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Bioengineering

जिलेटिन मेथाक्रिलोयल ग्रैनुलर हाइड्रोगेल स्काफोल्ड्स: उच्च-थ्रूपुट माइक्रोगेल फैब्रिकेशन, लियोफिलाइजेशन, केमिकल असेंबली और 3 डी बायोप्रिंटिंग

Published: December 9, 2022 doi: 10.3791/64829
Automatic Translation
1, 1, 1, 2, 1,2
1Department of Chemical Engineering, The Pennsylvania State University, 2Department of Biomedical Engineering, The Pennsylvania State University

Summary

यह लेख माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों का उपयोग करके उच्च-थ्रूपुट जिलेटिन मेथाक्रिलोयल माइक्रोजेल निर्माण के प्रोटोकॉल का वर्णन करता है, माइक्रोगेल को पुन: निलंबित पाउडर (माइक्रो-एयरगेल) में परिवर्तित करता है, दानेदार हाइड्रोगेल मचानों को बनाने के लिए माइक्रोगेल की रासायनिक असेंबली, और 3 डी बायोप्रिंटिंग के लिए संरक्षित माइक्रोपोरसिटी के साथ दानेदार हाइड्रोगेल बायोइंक विकसित करता है।

Abstract

हाइड्रोजेल माइक्रोपार्टिकल्स (एचएमपी) को इकट्ठा करने के माध्यम से निर्मित दानेदार हाइड्रोगेल स्काफोल्ड्स (जीएचएस) के उद्भव ने सीटू में माइक्रोपोरस पाड़ गठन को सक्षम किया है। पारंपरिक थोक हाइड्रोगेल के विपरीत, जीएचएस में इंटरकनेक्टेड माइक्रोस्केल छिद्र गिरावट-स्वतंत्र सेल घुसपैठ के साथ-साथ ऑक्सीजन, पोषक तत्व और सेलुलर उपोत्पाद हस्तांतरण की सुविधा प्रदान करते हैं। मेथाक्रिलोयल-संशोधित जिलेटिन (गेलएमए), एक (फोटो) रासायनिक रूप से क्रॉसलिंकेबल, प्रोटीन-आधारित बायोपॉलिमर जिसमें सेल चिपकने वाला और बायोडिग्रेडेबल मोइटी होता है, का व्यापक रूप से सेल-उत्तरदायी / शिक्षाप्रद बायोमैटेरियल के रूप में उपयोग किया जाता है। थोक गेलएमए को जीएचएस में परिवर्तित करने से ऊतक इंजीनियरिंग और पुनर्जनन के लिए अवसरों की अधिकता खुल सकती है। इस लेख में, हम उच्च-थ्रूपुट गेलएमए माइक्रोजेल निर्माण, पुन: निलंबित शुष्क माइक्रोगेल (माइक्रो-एयरगेल) में रूपांतरण, माइक्रोगेल की रासायनिक असेंबली के माध्यम से जीएचएस गठन और एक्सट्रूज़न बायोप्रिंटिंग के लिए दानेदार बायोइंक निर्माण की प्रक्रियाओं का प्रदर्शन करते हैं। हम दिखाते हैं कि शीतलन और फोटोक्रॉसलिंकिंग के माध्यम से एक अनुक्रमिक भौतिक रासायनिक उपचार यांत्रिक रूप से मजबूत जीएचएस के गठन को कैसे सक्षम बनाता है। जब प्रकाश दुर्गम होता है (उदाहरण के लिए, गहरे ऊतक इंजेक्शन के दौरान), व्यक्तिगत रूप से क्रॉसलिंक किए गए गेलएमए एचएमपी को ट्रांसग्लूटामिनेस का उपयोग करके एंजाइमेटिक क्रॉसलिंकिंग के माध्यम से बायोऑर्थोगोनल रूप से इकट्ठा किया जा सकता है। अंत में, कम एचएमपी पैकिंग घनत्व पर माइक्रोपोरस जीएचएस के त्रि-आयामी (3 डी) बायोप्रिंटिंग को विषम रूप से चार्ज नैनोकणों के इंटरफेशियल स्व-असेंबली के माध्यम से प्रदर्शित किया जाता है।

Introduction

ऊतक इंजीनियरिंग मचानों को बनाने के लिए एचएमपी बिल्डिंग ब्लॉकों को इकट्ठा करने ने पिछले कुछ वर्षों में जबरदस्त ध्यान आकर्षितकिया है। एचएमपी असेंबली के माध्यम से निर्मित जीएचएस में उनके थोक समकक्षों की तुलना में अद्वितीय गुण हैं, जिसमें असतत बिल्डिंग ब्लॉकों के बीच शून्य स्थान से उत्पन्न सेल-स्केल माइक्रोपोरसिटी शामिल है। अतिरिक्त गुण, जैसे कि इंजेक्टेबिलिटी, मॉड्यूलरिटी, और सरंध्रता से विघटित कठोरता, जीएचएस को ऊतक की मरम्मतऔर पुनर्जनन को बढ़ाने के लिए एक आशाजनक मंच प्रदान करते हैं। जीएचएस निर्माण के लिए विभिन्न बायोमैटेरियल्स का उपयोग किया गया है, जिसमें सिंथेटिक पीईजी-आधारित पॉलिमर 3,4 और पॉलीसेकेराइड शामिल हैं, जैसे कि एल्गिनेट5 और हाइलूरोनिक एसिड 6,7। स्वाभाविक रूप से व्युत्पन्न पॉलिमर में, जीएचएस निर्माण के लिए सबसे आम प्रोटीन-आधारित बायोपॉलिमर जेलएमए 8,9,10,11, एक क्रॉसलिंकेबल, बायोकम्पैटिबल, बायोडिहेसिव और बायोडिग्रेडेबल बायोमटेरियल12,13 है।

एचएमपी को बैच इमल्सीफिकेशन8, फ्लो-फोकसिंग14,15 या स्टेप-इमल्सिफिकेशन 9,11 माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों, सम्मिश्रण 16, या जटिल कोसरवेशन17,18 के माध्यम से बनाया जा सकता है। आमतौर पर, फैब्रिकेशन थ्रूपुट और एचएमपी मोनोस्प्रेसिटी के बीच एक ट्रेड-ऑफ होता है। उदाहरण के लिए, सम्मिश्रण तकनीक अनियमित आकार और अत्यधिक पॉलीस्प्रेटेड एचएमपी उत्पन्न करती है। बैच इमल्सीफिकेशन या जटिल कोसरवेशन पॉलीस्प्रेटेड गोलाकार एचएमपी की बड़ी मात्रा के उत्पादन को सक्षम बनाता है। फ्लो-फोकसिंग माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों का उपयोग <5% की भिन्नता के गुणांक के साथ अत्यधिक मोनोस्प्रेटेड बूंदों को बनाने के लिए किया गया है, हालांकि थ्रूपुट काफी कम है। स्टेप-इमल्सिफिकेशन माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों में, अत्यधिक समानांतर चरण मोनोस्प्रेटेड एचएमपी19 के उच्च-थ्रूपुट निर्माण को सक्षम करते हैं।

