Summary
Протокол описывает легкую черепно-мозговую травму на мышиной модели. В частности, полностью объясняется пошаговый протокол для индукции легкой закрытой травмы головы по средней линии и характеристика животной модели.
Abstract
Высоковоспроизводимые модели черепно-мозговой травмы (ЧМТ) на животных с четко определенными патологиями необходимы для тестирования терапевтических вмешательств и понимания механизмов того, как ЧМТ изменяет функцию мозга. Наличие нескольких моделей ЧМТ на животных необходимо для моделирования различных аспектов и тяжести ЧМТ, наблюдаемых у людей. В этой рукописи описывается использование средней закрытой черепно-мозговой травмы (ОМС) для разработки мышиной модели легкой ЧМТ. Модель считается мягкой, потому что она не вызывает структурных поражений головного мозга, основанных на нейровизуализации или грубой потере нейронов. Тем не менее, один удар создает достаточно патологии, чтобы когнитивные нарушения можно было измерить по крайней мере через 1 месяц после травмы. В статье определен пошаговый протокол индуцирования ОМС у мышей с использованием электромагнитного ударного элемента со стереотаксическим управлением. Преимущества модели ОМС легкой средней линии включают воспроизводимость изменений, вызванных травмой, с низкой смертностью. Модель была временно охарактеризована до 1 года после травмы для нейровизуализации, нейрохимических, невропатологических и поведенческих изменений. Модель дополняет модели открытого черепа с контролируемым кортикальным воздействием с использованием того же ударного устройства. Таким образом, лаборатории могут моделировать как легкую диффузную ЧМТ, так и очаговую ЧМТ средней и тяжелой степени тяжести с одним и тем же ударом.
Introduction
Черепно-мозговая травма (ЧМТ) вызвана внешней силой на мозг, часто связанной с падениями, спортивными травмами, физическим насилием или дорожно-транспортными происшествиями. В 2014 году Центры по контролю и профилактике заболеваний определили, что 2,53 миллиона американцев обратились в отделение неотложной помощи, чтобы обратиться за медицинской помощью в связи с несчастными случаями, связанными с ЧМТ1. Поскольку легкая ЧМТ (мЧМТ) составляет большинство случаев ЧМТ, за последние несколько десятилетий было принято несколько моделей ЧМТ, которые включают снижение веса, закрытую черепно-мозговую травму, управляемую поршнем, и контролируемое воздействие коры, ротационную травму, легкую жидкостную ударную травму и модели взрывной травмы 2,3. Гетерогенность моделей mTBI полезна для устранения различных особенностей, связанных с mTBI, наблюдаемых у людей, и для оценки клеточных и молекулярных механизмов, связанных с повреждением головного мозга.
Из широко используемых моделей закрытой черепно-мозговой травмы одной из первых и наиболее широко используемых моделей является метод сброса веса, при котором на голову животного (обезболиваемый или бодрствующий) падает предмет с определенной высоты)2,4. В методе снижения веса тяжесть травмы зависит от нескольких параметров, в том числе от трепанации черепа, неподвижной или свободной головы, а также расстояния и веса падающего предмета 2,4. Одним из недостатков этой модели является высокая вариабельность тяжести травмы и высокий уровень смертности, связанный с угнетением дыхания 5,6. Распространенной альтернативой является нанесение удара с помощью пневматического или электромагнитного устройства, которое может быть выполнено непосредственно на открытой твердой мозговой оболочке (контролируемое корковое воздействие: CCI) или закрытом черепе (закрытая черепно-мозговая травма: CHI). Одной из сильных сторон поршневой травмы является ее высокая воспроизводимость и низкая смертность. Однако CCI требует трепанации черепа 7,8, а сама трепанациячерепа вызывает воспаление9. Вместо этого в модели ОМС нет необходимости в трепанации черепа. Как уже говорилось, каждая модель имеет ограничения. Одним из ограничений модели ОМС, описанной в данной статье, является то, что операция проводится с использованием стереотаксического каркаса, а голова животного обездвиживается. В то время как полная иммобилизация головы обеспечивает воспроизводимость, она не учитывает движение после удара, которое может способствовать травме, связанной с мЧМТ.
В этом протоколе описывается базовый способ выполнения воздействия ОМС с помощью коммерчески доступного электромагнитного ударного устройства10 в мыши. В этом протоколе подробно описаны точные параметры, необходимые для достижения высоковоспроизводимой травмы. В частности, исследователь имеет точный контроль над параметрами (глубина травмы, время выдержки и скорость удара) для точного определения тяжести травмы. Как описано, эта модель ОМС вызывает травму, которая приводит к двусторонней патологии, как диффузной, так и микроскопической (т.е. хронической активации глии, аксонального и сосудистого повреждения), а также поведенческим фенотипам 11,12,13,14,15. Кроме того, описанная модель считается легкой, так как не вызывает структурных поражений головного мозга на основе МРТ или грубых поражений по патологии даже через 1 год после травмы16,17.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Проведенные эксперименты были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию (IACUC) Университета Кентукки, и во время исследования соблюдались как ARRIVE, так и Руководство по уходу и использованию лабораторных животных.
1. Хирургическая установка
ПРИМЕЧАНИЕ: Мыши содержатся в группах по 4-5 человек в клетке, влажность в помещении поддерживается на уровне 43-47%, а температура поддерживается на уровне 22-23 °C. Мышам предоставляется свободный доступ к пище и воде, и они подвергаются воздействию 12-часового / 12-часового цикла свет/темнота (7 утра / 7 вечера).
