Summary
Molti geni sovraregolati stimolano la migrazione e l'invasione delle cellule tumorali, portando a una prognosi infausta. Determinare quali geni regolano la migrazione e l'invasione delle cellule tumorali è fondamentale. Questo protocollo presenta un metodo per studiare gli effetti dell'aumentata espressione di un gene sulla migrazione e l'invasione delle cellule tumorali in tempo reale.
Abstract
Le cellule tumorali sono altamente mobili e invasive e mostrano modelli di espressione genica alterati. La conoscenza di come i cambiamenti nell'espressione genica regolano la migrazione e l'invasione delle cellule tumorali è essenziale per comprendere i meccanismi di infiltrazione delle cellule tumorali nei tessuti sani vicini e le metastasi. In precedenza, è stato dimostrato che il knockdown genico seguito dalla misurazione in tempo reale basata sull'impedenza della migrazione e dell'invasione delle cellule tumorali consente l'identificazione dei geni necessari per la migrazione e l'invasione delle cellule tumorali. Recentemente, i vaccini a mRNA contro SARS-CoV-2 hanno aumentato l'interesse per l'utilizzo di mRNA sintetico per scopi terapeutici. Qui, il metodo che utilizza l'mRNA sintetico è stato rivisto per studiare l'effetto della sovraespressione genica sulla migrazione e l'invasione delle cellule tumorali. Questo studio dimostra che l'elevata espressione genica con trasfezione sintetica di mRNA seguita da una misurazione in tempo reale basata sull'impedenza può aiutare a identificare i geni che stimolano la migrazione e l'invasione delle cellule tumorali. Questo documento fornisce importanti dettagli sulle procedure per esaminare l'effetto dell'espressione genica alterata sulla migrazione e l'invasione delle cellule tumorali.
Introduction
La motilità delle cellule tumorali gioca un ruolo cruciale nelle metastasi 1,2. La diffusione delle cellule tumorali ai tessuti sani vicini e remoti rende difficile il trattamento del cancro e contribuisce alla recidiva 3,4. Pertanto, è essenziale comprendere i meccanismi della motilità delle cellule tumorali e sviluppare strategie terapeutiche pertinenti. Poiché molte cellule tumorali hanno profili di espressione genica alterati, è fondamentale capire quali cambiamenti nel profilo di espressione genica portano ad un'alterazione della motilità delle cellule tumorali 5,6.
Sono stati sviluppati diversi saggi per misurare la migrazione cellulare in vitro. Alcuni test forniscono solo informazioni limitate a causa della possibilità di misurazioni solo in punti temporali specifici, mentre altri offrono informazioni complete sulla motilità delle cellule tumorali in tempo reale7. Sebbene molti di questi saggi di motilità cellulare possano fornire risultati quantitativi in un dato momento o nel punto finale, non riescono a fornire informazioni sufficientemente dettagliate sui cambiamenti dinamici nel tasso di migrazione cellulare durante il periodo sperimentale. Inoltre, può essere difficile esaminare i potenziali cambiamenti nel tasso di migrazione cellulare a seconda del disegno sperimentale, dei tipi di cellule e del numero di cellule. Inoltre, gli effetti di trattamenti non complicati possono essere studiati con la semplice quantificazione dei tradizionali saggi di motilità, ma può essere necessaria una quantificazione più sofisticata per studiare gli effetti complessi di vari trattamenti combinati8.
E' stato messo a punto uno strumento per monitorare la corrente elettrica di una piastra per microtitolazione sul fondo di un pozzetto ricoperto di microelettrodi9. L'adesione delle cellule alla superficie del pozzetto ostacola il flusso di elettroni e l'impedenza è correlata al legame quantitativo e qualitativo delle cellule. La presenza dei microelettrodi sul fondo del pozzetto consente di misurare l'adesione, la diffusione e la proliferazione cellulare. La presenza dei microelettrodi sotto una membrana microporosa della camera superiore consente di misurare la migrazione e l'invasione cellulare nella camera inferiore, con la camera superiore rivestita con proteine della matrice extracellulare (ECM) per consentire l'invasione10.
In precedenza, è stato dimostrato che le misurazioni in tempo reale basate sull'impedenza della migrazione e dell'invasione delle cellule tumorali forniscono dati in tempo reale durante l'intero esperimento, nonché confronti e quantificazioni istantanei in varie condizioni sperimentali11. In quel documento, il knockdown genico è stato indotto per testare il ruolo delle proteine di interesse nella migrazione e nell'invasione delle cellule tumorali. Poiché un effetto di knockdown genico in piena regola nelle condizioni sperimentali testate ha richiesto 3-4 giorni dopo l'elettroporazione con piccoli RNA interferenti (siRNA)8, le cellule sono state ripiastrate dopo l'elettroporazione e riraccolte 3 giorni dopo per la misurazione in tempo reale basata sull'impedenza della migrazione e dell'invasione delle cellule tumorali.
CT10 regolatore della chinasi (Crk) e Crk-like (CrkL) sono proteine adattatrici che mediano le interazioni proteina-proteina a valle di varie vie chinasici del recettore del fattore di crescita e vie tirosin-chinasici non recettoriali12. Livelli elevati di proteine Crk e CrkL contribuiscono a una prognosi infausta in diversi tumori umani, tra cui il glioblastoma13. Tuttavia, non è chiaro come le proteine Crk e CrkL elevate portino a una prognosi infausta. Pertanto, è importante definire l'effetto della sovraespressione di Crk e CrkL sulle funzioni delle cellule tumorali. In precedenza, è stato eseguito uno studio di knockdown genico per dimostrare che i livelli endogeni delle proteine Crk e CrkL sono necessari per la migrazione e l'invasione delle cellule di glioblastoma8. Qui, è stato sviluppato un sistema di analisi modificato per affrontare l'effetto della sovraespressione di Crk e CrkL sulla migrazione e l'invasione delle cellule tumorali.
Recentemente, la sintesi in vitro dell'mRNA e le sue applicazioni terapeutiche hanno attirato una rinnovata attenzione a causa dello sviluppo dei vaccini a mRNA contro SARS-CoV-2 (revisionato da Verbeke et al.14). Inoltre, sono stati compiuti notevoli progressi nell'uso dell'mRNA sintetico nel cancro e in altre malattie15,16. L'elettroporazione delle cellule è un metodo efficace per fornire mRNA sintetico e indurre modificazioni genetiche transitorie (revisionato da Campillo-Davo et al.17), e l'uso di mRNA sintetico consente un'espressione genica rapida ed efficiente nei fibroblasti immortalizzati 18. Questo documento combina la sovraespressione genica utilizzando l'mRNA sintetico con analisi cellulari in tempo reale per studiare la migrazione e l'invasione delle cellule tumorali. Tuttavia, lo schema sperimentale utilizzato per i siRNA non funziona con la trasfezione di mRNA sintetico, poiché il livello di proteine esogene aumenta rapidamente e diminuisce gradualmente dopo la trasfezione di mRNA sintetico18. Pertanto, il metodo è stato modificato per eseguire l'analisi in tempo reale della migrazione e dell'invasione cellulare subito dopo la trasfezione senza coltivare ulteriormente le cellule.