मेथाक्रिलोयल-संशोधित जिलेटिन (गेलएमए) एचएमपी बिल्डिंग ब्लॉक थर्मोरेस्पॉन्सिव और (फोटो) रासायनिक रूप से क्रॉसलिंकेबल हैं, जो आसान जीएचएस निर्माण20 को सक्षम करते हैं। ऊपरी महत्वपूर्ण समाधान तापमान (यूसीएसटी) 21 (उदाहरण के लिए, 4 डिग्री सेल्सियस पर) के नीचे ठंडा होने पर, गेलएमए समाधान वाली बूंदों को शारीरिक रूप से क्रॉसलिंक एचएमपी में परिवर्तित किया जाता है। इन एचएमपी बिल्डिंग ब्लॉकों को तब बाहरी बलों (जैसे, सेंट्रीफ्यूजेशन के माध्यम से) का उपयोग करके पैक किया जाता है ताकि जाम माइक्रोगेल निलंबन प्राप्त किया जा सके। यांत्रिक रूप से मजबूत जीएचएस14 बनाने के लिए (फोटो) रासायनिक क्रॉसलिंकिंग के माध्यम से आसन्न एचएमपी के बीच इंटरपार्टिकल लिंकेज स्थापित किए जाते हैं। जीएचएस के सबसे महत्वपूर्ण गुणों में से एक माइक्रोपोरसिटी है, जो विट्रो11 में आसान सेल प्रवेश और विवो22 में बढ़ी हुई ऊतक वृद्धि को सक्षम करता है। एचएमपी के त्रि-आयामी (3 डी) बायोप्रिंटिंग को पारंपरिक रूप से कसकर पैक किए गए माइक्रोगेल सस्पेंशन का उपयोग करके किया जाता है, जो माइक्रोपोरसिटी23 से समझौता करता है।

हमने हाल ही में विषम रूप से चार्ज नैनोकणों के सोखना के माध्यम से गेलएमए माइक्रोगेल के इंटरफेशियल नैनोइंजीनियरिंग के आधार पर दानेदार बायोइंक का एक नया वर्ग विकसित किया है, इसके बाद नैनोपार्टिकल प्रतिवर्ती स्व-असेंबली है। यह रणनीति शिथिल रूप से पैक किए गए माइक्रोगेल कतरनी-उपज और एक्सट्रूज़न 3 डी बायोप्रिंटेबल बनाती है, जो योजक रूप से निर्मित जीएचएस11 के माइक्रोस्केल पोरसिटी को संरक्षित करती है। यह लेख उच्च-थ्रूपुट गेलएमए ड्रॉपलेट फैब्रिकेशन के तरीकों को प्रस्तुत करता है, इन बूंदों को शारीरिक रूप से क्रॉसलिंक एचएमपी में परिवर्तित करता है, पुन: निलंबित पाउडर का उपयोग करके गेलएमए एचएमपी का निर्माण करता है, गेलएमए जीएचएस गठन, गेलएमए नैनोइंजीनियर्ड दानेदार बायोइंक (एनजीबी) तैयारी, और 3 डी बायोप्रिंटिंग।

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Protocol

नोट: इस प्रोटोकॉल में उपयोग की जाने वाली सभी सामग्रियों, उपकरणों और अभिकर्मकों से संबंधित विवरण के लिए सामग्री की तालिका देखें।

1. गेलएमए संश्लेषण

नोट: गेलएमए संश्लेषण एक रासायनिक फ्यूम हुड में आयोजित किया जाना चाहिए, और उचित व्यक्तिगत सुरक्षा उपकरण (पीपीई) का उपयोग हर समय किया जाना चाहिए।

  1. एक एर्लेनमेयर फ्लास्क में 200 एमएल डल डलबेको के फॉस्फेट बफर्ड सेलाइन (डीपीबीएस, 1 एक्स) जोड़ें और घोल को 50 डिग्री सेल्सियस तक पहुंचने तक गर्म करें। वाष्पीकरण को रोकने के लिए फ्लास्क को एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर करें।
  2. डीपीबीएस घोल में 20 ग्राम जिलेटिन पाउडर 50 डिग्री सेल्सियस पर डालें, जबकि पाउडर पूरी तरह से घुलने तक 240 आरपीएम पर हिलाएं।
  3. क्रमशः उच्च, मध्यम या निम्न डिग्री मेथाक्रिलोयल प्रतिस्थापन के साथ जेलएमए को संश्लेषित करने के लिए ग्लास पाश्चर पिपेट के माध्यम से जिलेटिन समाधान में मेथैक्रिलेट एनहाइड्राइड (एमए) के 16, 2.5, या 0.5 एमएल जोड़ें।
    चेतावनी: एमए एक खतरनाक सामग्री है। एमए के साथ काम करते समय उचित पीपीई का उपयोग किया जाना चाहिए। एमए भी प्रकाश-संवेदनशील है, इसलिए एल्यूमीनियम पन्नी के साथ फ्लास्क लपेटकर प्रतिक्रिया को प्रकाश से बचाएं।
  4. 2 घंटे के बाद, प्रतिक्रिया को रोकने के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर डीपीबीएस के 400 एमएल जोड़ें। 10 मिनट के लिए 50 डिग्री सेल्सियस पर हिलाने दें।
  5. 12-14 केडीए आणविक भार कटऑफ के साथ एक डायलिसिस झिल्ली ट्यूबिंग में घोल डालें, और फिर ट्यूबिंग को 40 डिग्री सेल्सियस अल्ट्राप्योर पानी से भरे 5 एल बीकर में रखें। 240 आरपीएम और 40 डिग्री सेल्सियस पर पानी मिलाएं।
  6. 10 दिनों के लिए अल्ट्राप्योर पानी के खिलाफ घोल को डायलाइज़ करें और अपरिवर्तित मेथैक्रिलेट एनहाइड्राइड, उपोत्पादों और अन्य अशुद्धियों को हटाने के लिए दिन में 2 गुना पानी बदलें।
  7. 10 दिनों के बाद, गेलएमए समाधान में 40 डिग्री सेल्सियस पर 400 एमएल अल्ट्राप्योर पानी जोड़ें। 15 मिनट के लिए 240 आरपीएम पर घोल को हिलाएं।
  8. कॉफी फिल्टर का उपयोग करके समाधान को दो बार फ़िल्टर करें, इसके बाद 0.2 μm वैक्यूम निस्पंदन इकाई के माध्यम से वैक्यूम निस्पंदन करें।
  9. फ़िल्टर किए गए घोल के 25 एमएल को 50 एमएल सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों में डालें और ट्यूबों को क्षैतिज रूप से रखते हुए -80 डिग्री सेल्सियस पर फ्रीज करें।
  10. 2 दिनों के बाद, कैप्स को हटा दें और सेंट्रीफ्यूज ट्यूबों को प्रयोगशाला पोंछे के साथ कवर करें। वाइप्स को कसकर पकड़ने के लिए टेप या रबर बैंड का उपयोग करें।
  11. सफेद ठोस जेलएमए उत्पन्न करने के लिए जमे हुए गेलएमए समाधान को लियोफिलाइज़ करें।
  12. प्रोटॉन परमाणु चुंबकीय अनुनाद (1एच एनएमआर) स्पेक्ट्रोस्कोपी का संचालन करने के लिए, अलग से 1 एमएल ड्यूटेरियम ऑक्साइड (डी2ओ) में 30 मिलीग्राम जिलेटिन पाउडर (नियंत्रण) या लियोफिलाइज्ड जेलएमए जोड़ें और नमूनों को 37 डिग्री सेल्सियस पर बनाए रखें जब तक कि जिलेटिन पाउडर या गेलएमए पूरी तरह से भंग न हो जाए।
  13. 1एच एनएमआर स्पेक्ट्रा प्राप्त करें और क्रमशः ~ 6.5-7.5 और ~ 3.0 पीपीएम के रासायनिक बदलावों पर सुगंधित एसिड और लाइसिन मेथिलीन प्रोटॉन चोटियों को एकीकृत करके मेथाक्रिलोयल प्रतिस्थापन की डिग्री निर्धारित करें। एक संदर्भ के रूप में सुगंधित एसिड शिखर का उपयोग करें और समीकरण (1) के आधार पर लाइसिन मेथिलीन चोटियों का उपयोग करके प्रतिस्थापन (डीएस) की डिग्री निर्धारित करें:
    डीएस (%) = [1 - (जेलएमए में लाइसिन मेथिलीन का क्षेत्र / जिलेटिन में लाइसिन मेथिलीन का क्षेत्र)] × 100 (1)

