Summary
本論文では、生体組織の その場で 放射輝度を測定する方法について説明します。この作業には、放射輝度と放射照度のさまざまな測定のためのマイクロスケールプローブの構築の詳細が含まれ、放射輝度の特性評価のための組織を取り付けるためのガイダンスを提供し、結果のデータを分析するための計算方法の概要を説明します。
Abstract
生物が不透明に見えるのは、主にその外側の組織層が入射光に対して強く散乱しているためです。血液などの強く吸収する顔料は、通常、吸光度が狭いため、吸光度ピークの外側の光の平均自由行程は非常に長くなる可能性があります。人々は組織を通して見ることができないので、彼らは一般的に脳、脂肪、骨のような組織にはほとんどまたはまったく光が含まれていないと想像します。しかし、光応答性オプシンタンパク質はこれらの組織の多くで発現しており、その機能はほとんどわかっていません。組織内部の放射輝度も光合成を理解するために重要です。たとえば、巨大なアサリは強く吸収しますが、組織の奥深くに藻類の密集した集団を維持します。堆積物やバイオフィルムなどのシステムを通る光の伝播は複雑になる可能性があり、これらのコミュニティは生態系の生産性に大きく貢献する可能性があります。そこで、生体組織内部のこれらの現象をよりよく理解するために、スカラー放射照度(点と交差する光子束)とダウンウェル放射照度(平面と垂直に交差する光子束)を測定するための光マイクロプローブを構築する方法が開発されました。この手法は、フィールドラボでも扱いやすいです。これらのマイクロプローブは、熱引きされた光ファイバから作られ、引っ張られたガラスピペットに固定されます。プローブの角度受容を変えるために、二酸化チタンと混合されたUV硬化型エポキシの10〜100μmサイズの球を、引っ張ってトリミングしたファイバーの端に固定します。プローブを生体組織に挿入し、マイクロマニピュレーターを用いてその位置を制御する。これらのプローブは、10〜100μmの空間分解能または単一細胞のスケールでin situ 組織放射輝度を測定することができます。これらのプローブは、生きているマウスの皮膚から4 mm下の脂肪細胞と脳細胞に到達する光を特徴付け、生きている藻類が豊富な巨大なハマグリ組織内で同様の深さに到達する光を特徴付けるために使用されました。
Introduction
驚いたことに、陸上動物や浅い海の住人は、視覚生理学や光合成さえものに十分な光を体内に持っています。たとえば、マウスの頭の中心(強いヘモグロビン吸光度バンドの外側)の光レベルは、外界に対して3〜4桁減衰します。これは、屋内と屋外の光レベルの違いです。したがって、強い散乱による組織または材料の不透明度は、強い光吸収による不透明度と同じではありません。光は、高濃度の細胞や粒子を含む水系を伝播する光と同様に、強い前方散乱系で長距離を伝播し続けることができます1。この観察は、オプシンタンパク質がすべての動物のすべての組織にほぼ遍在的に発現しているという事実に照らして特に顕著です。したがって、生体組織内で光がどのようにどこで減衰および散乱されるかを理解することが重要です。しかし、水生系とは異なり、生体組織では、機器を水柱に浸して放射輝度と放射照度の測定値を取得することは不可能であり、新しい技術が必要です。
生体組織の吸収および散乱特性を特徴付けるために以前に使用された他の方法には、組織反射率プローブおよび/または積分球2,3の測定、走査型共焦点顕微鏡4などの微視的方法、表面上のレーザー光の拡散の測定5、およびモンテカルロ放射伝達6などのモデリング技術が含まれる。.言及された実験方法は、多くの場合、組織構造に関する特定の、大型で高価な機器または詳細な知識を必要とし、一般に、組織の深部にある光の空間構造を特徴付ける能力に制限があります。
皮下注射針を使用して組織7、8、9を通して光ファイバを挿入する同様のプローブベースの方法もあります。私たちの経験では、修飾針は組織を穿刺するのに効果的ですが、かなりの力を必要とし、密集した細胞を継代するときに一般的に繊細な組織を引き裂きます。したがって、これらの針は一般に、組織層に1ミリメートル程度以上挿入するための外科的処置を必要とする。ここで説明する方法は、潤滑された引っ張りガラス支持体を使用して、組織の最小限の傷で、追加の手術なしで細胞間を滑ることができる。
この原稿は、高密度組織の深部までプローブし、現場での構築と使用に適したガラス支持光学マイクロプローブとポータブル電子機器を使用して、藻類マット10,11内の光を測定するというJorgensonらの研究に触発された方法を提示します。これらのプローブは、生体組織内のスカラー放射照度(あらゆる方向から点に当たる光)とダウンウェル放射輝度(水平面と交差する光)を高い空間分解能で特徴付けるように構築できます。これらのプローブはもともと、光共生型オオハマグリ12の組織内の放射伝達を測定するために開発されました。全組織の吸収と透過の標準的な測定は、すべての入射光が組織の表面で高強度を経験している少数の細胞によって吸収されるか、組織の体積全体で低強度を経験している多くの細胞によって吸収されるかに大きな違いがあるため、組織の光合成性能を特徴付けるのに十分ではありませんでした。第2のプロジェクトでは、これらのプローブを使用して、マウスの脳内の生体内放射照度を測定し13,14、それによって脳の深部で発現するオプシンの光環境を特徴付けた。これらのマイクロプローブは、すべての毛皮、皮膚、骨をそのままにしてマウス脳組織内の放射照度を測定するのに十分な小型で感度が高く、生理学的光レベルが脳深部オプシンを刺激するのに十分高いことを示しています。