Questo documento dimostra che la combinazione di misurazioni in tempo reale basate sull'impedenza con la trasfezione di cellule tumorali con mRNA sintetici fornisce un'analisi rapida e completa degli effetti della sovraregolazione genica sulla migrazione e sull'invasione delle cellule tumorali. Questo documento descrive procedure dettagliate per misurare come la migrazione e l'invasione delle cellule di glioblastoma sono influenzate dalla sovraespressione di Crk e CrkL. Esaminando gli effetti dipendenti dalla concentrazione dell'mRNA sintetico sulla migrazione delle cellule tumorali, l'articolo descrive chiaramente come un aumento dei livelli proteici stimoli la migrazione delle cellule tumorali. Inoltre, viene presentato un approccio di variazione della concentrazione del gel ECM per valutare gli effetti dei cambiamenti nell'espressione genica sull'invasione delle cellule tumorali.
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Protocol
1. Sintesi dell'mRNA
NOTA: Per la sintesi dell'mRNA, tutti i reagenti e le apparecchiature devono essere trattati in modo speciale per inattivare le RNasi prima dell'uso. Vedere la Tabella dei materiali per i dettagli su tutti i materiali, gli strumenti e i reagenti utilizzati in questo protocollo.
- Linearizzazione del DNA
NOTA: I cDNA murini di CrkI e CrkL sono stati clonati nel vettore di espressione pFLAG-CMV-5a per aggiungere il tag dell'epitopo FLAG all'estremità C e subclonati nel vettore pcDNA3.1/myc-His per incorporare il promotore T7, come descrittoin precedenza 18,19.- Aggiungere 10 μL di tampone di reazione 10x, 1,5 μL di PmeI (10.000 unità/mL) e 10 μg di DNA plasmidico a una provetta per microcentrifuga per linearizzare il DNA plasmidico con l'enzima di restrizione. Aggiungere acqua priva di nucleasi per portare il volume di reazione a 100 μL.
- Miscelare picchiettando, centrifugare e incubare la miscela di reazione a 37 °C per una notte.
- Centrifugare e aggiungere 5 μL di sodio dodecil solfato (SDS) al 10% e 1 μL di proteinasi K (20 mg/mL, grado RNA) alla miscela di reazione. Miscelare alla spina, centrifugare e incubare a 50 °C per 30 min.
- Sotto la cappa aspirante, aggiungere 100 μL della fase inferiore di fenolo:cloroformio:alcol isoamilico alla miscela di reazione plasmidica per l'estrazione. Vortex, quindi centrifugare a 18.800 × g per 5 minuti a temperatura ambiente. Spostare la fase superiore su un nuovo tubo.
- Ripetere il passaggio 1.1.4 con cloroformio: alcol isoamilico a 24:1.
- Nella nuova provetta, portare il volume di reazione a 300 μL aggiungendo 200 μL di acqua priva di nucleasi, quindi aggiungere 30 μL di acetato di sodio 3 M e 600 μL di etanolo al 100%.
- Mescolare mediante vortice, quindi porre a -20 °C per 30-60 minuti per la precipitazione dell'etanolo del DNA.
- Centrifugare a 18.800 × g per 20 minuti a 4 °C, eliminare il surnatante e sciacquare il pellet con 1 ml di etanolo al 70%. Ripetere la centrifugazione per 10 minuti, quindi rimuovere completamente il surnatante.
- Asciugare con il tappo aperto per 2 minuti, aggiungere 30 μL di acqua priva di nucleasi e risospendere il pellet di DNA.
- Determinare la concentrazione di DNA utilizzando uno spettrofotometro.
- Verificare la dimensione e la quantità del DNA linearizzato utilizzando l'elettroforesi su gel di agarosio.
- Sintesi dell'RNA mediante T7 RNA polimerasi
- Aggiungere 2 μL ciascuno di 10 tamponi di trascrizione, ATP, GTP, UTP, CTP e T7 e 1 μg di DNA linearizzato a una provetta per microcentrifuga. Aggiungere acqua priva di nucleasi per portare il volume di reazione a 20 μL.
- Miscelare picchiettando, centrifugare e incubare la miscela di reazione a 37 °C per 2 ore per la sintesi dell'RNA.
- Centrifugare, aggiungere 1 μL di DNasi (2 U/μL) e incubare a 37 °C per 15 minuti per rimuovere il DNA stampo.
- Precipitazione del cloruro di litio dell'RNA
- Aggiungere 10 μL di cloruro di litio (7,5 M) alla miscela di reazione. Miscelare picchiettando, centrifugare e incubare la miscela di reazione a -20 °C per 30 minuti.
- Centrifugare a 18.800 × g per 20 minuti a 4 °C, eliminare il surnatante e sciacquare il pellet con 500 μL di etanolo al 70%. Ripetere la centrifugazione per 10 minuti, quindi rimuovere completamente il surnatante.
- Asciugare con il tappo aperto per 2 minuti, aggiungere 30 μL di acqua priva di nucleasi e risospendere il pellet di RNA.
- Tappatura
- Riscaldare il campione di RNA a 65 °C per 10 minuti, quindi metterlo sul ghiaccio per il raffreddamento.
- Aggiungere 5 μL ciascuno di 10x tampone di capping, 10 mM GTP e 1 mM (10x) S-adenosilmetionina (SAM), 2 μL ciascuno di una miscela di enzimi di capping e una miscela di enzimi O-metiltransferasi e 1,25 μL di inibitore della RNasi. Miscelare picchiettando, centrifugare e incubare la miscela di reazione a 37 °C per 1 ora.
- Coda in polietilene (A)
- Centrifugare il campione, quindi aggiungere 6 μL di acqua priva di nucleasi, 20 μL di tampone E-PAP 5x, 10 μL di MnCl2 da 25 mM, 10 μL di ATP 10 mM e 4 μL di enzima di coda poli(A) E-PAP. Miscelare picchiettando, centrifugare e incubare la miscela di reazione a 37 °C per 2 ore.
