeneemt (Figuur 2B,C). Daarom wordt aanbevolen om verschillende ECM-gelconcentraties te testen en de effecten van veranderingen in genexpressie op celinvasie onder deze verschillende ECM-gelconcentraties te vergelijken.
Met het real-time celanalysesysteem is optimalisatie eenvoudig en ongecompliceerd, aangezien het testsysteem gegevens in realtime produceert zonder hands-on tijd. Het testsysteem identificeert hoe snel de cellen migreren of binnendringen en wanneer ze het maximale celmigratie- of invasieniveau bereiken. Het verkrijgen van deze informatie over de beweeglijkheid van de cellen maakt gedetailleerde vergelijkende analyses tussen verschillende behandelingsgroepen mogelijk, die eenvoudig kunnen worden uitgevoerd door gebruik te maken van de ingebouwde functies van het programma. Bovendien maakt de gevoeligheid van het real-time testsysteem het mogelijk om subtiele veranderingen in celmigratie en -invasie te identificeren en te kwantificeren door concentratie-afhankelijke genexpressie, zoals aangetoond in figuur 1 en figuur 2.
Eerder werd een gedetailleerde procedure verstrekt om de migratie en invasie van tumorcellen na het uitschakelen van genen te meten met behulp van het op impedantie gebaseerde real-time celanalysesysteem. Aangezien het uitschakelen van genen 3-4 dagen duurt nadat de cellen zijn geëlektropoleerd met siRNA's, werden de cellen opnieuw geplateerd na elektroporatie. De geëlektropoleerde cellen werden gedurende 3 dagen gekweekt voordat ze opnieuw werden geoogst voor de real-time celanalyses, waardoor het hele experiment een proces in twee stappen werd: elektroporatie op dag 1 en real-time celanalyse op dag 4, zoals weergegeven in figuur 3. Daarentegen is genexpressie bij de elektroporatie van cellen met synthetisch mRNA snel en efficiënt, aangezien de time-lapse-analyse van fibroblasten die zijn geëlektropoleerd met synthetisch mRNA voor GFP 5 uur na transfectie een sterk GFP-signaal vertoonde; De fluorescentie-intensiteit bereikte een maximum rond 24 uur, waarna er een geleidelijke afname van het fluorescentiesignaal was18.
Bovendien vertoonden de U-118MG-cellen in dit werk een robuuste expressie van het exogene eiwit wanneer ze werden geëlektropoleerd met synthetisch mRNA voor CrkI (Figuur 1A) en voor CrkL (Figuur 2A), in overeenstemming met eerdere waarnemingen8. Daarom is het aangewezen om de real-time celanalyses direct na elektroporatie uit te voeren. Sommige stappen voor de real-time celanalyse moeten worden uitgevoerd voordat de cellen worden geoogst voor elektroporatie. Het hele experiment is een eenstapsproces met elektroporatie en real-time celanalyse op dag 1. Het op impedantie gebaseerde real-time celanalysesysteem is uitgebreid gebruikt om tumorcelmigratie en -invasie in verschillende solide tumorcellen te bestuderen, waaronder borstkanker29, colorectale kanker 30, melanoom 31, eierstokkanker 32, hoofd-halsplaveiselcelkanker 33, niercelcarcinoom 34, pancreascarcinoom 35, hepatocellulair carcinoom 36 en niet-kleincellige longkankercellen 10. Daarom maakt het gecombineerde gebruik van gen-overexpressie met behulp van mRNA of gen-knockdown met behulp van siRNA's de real-time meting van celmigratie en -invasie nuttiger en toepasbaarder.