このマイクロ光学プローブと測定セットアップは、特に光合成や目の外で発現される視覚色素の機能をより微妙に理解するために、生体組織内部の光を定量化および特性評価する必要がある研究者に役立つ可能性があります。この方法は、単独で、または他の技術と組み合わせて使用 して、社内に構築された小型のポータブル機器とタスク依存の調整可能なパラメータを使用して、生体組織内の光学特性と光伝播を低コストで完全に特徴付けることができます。
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Protocol
この研究は、脊椎動物および無脊椎動物の研究に関するイェール大学のすべての関連する倫理規制に準拠しています。
1. 光マイクロプローブの構築
- ガラススリーブの構築、材質:パスツールピペット、5.75インチ( 材料表を参照)
- 取り付け可能なワニ口クリップ(材料表)を使用して、テーパーの端が床に向かって下を向き、ピペットの向きが床に垂直になるように、ガラスピペットを広い端で取り付けます。
- ピペットのテーパー端から50gのプラスチック製バイスグリップ(材料表)を吊るします。ピペットとバイスグリップの間に電気テープのパッドを置き、滑りを防ぎます。
- 小さなブタントーチを使用してピペットのテーパー端を加熱します(材料表)。バイスグリップの1 cm上に炎を適用します。炎の最も明るい部分がガラスから3 cm離れ、ガラスが炎の先端になるようにトーチを保持します。ピペットの長さが約5インチ増加したら、すぐに炎を取り除きます。
- 小さなはさみまたはガラスカッターを使用して、新しい引っ張り直径が次のセクションで使用する光ファイバーの約2倍になるようにピペットの引っ張られた端を切り取ります(手順1.2を参照)。カーボランダム紙(材料表)を使用して、トリミングされた端の鋭い領域をファイリングします。イソプロピルアルコールの噴出ボトルとそれに続く圧縮空気を使用して、結果として生じる小さなガラスの破片やほこりを洗い流します。
- 光ファイバを引っ張る(図1D)
- かみそりの刃を使用して光ファイバを切断し、直径200μmのSMA終端光ファイバのSMAコネクタを1つ取り外します(材料表)。SMA終端の1つの近くでカットします。次に、かみそりの刃を使用して、次の5 cmのプラスチックとグラスファイバーのジャケットを取り除き、裸の光ファイバーが露出し、無傷のアセンブリの残りの部分から突き出るようにします。
- ブタントーチを使用して、ガラス繊維からポリイミドポリマーコーティングを焼き払います。イソプロパノールですすいでください。糸くずの出ないワイプを使用して、むき出しのガラス繊維をきれいに拭きます。
- 次のステップは、裸の繊維を取り付けて、炎で引っ張ることもできるようにすることです。光ファイバの裸の端をプライヤークランプ(材料表)に直接取り付けます テーブルまたは棚の端、ファイバーのSMA終端端を床に向かってぶら下げます。ファイバーのジャケット付き端に、裸の光ファイバーがプライヤークランプに保持されている場所から約12インチ下に、2つの小さなクランプ(総重量:10 g)の形で引っ張るためのウェイトを追加します。
- 繊維を引っ張るには、ブタントーチの炎をつけて始めます。炎をオンにした状態で、ブタントーチを裸のファイバーから1 cm保持し、炎が光ファイバーに垂直になり、プライヤークランプが裸のファイバーを保持する場所から垂直に3 cm下になるようにします。ファイバーを伸ばしたり、引っ張ったり、分離したり、床に落としたりします。
- 結果として引っ張られた光ファイバ端を調べます。カーボランダム紙で凹凸をやさしく研磨し、イソプロピルアルコールと糸くずの出ないワイプできれいにし、圧縮空気で乾かします。
注:この時点で、顕微鏡を使用して、引っ張られた繊維のサイズと形状を特徴付け、文書化することができます。 - フィルム不透明ペンを使用して、ファイバーの側面を暗くし、迷光の侵入を防ぎます(材料表)。ペンの先端を横切ってファイバーをそっと引っ張り、先端の小さな領域だけを覆い隠します。
- 引っ張ったファイバーをガラスピペットスリーブ内に取り付けます(図1A)
- 実体顕微鏡下で作業し、ステップ1.2のテーパー光ファイバをステップ1.1の変更されたガラスピペットの広い方の端に注意深く挿入し、~1mmのベアファイバがピペットのテーパー端から突き出るまでファイバを押し込みます。
- 電気テープを使用して、光ファイバのジャケット付き端をピペットの広い端に固定します。
- シアノアクリレート接着剤を小さなゲージの針に一滴入れます(材料の表)。引っ張られた繊維のむき出しの端を避けて、引っ張られたピペットの切断端に接着剤の滴を慎重に触れます。
- 毛細管現象により接着剤がピペットに吸い付き、ピペットの壁と光ファイバーの間の領域が濡れます。プローブアセンブリを移動する前に、接着剤を少なくとも15分間硬化させます。
- 散乱球によるファイバーチップの変更(図1C)
- UV硬化型接着剤と二酸化チタン粉末(材料表)を~1:1 v/vで一滴混合して、散乱ボール先端の原料を作成します。
- プローブが水平方向になるように、取り付けロッドホルダー(材料表)を備えたマイクロマニピュレーターにプローブを取り付けます。接着剤の液滴が形成されるように、上記で調製した接着剤/ TiO2 混合物にワイヤーまたは針の先端を浸すことによって、散乱物質の作業リザーバーを準備します。ワイヤーまたは針を水平プローブの先端近くの液滴で取り付けます。ベンチに取り付けられたワニ口クリップを使用してこれを行うと便利です。