- Precipitazione del cloruro di litio e quantificazione dell'mRNA sintetico
- Aggiungere 50 μL di cloruro di litio (7,5 M) ed eseguire la precipitazione del cloruro di litio come descritto nei passaggi 1.3.1-1.3.3.
- Misurare la concentrazione dell'mRNA utilizzando uno spettrofotometro.
- Verificare la dimensione e la quantità di mRNA utilizzando l'elettroforesi su gel di formaldeide (1%-2%) agarosio (1%).
2. Rivestimento in gel della matrice extracellulare (ECM) delle piastre di invasione e migrazione cellulare (CIM)
NOTA: Una piastra CIM (Cell Invasion and Migration) è una piastra a 16 pozzetti prodotta commercialmente per l'analisi cellulare in tempo reale basata sull'impedenza. Per il saggio di invasione cellulare, rivestire le piastre CIM con gel ECM, come descritto in precedenza, ma con alcune modifiche11.
- Rimuovere un'aliquota di brodo di gel ECM dal congelatore e conservarla sul ghiaccio.
- Diluire il gel ECM (10 mg/mL) a una concentrazione di lavoro (100 μg/mL) mescolando 990 μL di Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) (senza siero o antibiotici) con 10 μL di gel ECM in una provetta per microcentrifuga. Miscelare mediante pipettaggio delicato.
- Aggiungere 60 μL di gel ECM diluito a ciascuno dei 16 pozzetti della camera superiore della piastra CIM. Applicare il metodo di pipettaggio inverso evitando le bolle d'aria20,21.
NOTA: Ottimizzare la concentrazione del gel ECM per ogni linea cellulare. Per le linee cellulari di glioblastoma, per l'ottimizzazione è stato utilizzato gel ECM da 0,1 μg/μL a 1 μg/μL. - Posizionare la camera superiore della piastra CIM con il coperchio della piastra su un foglio di plastica protettiva all'interno di un incubatore di CO2 per circa 4 ore per formare uno strato di gel.
ATTENZIONE: Durante il rivestimento della piastra CIM con gel ECM, gli elettrodi della camera superiore della piastra CIM non devono avere contatto diretto con le mani dello sperimentatore o le superfici dell'apparecchiatura, compresa la cabina di biosicurezza o l'incubatore di CO2 .
3. Preparazione delle cellule tumorali
NOTA: Tutti i materiali di coltura cellulare devono essere mantenuti sterili. Prelevare ed elettropolizzare le cellule tumorali in una cabina di sicurezza biologica con adeguati dispositivi di protezione individuale (DPI), come descritto in precedenza ma con alcune modifiche11.
- Coltura delle cellule tumorali
- Coltura di cellule U-118MG in 10 mL di DMEM contenente il 5% di siero fetale bovino (FBS) e l'1% di antibiotici per piastra di coltura tissutale in polistirene da 100 mm x 20 mm a 37 °C in un incubatore al 5% di CO2 (condizione di coltura).
- Deplezione sierica delle cellule tumorali
NOTA: L'esposizione delle cellule ai chemioattrattivi presenti in FBS deve essere ridotta al minimo prima dei saggi di migrazione e invasione cellulare utilizzando un'alta concentrazione di FBS.- Rimuovere il vecchio terreno e aggiungere 10 ml di DMEM preriscaldato contenente lo 0,5% di FBS e l'1% di antibiotici per piatto (terreno a basso contenuto di siero).
- Ripetere il passaggio 3.2.1.
- Incubare le cellule a 37 °C in un incubatore al 5% di CO2 per 4 ore o più.
- Raccolta delle cellule tumorali
- Rimuovere il vecchio terreno, aggiungere 8 mL di soluzione salina tamponata con fosfato di Dulbecco (DPBS) preriscaldata per piatto, rimuovere il DPBS, aggiungere tripsina-EDTA allo 0,05% preriscaldato (2 mL/piatto) per coprire la superficie e incubare nell'incubatore CO2 per 30 secondi.
- Aspirare con cautela la tripsina-EDTA, aggiungere terreno a basso contenuto di siero (7 ml/piatto), quindi raccogliere le cellule in una provetta da centrifuga da 50 ml o 15 ml.
- Quotare un piccolo volume di celle e utilizzare un contatore di cellule automatizzato portatile per contare le cellule.
- Calcola il numero totale di celle e il volume richiesto per 10.000 cellule/μL.
- Centrifugare le cellule centrifugandole a 100 × g per 5 minuti a temperatura ambiente, aspirare il surnatante, aggiungere il volume calcolato di DMEM contenente lo 0,5% di FBS (senza antibiotici) e risospendere delicatamente il pellet cellulare.
- Trasferire 110 μL della sospensione cellulare, contenente 1,1 milioni di cellule, in una provetta per microcentrifuga per ogni trattamento.
- Ripetere il passaggio 3.3.6 per trasferire le cellule in quattro provette per microcentrifuga per quattro diversi trattamenti.
NOTA: Una piastra CIM ha un totale di 16 pozzetti. Progettare quattro diversi trattamenti per il confronto in modo che sia possibile assegnare quattro pozzetti della piastra CIM per ciascun trattamento. Utilizzare le celle elettroporate per i seguenti esperimenti: analisi western blot (0,3 milioni di cellule per piastra di coltura tissutale da 35 mm), quattro pozzetti di saggi di migrazione cellulare in tempo reale (0,1 milioni di cellule/pozzetto) e quattro pozzetti di saggi di invasione cellulare in tempo reale (0,1 milioni di cellule/pozzetto) per ciascun trattamento. Regolare il numero di celle che devono essere elettroporate se il progetto sperimentale cambia.
4. Elettroporazione delle cellule tumorali
- Per rimuovere il terreno, aggiungere 1 mL di DPBS alla sospensione cellulare in ciascuna provetta, far ruotare la sospensione cellulare tre volte per 10 secondi ogni volta ruotando la provetta di 180° ogni 10 secondi utilizzando una mini centrifuga e rimuovere il surnatante utilizzando una micropipetta.
NOTA: È importante formare un pellet cellulare compatto ma facilmente rispendibile. - Aggiungere 110 μL di tampone di risospensione R al pellet cellulare per ottenere 0,1 milioni di cellule in 10 μL.
- Aggiungere mRNA sintetico al pellet cellulare per ottenere una concentrazione di 0,2-20 ng/μL a seconda del livello di espressione desiderato. Miscelare e risospendere delicatamente il pellet cellulare picchiettando o pipettando delicatamente.