Figure 1
चित्रा 1: गेलएमए संश्लेषण और लक्षण वर्णन। (ए) गेलएमए संश्लेषण प्रतिक्रिया। (बी) जिलेटिन और गेलएमए के प्रोटॉन परमाणु चुंबकीय अनुनाद (1एच एनएमआर) स्पेक्ट्रा: (ए) सुगंधित एसिड के लिए शिखर, जिसे अंशांकन के लिए संदर्भ के रूप में चुना जाता है, (बी) जिलेटिन के एमए संशोधन के बाद विनाइल कार्यात्मक समूह शिखर, और (सी) लाइसिन प्रोटीन के लिए शिखर। इस उदाहरण में, प्रतिस्थापन की एमए डिग्री 71% ± 3% (एन = 3) थी। इस आंकड़े को Ataie et al.11 से अनुमति के साथ संशोधित किया गया है: GelMA = जिलेटिन मेथैक्रिलोइल; डीपीबीएस = डलबेको का फॉस्फेट-बफर्ड खारा; एमए = मेथाक्रिलोयल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

2. उच्च-थ्रूपुट गेलएमए माइक्रोजेल निर्माण

  1. डिवाइस मास्टर मोल्ड माइक्रोफैब्रिकेशन
    नोट: मास्टर मोल्ड्स को केएमपीआर 1000 नकारात्मक फोटोरेसिस्ट श्रृंखला19 का उपयोग करके नरम लिथोग्राफी के माध्यम से माइक्रोफैब्रिकेट किया जा सकता है।
    1. केएमपीआर 1025 और 1035 को रातोंरात पिघलाएं। किसी भी प्रकाश जोखिम से बचें।
    2. वेफर पर पहली परत को कोट करने के लिए, फोटोरेसिस्ट का लगभग 5 सेमी सर्कल बनाने के लिए वेफर के बीच में सीधे केएमपीआर 1025 जोड़ें। स्पिन कोटर को 30 सेकंड के लिए 3,000 आरपीएम पर चलाएं।
    3. 100 डिग्री सेल्सियस हॉटप्लेट पर 12 मिनट के लिए नरम बेक करें। फिर, 5 मिनट के लिए कूलिंग प्लेट पर ठंडा करें।
    4. पहली परत मास्क को खाली सोडा चूने से जोड़ें, फिर 645 एमजे / सेमी 2 खुराक के लिए मास्क संरेखक का उपयोग करके लेपित वेफरको यूवी प्रकाश में उजागर करें।
    5. 100 डिग्री सेल्सियस हॉटप्लेट पर 3 मिनट के लिए बेक करें। 5 मिनट के लिए कूलिंग प्लेट पर ठंडा करें।
      नोट: इस चरण के बाद विकास न करें। प्रक्रिया के अंत में केवल एक बार विकसित करें।
    6. केएमपीआर 1035 का उपयोग करके वेफर पर दूसरी परत को स्पिन कोट करें। स्पिन कोटर को 30 सेकंड के लिए 1,000 आरपीएम पर चलाएं।
    7. 100 डिग्री सेल्सियस हॉटप्लेट पर 30 मिनट के लिए नरम बेक करें। 5 मिनट के लिए कूलिंग प्लेट पर ठंडा करें।
    8. खाली सोडा चूने के लिए दूसरी परत मास्क संलग्न करें और मानक संरेखण संकेतों के माध्यम से संरेखक का उपयोग करके दूसरे मास्क को संरेखित करें। 2,000 एमजे / सेमी 2 तक मास्क संरेखक का उपयोग करके यूवी प्रकाश के संपर्क मेंआएं।
    9. 100 डिग्री सेल्सियस हॉटप्लेट पर 5 मिनट के लिए बेक करें।
    10. SU-8 डेवलपर में >6 मिनट के लिए विकसित करें।
      नोट: यदि वेफर दूधिया दिखता है, तो विकास को लंबे समय तक जारी रखा जाना चाहिए। बेहतर परिणाम के लिए हर बार और बीच में नए डेवलपर का उपयोग करें।
    11. आइसोप्रोपेनॉल से स्प्रे करें। सुनिश्चित करें कि वेफर स्पष्ट है, जिसमें कोई दूधिया अवशेष नहीं है। नाइट्रोजन (एन 2) गैस का उपयोग करके वेफर कोअच्छी तरह से सुखाएं।
  2. माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस निर्माण
    1. एक पारदर्शी प्लास्टिक कप में 50 ग्राम पॉलीडिमिथाइलसिलोक्सेन (पीडीएमएस) बेस पार्ट डालें। फिर, प्लास्टिक कप में क्रॉसलिंकर के 5 ग्राम जोड़ें। बेस और क्रॉसलिंकर को स्पैटुला का उपयोग करके जोर से मिलाएं जब तक कि एक मलाईदार बनावट प्राप्त न हो जाए।
    2. वैक्यूम ने मिश्रण को 20 मिनट के लिए डेसिकेटर का उपयोग करके तब तक डिगैस किया जब तक कि यह स्पष्ट न हो जाए। मिश्रण को मास्टर मोल्ड पर डालें, जिसे अंदर रखा जाता है और पेट्री डिश पर टैप किया जाता है।
      नोट: सुनिश्चित करें कि डाले गए पीडीएमएस की मोटाई (ऊंचाई) ≤8 मिमी है।
    3. पेट्री डिश को डेसिकेटर में डालें और पीडीएमएस मिश्रण को फिर से 20 मिनट के लिए वैक्यूम डेगैस करें जब तक कि सभी बुलबुले हटा न जाएं। पेट्री डिश को 70 डिग्री सेल्सियस ओवन में 2 घंटे के लिए रखें जब तक कि पीडीएमएस क्रॉसलिंक न हो जाए। पेट्री डिश को ओवन से बाहर निकालें और इसे ठंडा होने दें।
    4. स्केलपेल का उपयोग करके उपकरणों को मोल्ड से बाहर काटें। मास्टर मोल्ड से उपकरणों को धीरे-धीरे अलग करें। इनलेट्स और आउटलेट के माध्यम से छेद काटने के लिए बायोप्सी पंच (1.5 मिमी व्यास) का उपयोग करें।
    5. मास्किंग टेप का उपयोग करके पीडीएमएस उपकरणों और ग्लास स्लाइड से किसी भी धूल को हटा दें, और ग्लास स्लाइड और उपकरणों को प्लाज्मा क्लीनर कक्ष में रखें। 400 मीटर से कम हवा के दबाव के साथ 45 सेकंड (जब कक्ष बैंगनी हो जाता है) के लिए प्लाज्मा उपचार करें। कक्ष से स्लाइड और उपकरणों को हटा दें, डिवाइस को ग्लास स्लाइड पर रखें, और थोड़ा दबाव लागू करें। बॉन्डिंग को बढ़ाने के लिए डिवाइस को 30 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस ओवन में रखें।