- プローブの先端に散乱球を堆積させます。マイクロマニピュレーターを使用して、プローブの光ファイバーの先端を接着剤/TiO2の液滴にゆっくりと慎重に押し込みます。次に、接着剤からチップをすばやく引き出します。所望のサイズの接着剤の球状の液滴が光ファイバの先端に堆積するまで、2〜3回繰り返す。
注意: 散乱球は、テーパー光ファイバの直径の2〜8倍の直径で安定します。最終的な最適なサイズは、最終的に必要なアプリケーションによって異なります。 - 光ファイバのSMA終端端をファイバ結合UV光源に接続して球を硬化させます(材料表)。
注:この研究で使用された光源の電力は5.3mWでした。この力では、推奨される硬化時間は少なくとも12時間または一晩です。硬化後は、最終的な光学プローブチップのサイズを特徴付けて測定する良い機会です。
2.光学測定用の組織の準備と取り付け(図2および図3)
- 実験用のサンプルをマウントするための皿を準備します。ブタントーチを使用してパスツールピペットの大きい方の端を加熱し、35 mm x 10 mmのプラスチック製ペトリ皿の底にある直径0.5 cmの穴を溶かすパンチを作ります。皿の底面の穴を電気テープまたはラボテープで塞ぎます。効率のために一度にいくつか作ります。
- パッケージの指示に従って液体ゼラチン(材料表)を準備します。
注:食料品店からの市販の食品グレードのフレーバーレスゼラチンは、化学グレードのゼラチンが食品よりも光学的に透明で機械的信頼性が低いため、化学サプライヤーからの化学グレードのゼラチンよりもこの目的に適しています。 - 使用する組織の解剖と準備を行います。
注:経験から、この実験では、目的のシステムに適した解剖技術を使用して、厚さ1cmまでの平らな組織を正常に測定できます。巨大なハマグリ組織については、8mmの生検パンチを使用して、実験12で使用するために、平らで規則的なアサリ組織を作成した。このシステムでは、実験終了時にサンプルが生き生きとした状態にあることを確認するために、測定を完了するのに必要な時間の長さを考えると、一度に1つのサンプルのみを効果的に準備できました。 - ステップ2.1の2つのペトリ皿を液体ゼラチンで4分の1満たし、ゲル化の直前に室温(RT)まで冷却します。1つの皿に、皿の底の穴に形成される粘性ゼラチンのクッションに生検を置きます。パスツールピペットを使用して、ペトリ皿がいっぱいになるまで生検の周りにRTゼラチンを穏やかに追加します(図3)。2番目の皿にゼラチンを入れて、空のサンプルを作ります。
- ゼラチンが完全に硬化し、手触りがわずかに弾力があるまで、サンプル皿を冷蔵庫に約10〜30分間入れます。
注:涼しい部屋では、これは必要ないかもしれません。熱帯地方で作業する場合、このステップはゼラチンを完全に硬化させるために必要です。 - マイクロマニピュレーターにペトリ皿のマウントを作る(図2)
- 厚さのプレキシガラスで1/4の6 cm x 6 cmの正方形を切り取ります(材料表)。
- プラスチックの正方形に、ペトリ皿と同じ直径(~35 mm)の穴を開けるか溶かします。ペトリ皿がこの穴にぴったりと収まり、摩擦で所定の位置に保持されていることを確認してください。皿の端にテープを追加して、サイズと摩擦接触をわずかに増やします。
- プラスチック製の正方形の角に直径1/4の穴を開けるか溶かします。この穴を使用して、1/4インチのネジとボルトを使用して正方形をマイクロマニピュレーターに取り付けます。
- プラスチック製の正方形を黒い電気テープで覆い、プローブに到達する迷光を減らします。同様に、テープを使用して、挿入された皿の底(>10 mm)の下に伸びる正方形の側面の周りにスカートを作成し、迷光を減らします(図2B)。
- ボルトと適切なハードウェアを使用して、ペトリ皿ホルダーをマイクロマニピュレーターに取り付け、サンプルの厚さよりも大きな範囲で3次元調整と十分に解決された垂直方向の動きを可能にします( 材料表 に記載されているマニピュレーターのパート1とパート2が良い例です)。このマイクロマニピュレーターを光学ブレッドボードに貼り付けます。
3.組織生検の測定セットアップ
- 測定が行われる領域の上に光源を取り付けて、サンプルが配置される平面に到達したときに光がコリメートされるようにします(図2A)。例えば、5mmの液体ライトガイド(材料表)に5cmのコリメートレンズ(材料表)を取り付け、光学ブレッドボードに取り付けられたバイスとフレームを使用してサンプルから>0.6m持ち上げます(材料表)。次に、ライトガイドを、材料の表に記載されているプラズマ光源などのブロードバンド光源に接続します。
- プローブを光源に向けるように垂直方向のマウントに取り付けます。プローブをクランプ、ホースクランプ、またはテープで光学テーブルポストに固定します。
注:ジャイアントハマグリの実験では、 材料の表に記載されているマイクロマニピュレーターなど、特別に設計されたロッドホルダーが使用されます。この作業では、光学ブレッドボード(材料表)に磁石で固定しました。プローブとサンプルの両方をマニピュレータ上に置くことによって得られるアライメントのための追加の自由度は便利ですが、必須ではありません。ポストに過度にクランプしないように注意してください、これはピペットハウジングを壊す可能性があるためです。 - 垂直に取り付けられたプローブの近くにサンプルマニピュレーターを配置します。サンプルマニピュレーターを使用して、プローブがペトリ皿の下部にある0.5cmの開口部の中央になるようにサンプルステージの位置を調整します。取り付けられたプローブの先端に触れたりぶつけたりしないように細心の注意を払ってください。