NOTA: Utilizzare diverse concentrazioni di mRNA sintetico, esaminare l'espressione proteica utilizzando l'analisi western blot e determinare la concentrazione di mRNA sintetico che porta al livello di espressione desiderato al fine di indagare la correlazione specifica tra l'espressione proteica e gli effetti biologici. - Elettroporare 10 μL della sospensione cellulare con un sistema di elettroporazione a 1.350 V per 10 ms con tre impulsi ogni volta.
- Trasferire le celle elettroporate in una nuova provetta per microcentrifuga con 1,1 mL di DMEM contenente lo 0,5% di FBS.
- Ripetere l'elettroporazione fino a quando il resto della sospensione cellulare non è elettroporato. Combinare le celle elettroporate nella provetta per microcentrifuga per ottenere 1,1 milioni di cellule in 1,1 mL.
NOTA: Sia i puntali per elettroporazione da 100 μL che quelli da 10 μL possono essere utilizzati per elettroporare un grande volume di cellule, ma i puntali per elettroporazione da 10 μL e 100 μL sono inclusi in due kit separati e devono essere acquistati separatamente. Il tampone di risospensione R è incluso in entrambi i kit. - Dopo aver completato tutte le rispettive elettroporazioni, risospendere delicatamente le celle raggruppate.
- Piastra di 0,3 milioni di cellule in un piatto di coltura tissutale in polistirene da 35 mm x 10 mm con 2 mL di DMEM contenente il 5% di FBS e coltivare le cellule per 1 giorno in condizioni di coltura per la preparazione del lisato cellulare totale e le analisi western blot.
- Mantenere il resto delle celle elettroporate a temperatura ambiente fino a quando il sistema di analisi delle celle in tempo reale non è pronto.
5. Impostazione dell'analizzatore di celle in tempo reale, del programma e delle piastre CIM
NOTA: Preparare l'analizzatore di celle in tempo reale e due piastre CIM, come descritto in precedenza11.
- Equilibratura dell'analizzatore di celle in tempo reale
- Spostare l'analizzatore di cellule in tempo reale in un incubatore di CO2 diverse ore prima dell'uso per bilanciare il sistema in condizioni di coltura.
- Impostazione del programma di analisi
- Aprire il programma di analisi facendo doppio clic sull'icona del software di analisi cellulare in tempo reale sul desktop.
- Una volta aperta l'opzione Impostazione modello di esperimento predefinito , selezionare l'opzione per eseguire tre esperimenti separatamente.
NOTA: Ogni base ha una finestra separata. Sono disponibili diverse schede per impostare l'intervallo e la durata della misurazione, l'analisi dei dati e altre condizioni sperimentali. - Aprire ogni base facendo clic sulla scheda Numero .
- Fare clic sulla scheda Note esperimento, selezionare la cartella in cui verranno salvati i dati e immettere il nome dell'esperimento .
- Fare clic sulla scheda Layout , impostare i pozzetti quadruplicati per ciascuna condizione di trattamento selezionando quattro pozzetti alla volta e inserendo le informazioni sul campione, quindi fare clic su Applica.
- Fare clic sulla scheda Pianificazione | Aggiungere un passo per impostare la modalità a due fasi delle misurazioni dell'impedenza della cella. Quindi, fai clic su Applica per impostare il primo passaggio.
- Fare nuovamente clic su Aggiungi un passaggio, immettere 10 minuti per l'intervallo e 48 ore per la durata per la migrazione e l'invasione, quindi fare clic su Applica per impostare il secondo passaggio.
NOTA: Il primo passaggio richiede una misurazione di base una tantum (una scansione con un intervallo di 1 minuto). La seconda fase misura l'impedenza cellulare per l'esperimento (ad esempio, 289 sweep con un intervallo di 10 minuti per 48 ore) nella culla. Regolare l'intervallo e la durata in base al disegno sperimentale. - Passare alla base successiva e configurarla ripetendo i passaggi 5.2.3-5.2.7.
- Preparazione delle lastre CIM
- Un'ora prima dell'inizio della misurazione dell'impedenza cellulare, riempire i pozzetti della camera inferiore della piastra CIM con 160 μL di DMEM contenente il 10% di siero o altri chemioattrattivi.
- Assemblare la camera superiore che contiene i pozzetti rivestiti di gel ECM (per l'invasione) o i pozzetti non rivestiti (per la migrazione) con la camera inferiore.
- Aggiungere 50 μL di terreno a basso contenuto di siero ai pozzetti della camera superiore della piastra CIM per il saggio di migrazione cellulare e posizionare la piastra CIM nella culla del sistema.
- Fare clic sulla scheda Messaggio e assicurarsi che venga visualizzato il messaggio Connessioni ok . La piastra CIM è ora pronta per l'esperimento.
- Preincubare la piastra CIM assemblata nell'incubatore di CO2 per 30-60 minuti prima dell'analisi cellulare in tempo reale per acclimatare la piastra CIM alle condizioni di coltura.
6. Analisi delle celle in tempo reale ed esportazione dei dati
NOTA: Eseguire una lettura della linea di base, la semina delle celle, la misurazione dell'impedenza cellulare e l'esportazione dei dati come descritto in precedenza11.
- Lettura di base
NOTA: La linea di base deve essere letta dopo che la piastra CIM è stata acclimatata e prima che le cellule vengano aggiunte ai pozzetti della camera superiore.- Fare clic sul pulsante Start per ogni base. Quando viene visualizzata la finestra Salva con nome , salvare il file sperimentale per eseguire la lettura della linea di base.
- Semina cellulare
- Rimuovere la piastra CIM dalla base e posizionarla nell'armadio di biosicurezza sul supporto della piastra.
- Aggiungere 100 μL (contenenti 100.000 celle) di celle elettroporate ai pozzetti della camera superiore della piastra CIM secondo il programma nell'unità di controllo. Applicare il metodo di pipettaggio inverso evitando la formazione di bolle d'aria.
- Lasciare la piastra CIM sotto l'armadio di biosicurezza per 30 minuti a temperatura ambiente per assicurarsi che le cellule si distribuiscano uniformemente sul fondo del pozzetto.
- Misura dell'impedenza delle celle
- Riportare la piastra CIM completamente assemblata nella rispettiva base. Fare clic sul pulsante Start della base per iniziare la misurazione dell'impedenza della cella per il secondo passaggio.
- Fare clic sulla scheda Grafico , quindi fare clic sul pulsante Aggiungi tutto e selezionare le caselle Media e STD DEV per visualizzare i dati in tempo reale.
NOTA: L'opzione di stampa di default è Tempo per l'asse x e Indice cella per l'asse y. La sezione Selezione grafico consente all'utente di selezionare opzioni alternative per l'asse y: Indice cella normalizzato o Indice cella delta. Una volta eseguita la scansione finale, l'esperimento è completato e i risultati vengono salvati automaticamente.