    6. चैनल की सतह फ्लोरोफिलिक को प्रस्तुत करने के लिए इंजीनियर तरल पदार्थ में उपकरणों को ट्राइक्लोरो (1एच, 1एच, 2एच, 2एच, 2एच-परफ्लोरोक्टिल) सिलेन (एफ-सिलेन, 2% वी / वी) से भरें। आउटलेट के माध्यम से एफ-सिलेन समाधान इंजेक्ट करें और सुनिश्चित करें कि सभी डिवाइस उजागर हैं। 5-10 मिनट तक प्रतीक्षा करें।
      नोट: एफ-सिलेन को ताजा तैयार किया जाना चाहिए। इसके अलावा, एफ-सिलेन को लंबे समय तक हवा के संपर्क में नहीं लाया जाना चाहिए।
    7. जलीय घोल इनलेट के माध्यम से डिवाइस से एफ-सिलेन समाधान को बाहर निकालें। इंजीनियरिंग द्रव और एस्पिरेट का उपयोग करके डिवाइस को दो बार धोएं। शेष तेल को वाष्पित करने के लिए डिवाइस को 30 मिनट के लिए 70 डिग्री सेल्सियस ओवन में रखें।
  3. ड्रॉपलेट गठन और गेलएमए माइक्रोजेल निर्माण
    1. फोटोइनिटेटर (पीआई) समाधान (0.1% डब्ल्यू / वी) तैयार करने के लिए डीपीबीएस के 10 एमएल में 10 मिलीग्राम लिथियम फिनाइल -2,4,6-ट्राइमिथाइलबेंजोइलफॉस्फिनेट (एलएपी) जोड़ें। एल्यूमीनियम पन्नी में लपेटकर घोल को प्रकाश से बचाएं।
    2. पीआई समाधान में गेलएमए की वांछित मात्रा को भंग करें और इसे 1 घंटे के लिए 37 डिग्री सेल्सियस ओवन में रखें जब तक कि एक स्पष्ट समाधान प्राप्त न हो जाए। एल्यूमीनियम पन्नी में लपेटकर घोल को प्रकाश से बचाएं।
    3. तेल चरण तैयार करने के लिए, इंजीनियरिंग द्रव में बायोकंपैटिबल सर्फेक्टेंट समाधान का 2% v / v बनाएं।
    4. पीडीएमएस डिवाइस के इनलेट्स और आउटलेट में टायगॉन ट्यूबिंग डालें। इनलेट्स के लिए टाइगॉन ट्यूबिंग के दूसरे छोर में एक 25 ग्राम कुंद सुई डालें। न्यूनतम संभव टयूबिंग लंबाई का उपयोग करें।
    5. उपकरण को माइक्रोस्कोप के नीचे रखें। हेयर ड्रायर और / या स्पेस हीटर का उपयोग करके पर्यावरण को गर्म (~ 40 डिग्री सेल्सियस) रखें।
    6. डिवाइस से जुड़े अलग-अलग सिरिंज में जलीय और तेल समाधान लोड करें। तेल (निरंतर) और जलीय (छितरी हुई) चरणों के लिए क्रमशः 160 और 80 μL / min की प्रवाह दर के साथ सिरिंज पंप शुरू करें।
      नोट: पहले तेल चरण शुरू करें; सुनिश्चित करें कि तेल चैनल को भरता है, फिर जलीय चरण शुरू करें।
    7. बूंदों को एक कंटेनर में इकट्ठा करें और ऑप्टिकल माइक्रोस्कोपी इमेजिंग के माध्यम से इमेजिंग कक्ष में उनका मूल्यांकन करें।
    8. बूंदों को रात भर 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें, जबकि उन्हें जेलएमए एचएमपी भौतिक क्रॉसलिंकिंग शुरू करने और बूंदों को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्थिर माइक्रोगेल में परिवर्तित करने के लिए प्रकाश से बचाते हैं।

3. माइक्रोइंजीनियर्ड इमल्शन-टू-पाउडर (एमटीओपी) तकनीक के माध्यम से माइक्रोगेल को पुन: निलंबित पाउडर में परिवर्तित करना

नोट: पानी में तेल इमल्शन-आधारित एचएमपी को माइक्रोपार्टिकल पाउडर (माइक्रो-एयरगेल) में बदलने के लिए एमटीओपी तकनीक विकसित की गई है, जिसमें संरक्षित गुण हैं, जैसे कि पुनर्निर्भरता, आकार, आकार और असेंबली, विकसित किया गया है।

  1. एमटीओपी को लागू करने के लिए, थर्मली टिकाऊ माइक्रोसेंट्रीफ्यूज ट्यूबों या क्रायोवियल्स का उपयोग करके इंजीनियरिंग द्रव में शारीरिक रूप से क्रॉसलिंक एचएमपी एकत्र करें। ट्यूब कैप खोलें और उन्हें प्रयोगशाला पोंछे और टेप के साथ सील करें।
  2. 10 मिनट के लिए तरल नाइट्रोजन (-196 डिग्री सेल्सियस) में भौतिक रूप से क्रॉसलिंक एचएमपी को डीप-फ्रीज करें।
  3. फ्लैश-जमे हुए ट्यूबों को फ्रीज-ड्रायर उपकरण में स्थानांतरित करें। पाउडर उत्पन्न करने के लिए कम से कम 6 घंटे के लिए कम दबाव (जैसे, 0.06 एमबार) पर ट्यूबों को लियोफिलाइज़ करें।
    नोट: जब लियोफिलाइजेशन चक्र समाप्त हो जाता है, तो दबाव को धीरे-धीरे तोड़ें ताकि पाउडर खो न जाए।
  4. माइक्रोजेल सस्पेंशन बनाने के लिए पाउडर में 1 एमएल ठंडा पीआई समाधान (0.1% डब्ल्यू / वी, 4 डिग्री सेल्सियस) जोड़ें। 5 सेकंड के लिए भंवर, फिर 15 सेकंड के लिए 3,000 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज। सतह पर तैरने वाले को त्याग दें।
  5. पैक किए गए माइक्रोजेल सस्पेंशन को सकारात्मक विस्थापन पिपेट का उपयोग करके एक मोल्ड में स्थानांतरित करें, इसके बाद जीएचएस बनाने के लिए 60 सेकंड के लिए 15 एमडब्ल्यू / सेमी2 की तीव्रता के साथ 400 एनएम तरंग दैर्ध्य पर यूवी प्रकाश एक्सपोजर।