De beperking van dit protocol is dat deze methode het dissociëren en oogsten van cellen vereist vlak voor de meting van de celmigratie en -invasie. De enzymatische en mechanische behandelingen tijdens dissociatie, oogst en resuspensie kunnen de analyse beïnvloeden37. Bovendien kan er een vertraging optreden in de celmigratie terwijl de cellen herstellen van de enzymatische en mechanische behandelingen. Deze methode is mogelijk niet geschikt als de cellen gemakkelijk worden beschadigd door trypsinisatie of andere mechanische behandelingen tijdens dissociatie en verzameling van eencellige cellen of als ze een lange hersteltijd nodig hebben na die manipulaties. Deze beperking geldt ook voor de transwell-migratietest, een andere methode voor het meten van gerichte celmigratie. Bovendien kan de elektroporatie na celvoorbereiding cellen kwetsbaarder maken voor schade38. Daarom is het belangrijk om de omstandigheden voor elektroporatie voor elke cellijn te optimaliseren en ook om de controlecellen te elektropoeren voor nauwkeurigere vergelijkingen.
Op de homepage van de fabrikant van het elektroporatiesysteem vindt u de aanbevolen parameters voor elektroporatie (zie de voetnoot in de materiaaltabel). Het gebruik van consistente en minimaal schadelijke experimentele omstandigheden tijdens celdissociatie en resuspensie is van cruciaal belang voor het verkrijgen van reproduceerbare resultaten. Bovendien is het correleren van de hoeveelheid mRNA, het eiwitniveau en de celmotiliteit cruciaal om onderscheid te maken tussen de specifieke en niet-specifieke effecten van mRNA-transfectie. In dit werk werd waargenomen dat als de mRNA-concentratie een bepaald niveau overschreed, het niet-specifiek cellulaire functies remde, waaronder celmigratie en -invasie (gegevens niet getoond). Daarom is het belangrijk om de concentratie van mRNA te titreren. Bovendien is het van cruciaal belang om de real-time celanalyse uit te voeren wanneer de eiwitexpressie op zijn hoogtepunt is, aangezien eiwitexpressie van voorbijgaande aard is met mRNA-transfectie. Net als bij andere celmotiliteitstesten kunnen de resultaten van deze real-time celanalyse worden verward door de proliferatie van cellen tijdens de migratie. Daarom wordt aanbevolen om daarnaast een celproliferatietest uit te voeren om de invloed van celproliferatie op de resultaten van celmigratie en -invasie te begrijpen.
Het is bekend dat de eiwitniveaus van Crk en CrkL verhoogd zijn bij sommige soorten kanker bij de mens. Aangezien de expressie van Crk en CrkL correleert met verschillende tumorcelfuncties en hun overexpressie bijdraagt aan een slechte prognose, zijn Crk en CrkL voorgesteld als therapeutische doelen voor de behandeling van kanker13. Eerder werd gen-knockdown geïnduceerd in glioblastoomcellen om aan te tonen dat migratie en invasie van glioblastoomcellen robuuste markers zijn van Crk- en CrkL-activiteit. De huidige studie biedt een systematische genexpressiebenadering om de overexpressie van Crk en CrkL te induceren met behulp van synthetisch mRNA. Er werd een nauwe correlatie verkregen tussen de eiwitniveaus van Crk en CrkL en glioblastoomcelmigratie en -invasie met behulp van het real-time celanalysesysteem. De resultaten ondersteunen verder de hypothese dat Crk en CrkL een essentiële rol spelen bij de migratie en invasie van glioblastoomcellen. Samen met de vorige methoden paper11 biedt deze studie een proof-of-concept benadering voor het onderzoeken van een mogelijke correlatie tussen veranderingen in genexpressie en tumorcelmigratie en -invasie.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
De auteurs hebben geen belangenconflicten om bekend te maken.