- Используйте специально отведенную хирургическую зону, такую как капюшон или специальный хирургический процедурный кабинет, для проведения операции на животном.
- Убедитесь, что в хирургической области есть грелка, стереотаксическая рама, оснащенная электромагнитным ударником, и анестезиологическая маска, предназначенная для введения газа изофлурана (см. рис. 1A).
- Убедитесь, что хирург или персонал, участвующий в операции, носит чистый лабораторный халат, маску для лица, перчатки и хирургическую шапочку.
- Используйте стерильные хирургические инструменты, стерильные аппликаторы с ватными наконечниками и марлевые салфетки. Используйте стерилизатор горячих шариков, чтобы стерилизовать инструменты между мышами в течение дня операции.
- Используйте индукционную камеру для анестезии, чтобы подготовить мышь к операции в предоперационной области.
- Используйте грелки для поддержания температуры животного, чистые послеоперационные клетки для держания мышей и таймеры для записи рефлекса выпрямления мыши после операции.
2. Предоперационная процедура
- Подготовьте аппарат для поддержки головы (см. рисунок 1B).
- Снимите свернутый концевой гребень с латексной пипетки объемом 1 мл (надувной конец) (см. рис. 1C).
- Прикрепите колбу к трубке с помощью парапленки (см. рис. 1C).
- Подсоедините трубку к шприцу объемом 10 мл с помощью запорного крана. Наполните шприц водой (см. рисунок 1C).
ПРИМЕЧАНИЕ: Латексная пипетка объемом 1 мл будет помещена под голову мыши, чтобы сместить силу удара от ушей. Постарайтесь удалить как можно больше воздуха из колбы перед использованием, чтобы колба была заполнена в основном водой, а не воздухом.
- Настройка импактора.
- Выберите наконечник зонда диаметром 5 мм, прикрутите его к поршню в нижней центральной части привода (внутри большего цилиндра) и осторожно затяните зонд, не прилагая чрезмерных усилий. Снова затяните наконечник между ударами (см. рис. 1B).
- Перед включением ударного элемента убедитесь, что переключатель «Удлинить/втянуть» находится в центральном положении «Выкл.». Затем подключите кабель привода к разъему на передней панели блока управления импактором, а кабель датчика — к разъему на передней панели. Затем включите выключатель питания на задней панели (см. рис. 1D).
ПРИМЕЧАНИЕ: Тумблер Extend/Retract должен оставаться в центральном положении Off, когда он не используется. - Установите скорость удара, вращая большую ручку с левой стороны блока управления, пока на дисплее не появится скорость удара 5,0 ± 0,2 м/с (см. рис. 1D).
- Установите счетчик выдержки на 100 мс, поворачивая циферблаты до тех пор, пока индикатор задержки не покажет 0,01 (см. рис. 1D).
ПРИМЕЧАНИЕ: Выдержка - это время контакта до того, как произойдет автоматическое втягивание. - Поместите привод ударного элемента на пакет со льдом, чтобы предотвратить расширение пластикового цилиндра, который фиксирует цилиндр на месте, предотвращая движение цилиндра и нанесение ударов в будущем (см. рис. 1E).
- Подготовьте мышь к операции.
- Визуально осмотрите мышь перед операцией и исключите мышь из исследования, если наблюдается одно из следующих состояний: плохое состояние шерсти, вялость или плохой вес (<20 г) для 4-месячной мыши.
- Обезболивают мышь 4%-5% изофлураном в 100% кислороде с помощью индукционной камеры, помещенной на грелку на 1-2 мин.
- Сбрейте мех с места проведения операции с помощью электрической машинки для стрижки волос.
- Очистите голову стерильными спиртовыми прокладками и нанесите местный анестетик на бритую кожу головы не менее чем за 15 минут до начала операции.
- Верните мышь в чистую клетку перед операцией. Начните операцию по крайней мере через 15 минут после применения местного анестетика (время индукции).
ПРИМЕЧАНИЕ: Время анестезии может варьироваться в зависимости от анестетика, используемого в процедуре.
- Еще раз убедитесь, что стереотаксическая рамка, импактор и цифровой стереотаксический дисплей (см. рис. 1F) готовы к использованию.
- Верните мышь в индукционную камеру изофлурана с 4-5% изофлураном в 100% кислороде в течение примерно 3 минут.
- Зафиксируйте мышь в головном этапе.
3. Хирургическое вмешательство
- Закрепите мышь в стереотаксической раме с помощью легких конических ушных планок из ацетальной смолы, прикусной планки и маски для анестезии мыши (см. рис. 1G, H). Газообразный изофлуран подается в количестве 2-3% в комнатном воздухе со скоростью 100-200 мл / мин. Внимательно следите за дыханием мыши, чтобы обеспечить глубину анестезии и отрегулировать уровень газа по мере необходимости.
- Нанесите стерильную смазку для глаз на глаза, чтобы предотвратить высыхание роговицы.
- Трижды стерилизуйте кожу головы тампонами с повидон-йодом и стерильными спиртовыми тампонами.
- Убедитесь, что мышь находится под глубоким наркозом, убедившись в отсутствии реакции на ущипывание пальцев ног.
- Сделайте разрез по средней линии кожи головы примерно 1 см между глазами и шеей с помощью скальпеля, обнажив череп (см. рисунок 1I).
- Дайте черепу высохнуть в течение 1-2 минут.