注:サンプル領域上に配置されたブームマウント実体顕微鏡が便利な場合があります。このようにして、実験を開始する前に、プローブの先端、ステージ、およびサンプルのトップダウンアライメントを確認できます(図2A)。 - プローブの光ファイバのSMA終端端をUSB光ファイバ分光器(材料表)に接続し、USBケーブルを使用して分光器をコンピューターに接続します。
4. データ収集
- 実験のセットアップ
- プローブとマニピュレータを、ステップ3.4のように、データが収集される正確な位置に配置します。
- 綿棒またはファインゲージの針を使用して、組織に挿入されるプローブの部分に少量のシリコーン潤滑剤(材料表)を注意深く塗布し、プローブの側面と組織サンプルの間の摩擦を下げます。各ベースラインまたは組織測定の前に、シリコーン潤滑剤を再塗布します。
- ブランクのサンプルペトリ皿の穴を覆っているテープをはがし、サンプルホルダーに入れ(ステップ2.7)、摩擦によってしっかりと固定されていることを確認します。
- マイクロマニピュレーターを使用して、サンプルをプローブに降ろします。プローブがシャーレの下側にある穴 から ゼラチンに入るようにします。プローブがゼラチン層の下部から約5 mmになるまで続けます。
- 光源をオンにします。分光器ソフトウェアを使用して、信号が可能な限り高くなるが飽和しなくなるまで分光器の統合時間を調整します。平均スキャンの数を 2 から 5 の間で設定し、スムージング ピクセルの値を 6 に設定します。この段階で使用可能な統合時間は、このベースラインで1〜50ミリ秒の間で変化する可能性があります。
- 参照スペクトルの収集
- 暗い測定値を収集します。
- ブランクサンプルで分光器のパラメータを設定したら、プローブファイバーを分光器から取り外し、分光器に付属の不透明な金属カバーでポートを覆います。
- 分光器から暗い測定値を取得して(多くの場合、GUIの暗い電球アイコンを使用)、入力光のない分光器のノイズを特徴付けます。データ収集戦略に従ってこの測定値を保存します。
- ランプの測定値を収集します。プローブファイバーを分光器に再接続し、信号が安定するのを待ってから、別のスペクトルを取得します。この測定は、組織の非存在下でゼラチンを通ってプローブに到達する光を特徴付ける。
- 暗い測定値を収集します。
- 組織スペクトルの収集
- サンプルシャーレの底にあるテープをはがし、サンプルホルダーに入れます。
- 組織生検がプローブの先端より上の中央に配置されるように、3次元操作を使用してサンプル皿をプローブに合わせます。
- シリコーンゲルをプローブに塗布し(4.1.2を参照)、プローブの先端が組織サンプルを支えるゼラチンを通過し、組織サンプルに入るまで、サンプルをプローブにゆっくりと下げます。
注意: 一部の分光計とコンピュータープログラムでは、検出された光をリアルタイムで監視できます。これを使用して、プローブがいつ組織に入るかを判断します。スペクトル強度は、プローブの先端が組織に直接接触するとすぐに急激に減少します。 - 測定スペクトルのノイズが多すぎず、飽和状態でもないことを確認して、積分時間が測定に適していることを確認します。必要に応じて積分時間を変更します。
- 積分時間を調整するたびに、新しいダーク測定を実行して保存します(ステップ4.2.1)。平均スキャンの数や平滑化されたピクセルの数は変更しないでください。
- 適切な測定パラメータを見つけたら、測定を行い、スペクトルを保存します。
- マイクロマニピュレーターを使用して、サンプルを指定された距離に移動します。この研究に使用したマニピュレータでは、各小さな目盛りは0.001インチまたは25.4μmでした。サンプルは、測定ごとに5つの目盛り(127 μm)を通って下に移動しました。手順 4.3.4 を繰り返します。
- 組織内の各垂直位置でスペクトルを保存し続けます。
注:ここで説明するシステムでは、単一の組織サンプル内の測定に必要な積分時間は1ミリ秒から5秒の間で変化しました。最終的に、プローブの先端は組織の上部を出て、そこに見えるようになります(図4A)。これは最終的な測定値であり、組織の上部に入射する光を特徴付けます。
- データのロードと処理
- 分光器のソフトウェアを使用して、収集されたすべてのスペクトル(暗スペクトル、ランプスペクトル、および組織測定値)を区切りテキストファイルに変換します。
- Matlabまたは選択したコーディング言語を使用して、サンプルのすべての測定ファイルをロードします。組織測定スペクトルごとに、暗スペクトルと一致する積分時間を減算し、積分時間で割ります。
注:この研究では、データの読み込みと処理にMatlabスクリプトを使用しました(補足ファイル1)。 - 組織内のプローブで得られたスペクトルを空のゼラチンで得られたベースラインスペクトルで割ることにより、組織内の各位置に到達する入射光の割合を計算します。