Figure 2
चित्रा 2: एमईटॉप तकनीक के माध्यम से जेलएमए माइक्रोपार्टिकल पाउडर तैयार करना। (ए) एमटीओपी तकनीक या एचएमपी के पारंपरिक लियोफिलाइजेशन से प्राप्त गेलएमए पाउडर की छवियां। एमटीओपी तकनीक या पारंपरिक लियोफिलाइजेशन में, एचएमपी को क्रमशः तेल-सर्फेक्टेंट या जलीय मीडिया में निलंबित कर दिया जाता है। इंजीनियरिंग द्रव बिखरे हुए चरण (एचएमपी) को एकत्रीकरण से बचाता है और लियोफिलाइजेशन के दौरान जेलएमए माइक्रोपार्टिकल्स के भौतिक रासायनिक गुणों को संरक्षित करता है। (बी) एक जलीय माध्यम में पारंपरिक रूप से लियोफिलाइज्ड एचएमपी की तुलना में एमटीओपी के माध्यम से तैयार सूखे एचएमपी का योजनाबद्ध चित्रण। (सी) पारंपरिक लियोफिलाइजेशन की तुलना में एमटीओपी के माध्यम से तैयार सूखे गेलएमए माइक्रोपार्टिकल्स की एसईएम छवियां। स्केल सलाखों = 2 मिमी (बाएं; ए), 500 μm (दाएं; ए), 10 μm (बाएं; सी), और 200 μm (दाएं; इस आंकड़े को शेखी एट अल.26 संक्षेपों की अनुमति से संशोधित किया गया था: जेलएमए = जिलेटिन मेथैक्रिलोयल; डीपीबीएस = डलबेको का फॉस्फेट-बफर्ड खारा; एमटीओपी = माइक्रोइंजीनियर्ड इमल्शन-टू-पाउडर; एचएमपी = हाइड्रोगेल माइक्रोपार्टिकल; एसईएम = स्कैनिंग इलेक्ट्रॉन माइक्रोस्कोपी। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

4. गेलएमए जीएचएस गठन

नोट: यह प्रोटोकॉल माइक्रोजेल निलंबन के 400 μL तैयार करने के लिए है। बड़ी मात्रा के लिए, स्केल-अप की आवश्यकता होती है। गेलएमए एचएमपी को शारीरिक रूप से क्रॉसलिंक रखने के लिए, माइक्रोजेल कंटेनरों को बर्फ के पानी की बाल्टी में रखकर सभी चरणों को लगभग 4 डिग्री सेल्सियस पर किया जाना चाहिए।

  1. भौतिक रूप से क्रॉसलिंक किए गए गेलएमए एचएमपी में इंजीनियरिंग द्रव (20% वी / वी) में 1 एच, 1 एच-परफ्लोरो-1-ऑक्टानोल (पीएफओ) समाधान का 400 μL जोड़ें। फिर, 5 सेकंड के लिए भंवर और 300 × ग्राम पर 15 सेकंड के लिए सेंट्रीफ्यूज।
    नोट: इंजीनियरिंग द्रव में पीएफओ समाधान ताजा तैयार किया जाना चाहिए और वाष्पीकरण को रोकने के लिए एक संलग्न कंटेनर में संग्रहीत किया जाना चाहिए।
  2. पाइपिंग के माध्यम से गेलएमए एचएमपी से तेल चरण को हटा दें।
  3. माइक्रोजेल निलंबन में 4 डिग्री सेल्सियस पर पीआई समाधान (0.1% डब्ल्यू / वी) का 400 μL जोड़ें। फिर, 5 सेकंड के लिए भंवर और 300 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज 15 सेकंड के लिए। बाद में तेल को फेंक दें।
  4. पिछले चरण को दोहराएं लेकिन सेंट्रीफ्यूज 3,000 × ग्राम पर। पाइपिंग के माध्यम से पैक किए गए गेलएमए एचएमपी के सुपरनैटेंट को हटा दें।
  5. पैक किए गए गेलएमए एचएमपी को सकारात्मक विस्थापन पिपेट का उपयोग करके एक मोल्ड में स्थानांतरित करें, इसके बाद यूवी प्रकाश जोखिम (तरंग दैर्ध्य = 400 एनएम, तीव्रता = 15 एमडब्ल्यू / सेमी2, एक्सपोज़र समय = 60 एस)।

5. संरक्षित माइक्रोपोरसिटी के साथ जीएचएस के 3 डी बायोप्रिंटिंग के लिए नैनोइंजीनियर्ड दानेदार बायोइंक (एनजीबी)