- Определите брегму (точку пересечения коронального и сагиттального швов) и лямбду (пересечение сагиттального и лямбдоидного швов) (см. рис. 1J).
ПРИМЕЧАНИЕ: Атлас мозга мыши может быть использован для справки. - Поместите устройство для поддержки головы под голову и надуйте луковицу водой, пока она не будет прижиматься к нижней части головы мыши, но не отрывать голову от стержня для укуса.
ПРИМЕЧАНИЕ: Этот шаг необходим для уменьшения возможных проблем с ушами из-за ОМС. Любое животное с повреждением уха от ушных решеток, что привело к перекатыванию или кровотечению, должно быть исключено из исследования и усыплено. - Переместите ударник на место над головой животного.
- Выдвиньте ударный элемент, поместив тумблер « Выдвинуть/втянуть » (на блоке управления ударным элементом) в положение «Расширить».
ПРИМЕЧАНИЕ: Обязательно убедитесь, что наконечник полностью выдвинут, потянув за наконечник вниз. - Выровняйте ударный элемент до тех пор, пока он не окажется по центру брегмы (см. рис. 1K).
- Сбросьте цифровые стереотаксические координаты x и y в стереотаксическом считывателе до 0 (на сенсорном экране)
- Совместите зонд по месту удара, переместив зонд от брегмы к целевым координатам: медиально-латеральный = 0,0 мм, передне-задний = −1,6 мм.
- Прикрепите контактный датчик к уху животного.
- Медленно опускайте наконечник зонда с удлиненным зондом до первого контакта с поверхностью. Остановитесь на звуковом сигнале.
- Сбросьте цифровые стереотаксические координаты z в стереотаксическом считывателе на 0.
- Внимательно осматривают, находится ли кончик на одном уровне с черепом (медиально-латеральная и передне-задняя плоскости).
ПРИМЕЧАНИЕ: Позиционирование наконечника зонда является наиболее важным этапом этого процесса для предотвращения переломов черепа и повреждения ушей. - Втяните ударник, поместив тумблер на блоке управления в положение «Втягивание». Наконечник отходит и больше не соприкасается с головой животного до момента удара.
- Установите глубину удара, отрегулировав дорсально-вентральную глубину на −1,2 мм.
ПРИМЕЧАНИЕ: Глубина удара влияет на тяжесть травмы. Глубина должна быть титрованной для разного возраста, веса и штаммов мышей до желаемой тяжести травмы. Глубина, возможно, потребуется отрегулировать/повторно титровать с течением времени, чтобы поддерживать постоянную тяжесть травмы. Степень тяжести может быть оценена невропатологически: микроглия и астроциты (ИГХ), и поведенчески: водный лабиринт радиальной руки и тест активного избегания. - Внимательно следите за дыханием мыши, чтобы обеспечить глубину анестезии, и при необходимости отрегулируйте уровень газа.
ПРИМЕЧАНИЕ: Часто процентное содержание газа изофлурана должно быть снижено или отключено на 10-20 с до удара. Внимательно следите за тем, чтобы дыхание немного ускорилось. Если дыхание слишком медленное во время удара, животное может умереть в течение первых 60 секунд после удара от апноэ. Этого можно избежать, отрегулировав глубину анестезии за секунды до удара. - Вызовите удар, нажав правый тумблер на удар. Наконечник зонда опускается вниз с отображаемой скоростью, а затем остается опущенным в течение установленного времени выдержки и втягивается.
ПРИМЕЧАНИЕ: Фиктивные мыши получают такое же обращение, как и мыши ОМС, но воздействие не оказывается. - Запустите таймер сразу после нанесения удара ОМС, чтобы записать время выпрямления (время возврата из бокового положения в положение лежа) или запустите таймер, когда мышь будет удалена из стереотаксической рамки для фиктивных мышей. Среднее время выпрямляющего рефлекса составляет 5-15 мин.
ПРИМЕЧАНИЕ: Время коррекционного рефлекса может варьироваться в зависимости от напряжения и возраста мыши. - Оцените мышей на предмет видимых переломов черепа, кровоизлияний и апноэ. Исключить из исследования мышей с вдавленным переломом черепа или видимым кровоизлиянием.
ПРИМЕЧАНИЕ: Существуют градуированные уровни переломов черепа. Животных с декомпрессированными переломами черепа, когда кость заметно вдавливается в ткань мозга, усыпляют (сначала CO2 , а обезглавливание используется в качестве вторичного метода). Если наконечник ударного элемента установлен правильно, эти типы переломов черепа чрезвычайно редки. Если перелом черепа действительно происходит, более распространенным проявлением является небольшая капля крови на черепе и небольшая тактильная шероховатость черепа, часто вдоль шва, соединяющего задний конец носовой кости. Эти мыши отмечены как возможный перелом черепа в записях, но обычно не исключаются из исследования. - Извлеките животное из стереотаксической рамки.
- Закройте кожу головы, скрепив кожу вместе.
ПРИМЕЧАНИЕ: Рассасывающиеся или нерассасывающиеся швы можно использовать для закрытия кожи головы в качестве альтернативы скобам. - Нанесите мазь с тройным антибиотиком стерильным аппликатором с ватным наконечником на закрытый разрез.
- Верните мышь в чистую клетку для восстановления. Половина клетки для восстановления находится на грелке (низкая настройка), обеспечивающей возможность отойти от тепла во время бодрствования и поддерживать температуру животного в бессознательном состоянии (см. рис. 1L).