Acknowledgments
De auteurs danken het Medical Writing Center van Children's Mercy Kansas City voor het redigeren van dit manuscript. Dit werk werd ondersteund door Natalie's A.R.T. Foundation (aan T.P.) en door een MCA Partners Advisory Board-subsidie van Children's Mercy Hospital (CMH) en het University of Kansas Cancer Center (KUCC) (aan TP).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AlphaImager HP | ProteinSimple | 92-13823-00 | Agarose gel imaging system |
| α-Tubulin antibody | Sigma | T9026 | Used to detect α-tubulin protein (dilution 1:3,000) |
| CIM-plate 16 | Agilent Technologies, Inc | 5665825001 | Cell invasion and migration plates |
| Crk antibody | BD Biosciences | 610035 | Used to detect CrkI and CrkII proteins (dilution 1:1,500) |
| CrkL antibody | Santa Cruz | sc-319 | Used to detect CrkL protein (dilution 1:1,500) |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | ATCC | 302002 | Cell culture medium |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Corning | 21-031-CV | Buffer used to wash cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30910.03 | Culture medium supplement |
| Heracell VIOS 160i CO2 incubator | Thermo Scientific | 51030285 | CO2 incubator |
| IRDye 800CW goat anti-mouse IgG secondary antibody | Li-Cor | 926-32210 | Secondary antibody for Western blot analysis (dilution 1:10,000) |
| IRDye 800CW goat anti-rabbit IgG secondary antibody | Li-Cor | 926-32211 | Secondary antibody for Western blot analysis (dilution 1:10,000) |
| Lithium chloride | Invitrogen | AM9480 | Used for RNA precipitation |
| Matrigel matrix | Corning | 354234 | Extracellular matrix (ECM) gel |
| MEGAscript T7 transcription kit | Invitrogen | AM1334 | Used for RNA synthesis |
| Millennium RNA markers | Invitrogen | AM7150 | Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis |
| Mini centrifuge | ISC BioExpress | C1301P-ISC | Used to spin down cells |
| Mouse brain QUICK-Clone cDNA | TaKaRa | 637301 | Source of genes (inserts) for cloning |
| NanoQuant | Tecan | M200PRO | Nucleic acid quantification system |
| Neon electroporation system | ThermoFisher Scientific | MPK5000 | Electroporation system1 |
| Neon transfection system 10 µL kit | ThermoFisher Scientific | MPK1025 | Electroporation kit |
| Neon transfection system 100 µL kit | ThermoFisher Scientific | MPK10096 | Electroporation kit |
| NorthernMax denaturing gel buffer | Invitrogen | AM8676 | Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis |
| NorthernMax formaldehyde load dye | Invitrogen | AM8552 | Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis |
| NorthernMax running buffer | Invitrogen | AM8671 | Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis |
| Nuclease-free water | Teknova | W3331 | Used for various reactions during mRNA synthesis |
| Odyssey CLx Imager | Li-Cor | Imager for Western blot analysis | |
| pcDNA3.1/myc-His | Invitrogen | V80020 | The vector into which inserts (mouse CrkI and CrkL cDNAs) were cloned |
| pFLAG-CMV-5a | Millipore Sigma | E7523 | Source of the FLAG epitope tag |
| Phenol:chloroform:isoamyl alcohol | Sigma | P2069 | Used for DNA extraction |
| PmeI | New England BioLabs | R0560L | Used to linearize the plasmids for mRNA synthesis |
| Poly(A) tailing kit | Invitrogen | AM1350 | Used for poly(A) tail reaction |
| Polystyrene tissue culture dish (100 x 20 mm style) | Corning | 353003 | Used for culturing cells before transfection |
| Polystyrene tissue culture dish (35 x 10 mm style) | Corning | 353001 | Used for culturing transfected cells |
| Proteinase K | Invitrogen | 25530049 | Used to remove protein in the reaction mixture |
| Purifier Axiom Class II, Type C1 | Labconco Corporation | 304410001 | Biosafety cabinet for sterile handling of cells |
| Resuspension Buffer R | ThermoFisher Scientific | A buffer included in the electroporation kits, MPK1025 and MPK10096. The buffer is used to resupend cells before electroporation, and its composition is proprietary information. | |
| RNaseZap | Invitrogen | AM9780 | RNA decontamination solution |
| Scepter | Millipore | C85360 | Handheld automated cell counter |
| ScriptCap 2'-O-methyltransferase kit | Cellscript | C-SCMT0625 | Used for capping reaction |
| ScriptCap m7G capping system | Cellscript | C-SCCE0625 | Used for capping reaction |
| Sodium dodecyl sulfate solution | Invitrogen | 15553-035 | Detergent used for the proteinase K reaction |
| Sorvall Legend XT centrifuge | Thermo Scientific | 75004532 | Benchtop centrifuge to spin down cells |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | Used for dissociation of cells |
| U-118MG | ATCC | HTB15 | An adherent cell line derived from a human glioblastoma patient |
| Vinculin antibody | Sigma | V9131 | Used to detect vinculin protein (dilution 1:100,000) |
| xCELLigence RTCA DP | Agilent Technologies, Inc | 380601050 | Instrument used for real-time cell analysis |
| 1Electroporation parameters and other related information for various cell lines are available on the manufacturer's homepage (https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-culture/transfection/neon-transfection-system/neon-transfection-system-cell-line-data.html?). |
References
- Palmer, T. D., Ashby, W. J., Lewis, J. D., Zijlstra, A. Targeting tumor cell motility to prevent metastasis. Advanced Drug Delivery Reviews. 63 (8), 568-581 (2011).