  1. नैनोपार्टिकल फैलाव (3.33% डब्ल्यू / वी) बनाने के लिए 3 एमएल 4 डिग्री सेल्सियस अल्ट्राप्योर पानी में 100 मिलीग्राम नैनोप्लेटलेट पाउडर जोड़ें। भंवर अन्यथा एकत्रित नैनोकणों को एक्सफोलिएट करने के लिए 15 मिनट के लिए 4 डिग्री सेल्सियस फ्रिज के अंदर जोरदार फैलाव होता है। ठीक से एक्सफोलिएटेड नैनोकणों से स्पष्ट फैलाव होता है।
  2. स्टॉक पीआई समाधान (1% डब्ल्यू / वी) तैयार करने के लिए 5 मिलीलीटर 4 डिग्री सेल्सियस अल्ट्राप्योर पानी में 50 मिलीग्राम एलएपी घोलें।
  3. एक्सफोलिएटेड नैनोपार्टिकल फैलाव में पीआई समाधान (1% डब्ल्यू / वी) का 333 μL जोड़ें। परिवेश प्रकाश से बचाने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी में लपेटें। नैनोपार्टिकल फैलाव और पीआई को मिलाने के लिए 1 मिनट के लिए भंवर। अंतिम मिट्टी और पीआई सांद्रता क्रमशः 3% w / v और 0.1% w / v है।
  4. 1: 1 वॉल्यूम अनुपात पर भौतिक रूप से क्रॉसलिंक किए गए गेलएमए एचएमपी में इंजीनियरिंग द्रव (4 डिग्री सेल्सियस) में पीएफओ 20% वी / वी जोड़ें। 5 सेकंड के लिए भंवर अच्छी तरह से। फिर, 15 सेकंड के लिए 300 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें और सर्फेक्टेंट युक्त तेल चरण को छोड़ दें।
  5. 15 सेकंड के लिए धोए गए जेलएमए एचएमपी में एलएपी-पूरक नैनोपार्टिकल फैलाव (4 डिग्री सेल्सियस) जोड़ें, 15 सेकंड के लिए 3,000 × ग्राम पर सेंट्रीफ्यूज करें, और शेष तेल को नीचे के साथ-साथ सतह पर तैरने वाले फैलाव को छोड़ दें।
  6. 1 दिन के लिए एल्यूमीनियम पन्नी का उपयोग करके प्रकाश से बचाने के दौरान निलंबन को 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें। इस चरण का उत्पाद GelMA NGB है।
  7. एनजीबी को 3 एमएल सिरिंज में लोड करें, भरी हुई सिरिंज को कैप और पैराफिल्म के साथ सील करें, और फंसी हुई हवा को हटाने के लिए 200 × ग्राम पर पल्स सेंट्रीफ्यूज करें। मादा-मादा लुएर-लोक कनेक्टर का उपयोग करके बायोइंक को 3 एमएल कारतूस में स्थानांतरित करें। फंसी हुई हवा को हटाने के लिए कारतूस को 200 × ग्राम पर फिर से सेंट्रीफ्यूज करें। उपयोग करने से पहले एनजीबी को फ्रिज में 4 डिग्री सेल्सियस पर रखें।
  8. सेल से भरे बायोइंक तैयार करने से पहले, एक केंद्रित सेल निलंबन (जैसे, एनआईएच / 3 टी 3 मुराइन फाइब्रोब्लास्ट कोशिकाएं) तैयार करें, जिसमें सेल कल्चर माध्यम के 100 μL में ~ 24 मिलियन कोशिकाएं होती हैं। सेल सस्पेंशन को 3 एमएल सिरिंज में लोड करें, एनजीबी-लोडेड सिरिंज और सेल-लोडेड सिरिंज को महिला-महिला ल्यूर-लोक कनेक्टर का उपयोग करके जोड़ें, और कोशिकाओं और एनजीबी को 40 गुना आगे और पीछे धकेलकर धीरे से मिलाएं।
  9. मानक शंक्वाकार नलिका के साथ एक उचित बायोप्रिंटर का उपयोग करके एनजीबी या सेल से लदे एनजीबी को प्रिंट करें। नोजल को 3 एमएल प्रिंटहेड में लोड करें। प्रिंटिंग बेड का तापमान 10 डिग्री सेल्सियस से नीचे रखें। मुद्रण से पहले गति और पीठ के दबाव जैसे मुद्रण मापदंडों को अनुकूलित करें।
  10. सब्सट्रेट और नोजल प्रकार का चयन करें (मानक शंक्वाकार नोजल से लैस वायवीय 3 एमएल सिरिंज), डिवाइस दिशानिर्देशों का उपयोग करके बायोप्रिंटर को कैलिब्रेट करें, वांछनीय जीकोड या एसटीएल फ़ाइल का चयन करें, और मुद्रण शुरू करें।
    नोट: सेल से भरे बायोप्रिंटिंग करते समय, संदूषण को कम करने के लिए सभी सामग्रियों और उपकरणों को जैविक सुरक्षा कैबिनेट के तहत बनाए रखा जाना चाहिए।
  11. मुद्रण के बाद, फोटोक्रॉसलिंकिंग के लिए निर्माण को यूवी प्रकाश में उजागर करें (तरंग दैर्ध्य = 400 एनएम, तीव्रता = 15 mW / cm2, एक्सपोज़र समय = 60 s)।

Figure 3
चित्र 3: गेलएमए माइक्रोगेल और जीएचएस गठन के योजनाबद्ध। (ए) तेल और एनजीबी तैयारी से गेलएमए माइक्रोगेल पृथक्करण की योजनाबद्धता। पीएफओ (इंजीनियरिंग द्रव में 20% वी / वी) को 1: 1 वॉल्यूमेट्रिक अनुपात में गेलएमए माइक्रोगेल-ऑयल इमल्शन में जोड़ा गया था, इसके बाद 15 सेकंड के लिए 300 × ग्राम पर भंवर और सेंट्रीफ्यूजेशन किया गया था। गेलएमए जीएचएस बनाने के लिए, पीआई समाधान (डीपीबीएस में एलएपी 0.1% डब्ल्यू / वी) को गेलएमए एचएमपी में जोड़ा गया था, इसके बाद 15 सेकंड के लिए 3,000 × ग्राम पर भंवर और सेंट्रीफ्यूजेशन किया गया था। एनजीबी तैयार करने के लिए, पीआई समाधान (अल्ट्राप्योर पानी में एलएपी 0.1% डब्ल्यू / वी) और नैनोप्लेटलेट फैलाव (अल्ट्राप्योर पानी में 3% डब्ल्यू / वी) को गेलएमए एचएमपी निलंबन में जोड़ा गया था, इसके बाद 15 सेकंड के लिए 3,000 × ग्राम पर भंवर और सेंट्रीफ्यूजेशन किया गया था। चित्रा 3 बी को शेखी एट अल.15 से अनुमति के साथ संशोधित किया गया था: जेलएमए = जिलेटिन मेथैक्रिलोयल; जीएचएस = दानेदार हाइड्रोगेल मचान; एनजीबी = नैनोइंजीनियर्ड दानेदार बायोइंक; पीएफओ = 1 एच, 1 एच-परफ्लोरो-1-ऑक्टेनोल; पीआई = फोटोइनिटेटर; एलएपी = लिथियम फिनाइल -2,4,6-ट्राइमिथाइलबेंजोइलफॉस्फिनेट; एचएमपी = हाइड्रोगेल माइक्रोपार्टिकल; डीपीबीएस = डलबेको का फॉस्फेट-बफर्ड खारा। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Representative Results

गेलएमए को एमए के साथ जिलेटिन की प्रतिक्रिया के माध्यम से संश्लेषित किया गया था, जैसा कि चित्रा 1 ए में प्रस्तुत किया गया है। एमए एकाग्रता जैसी प्रतिक्रिया स्थितियों को अनुकूलित करके, एमए प्रतिस्थापन की विभिन्न डिग्री प्राप्त की गई थी। एमए प्रतिस्थापन की डिग्री को निर्धारित करने के लिए, गेलएमए का मूल्यांकन 1एच एनएमआर स्पेक्ट्रोस्कोपी (चित्रा 1 बी) के माध्यम से किया गया था। ~ 5-6 पीपीएम के रासायनिक बदलावों पर प्रतिनिधि चोटियों के साथ विनाइल कार्यात्मक समूहों ने जिलेटिन से सफल गेलएमए संश्लेषण की पुष्टि की। डायलिसिस और बाँझ निस्पंदन के बाद प्रतिक्रिया उपज >70% (जिलेटिन के मिलीग्राम जेलएमए / मिलीग्राम) थी। माइक्रोजेल निर्माण उपज ~ 100% थी। प्रतिस्थापन24 की डिग्री को निर्धारित करने के लिए विभिन्न तरीकों का उपयोग किया जा सकता है। हमने लाइसिन एमिनो एसिड (प्राथमिक अमाइन) की कमी का आकलन किया, समीकरण (1) के आधार पर अप्रभावित सुगंधित एसिड प्रोटॉन का उपयोग करके सामान्यीकृत किया।