ПРИМЕЧАНИЕ: Мышь помещается на бок в клетке для восстановления. Чтобы предотвратить удушье, поместите животное в клетку без подстилки или на салфетку, если подстилка находится в клетке. - Верните тумблер « Выдвиньте/Втягивание » в положение «Центр/Выкл. ».
ПРИМЕЧАНИЕ: Ток будет продолжаться, если переключатель оставить в положении расширения или втягивания, что приведет к набуханию поршня. В этом случае ударник не будет функционировать до тех пор, пока поршень не остынет. - Извлеките ударник из держателя и аккуратно положите его на пакет со льдом.
ПРИМЕЧАНИЕ: Удержание импактора на пакете со льдом помогает уменьшить потенциальное набухание импактора. - Наблюдайте за животным до тех пор, пока не возникнет рефлекс выпрямления, и задокументируйте время до выпрямления (см. рис. 1M).
ПРИМЕЧАНИЕ: Рефлекс выпрямления определяется как момент, когда мышь возвращается в положение лежа. Клетку нужно оставлять нетронутой; Мышь может исправиться, если к клетке прикоснуться, переместить или подвергнуть воздействию каких-либо шумов. - Возвращайте мышей в их домашнюю клетку, когда они бодрствуют и бодрствуют. Обычно в течение 1 ч после травмы животные находятся в полном сознании и передвигаются. Кроме того, добавьте немного влажного корма на дно клетки.
4. Послеоперационный уход
- Наблюдайте за животными в течение 5 дней после операции.
- Запишите их вес и любые физические / поведенческие изменения, такие как частота дыхания (качественная дыхательная функция), походка, состояние тела и волосяного покрова, еда, питье, дефекация и мочеиспускание.
- Наблюдайте за мышью на предмет любых признаков дискомфорта и хирургической ране на предмет отека, экссудата или красных краев, расхождения. Обратитесь к ветеринару, если животное проявляет признаки боли и дискомфорта (вокализации, неподвижность, переохлаждение, не пьет и не ест).
- Снимают скобы через 7-10 дней после операции под наркозом и на грелке.
ПРИМЕЧАНИЕ: Если используются нерассасывающиеся швы, их необходимо снять через 7-10 дней после операции под наркозом.
5. Уборка
- Очистите и стерилизуйте операционную область и инструменты.
- Очищайте наконечник зонда после каждого использования и в конце дня спиртовыми прокладками.
ПРИМЕЧАНИЕ: Ударный элемент откалиброван на заводе и, как сообщается, стабилен с течением времени и использованием. Регулярная калибровка не требуется. Тем не менее, ударный элемент и стереотаксическая рама должны регулярно проверяться. Кроме того, следует контролировать периметры конечных точек модели, такие как время рефлекса выпрямления, смертность и невропатология, чтобы оценить возможный экспериментальный дрейф.
6. Критерии исключения
- Исключите животных до операции с плохим состоянием здоровья, например, с плохим весом <20 г для 4-месячной мыши, вялостью и плохим состоянием шерсти.
- Исключите животных с осложнениями во время операции, такими как вдавленный перелом черепа, видимое кровоизлияние, связанное с операцией, или ушное кровотечение.
- Исключить из исследования животных со следующими послеоперационными симптомами: неспособность есть и/или нормально двигаться, необычные вокализации, потеря веса или неспособность раны нормально заживать после операции.
ПРИМЕЧАНИЕ: Эта модель может быть использована в качестве повторяющейся модели легкой ЧМТ. Если мыши получают вторую операцию с интервалом в 24 часа после первой, скобы или швы могут быть удалены, и тот же разрез может быть использован для обнажения черепа. Новый разрез необходимо сделать, если между операциями проходит больше времени.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Это стереотаксическое электромагнитное ударное устройство является универсальным. Он используется как для открытого черепно-контролируемого кортикального воздействия (CCI), так и для закрытой черепно-мозговой травмы (CHI). Кроме того, тяжесть травмы можно модулировать, изменяя параметры травмы, такие как скорость удара, время выдержки, глубина удара, наконечник ударного элемента и цель травмы. Здесь описана операция ОМС с использованием ударного элемента со стальным наконечником толщиной 5,0 мм. Эта травма считается легкой, потому что нет структурных поражений головного мозга. Уровень смертности у взрослых мышей составляет менее 0,9%11,14 и немного увеличивается до ~ 2,5% у старых мышей (>8 месяцев)11. Смертность наступает в течение первых 2 минут из-за апноэ, которую в значительной степени можно предотвратить, тщательно контролируя глубину анестезии за секунды до удара.