注意: 組織の上部での測定値(ステップ4.3.6)は、ゼラチンのベースライン測定値(ステップ4.1)と非常によく似ており、分割すると100%に近いはずです。実験の状況に応じて、ランプスペクトル(空のゼラチンからのスペクトルまたは組織の最上部からのスペクトル)のいずれかを基準として使用できます。ただし、実験を開始する前にランプスペクトルを収集することは依然として重要です。これは、プローブが破損したり、組織の上部に到達する前に実験が失敗した場合でも、故障前に得られたデータは引き続き使用可能であり、対応する初期ランプ基準スペクトルがない場合はそうではないためです。 - データを視覚化します。等高線プロットが役立ちます(図4B)。
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Representative Results
このプロトコルは、ダウンウェル放射照度(一方向から点に到達する光)を測定するために使用できるマイクロ光学プローブを構築する手順を説明し、光散乱球面先端を追加して、スカラー放射照度(すべての方向から点に到達する光)。これらのプローブは、生体組織内の単一細胞の長さスケールに近い空間分解能で放射照度を測定することができます。このプロトコルはまた、記載されたプローブを使用して放射照度測定のための組織サンプルを調製するための代表的な方法、およびデータ表示および分析のための代表的な方法を説明する。
図1 は、マイクロプローブ製造の出力を示しています。引っ張ると、光ファイバは約3cm先細りになり、テーパーに沿って傷が付かないはずです。また、端が平らで、直径が15〜30 μmである必要があります(図1D)。先端の平坦度は、カーボランダム紙で端を研磨するか、スコアを付けて再度破損することで改善できます。同様に、ファイバーのハウジングとして使用されるプルドガラスピペットには、鋭いエッジや壊れたエッジがあってはなりません。散乱ボールがファイバーの平らな切断先端の端に形成される場合、それは球形である必要があります(図1C)。硬化する前に、ボールを親接着剤の液滴に挿入し、繊維をすばやく引き抜くことで、形の悪いものを取り除くことができます。動きの速度が速いと、繊維の端から接着剤のボールが引っ張られます。動きが遅いと、繊維上に追加の接着剤が構築されます。ファイバーを光源に取り付けた状態で解剖顕微鏡でプロセスを観察すると、作業を視覚化し、プロセスが機能しているかどうかを判断するのに役立ちます。散乱接着剤を塗布する前に、接着剤と電気テープでガラスピペット内の繊維を固定することが重要です。そうしないと、繊維が破損したり、接着剤が移動する繊維で汚れたりする可能性があります(図1)。
図2 に測定装置を示す。この例では、組織サンプルとプローブの両方のホルダーに3次元の調整機能があります(図2)。サンプルとプローブの両方をマニピュレータに取り付けることは、アライメントに役立ちますが、必須ではありません。プローブは固定ポストに取り付けることができます。マニピュレータの最も解決された動きは、組織内の位置および/またはプローブの移動量を正確に決定できるように、垂直のz方向に向ける必要があります(図2A)。ブームに取り付けられた実体顕微鏡は、接眼レンズを通してステージ、プローブ、およびサンプルを表示して、プローブとステージ、ディッシュ、およびサンプルの位置合わせを確認できるように配置すると便利です(図2B)。プローブによって測定されたスペクトルが突然変化した場合、これはサンプルが高度に散乱または吸収される組織内に正常に配置されているか、プローブが曲がっているか壊れていることを示唆しているため、サンプルをプローブに降ろしながらスペクトルをリアルタイムで観察するのに役立ちます。スペクトルの形状と強度の急激な変化は、組織の入り口を示している可能性が最も高いですが、形状の変化のない急激な強度の変化は、プローブが曲がったり壊れたりしていることを示唆しています。ハマグリ組織の上部には、プローブが壊れずに貫通できない薄い透明な膜があります。このような場合、組織の上部を監視してプローブがいつ出ようとしているかを確認し、プローブが壊れないようにその時点で測定を停止する必要があります。
図3 は、セクション2で説明したように、ゼラチンのシャーレに埋め込まれた組織生検サンプルを示す。ペトリ皿の底には穴があり、光学プローブを下から組織に挿入できます。生検は直径8 mmで、シャーレの穴の中央にあります(図3A)。組織サンプルの下に少量のゼラチンがあり、ゼラチンは組織の上の皿の上部まで充填されています(図3B)。
図4Aは、その組織が上部から出始めるときのプローブを示し、図4Bは代表的なデータを示す。Matlabスクリプト(補足ファイル2)を使用して、図4Bのトレースを生成しました。x軸は波長で、y軸はベースラインスペクトルに対する組織の深さでの光の割合です。組織の深さの個々の測定値は、グレースケールの色の線で示されます。組織のより深いところで行われた測定値は、より暗い線で表されます。ベースラインスペクトルは、ゼラチンのみのサンプルでの測定であり、ランプとランプに対するプローブの応答の特性評価に使用されます。ゼラチンはわずかな吸収と散乱があり、波長に対するゼラチン吸収のシグナルは完全に平坦ではありません。したがって、組織全体で採取されたスペクトルは、ゼラチン中のプローブのスペクトルまたは組織上部のプローブのスペクトルによって分割され、図4Bに示すスペクトルデータは、組織サンプルのみの光の割合を表し、したがって、光源とは無関係であり、 ゼラチン、および個々のプローブの詳細。