- Esportazione dei dati per l'analisi
- Fare clic sulla scheda Grafico e selezionare le caselle Media e STD DEV per copiare i dati per ciascun pozzetto singolarmente.
- Fare clic con il pulsante destro del mouse sull'area del tracciato e selezionare Copia dati in formato elenco.
- Apri un foglio di calcolo vuoto, incolla i dati e salva il file.
- Tornare al programma di analisi, fare clic sulla scheda Piastra per ciascuna base e selezionare Rilascia per chiudere l'esperimento per la culla.
- Tornare al file del foglio di calcolo e regolare l'ora dei dati grezzi in modo che l'ora di inizio del secondo passaggio diventi l'ora di inizio effettiva della misurazione.
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Representative Results
Le proteine Crk e CrkL svolgono un ruolo importante nella motilità di molti tipi di cellule, tra cui i neuroni22, le cellule T23, i fibroblasti 18,19 e una varietà di cellule tumorali13. Poiché le proteine Crk e CrkL sono state segnalate per essere elevate nel glioblastoma24,25,26, in questo lavoro sono stati studiati gli effetti della sovraespressione di CrkI, una variante di splicing di Crk, sulla migrazione delle cellule di glioblastoma. Le cellule U-118MG sono state elettroporate con diverse concentrazioni di mRNA CrkI sintetico e analizzate per i livelli proteici e la migrazione cellulare. L'elettroporazione di cellule di glioblastoma U-118MG con concentrazioni variabili di mRNA CrkI sintetico ha provocato un aumento dipendente dalla concentrazione della proteina CrkI marcata con FLAG 1 giorno dopo la trasfezione (Figura 1A). Mentre l'mRNA di 0,2 ng/μL e 2 ng/μL ha portato a un'espressione non rilevabile o modesta della proteina CrkI esogena, l'mRNA di 20 ng/μL ha determinato un livello di espressione molto più elevato rispetto alla proteina CrkI endogena.
I risultati del test di migrazione cellulare utilizzando il sistema di analisi cellulare in tempo reale hanno indicato che l'elettroporazione con mRNA CrkI 0,2 ng/μL o 2 ng/μL non ha influenzato notevolmente la migrazione cellulare. Tuttavia, l'elettroporazione con mRNA CrkI da 20 ng/μL ha portato a una chiara stimolazione della migrazione cellulare, con un maggior numero di cellule che migrano tra 2 e 13 ore (Figura 1B). Il confronto tra il livello della proteina CrkI e la migrazione cellulare ha rivelato che la migrazione delle cellule di glioblastoma è stata stimolata dall'aumento del livello della proteina CrkI. Sembra che il livello della proteina CrkI dovrebbe essere superiore a una certa soglia per causare una sostanziale stimolazione della migrazione cellulare. Se la migrazione cellulare fosse stata misurata in modi diversi per contare o osservare le cellule migrate in punti temporali specifici, sarebbe stato necessario uno sforzo molto maggiore per identificare questo tipo di cambiamento nella migrazione cellulare.
Per studiare come la sovraespressione di CrkL influenzi l'invasione delle cellule di glioblastoma attraverso strati di gel ECM con diverse concentrazioni di proteine ECM, le cellule U-118MG sono state elettroporate con mRNA sintetico di CrkL e analizzate in termini di livelli proteici e invasione cellulare attraverso uno strato di gel ECM. L'elettroporazione di cellule di glioblastoma U-118MG con mRNA sintetico di CrkL ha portato a una robusta espressione della proteina CrkL marcata con FLAG 1 giorno dopo la trasfezione (Figura 2A). Con l'aumento della concentrazione di proteine ECM, l'invasione delle cellule di controllo è rallentata (Figura 2B). Le cellule che sovraesprimono CrkL hanno anche mostrato una diminuzione dipendente dalla concentrazione del gel ECM nell'invasione cellulare (Figura 2C). Il confronto tra le cellule di controllo e le cellule che sovraesprimono CrkL a diverse concentrazioni di gel ECM ha indicato che la sovraespressione di CrkL generalmente stimola l'invasione cellulare attraverso lo strato di gel ECM (Figura 2D-G). Tuttavia, la differenza tra le due popolazioni cellulari è diventata evidente in momenti diversi a seconda della concentrazione di gel ECM.
Per il gel ECM da 0,1 μg/μL, la stimolazione dell'invasione cellulare mediata dalla sovraespressione di CrkL è stata evidente tra le 8 e le 20 ore (Figura 2D), ma la differenza nell'invasione cellulare è risultata trascurabile dopo 32 ore. Per il gel ECM da 0,2 μg/μL, la differenza nell'invasione cellulare con e senza sovraespressione di CrkL è stata sempre minima (Figura 2E). Per il gel ECM da 0,5 μg/μL, la differenza nell'invasione cellulare è stata evidente tra 24 e 36 ore (Figura 2F). Per il gel ECM da 1 μg/μL, l'effetto di sovraespressione di CrkL sull'invasione cellulare è diventato leggermente evidente a 48 ore (Figura 2G). I risultati suggeriscono che la finestra per rilevare la differenza tra le cellule di controllo e quelle che sovraesprimono CrkL si sposta in tempi successivi all'aumentare della concentrazione del gel ECM. I risultati suggeriscono anche che le due popolazioni cellulari sono state influenzate in modo differenziato dall'aumento della concentrazione di gel ECM in diversi momenti. Ad esempio, a 12 ore, le cellule che sovraesprimono CrkL hanno mostrato un'invasione sostanzialmente maggiore solo a 0,1 μg/μL di gel ECM (Figura 2H). Tuttavia, a 24 ore, le cellule che sovraesprimono CrkL hanno mostrato un'invasione leggermente superiore o simile alle concentrazioni di gel ECM testate (Figura 2I). Pertanto, è importante studiare sia le differenze dipendenti dal tempo che quelle dipendenti dalla concentrazione del gel ECM nell'invasione cellulare per ottenere una visione completa delle differenze tra le due popolazioni cellulari con e senza sovraespressione di CrkL. Questi risultati dimostrano che la combinazione di sovraespressione transitoria utilizzando mRNA sintetico con analisi cellulari in tempo reale basate sull'impedenza fornisce un potente strumento per analizzare la potenziale correlazione tra la sovraespressione genica e la migrazione e l'invasione delle cellule tumorali. L'esame degli effetti delle variazioni di concentrazione nell'mRNA sintetico e nel gel ECM fornirebbe informazioni più accurate e dettagliate.