एचएमपी आमतौर पर जलीय मीडिया, जैसे डीपीबीएस या सेल कल्चर मीडिया में निलंबित होते हैं। एचएमपी की हाइड्रेटेड स्थिति नसबंदी, शिपिंग, भंडारण और दीर्घकालिक स्थिरता में कई चुनौतियों का परिचय दे सकती है। एमटीओपी एचएमपी को उनके मूल आणविक और कोलाइडल गुणों को प्रभावित किए बिना सूखे पाउडर में परिवर्तित करने का एक नया तरीकाहै। एमटीओपी तकनीक कम दबाव फ्रीज-सुखाने के माध्यम से पुन: निलंबित, सूखे एचएमपी (माइक्रो-एयरगेल) का उत्पादन करती है, जबकि एचएमपी को एक जलीय माध्यम के बजाय वाष्पशील तेल का उपयोग करके एकत्रीकरण और गंभीर विरूपण से बचाती है (चित्रा 2 ए)। इस तकनीक का उपयोग करके, माइक्रोगेल को व्यक्तिगत रूप से एकत्रीकरण (चित्रा 2 बी) के बिना सुखाया जाता है, इस प्रकार लियोफिलाइजेशन (चित्रा 2 सी) के बाद उनके गोलाकार आकार को बनाए रखा जाता है। ये माइक्रोपार्टिकल्स पुनर्जलीकरण पर आसानी से अपने प्रारंभिक गुणों को पुनर्प्राप्त करते हैं, जिससे एचएमपी निलंबन उत्पन्न होते हैं जो असेंबली पर जीएचएस बनाने के लिए तैयार होते हैं।

स्टेप-इमल्सीफिकेशन माइक्रोफ्लुइडिक डिवाइस उच्च-थ्रूपुट मोनोस्प्रेटेड गेलएमए बूंदों का उत्पादन करते हैं, जो जलीय / तेल चरण प्रवाह दरों से स्वतंत्र होते हैं। चूंकि गेलएमए एक थर्मोसेंसिटिव बायोपॉलिमर है, इसलिए बूंदों को तापमान को ~ 4 डिग्री सेल्सियस तक कम करके थर्मली क्रॉसलिंक एचएमपी में परिवर्तित किया जाता है। स्थिर एचएमपी को पीएफओ (20% वी / वी) का उपयोग करके तेल और सर्फेक्टेंट को हटाने के लिए धोया जा सकता है। सर्फेक्टेंट हटाने के बाद, गेलएमए एचएमपी को रासायनिक असेंबली के लिए पीआई के साथ या इंटरफेशियल सेल्फ-असेंबली के लिए नैनोकणों के साथ मिलाया जा सकता है (चित्रा 3 ए)। जीएचएस गठन प्रकाश (तरंगदैर्ध्य = 400 एनएम, तीव्रता = 15 एमडब्ल्यू / सेमी2, एक्सपोज़र समय = 60 एस) -मध्यस्थता मुक्त-कट्टरपंथी पोलीमराइजेशन के माध्यम से शुरू किया जाता है, जिसके परिणामस्वरूप माइक्रोगेल-माइक्रोगेल बॉन्डिंग (चित्रा 3 बी) होता है।

माइक्रोपोरसिटी जीएचएस की प्रमुख विशेषताओं में से एक है, जो आसान ऑक्सीजन और सेलुलर अपशिष्ट विनिमय, सेल घुसपैठ, प्रवासऔर प्रसार को सक्षम करता है। माइक्रोपोरसिटी का आकलन करने के लिए, एचएमपी के बीच शून्य रिक्त स्थान की कल्पना करने के लिए एक उच्च आणविक भार फ्लोरेसेंस डाई का उपयोग किया जाता है। चित्र 4 ए जीएचएस मचानों के शीर्ष और 3 डी दृश्यों को दर्शाता है, जिसमें हरा क्षेत्र परस्पर जुड़े माइक्रोपोरसिटी दिखाता है। चित्रा 4 बी एक प्रतिदीप्ति छवि प्रस्तुत करता है, जिसका मूल्यांकन छिद्र क्षेत्र का पता लगाने के लिए कस्टम-लिखित MATLAB स्क्रिप्ट का उपयोग करके किया जाता है। शून्य अंश (चित्रा 4 सी) और औसत छिद्र समकक्ष व्यास (चित्रा 4 डी) माप जीएचएस और 3 डी मुद्रित एनजीबी मचानों के बीच कोई महत्वपूर्ण अंतर नहीं दिखाते हैं, जो एनजीबी के माइक्रोस्केल छिद्रों की उपलब्धता और इंटरकनेक्टिविटी को प्रमाणित करते हैं।

Figure 4
चित्र 4: गेलएमए जीएचएस और एनजीबी के पोर लक्षण वर्णन (ए) जीएचएस और एनजीबी मचानों के शीर्ष और 3 डी ऑर्थोग्राफिक दृश्य। (बी) फोटोक्रॉसलिंक्ड गेलएमए जीएचएस और एनजीबी के लिए कस्टम-लिखित मैटलैब कोड के माध्यम से शून्य क्षेत्र और छिद्र का पता लगाने की प्रतिदीप्ति छवि। स्केल बार = 200 μm. (C) GelMA GHS और NGB का शून्य अंश। (डी) गेलएमए जीएचएस और एनजीबी के औसत समकक्ष छिद्र व्यास। इस आंकड़े को एटी एट अल.11 से अनुमति के साथ संशोधित किया गया था: जेलएमए = जिलेटिन मेथैक्रिलोइल; जीएचएस = दानेदार हाइड्रोगेल मचान; एनजीबी = नैनोइंजीनियर्ड दानेदार बायोइंक; एनएस = गैर-महत्वपूर्ण। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

एनजीबी को संरक्षित माइक्रोपोरसिटी के साथ प्रिंट करने योग्य एचएमपी निलंबन के रूप में डिज़ाइन किया गया है। एनजीबी की एक्सट्रूडेबिलिटी और प्रिंटेबिलिटी को प्रदर्शित करने के लिए, हमने एक्सट्रूज़न-आधारित 3 डी प्रिंटिंग का प्रदर्शन किया, जैसा कि चित्रा 5 में प्रस्तुत किया गया है। पीएसयू पत्रों को एनजीबी का उपयोग करके मुद्रित किया गया था, इसके बाद प्रकाश एक्सपोजर (चित्रा 5 ए)। कसकर पैक किए गए और शिथिल रूप से पैक किए गए गेलएमए एचएमपी के लिए एनजीबी की श्रेष्ठता का आकलन करने के लिए, हैंगिंग फिलामेंट लंबाई (एलएफ) को मापा गया था (चित्रा 5 बी)। एनजीबी में पैक किए गए एचएमपी की तुलना में सबसे अधिक एलएफ था। ढीले पैक किए गए एचएमपी से फिलामेंट्स नहीं निकलते थे। इसके अतिरिक्त, एक खोखले सिलेंडर को 3 डी मुद्रित किया गया था, और पूरे निर्माण को फोटोक्रॉसलिंकिंग (चित्रा 5 डी) और शारीरिक रूप से आयोजित (चित्रा 5 ई) के लिए प्रकाश के संपर्क में लाया गया था ताकि क्रमशः फोटोक्रॉसलिंक्ड गेलएमए एनजीबी की 3 डी प्रिंटेबिलिटी और आकार निष्ठा प्रदर्शित की जा सके।