図1:マイクロ光学組織内放射測定プローブの作製段階 。 (A)光プローブの概略図。(B)完成した光学プローブのビュー。(C)ガラスピペット支持体内部に引っ張られた光ファイバに取り付けられた散乱球のクローズアップ。(D)引き抜かれて洗浄された光ファイバ。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図2:組織内のスカラー放射照度を測定するための実験セットアップの画像と図。 (A)実験セットアップの全体的な回路図とイメージ。(B)サンプルのシャーレホルダーのクローズアップ。この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図3:ハマグリ組織生検 。 (A)ゼラチンで満たされた改変されたペトリ皿で測定する準備ができているハマグリ組織の生検の上面図および(B)側面図。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
図4:代表的なデータ 。 (A)プローブが組織を通って上がったときにどのように見えるかを示す顕微鏡画像。(B)組織内放射測定プローブで得られた代表的なデータ。 この図の拡大版を表示するには、ここをクリックしてください。
補足ファイル1:データの読み込みと処理に使用されるMatlabスクリプト。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル 2: 図 4B のトレースを生成するために使用される Matlab スクリプト。このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
このプロトコルは、ほぼ単一細胞のスケールの空間分解能で大量の生体組織を通して光学環境を体系的に特徴付けるための技術を記述しています。この安価で柔軟性があり、フィールド扱いやすい方法は、生体システム内での光の伝播を研究する研究者に役立つ可能性があります。経験から、既存の方法7と比較して、これらのプローブは構築するのにもう少し練習とスキルを必要としますが、組織の損傷が少なく、大量の高密度組織をより包括的に特徴付ける能力をもたらします。
この方法は4つの部分で構成されています。プローブの構築の最初の部分は、以前のデバイス設計10,11に触発されました。現在のアプローチは、引っ張られたガラス針が細胞間を穏やかにスライドできるため、厚い組織全体の体系的で破壊的でないスキャンのために開発されました。また、フィールドラボでの使用にも適しています12、13、14。このプロトコルにより、ダウンウェル放射輝度を測定するための直径~20μmの先端と、スカラー放射照度を測定するためのオプションの直径50〜100μmの散乱球を備えたプローブが得られます。より大きなまたはより小さなスカラー放射照度球は、使用される材料、例えば、異なる初期粘度を有するUV硬化型接着剤を変更することによって開発することができる。ピペットプルとファイバープロセスの両方の重量を調整して、多かれ少なかれテーパーを得ることができます。加熱速度は、トーチ炎からの距離によって変更して、引っ張りプロセスと結果として生じるテーパーを調整することもできます。
プローブ構築技術は、完成させるにはある程度の手動スキルと試行錯誤が必要ですが、練習すれば信頼性が高く迅速になります。ここでは、時間の経過とともに開発されたいくつかのトラブルシューティングのニュアンスを示します。光ファイバをジャケットの端から引き下げると、より一貫したテーパーが得られます。不透明なインクの濡れ特性は、繊維先端での整頓された接着剤のボールの形成に有利に影響するため、球状散乱チップを追加する前に不透明ペンを適用することが重要です。得られた粘着ボールの形状が崩れている場合は、それを引き抜いて再試行することができます。これを行うために、マイクロマニピュレータを使用してボール全体を接着剤リザーバーにスライドさせ、その後非常にゆっくりと引き出すことができます。これは通常、最初の奇形の試みを引き離し、接着剤リザーバーに残し、再試行を可能にします。
慎重に処理すれば、これらのプローブはさまざまなサンプルに繰り返し使用できます。最大の危険は、プローブの先端を動かしているときに誤って何かにぶつかることです。測定の合間に、イソプロピルアルコールと圧縮空気を使用して細胞の破片を取り除く必要があります。プローブは、プローブの先端が何にも触れておらず、ガラススリーブ内にプローブを保持しているテープと接着剤を引き離す可能性のある光ファイバーアセンブリに力がない限り、数週間保管することもできます。これは、ファイバーとガラスのピペットをいくつかの場所で高い棚の端にクランプすることで実現できます。
この方法の2番目と3番目の部分は、実験のメカノ光学的側面と測定のための組織の固定を含みます。この方法のこの部分は、巨大なハマグリ組織12内の組織内スカラー放射照度を測定するために特別に開発されました。ここでは、メソッドのこれらの側面のトラブルシューティングの詳細を示します。まず、生検はプローブに対して大きくなければなりません。これにより、プローブが通過するときに組織が移動することを防ぎます。さらに、組織はペトリ皿の底に座って、ゼラチンの弾力性と重量が組み合わさって、測定中に組織を所定の位置に保持する必要があります。実験用光源の下でゼラチンを弾力性のある固体状態に維持するのに十分なほど部屋が涼しいことも重要です。同様に、可視光に比べて発熱が比較的少ないLEDまたはその他の光源を使用すると役立ちます。