Figura 1: Gli effetti della sovraespressione di CrkI sulla migrazione delle cellule di glioblastoma. Le cellule U-118MG sono state elettroporate con le concentrazioni indicate (ng/μL) di mRNA CrkI marcato con FLAG. (A) Per le analisi western blot, le cellule elettroporate sono state coltivate per 1 giorno prima della preparazione del lisato cellulare totale. Sono stati confrontati i livelli di proteina dopo la trasfezione con mRNA sintetico di CrkI . Gli anticorpi anti-Crk e anti-CrkL sono stati utilizzati per rilevare sia le proteine endogene che quelle marcate con FLAG e per confrontare il rapporto tra le proteine endogene e le proteine marcate con FLAG. La vinculina e la α-tubulina sono state utilizzate come controlli di carico. (B) Per le analisi di migrazione cellulare, le cellule elettroporate sono state placcate su una piastra CIM senza ulteriore coltura. I valori dell'indice cellulare sono stati ottenuti da quattro pozzetti per ciascun campione e sono mostrati i loro valori medi ± SD. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 2: Effetti della sovraespressione di CrkL sull'invasione delle cellule di glioblastoma. Le cellule U-118MG sono state elettroporate con mRNA CrkL marcato con FLAG H2O privo di nucleasi o 20 ng/μL marcato con FLAG. (A) Per le analisi western blot, le cellule elettroporate sono state coltivate per 1 giorno prima della preparazione del lisato cellulare totale. Sono stati confrontati i livelli di proteina dopo trasfezione con mRNA sintetico di CrkL. Gli anticorpi anti-Crk e anti-CrkL sono stati utilizzati per rilevare sia le proteine endogene che quelle marcate con FLAG e per confrontare il rapporto tra le proteine endogene e le proteine marcate con FLAG. La vinculina e la α-tubulina sono state utilizzate come controlli di carico. (B-G) Per l'analisi dell'invasione cellulare, le cellule elettroporate sono state placcate su una piastra CIM con un rivestimento in gel ECM senza ulteriore coltura. I valori dell'indice cellulare sono stati ottenuti da quattro pozzetti per ciascun campione e sono mostrati i loro valori medi ± SD. (B) Sono stati confrontati i dati di invasione cellulare delle cellule di controllo con diverse concentrazioni di gel ECM. (C) Sono stati confrontati i dati sull'invasione cellulare delle cellule che sovraesprimono CrkL con varie concentrazioni di gel ECM. (D-G) I dati sull'invasione cellulare tra le cellule di controllo e le cellule che sovraesprimono CrkL sono stati confrontati per la concentrazione di gel ECM indicata. (H) Un confronto dell'invasione cellulare a 12 ore tra le cellule di controllo e le cellule che sovraesprimono CrkL. (I) Un confronto dell'invasione cellulare a 24 ore tra le cellule di controllo e le cellule che sovraesprimono CrkL. Abbreviazioni: ECM = matrice extracellulare; CIM = invasione e migrazione cellulare. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
Figura 3: Diagrammi schematici delle procedure sperimentali a seguito di knockdown genico o sovraespressione genica . (A) La procedura sperimentale dell'analisi cellulare in tempo reale a seguito della trasfezione di siRNA. Poiché sono necessari 3-4 giorni per indurre il knockdown genico completo dopo la trasfezione del siRNA nelle condizioni sperimentali, le cellule sono state ripiallate e coltivate per 3 giorni dopo l'elettroporazione prima di essere pronte per le analisi cellulari in tempo reale. (B) La procedura sperimentale per l'analisi cellulare in tempo reale a seguito della trasfezione di mRNA sintetico. Poiché l'espressione proteica dalla trasfezione di mRNA sintetico è rapida, le cellule elettroporate sono state utilizzate per analisi cellulari in tempo reale lo stesso giorno. Si noti la differenza tra le due procedure sperimentali; mentre l'analisi cellulare in tempo reale è stata eseguita 3 giorni dopo l'elettroporazione per il knockdown genico utilizzando siRNA, l'analisi cellulare in tempo reale è stata eseguita subito dopo l'elettroporazione per la sovraespressione genica con mRNA sintetico. Fare clic qui per visualizzare una versione più grande di questa figura.
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Discussion
La migrazione e l'invasione sono caratteristiche importanti delle cellule tumorali. La misurazione della motilità delle cellule tumorali e la comprensione del meccanismo sottostante che controlla la motilità delle cellule tumorali forniscono informazioni critiche sugli interventi terapeutici 2,27. Sono stati sviluppati diversi metodi per studiare la migrazione cellulare7. Il test di guarigione delle ferite che utilizza graffi o inserti di coltura è un metodo semplice e frequentemente utilizzato che fornisce immagini contrastanti della chiusura del gap. Il test di tracciamento delle singole cellule richiede il monitoraggio delle singole cellule con l'imaging time-lapse, per il quale le cellule possono essere etichettate con coloranti fluorescenti. Sia il test di guarigione delle ferite che il test di tracciamento delle singole cellule misurano il movimento spontaneo delle cellule.
Con l'aiuto dell'imaging time-lapse e dell'elaborazione intensiva dei dati post-requisizione, entrambi i saggi possono fornire confronti quantitativi tra i campioni28. Tuttavia, questi saggi non sono adatti per studiare l'invasione cellulare attraverso uno strato proteico ECM. Al contrario, i saggi di migrazione e invasione del transwell misurano la migrazione cellulare diretta attraverso una membrana di inserto del transwell con o senza uno strato proteico ECM. Tuttavia, il monitoraggio continuo non è fattibile con questi saggi perché le cellule migrate devono essere raccolte in un determinato momento e il transwell non può essere riutilizzato. Tutti questi saggi richiedono tempo e sforzi significativi per l'elaborazione dei dati o per esperimenti pratici per raccogliere e contare le cellule, con conseguenti potenziali variazioni legate all'operatore. La sfida più grande per questi test è quella di effettuare sofisticati confronti quantitativi tra più trattamenti combinati in vari punti temporali.
L'uso del sistema di analisi cellulare in tempo reale presentato in questo lavoro consente un monitoraggio quantitativo, continuo e completo per misurare la migrazione e l'invasione cellulare, e questo sistema presenta molti vantaggi rispetto ad altri semplici saggi di motilità cellulare, che forniscono risultati in punti temporali limitati e fissi. Come per altri saggi, le condizioni sperimentali delle analisi cellulari in tempo reale devono essere ottimizzate per ciascuna linea cellulare, poiché la migrazione e l'invasione di diverse linee cellulari possono essere influenzate in modo differenziato dal numero di cellule. Inoltre, il tasso di invasione cellulare diminuisce all'aumentare della concentrazione del gel ECM (Figura 2B,C). Pertanto, si raccomanda di testare diverse concentrazioni di gel ECM e confrontare gli effetti dei cambiamenti dell'espressione genica sull'invasione cellulare sotto queste diverse concentrazioni di gel ECM.