Преимущество этой модели ОМС заключается в том, что воздействие вызывает двустороннюю диффузную патологию без необходимости обнажения поверхности дуральной мозговой оболочки (трепанация черепа). Еще одна особенность, которая делает эту модель ЧМТ эффективной, заключается в том, что менее 1% мышей исключаются из исследования из-за переломов черепа или проблем с ушами после хирургической процедуры. Важно отметить, что модель вызывает нейропатологические и поведенческие нарушения с одним воздействием, что снижает экспериментальную сложность, связанную с повторяющимися моделями ОМСлегкой степени 15. Например, выявлена воспроизводимая временная картина морфологических изменений микроглии и астроцитов11 (рис. 2А, Б). При валидации модели рекомендуется использовать начальные диапазоны передне-задних координат −1,5 мм ± 0,2 мм и глубину удара 1,0 ± 0,2 мм. Возможно, потребуется скорректировать координаты с учетом возраста и штамма мышей, а также марки и модели используемого оборудования. После проверки параметров они должны оставаться постоянными для эксперимента. Для валидации рекомендуется невропатологическая характеристика микроглии и астроцитов через 3 дня после травмы. Иммуногистохимическое (ИГХ) окрашивание проводили по методикам Bachstetter et al.18. В частности, корональные свободно плавающие срезы размером 30 мкм окрашивали для глиальной активации с помощью кроличьего анти-GFAP (1:10 000) и для астроцитов с использованием кроличьего анти-IBA1 (1:10 000). Конъюгированный HRP козий антикроличий IgG (1: 200) использовался для обнаружения как GFAP, так и IBA-1. Программное обеспечение для количественной оценки окрашивания в каждом рассматриваемом регионе использовалось программное обеспечение для количественной оценки. Кроме того, через 1 день после травмы маркеры повреждения аксонов были обнаружены в неокортексе, а изменения в митохондриальном метаболизме были обнаружены через 28 дней после CHI16 (данные не показаны).
Вторичными конечными точками для проверки модели будут поведенческие анализы. Были обнаружены воспроизводимые дефициты, вызванные ОМС, в водном лабиринте радиального плеча (RAWM)12 и поведении активного избегания13 (рис. 3). Мыши были протестированы в 8-групповом RAWM, специальном тесте обучения, как описано в Macheda et al.12. Вкратце, мыши были протестированы в общей сложности в 28 испытаниях в течение 4-дневного протокола, и у них было 60 секунд, чтобы найти платформу, расположенную в целевой руке. Общее число испытаний в день составляло семь; День 1 и день 2 рассматривались как тренировочные дни, а 3-й и 4-й дни - как дни тестирования. В дни обучения мышей обучали определять местонахождение платформы, чередуя видимые и скрытые испытания; В дни тестирования платформа была скрыта во время всех испытаний. Эксперименты записывались с помощью камеры, а для анализа поведения использовалась система слежения (количество ошибок, общее расстояние и задержка). Мыши были протестированы через 2 недели после травмы. Хотя не было никакого эффекта пола, мыши CHI сделали больше ошибок, чтобы успешно выполнить задачу и добраться до платформы (рис. 3A). Кроме того, нарушения памяти были обнаружены в 6-групповом тесте RAWM 11,14,15,16. Активное избегание, ассоциативный тест, основанный на обучении, использовался для измерения когнитивного дефицита, связанного с этой мягкой моделью ОМС. Мыши были протестированы с использованием 5-дневного протокола и подвергнуты 50 испытаниям вдень 13. Мышей обучали избегать легкого удара ногой (безусловный стимул, УЗИ), связывая с ним условный стимул (CS, свет). Со временем мыши научились избегать США, когда был представлен CS. У мышей с ОМС наблюдались нарушения когнитивных функций при активном избегании по сравнению с фиктивными мышами (рис. 3B). Фиктивные самки мышей учились значительно быстрее по сравнению с самцами, но пол не играл роли у мышейCHI 13. Поведение регистрировалось с помощью активного/пассивного программного обеспечения для избегания. Воспроизводимый дефицит двигательной функции после первой недели после травмы не был обнаружен11.
В этой модели легкой ЧМТ не было обнаружено грубых структурных повреждений головного мозга, а однократный удар вызвал двустороннюю глиальную активацию и изменения морфологии микроглии. Кроме того, когнитивный дефицит связан с этой моделью ЧМТ.
Рисунок 1: Шаг 1: Настройка хирургической зоны. (A) Показан пример хирургической области и инструментов, необходимых для выполнения операции ОМС (пакет со льдом для ударного элемента, стереотаксическая рама, оснащенная импактором, блок управления импактором и хирургические инструменты). (B) Крупный план 5-миллиметрового стального наконечника зонда, прикусного стержня и опорного устройства головы, который иллюстрирует позиционирование, необходимое для удара по средней линии. (C) Аппарат для поддержки головы изготовлен из латексной пипетки объемом 1 мл, прикрепленной к трубке с помощью парапленки. Шприц объемом 10 мл наполняется водой для надувания колбы с запорным краном, чтобы удерживать колбу надутой в нужном положении. (D) Блок управления ударным элементом: (1) большая ручка для регулировки скорости удара, (2) счетчик задержки, (3) тумблер выдвижения/втягивания, (4) тумблер, который при нажатии вниз будет производить удар. (E) Когда ударный элемент не используется, он хранится на пакете со льдом, чтобы предотвратить перегрев и возможную неисправность. (F) Цифровой стереотаксический дисплей используется для определения координат x (передне-задний), y (медиально-латеральный) и z (дорсально-вентральный). Шаг 2: Хирургическая процедура. (Г,Г) Анестезированная и выбритая мышь закрепляется в стереотаксической рамке, (I) делается разрез по средней линии, чтобы обнажить (J) брегму, (K), которая используется во время операции для выравнивания ударного элемента. Шаг 3: Восстановление. (L) Мышь удаляется из стереотаксической рамки. После того, как кожа головы закрыта сшиванием или сшиванием кожи, ее помещают в чистую клетку для восстановления на боку. (M) Мышь контролируется до тех пор, пока мышь не перевернется и не возникнет рефлекс выпрямления. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 2: Временные паттерны морфологических изменений астроцитов (GFAP) и микроглии (IBA1) после CHI. (A) Окрашивание GFAP при малом увеличении показывает региональное увеличение окрашивания, наблюдаемое в коре группы CHI. Морфологический вид астроцитов показан на вставках с большим увеличением, которые были взяты из средних отделов мозга и из тех же областей коры. (B) IBA1-положительное окрашивание в коре через 1 день, 7 дней и 2 месяца после травмы показывает изменения морфологии микроглии в неокортексе после ОМС (n = 7-14, 50/50 мужчин/женщина). Мышам (фон CD-1/129) на момент операции было 8 месяцев. Этот рисунок был адаптирован из 11 и воспроизведен с разрешения. Масштабная линейка = 1 мм, 50 мкм и 100 мкм, как показано на рисунке. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Рисунок 3: CHI-индуцированный дефицит памяти при RAWM и активном избегании. (A) Через 2 недели после травмы мыши с ОМС и фиктивной операцией смогли выучить задачу RAWM, но мыши с ОМС допустили больше ошибок по сравнению с фиктивными мышами (*** p < 0,0005); фиктивный (n = 20/20 мужчина/женщина); CHI (n = 20/20 мужчина/женщина). На момент операции мышам (C57BL/6J) было 3-4 месяца. (B) Через 4 недели после травмы мыши с ОМС и фиктивным управлением смогли научиться выполнять задачу активного избегания, но мыши с ОМС избежали меньшего количества ударов ногами по сравнению с фиктивными мышами (*** p = 0,0005; **** p < 0,0001); фиктивный (n = 10/10 мужчина/женщина); CHI (n = 9/10 мужчина/женщина). На момент операции мышам (C57BL/6J) было 3-5 месяцев. Данные отображаются как среднее значение ± SEM. (A) Этот рисунок был адаптирован из 12 и воспроизведен с разрешения. (B) Этот рисунок был адаптирован из 13 и воспроизведен с разрешения. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Несколько этапов включают в себя воссоздание согласованной модели травмы с использованием описанной модели. Во-первых, очень важно правильно закрепить животное в стереотаксической рамке. Голова животного не должна иметь возможности двигаться вбок, а череп должен быть полностью плоским, а брегма и лямбда считывают одни и те же координаты. Правильное размещение амбушюр является самым сложным аспектом этой операции, и этому можно научиться только с практикой. Если череп не выровнен, голова должна быть отрегулирована, прежде чем вызывать ОМС. Неспособность отрегулировать положение головы приведет к перелому черепа. Чтобы оценить, что череп плоский, следует посмотреть на зазор между черепом и ударным наконечником со всех углов вокруг наконечника. Мыши с вдавленными переломами черепа должны быть исключены из экспериментов, так как у них гораздо более сильная воспалительная реакция и более тяжелая травма по сравнению с мышами, у которых не было переломов черепа19. Кроме того, у мышей с переломами черепа наблюдаются более тяжелые исходы ЧМТ, такие как посттравматическое угнетение дыхания, вторичная травма отскока и, в конечном итоге, смерть20.
В этом исследовании голова животного была закреплена ушными решетками. В частности, рекомендуется использовать только ушные брусья из ацетальной смолы, специфичные для мышей, с коническим заострием, а не большие ушные брусья для крыс. Можно использовать непроколотые ушные вкладыши с резиновыми наконечниками, но эти ушные вкладыши сдавливают череп, изменяя биомеханику ОМС, и менее воспроизводимы. Кроме того, существует ограничение на использование амбушюр, так как они не допускают каких-либо вращательных сил. Тем не менее, большая воспроизводимость амбушюр перевешивает ограниченное количество вращательных сил, которые могут быть созданы, если головка не закреплена.
Однако фиксация головы с помощью амбушюр также может привести к травме уха при ударе, если все силы удара направлены на уши. Был разработан аппарат поддержки головы, размещенный под головой, чтобы сместить силы от ушей. После тестирования нескольких предметов, похожих на подушки, лучше всего работала латексная колба-пипетка объемом 1 мл, наполненная водой. Колба пипетки под головой животного может быть расширена после того, как животное находится в стереотаксической рамке, что позволяет ей плотно прилегать и обеспечивать полную поддержку под головой. При правильном размещении не должно быть кровотечения из ушей или поведенческих признаков повреждения уха (перекатывание / наклон головы) после травмы.
В некоторых версиях модели CHI используется зонд 21,22 с резиновым наконечником или металлический шлем 23,24 для уменьшения частоты переломов черепа. Пока 5-миллиметровый наконечник ударного элемента находится на одном уровне с черепом, нет необходимости использовать какой-либо из них. Для новых пользователей, не имеющих большого опыта стереотаксической хирургии, может возникнуть соблазн вызвать травму кончиком не вровень с черепом в медиально-латеральной плоскости. Если череп не находится на одном уровне в медиально-латеральной плоскости, это связано с тем, что ушные перекладины расположены неправильно. Единственное решение этой проблемы - снять животное с ударного элемента и назначить мышь на фиктивную травму. Если кончик не находится на одном уровне в передней-задней плоскости, то необходимо отрегулировать высоту стержня прикуса и выровнять кончик с брегмой. Кроме того, использование ударного элемента диаметром 5 мм с плоским наконечником снижает вероятность переломов черепа19 по сравнению с ударными наконечниками меньшего диаметра. Другими важными факторами, которые следует учитывать, являются возраст и вес субъекта, а также толщина черепа25 и штаммы мышей26.