この方法の幾何学的およびオプトメカニカルパラメータは非常に柔軟です。例えば、スカラー放射照度プローブは、無傷のマウスの脳および脂肪組織内の放射照度を測定するために使用された13,14。これを行うために、プローブを標準的なげっ歯類定位フレーム上のマニピュレータに取り付け、光源をマウスの吻に向けて取り付けた。どのような形状においても、この方法をうまく使用するための鍵は、特定の測定の開始時に常に適切なランプと暗い基準スペクトルを収集することです。組織測定中にプローブが破損し、組織が所定の位置にない状態で初期特性評価が行われない場合、データの解釈が困難または不可能になり、新しいプローブで最初からやり直す必要があります。対照的に、最初に適切な参照が配置されている場合、部分的な測定値は使用可能なデータです。
この方法の最後の部分は、データ収集に関するものです。プローブからの信号を監視するための光ファイバ分光計の使用について説明し、SMA結合を容易にし、完全なスペクトル波長情報を提供します。ただし、光子束が低いシステムでは、これらのプローブを光電子増倍管またはアバランシェフォトダイオードに結合することもできます。いずれの場合も、すべての検出器は、新しい測定ごとに基準測定を必要とします。したがって、記載したデータ収集方法をわずかに調整するだけで、すべての異なるタイプの光学パラメータを特徴付けることができます。
この方法の将来の興味深い用途は、大型哺乳類の体内深部や多肉植物などの複雑な放射伝達特性を持つ植物内の光の定量化である可能性があります。
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Disclosures
利益相反はありません。
Acknowledgments
著者らは、ヨルゲンセン博士の同僚と彼の研究を紹介してくれたSanaz Vahidiniaに感謝します。この研究は、陸軍研究局(番号W911NF-10-0139)、海軍研究局(MURI賞番号N00014-09-1-1053)、およびNSF-INSPIRE賞NSF-1343158からの助成金によって支援されました。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 1" travel ball bearing center+D11+A2:D31+A2:A2:D31 | Edmond Optics | 37-935 | Part 2 of manipulator for lowering sample |
| 1/4" thick acrylic sheet | McMaster-Carr | 8505K754 | For making Petri dish holder |
| 3/4" mini spring clamp | Anvil | 99693 | Use as weight for pulling optical fiber |
| 8 mm biopsy punch | Fisher Scientific | NC9324386 | For tissue sample |
| Butane Torch | McMaster-Carr | MT-51 | Heat source for pulling fiber and pipette |
| Collimating lens | Thorlabs | LLG5A1-A | To collimate light source through liquid light guide |
| Compressed air | McMaster-Carr | 7437K35 | For drying pulled fiber and pipette |
| Cyanoacrylate glue - liquid | McMaster-Carr | 66635A31 | For securing tapered fiber end at top of pulled pipette |
| Electrical tape | McMaster-Carr | 76455A21 | For securing fiber in pipette and for adding grip to clamps |
| Fine grade carborundum paper | McMaster-Carr | 4649A24 | Small triangle on exacto knife holder works well |
| Gelatin | Knox | 10043000048679 | For securing the tissue biopsy in the petri dish |
| Glass Pasteur Pipete | Fisher Scientific | 13-678-20B | Disposable glass pipette 5.75" in length |
| Insulin syringes, 31G needle | BD | 320440 | For applying glue |
| Isopropanol | McMaster-Carr | 54845T42 | For cleaning pulled fiber and pipette |
| Kimwipe | Cole-Parmer | SKU 33670-04 | For wiping optical fiber and glass pipette clean |
| LED driver | Thorlabs | LEDD1B | For powering the UV LEDs |