Con il sistema di analisi cellulare in tempo reale, l'ottimizzazione è facile e diretta, poiché il sistema di analisi produce dati in tempo reale senza tempi di intervento. Il sistema di analisi identifica la velocità con cui le cellule migrano o invadono e quando raggiungono il massimo livello di migrazione o invasione cellulare. L'ottenimento di queste informazioni sulla motilità cellulare consente analisi comparative dettagliate tra i vari gruppi di trattamento, che possono essere eseguite semplicemente utilizzando le funzionalità integrate del programma. Inoltre, la sensibilità del sistema di analisi in tempo reale consente l'identificazione e la quantificazione di sottili cambiamenti nella migrazione cellulare e nell'invasione da parte dell'espressione genica dipendente dalla concentrazione, come dimostrato nella Figura 1 e nella Figura 2.
In precedenza, è stata fornita una procedura dettagliata per misurare la migrazione e l'invasione delle cellule tumorali in seguito al knockdown del gene utilizzando il sistema di analisi cellulare in tempo reale basato sull'impedenza. Poiché il knockdown genico richiede 3-4 giorni dopo che le cellule sono state elettroporate con siRNA, le cellule sono state riplaccate dopo l'elettroporazione. Le cellule elettroporate sono state coltivate per 3 giorni prima di essere nuovamente raccolte per le analisi cellulari in tempo reale, rendendo l'intero esperimento un processo in due fasi: elettroporazione il giorno 1 e analisi cellulare in tempo reale il giorno 4, come mostrato nella Figura 3. Al contrario, l'espressione genica all'elettroporazione di cellule con mRNA sintetico è rapida ed efficiente, poiché l'analisi time-lapse di fibroblasti elettroporati con mRNA sintetico per GFP ha mostrato un forte segnale GFP 5 h dopo la trasfezione; L'intensità della fluorescenza ha raggiunto un massimo intorno alle 24 ore, dopodiché si è verificato un graduale declino del segnale di fluorescenza18.
Inoltre, in questo lavoro, le cellule U-118MG hanno mostrato una robusta espressione della proteina esogena quando elettroporate con mRNA sintetico per CrkI (Figura 1A) e per CrkL (Figura 2A), in linea con le precedenti osservazioni8. Pertanto, è opportuno eseguire le analisi cellulari in tempo reale subito dopo l'elettroporazione. Alcuni dei passaggi per l'analisi cellulare in tempo reale devono essere eseguiti prima di prelevare le cellule per l'elettroporazione. L'intero esperimento è un processo in un'unica fase che prevede l'elettroporazione e l'analisi cellulare in tempo reale il giorno 1. Il sistema di analisi cellulare in tempo reale basato sull'impedenza è stato ampiamente utilizzato per studiare la migrazione e l'invasione delle cellule tumorali in varie cellule tumorali solide, tra cui il cancro al seno29, il cancro del colon-retto 30, il melanoma 31, il cancro ovarico 32, il cancro squamoso della testa e del collo 33, il carcinoma a cellule renali 34, il carcinoma pancreatico 35, il carcinoma epatocellulare 36 e le cellule di cancro del polmone non a piccole cellule 10. Pertanto, l'uso combinato della sovraespressione genica mediante mRNA o del knockdown genico mediante siRNA rende più utile e applicabile la misurazione in tempo reale della migrazione e dell'invasione cellulare.
Il limite di questo protocollo è che questo metodo richiede la dissociazione e la raccolta delle cellule subito prima della misurazione della migrazione e dell'invasione cellulare. I trattamenti enzimatici e meccanici durante la dissociazione, la raccolta e la risospensione possono influenzare l'analisi37. Inoltre, ci può essere un ritardo nella migrazione cellulare mentre le cellule si riprendono dai trattamenti enzimatici e meccanici. Questo metodo potrebbe non essere appropriato se le cellule sono facilmente danneggiate dalla tripsinizzazione o da altri trattamenti meccanici durante la dissociazione e la raccolta di singole cellule o richiedono un lungo tempo di recupero dopo tali manipolazioni. Questa limitazione si applica anche al saggio di migrazione transwell, che è un altro metodo per misurare la migrazione cellulare diretta. Inoltre, l'elettroporazione che segue la preparazione delle cellule può rendere le cellule più vulnerabili ai danni38. Pertanto, è importante ottimizzare le condizioni per l'elettroporazione per ogni linea cellulare e anche elettroporare le celle di controllo per confronti più accurati.
La homepage del produttore del sistema di elettroporazione fornisce i parametri consigliati per l'elettroporazione (vedere la nota a piè di pagina nella tabella dei materiali). L'utilizzo di condizioni sperimentali coerenti e minimamente dannose durante la dissociazione e la risospensione cellulare è fondamentale per ottenere risultati riproducibili. Inoltre, correlare la quantità di mRNA, il livello proteico e la motilità cellulare è fondamentale per distinguere tra gli effetti specifici e non specifici della trasfezione dell'mRNA. In questo lavoro, è stato osservato che se la concentrazione di mRNA superava un certo livello, inibiva in modo non specifico le funzioni cellulari, compresa la migrazione e l'invasione cellulare (dati non mostrati). Pertanto, è importante titolare la concentrazione di mRNA. Inoltre, è fondamentale eseguire l'analisi cellulare in tempo reale quando l'espressione proteica è al suo livello di picco, poiché l'espressione proteica è transitoria con la trasfezione dell'mRNA. Come per altri saggi di motilità cellulare, i risultati di questa analisi cellulare in tempo reale possono essere confusi dalla proliferazione delle cellule durante la migrazione. Pertanto, si raccomanda di eseguire anche un test di proliferazione cellulare per comprendere l'influenza della proliferazione cellulare sui risultati della migrazione e dell'invasione cellulare.