- Eccles, S. A., Box, C., Court, W. Cell migration/invasion assays and their application in cancer drug discovery. Biotechnology Annual Review. 11, 391-421 (2005).
- Kluiver, T. A., Alieva, M., van Vuurden, D. G., Wehrens, E. J., Rios, A. C. Invaders exposed: Understanding and targeting tumor cell invasion in diffuse intrinsic pontine glioma. Frontiers in Oncology. 10, 92 (2020).
- Xie, Q., Mittal, S., Berens, M. E. Targeting adaptive glioblastoma: An overview of proliferation and invasion. Neuro-Oncology. 16 (12), 1575-1584 (2014).
- Wee, Y., Wang, T., Liu, Y., Li, X., Zhao, M. A pan-cancer study of copy number gain and up-regulation in human oncogenes. Life Sciences. 211, 206-214 (2018).
- Zhao, M., Liu, Y., Qu, H. Expression of epithelial-mesenchymal transition-related genes increases with copy number in multiple cancer types. Oncotarget. 7 (17), 24688-24699 (2016).
- Pijuan, J., et al. In vitro cell migration, invasion, and adhesion assays: From cell imaging to data analysis. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 7, 107 (2019).
- Park, T., Large, N., Curran, T. Quantitative assessment of glioblastoma phenotypes in vitro establishes cell migration as a robust readout of Crk and CrkL activity. The Journal of Biological Chemistry. 296, 100390 (2021).
- Urcan, E., et al. Real-time xCELLigence impedance analysis of the cytotoxicity of dental composite components on human gingival fibroblasts. Dental Materials. 26 (1), 51-58 (2010).
- Limame, R., et al. Comparative analysis of dynamic cell viability, migration and invasion assessments by novel real-time technology and classic endpoint assays. PLoS One. 7 (10), e46536 (2012).
- Mudduluru, G., Large, N., Park, T. Impedance-based real-time measurement of cancer cell migration and invasion. Journal of Visualized Experiments. (158), e60997 (2020).
- Feller, S. M. Crk family adaptors-signalling complex formation and biological roles. Oncogene. 20 (44), 6348-6371 (2001).
- Park, T. Crk and CrkL as therapeutic targets for cancer treatment. Cells. 10 (4), 739 (2021).
- Verbeke, R., Lentacker, I., De Smedt, S. C., Dewitte, H. The dawn of mRNA vaccines: The COVID-19 case. Journal of Controlled Release. 333, 511-520 (2021).
- Heine, A., Juranek, S., Brossart, P. Clinical and immunological effects of mRNA vaccines in malignant diseases. Molecular Cancer. 20 (1), 52 (2021).
- Kwon, H., et al. Emergence of synthetic mRNA: In vitro synthesis of mRNA and its applications in regenerative medicine. Biomaterials. 156, 172-193 (2018).
- Campillo-Davo, D., et al. The ins and outs of messenger RNA electroporation for physical gene delivery in immune cell-based therapy. Pharmaceutics. 13 (3), 396 (2021).
- Park, T., Koptyra, M., Curran, T. Fibroblast growth requires CT10 regulator of kinase (Crk) and Crk-like (CrkL). The Journal of Biological Chemistry. 291 (51), 26273-26290 (2016).
- Park, T. J., Curran, T. Essential roles of Crk and CrkL in fibroblast structure and motility. Oncogene. 33 (43), 5121-5132 (2014).