| Light source for measurements | Cole-Parmer | UX-78905-05 | Low heat white light source for measurements |
| Linear metric X-Y-Z axis rack and pinion stage | Edmond Optics | 55-023 | Part 1 of manipulator for lowering sample |
| Liquid light guide | Thorlabs | LLG5-4T | For light source in measurements |
| Magnetic feet | Siskiyou | MGB 8-32 | For use with magnetic strips |
| Magnetic strips | Siskiyou | MS-6.0 | For mounting magnetically to breadboard |
| Manipulator #1 | Siskiyou | MX10R | 4-axis manipulator with pipette holder |
| Opaquer pen, small | WindowTint | TOP01 | For opaquing side of optical fiber to prevent stray light from enter probe |
| Optical breadboard | Edmond Optics | 03-640 | For stable affixation of probe holder, sample, microscope and light source |
| Optical fibers | Ocean Optics | P-100-2-UV-VIS | About 4 fibers are good to have |
| Plasma light source | Thorlabs | HPLS345 | For tissue radiometry measurements |
| Plastic plier clamp | McMaster-Carr | 5070A11 | Plier clamp used for weight in pulling pipette |
| Polystyrene Petri dishes | Thomas scientific | 3488N10 | Sample holders, enough volume to hold sample thickness plus ~10 mm of gelatin on top |
| Razor blades | McMaster-Carr | 3962A3 | For stripping jacketing from optical fiber |
| Silicone oil lubricant | Thomas scientific | 1232E30 | For reducing friction between probe and tissue |
| Software for analyzing data | Matlab | Chosen software for data analysis | |
| Spectrometer + spectrometer software | Avantes | AvaSpec-2048L | Spectrometer can be any brand, this one is compatible with sma-terminated optical fibers and comes with its own software for running the spectrometer |
| Titanium dioxide powder | Sigma Aldrich | 718467-100G | For making scattering sphere |
| Toolour tabletop clip | Toolour | Toolour0004 | For holding pipette while pulling and for holding finished probes |
| Trigger-action bar clamps | mcMaster-Carr | 51755A2 | Good for holding optical fibers while pulling or curing |
| UV curable adhesive | Delo Photobond | GB368 | For making scattering sphere |
| UV light source | Thorlabs | M365FP1 | Light source for curing adhesive in scattering ball, this one is sma-fiber compatible, higher intensity = less cure time |
| White LED light source | Thorlabs | MCWHF2 | For characterizing pulled fiber and scattering sphere |
References
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