У людей легкая ЧМТ не связана со смертью в течение первых минут после травмы. У животных даже легкая травма может привести к летальному исходу. Однако в этой модели смертность почти всегда связана с хирургическими осложнениями, а не только с травмой. Наиболее распространенной причиной, по которой мышь умрет после удара, является глубина анестезии. Это может произойти, если операция заняла больше времени, чем ожидалось, или если газ изофлуран был в более высокой концентрации, чем необходимо для этого животного. Если дыхание животного медленное или затрудненное, это может быть признаком того, что глубина анестезии должна быть уменьшена перед нанесением удара. Если дыхание животного медленное или затрудненное во время удара, у животного, скорее всего, будет апноэ и оно может умереть.
Существует множество моделей легкой ЧМТ. У каждого есть сильные и слабые стороны, и эта модель ничем не отличается. Как сообщалось, здесь описана единичная модель ЧМТ, но модель была использована для того, чтобы вызвать повторяющуюся ЧМТ15. Шаги, описанные в этом протоколе, могут быть повторены, чтобы вызвать повторяющуюся травму ЧМТ. При оценке различных моделей ЧМТ важно учитывать, имеет ли модель желаемую патологию, которую пытаются смоделировать. Следует также учитывать, насколько воспроизводима модель. Настоятельно рекомендуется, чтобы отправной точкой для использования этой или любой модели ЧМТ была независимая проверка и характеристика того, что модель работает так, как сообщалось ранее.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Авторам раскрывать нечего.
Acknowledgments
Эта работа была частично поддержана Национальными институтами здравоохранения под номерами наград R01NS120882, RF1NS119165 и R01NS103785 и наградой Министерства обороны AZ190017. Содержание является исключительной ответственностью авторов и не отражает официальную точку зрения Национальных институтов здравоохранения или Министерства обороны.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 9 mm Autoclip Applier | Braintree scientific | ACS- APL | Surgery |
| 9 mm Autoclip Remover | Braintree scientific | ACS- RMV | Surgery |
| 9 mm Autoclip, Case of 1,000 clips | Braintree scientific | ACS- CS | Surgery (Staples) |
| Aperio ImageScope software | Leica BioSystems | NA | IHC |
| BladeFLASK Blade Remover | Fisher Scientific | 22-444-275 | Surgery |
| Cotton tip applicator | VWR | 89031-270 | Surgery |
| Digitial mouse stereotaxic frame | Stoelting | 51730D | Surgery |
| Dumont #7 Forceps | Roboz | RS-5047 | Surgery |
| Ear bars | Stoelting | 51649 | Surgery |
| EthoVision XT 11.0 | Noldus Information Technology | NA | RAWM |
| Fiber-Lite | Dolan-Jeffer Industries | UN16103-DG | Surgery |
| Fisherbrand Bulb for Small Pipets | Fisher Scientific | 03-448-21 | Head support apparatus |
| Gemini Avoidance System | San Diego Instruments | NA | Active avoidance |
| Heating Pad | Sunbeam | 732500000U | Surgery prep |
| HRP conjugated goat anti-rabbit IgG | Jackson Immuno Research laboratories | 111-065-144 | IHC |
| Induction chamber | Kent Scientific | VetFlo-0530XS | Surgery prep |
| Isoflurane, USP | Covetrus | NDC: 11695-6777-2 | Surgery |
| Mouse gas anesthesia head holder | Stoelting | 51609M | Surgery |
| Neuropactor Stereotaxic Impactor | Neuroscience Tools | n/a | Surgery: Formally distributed by Lecia as impact one |
| NexGen Mouse 500 | Allentown | n/a | Post-surgery, holding cage |
| Parafilm | Bemis | PM992 | Head support apparatus |
| Peanut - Professional Hair Clipper | Whal | 8655-200 | Surgery prep |
| Povidone-Iodine Solution USP, 10% (w/v), 1% (w/v) available Iodine, for laboratory | Ricca | 3955-16 | Surgery |
| Puralube Vet Oinment,petrolatum ophthalmic ointment, Sterile ocular lubricant | Dechra | 17033-211-38 | Surgery |
| Rabbit anti-GFAP | Dako | Z0334 | IHC |
| Rabbit anti-IBA1 | Wako | 019-19741 | IHC |
| 8-arm Radial Arm Water Maze | MazeEngineers | n/a | RAWM |
| Scale | OHAUS CS series | BAL-101 | Surgery prep |
| Scalpel Handle #7 Solid 6.25" | Roboz | RS-9847 | Surgery |
| Sterile Alcohol Prep Pads (isopropyl alcohol 70% v/v) | Fisher Brand | 22-363-750 | Surgery prep |
| SumnoSuite low-flow anesthesia system | Kent Scientific | SS-01 | Surgery |
| 10 mL syringe Luer-Lok Tip | BD Bard-Parker | 302995 | Head support apparatus |
| Timers | Fisher Scientific | 6KED8 | Surgery |
| Topical anesthetic cream | L.M.X 4 | NDC 0496-0882-15 | Surgery prep |
| Triple antibiotic ointment | Major | NDC 0904-0734-31 | Post-surgery |
| Tubing | MasterFlex | 96410-16 | Head support apparatus |
| Vaporizer Single Channel Anesthesia System | Kent Scientific | VetFlo-1210S | Surgery prep |
References
- Capizzi, A., Woo, J., Verduzco-Gutierrez, M. Traumatic brain injury: An overview of epidemiology, pathophysiology, and medical management. The Medical Clinics of North America. 104 (2), 213-238 (2020).