I livelli proteici di Crk e CrkL sono noti per essere elevati in alcuni tipi di tumori umani. Poiché l'espressione di Crk e CrkL è correlata a varie funzioni delle cellule tumorali e la loro sovraespressione contribuisce a una prognosi sfavorevole, Crk e CrkL sono stati proposti come bersagli terapeutici per il trattamento del cancro13. In precedenza, il knockdown genico è stato indotto nelle cellule di glioblastoma per dimostrare che la migrazione e l'invasione delle cellule di glioblastoma sono marcatori robusti dell'attività di Crk e CrkL. Il presente studio fornisce un approccio sistematico di espressione genica per indurre la sovraespressione di Crk e CrkL utilizzando mRNA sintetico. È stata ottenuta una stretta correlazione tra i livelli proteici di Crk e CrkL e la migrazione e l'invasione delle cellule di glioblastoma utilizzando il sistema di analisi cellulare in tempo reale. I risultati supportano ulteriormente l'ipotesi che Crk e CrkL svolgano un ruolo essenziale nella migrazione e nell'invasione delle cellule di glioblastoma. Insieme al precedente documento sui metodi11, questo studio fornisce un approccio proof-of-concept per studiare una potenziale correlazione tra i cambiamenti nell'espressione genica e la migrazione e l'invasione delle cellule tumorali.
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Disclosures
Gli autori non hanno conflitti di interesse da rivelare.
Acknowledgments
Gli autori ringraziano il Medical Writing Center del Children's Mercy Kansas City per aver curato questo manoscritto. Questo lavoro è stato sostenuto dalla Fondazione A.R.T. di Natalie (a T.P.) e da una sovvenzione del Comitato Consultivo dei Partner MCA da parte del Children's Mercy Hospital (CMH) e del Centro Oncologico dell'Università del Kansas (KUCC) (a T.P.).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| AlphaImager HP | ProteinSimple | 92-13823-00 | Agarose gel imaging system |
| α-Tubulin antibody | Sigma | T9026 | Used to detect α-tubulin protein (dilution 1:3,000) |
| CIM-plate 16 | Agilent Technologies, Inc | 5665825001 | Cell invasion and migration plates |
| Crk antibody | BD Biosciences | 610035 | Used to detect CrkI and CrkII proteins (dilution 1:1,500) |
| CrkL antibody | Santa Cruz | sc-319 | Used to detect CrkL protein (dilution 1:1,500) |
| Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium (DMEM) | ATCC | 302002 | Cell culture medium |
| Dulbecco's phosphate-buffered saline (DPBS) | Corning | 21-031-CV | Buffer used to wash cells |
| Fetal bovine serum (FBS) | Hyclone | SH30910.03 | Culture medium supplement |
| Heracell VIOS 160i CO2 incubator | Thermo Scientific | 51030285 | CO2 incubator |
| IRDye 800CW goat anti-mouse IgG secondary antibody | Li-Cor | 926-32210 | Secondary antibody for Western blot analysis (dilution 1:10,000) |
| IRDye 800CW goat anti-rabbit IgG secondary antibody | Li-Cor | 926-32211 | Secondary antibody for Western blot analysis (dilution 1:10,000) |
| Lithium chloride | Invitrogen | AM9480 | Used for RNA precipitation |
| Matrigel matrix | Corning | 354234 | Extracellular matrix (ECM) gel |
| MEGAscript T7 transcription kit | Invitrogen | AM1334 | Used for RNA synthesis |
| Millennium RNA markers | Invitrogen | AM7150 | Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis |
| Mini centrifuge | ISC BioExpress | C1301P-ISC | Used to spin down cells |
| Mouse brain QUICK-Clone cDNA | TaKaRa | 637301 | Source of genes (inserts) for cloning |
| NanoQuant | Tecan | M200PRO | Nucleic acid quantification system |
| Neon electroporation system | ThermoFisher Scientific | MPK5000 | Electroporation system1 |
| Neon transfection system 10 µL kit | ThermoFisher Scientific | MPK1025 | Electroporation kit |
| Neon transfection system 100 µL kit | ThermoFisher Scientific | MPK10096 | Electroporation kit |
| NorthernMax denaturing gel buffer | Invitrogen | AM8676 | Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis |
| NorthernMax formaldehyde load dye | Invitrogen | AM8552 | Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis |
| NorthernMax running buffer | Invitrogen | AM8671 | Used for formaldehyde agarose gel electrophoresis |
| Nuclease-free water | Teknova | W3331 | Used for various reactions during mRNA synthesis |
| Odyssey CLx Imager | Li-Cor | Imager for Western blot analysis | |
| pcDNA3.1/myc-His | Invitrogen | V80020 | The vector into which inserts (mouse CrkI and CrkL cDNAs) were cloned |
| pFLAG-CMV-5a | Millipore Sigma | E7523 | Source of the FLAG epitope tag |
| Phenol:chloroform:isoamyl alcohol | Sigma | P2069 | Used for DNA extraction |
| PmeI | New England BioLabs | R0560L | Used to linearize the plasmids for mRNA synthesis |
| Poly(A) tailing kit | Invitrogen | AM1350 | Used for poly(A) tail reaction |
| Polystyrene tissue culture dish (100 x 20 mm style) | Corning | 353003 | Used for culturing cells before transfection |
| Polystyrene tissue culture dish (35 x 10 mm style) | Corning | 353001 | Used for culturing transfected cells |
| Proteinase K | Invitrogen | 25530049 | Used to remove protein in the reaction mixture |
| Purifier Axiom Class II, Type C1 | Labconco Corporation | 304410001 | Biosafety cabinet for sterile handling of cells |
| Resuspension Buffer R | ThermoFisher Scientific | A buffer included in the electroporation kits, MPK1025 and MPK10096. The buffer is used to resupend cells before electroporation, and its composition is proprietary information. | |
| RNaseZap | Invitrogen | AM9780 | RNA decontamination solution |
| Scepter | Millipore | C85360 | Handheld automated cell counter |
| ScriptCap 2'-O-methyltransferase kit | Cellscript | C-SCMT0625 | Used for capping reaction |
| ScriptCap m7G capping system | Cellscript | C-SCCE0625 | Used for capping reaction |
| Sodium dodecyl sulfate solution | Invitrogen | 15553-035 | Detergent used for the proteinase K reaction |
| Sorvall Legend XT centrifuge | Thermo Scientific | 75004532 | Benchtop centrifuge to spin down cells |
| Trypsin-EDTA | Gibco | 25300-054 | Used for dissociation of cells |
| U-118MG | ATCC | HTB15 | An adherent cell line derived from a human glioblastoma patient |
| Vinculin antibody | Sigma | V9131 | Used to detect vinculin protein (dilution 1:100,000) |
| xCELLigence RTCA DP | Agilent Technologies, Inc | 380601050 | Instrument used for real-time cell analysis |
| 1Electroporation parameters and other related information for various cell lines are available on the manufacturer's homepage (https://www.thermofisher.com/us/en/home/life-science/cell-culture/transfection/neon-transfection-system/neon-transfection-system-cell-line-data.html?). |
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