- Chou, P. P., Jaynes, P. K., King, B. P., Chapman, E., Bailey, J. L. Precision comparison between conventional (method-I) and reverse (method-Ii) pipetting. Clinical Chemistry. 30 (6), 958 (1984).
- Pushparaj, P. N. Revisiting the micropipetting techniques in biomedical sciences: A fundamental prerequisite in good laboratory practice. Bioinformation. 16 (1), 8-12 (2020).
- Park, T. J., Curran, T. Crk and Crk-like play essential overlapping roles downstream of disabled-1 in the Reelin pathway. The Journal of Neuroscience. 28 (50), 13551-13562 (2008).
- Huang, Y., et al. CRK proteins selectively regulate T cell migration into inflamed tissues. The Journal of Clinical Investigation. 125 (3), 1019-1032 (2015).
- Wang, L., et al. Signaling adaptor protein Crk is indispensable for malignant feature of glioblastoma cell line KMG4. Biochemical and Biophysical Research Communications. 362 (4), 976-981 (2007).
- Kumar, S., et al. Reciprocal regulation of Abl kinase by Crk Y251 and Abi1 controls invasive phenotypes in glioblastoma. Oncotarget. 6 (35), 37792-37807 (2015).
- Kumar, S., et al. Crk tyrosine phosphorylation regulates PDGF-BB-inducible Src activation and breast tumorigenicity and metastasis. Molecular Cancer Research. 16 (1), 173-183 (2018).
- Raudenska, M., et al. Engine shutdown: Migrastatic strategies and prevention of metastases. Trends in Cancer. 9 (4), 293-308 (2023).
- Decaestecker, C., Debeir, O., Van Ham, P., Kiss, R. Can anti-migratory drugs be screened in vitro? A review of 2D and 3D assays for the quantitative analysis of cell migration. Medicinal Research Reviews. 27 (2), 149-176 (2007).
- Farasani, A., Darbre, P. D. Long-term exposure to triclosan increases migration and invasion of human breast epithelial cells in vitro. Journal of Applied Toxicology. 41 (7), 1115-1126 (2021).
- Hanusova, V., Skalova, L., Kralova, V., Matouskova, P. The effect of flubendazole on adhesion and migration in SW480 and SW620 colon cancer cells. Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. 18 (6), 837-846 (2018).
- Lago-Baameiro, N., et al. PARK7/DJ-1 inhibition decreases invasion and proliferation of uveal melanoma cells. Tumori. 109 (1), 47-53 (2023).
- Escalona, R. M., et al. Knock down of TIMP-2 by siRNA and CRISPR/Cas9 mediates diverse cellular reprogramming of metastasis and chemosensitivity in ovarian cancer. Cancer Cell International. 22 (1), 422 (2022).
- Mosca, L., et al. Effects of S-adenosyl-L-methionine on the invasion and migration of head and neck squamous cancer cells and analysis of the underlying mechanisms. International Journal of Oncology. 56 (5), 1212-1224 (2020).
- Zhao, Q., et al. VEGI174 protein and its functional domain peptides exert antitumour effects on renal cell carcinoma. International Journal of Oncology. 54 (1), 390-398 (2019).
- Witte, D., et al. TGF-beta1-induced cell migration in pancreatic carcinoma cells is RAC1 and NOX4-dependent and requires RAC1 and NOX4-dependent activation of p38 MAPK. Oncology Reports. 38 (6), 3693-3701 (2017).
- Bui, L. C., et al. Regulation of aquaporin 3 expression by the AhR pathway is critical to cell migration. Toxicological Sciences. 149 (1), 158-166 (2016).
- Tsuji, K., et al. Effects of different cell-detaching methods on the viability and cell surface antigen expression of synovial mesenchymal stem cells. Cell Transplantation. 26 (6), 1089-1102 (2017).
- Frandsen, S. K., McNeil, A. K., Novak, I., McNeil, P. L., Gehl, J. Difference in membrane repair capacity between cancer cell lines and a normal cell line. The Journal of Membrane Biology. 249 (4), 569-576 (2016).