- Bodnar, C. N., Roberts, K. N., Higgins, E. K., Bachstetter, A. D. A systematic review of closed head injury models of mild traumatic brain injury in mice and rats. Journal of Neurotrauma. 36 (11), 1683-1706 (2019).
- Shultz, S. R., et al. The potential for animal models to provide insight into mild traumatic brain injury: Translational challenges and strategies. Neuroscience and Biobehavioral Reviews. 76, 396-414 (2017).
- Xiong, Y., Mahmood, A., Chopp, M.
- Albert-Weissenberger, C., Varrallyay, C., Raslan, F., Kleinschnitz, C., Siren, A. L. An experimental protocol for mimicking pathomechanisms of traumatic brain injury in mice. Experimental and Translational Stroke Medicine. 4, 1 (2012).
- Chen, Y., Constantini, S., Trembovler, V., Weinstock, M., Shohami, E. An experimental model of closed head injury in mice: pathophysiology, histopathology, and cognitive deficits. Journal of Neurotrauma. 13 (10), 557-568 (1996).
- Dixon, C. E., Clifton, G. L., Lighthall, J. W., Yaghmai, A. A., Hayes, R. L. A controlled cortical impact model of traumatic brain injury in the rat. Journal of Neuroscience Methods. 39 (3), 253-262 (1991).
- Schwulst, S. J., Islam, M. Murine model of controlled cortical impact for the induction of traumatic brain injury. Journal of Visualized Experiments. (150), e60027 (2019).
- Cole, J. T., et al. Craniotomy: True sham for traumatic brain injury, or a sham of a sham. Journal of Neurotrauma. 28 (3), 359-369 (2011).
- Brody, D. L., et al. Electromagnetic controlled cortical impact device for precise, graded experimental traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 24 (4), 657-673 (2007).
- Webster, S. J., Van Eldik, L. J., Watterson, D. M., Bachstetter, A. D. Closed head injury in an age-related Alzheimer mouse model leads to an altered neuroinflammatory response and persistent cognitive impairment. The Journal of Neuroscience. 35 (16), 6554-6569 (2015).
- Macheda, T., Roberts, K. N., Morganti, J. M., Braun, D. J., Bachstetter, A. D. Optimization and validation of a modified radial-arm water maze protocol using a murine model of mild closed head traumatic brain injury. PLoS One. 15 (8), 0232862 (2020).
- Macheda, T., Snider, H. C., Watson, J. B., Roberts, K. N., Bachstetter, A. D. An active avoidance behavioral paradigm for use in a mild closed head model of traumatic brain injury in mice. Journal of Neuroscience Methods. 343, 108831 (2020).
- Bachstetter, A. D., et al. Attenuation of traumatic brain injury-induced cognitive impairment in mice by targeting increased cytokine levels with a small molecule experimental therapeutic. Journal of Neuroinflammation. 12, 69 (2015).
- Bachstetter, A. D., et al. The effects of mild closed head injuries on tauopathy and cognitive deficits in rodents: Primary results in wild type and rTg4510 mice, and a systematic review. Experimental Neurology. 326, 113180 (2020).
- Lyons, D. N., et al. A mild traumatic brain injury in mice produces lasting deficits in brain metabolism. Journal of Neurotrauma. 35 (20), 2435-2447 (2018).
- Yanckello, L. M., et al. Inulin supplementation mitigates gut dysbiosis and brain impairment induced by mild traumatic brain injury during chronic phase. Journal of Cellular Immunology. 4 (2), 50-64 (2022).
- Bachstetter, A. D., et al. Early stage drug treatment that normalizes proinflammatory cytokine production attenuates synaptic dysfunction in a mouse model that exhibits age-dependent progression of Alzheimer's disease-related pathology. The Journal of Neuroscience. 32 (30), 10201-10210 (2012).
- Zvejniece, L., et al. Skull fractures induce neuroinflammation and worsen outcomes after closed head injury in mice. Journal of Neurotrauma. 37 (2), 295-304 (2020).
- Flierl, M. A., et al. Mouse closed head injury model induced by a weight-drop device. Nature Protocols. 4 (9), 1328-1337 (2009).
- Yang, Z., et al. Temporal MRI characterization, neurobiochemical and neurobehavioral changes in a mouse repetitive concussive head injury model. Scientific Reports. 5, 11178 (2015).
- Petraglia, A. L., et al. The spectrum of neurobehavioral sequelae after repetitive mild traumatic brain injury: a novel mouse model of chronic traumatic encephalopathy. Journal of Neurotrauma. 31 (13), 1211-1224 (2014).
- Laskowitz, D. T., et al. COG1410, a novel apolipoprotein E-based peptide, improves functional recovery in a murine model of traumatic brain injury. Journal of Neurotrauma. 24 (7), 1093-1107 (2007).
- Lloyd, E., Somera-Molina, K., Van Eldik, L. J., Watterson, D. M., Wainwright, M. S. Suppression of acute proinflammatory cytokine and chemokine upregulation by post-injury administration of a novel small molecule improves long-term neurologic outcome in a mouse model of traumatic brain injury. Journal of Neuroinflammation. 5, 28 (2008).
- Lillie, E. M., Urban, J. E., Lynch, S. K., Weaver, A. A., Stitzel, J. D. Evaluation of skull cortical thickness changes with age and sex from computed tomography scans. Journal of Bone and Mineral Research. 31 (2), 299-307 (2016).
- Kawakami, M., Yamamura, K. Cranial bone morphometric study among mouse strains. BMC Evolutionary Biology. 8, 73 (2008).