Figure 5
चित्रा 5: एनजीबी की मुद्रणक्षमता के बाद यूवी-लाइट मध्यस्थता फोटोक्रॉसलिंकिंग (तरंग दैर्ध्य = 395-405 एनएम, तीव्रता = 15 mW / cm2, एक्सपोज़र समय = 60 s)। स्केल बार = 3 मिमी (बी) एनजीबी, कसकर पैक किए गए गेलएमए एचएमपी और शिथिल रूप से पैक किए गए गेलएमए एचएमपी का उपयोग करके फिलामेंट एक्सट्रूज़न की दृश्य तुलना। स्केल बार = 10 मिमी (सी) एनजीबी की हैंगिंग फिलामेंट लंबाई, कसकर पैक, और शिथिल रूप से पैक किए गए दानेदार हाइड्रोगेल। एनजीबी कसकर पैक किए गए माइक्रोगेल (एलएफ = 19.3 ± 0.7 मिमी, एन = 10) की तुलना में लंबे समय तक लटकने वाले फिलामेंट्स (फिलामेंट लंबाई एलएफ = 45.0 ± 5.0 मिमी, एन = 10) बनाता है। शिथिल रूप से पैक किए गए माइक्रोगेल बूंद-आकार (एलएफ = 5.7 ± 0.7 मिमी, एन = 10) फिलामेंट्स उत्पन्न करते हैं। (D) NGB का उपयोग 5 मिमी व्यास और 10 मिमी की ऊंचाई वाले खोखले सिलेंडरों के 3D मुद्रण के लिए किया गया था। (E) पूरा निर्माण (d = 5 और h = 10 मिमी के साथ खोखला सिलेंडर) मुद्रित किया गया था, फिर यूवी प्रकाश के संपर्क में आया। परत-दर-परत फोटोक्रॉसलिंकिंग आकार निष्ठा को बढ़ा सकती है लेकिन संरचनात्मक अखंडता को कम करती है क्योंकि परतें एक साथ क्रॉसलिंक नहीं होती हैं। खोखले मुद्रित सिलेंडर को चिमटी का उपयोग करके रखा गया था, जो यांत्रिक मजबूती दिखाता था। स्केल बार = 1 सेमी। इस आंकड़े को एटी एट अल.11 संक्षेप से संशोधित किया गया था: एनजीबी = नैनोइंजीनियर्ड दानेदार बायोइंक; जेलएमए = जिलेटिन मेथाक्रिलोयल; एचएमपी = हाइड्रोगेल माइक्रोपार्टिकल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

जिलेटिन और इसके डेरिवेटिव एचएमपी निर्माण के लिए सबसे अधिक इस्तेमाल किए जाने वाले प्रोटीन-आधारित बायोमैटेरियल्स हैं। थ्रूपुट बनाम कण आकार मोनोस्प्रिसिटी ट्रेड-ऑफ की चुनौती को स्टेप-इमल्सीफिकेशन माइक्रोफ्लुइडिक उपकरणों का उपयोग करके दूर किया जा सकता है। ये उपकरण प्रति घंटे 40 मिलियन से अधिक बूंदें बनाने में सक्षम हैं, जिसमें भिन्नता का गुणांक 5% 27 से कम है। इस लेख में, हमने गेलएमए समाधान युक्त बूंदों के माइक्रोफैब्रिकेशन पर चर्चा की, इसके बाद उन्हें गेलएमए एचएमपी, पाउडर, जीएचएस और एनजीबी में परिवर्तित किया।

गेलएमए की थर्मोरेस्पोंसिविटी आसान माइक्रोफ्लुइडिक-सक्षम एचएमपी निर्माण और स्थिरीकरण को सक्षम बनाती है। यूसीएसटी (जैसे, 37 डिग्री सेल्सियस) से अधिक तापमान पर, गेलएमए एक जलीय घोल में घुल जाता है, जिससे स्टेप-इमल्सीफिकेशन उपकरणों में पानी-इन-ऑयल इमल्शन गठन के लिए एक उपयुक्त जलीय तरल पदार्थ उत्पन्न होता है। घटता तापमान (जैसे, 4 डिग्री सेल्सियस) बूंद गठन के बाद भौतिक क्रॉसलिंकिंग के माध्यम से गेलएमए एचएमपी गठन को सक्षम बनाता है। गेलएमए एचएमपी का उपयोग विभिन्न दृष्टिकोणों के माध्यम से जीएचएस निर्माण के लिए बिल्डिंग ब्लॉक के रूप में किया जा सकता है। थर्मल रूप से स्थिर एचएमपी को यांत्रिक रूप से मजबूत जीएचएस बनाने के लिए जोड़ा जा सकता है, जो दानेदार मचानों के बीच उच्चतम रिपोर्ट किए गए संपीड़न मोडुलिन में से एक प्राप्त करता है, जिसमें इंटरपेनिट्रेटिंग परकोलेशन नेटवर्क28 शामिल नहीं है। फोटोअसेंबली विधि में, सभी प्रक्रियाओं को कम तापमान (जैसे, 4 डिग्री सेल्सियस) पर किया जाना चाहिए ताकि गेलएमए एचएमपी पिघलने से बचा जा सके।

एचएमपी की 3 डी (जैव) प्रिंटिंग ज्यामितीय रूप से अच्छी तरह से परिभाषित जीएचएस के निर्माण को सक्षम बनाती है; हालांकि, यह कसकर पैक किए गए एचएमपी का उपयोग करके किया गया है, जो एडिटिव रूप से निर्मित दानेदार संरचनाओं की माइक्रोपोरसिटी से समझौता करता है। इस चुनौती का समाधान करने के लिए, हम दिखाते हैं कि एचएमपी सतहों पर अधिशोषित विषम रूप से चार्ज नैनोकणों की प्रतिवर्ती स्व-असेंबली संरक्षित माइक्रोपोरसिटी के साथ शिथिल रूप से पैक किए गए एचएमपी कतरनी-उपज और 3 डी प्रिंट करने योग्य (एनजीबी) कैसे प्रस्तुत करती है।

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Disclosures

लेखक ों ने हितों के टकराव की घोषणा नहीं की है।

Acknowledgments

लेखक पेंसिल्वेनिया स्टेट यूनिवर्सिटी (पेन स्टेट) के केमिकल इंजीनियरिंग विभाग में अनुसंधान सहायता विशेषज्ञ टी पोंड, पेन स्टेट में नैनोफैब्रिकेशन लैब स्टाफ और पार्टिलियन बायोसाइंस के डॉ जे डी रूटे को नैनोफैब्रिकेशन प्रक्रियाओं के बारे में मदद और चर्चा के लिए धन्यवाद देना चाहते हैं। शेखी मानव स्तर के बीज अनुदान पर सामग्री अनुसंधान संस्थान (एमआरआई) और इंजीनियरिंग सामग्री मैटर कॉलेज, लिविंग मल्टीफंक्शनल मैटेरियल सिस्टम्स (एलआईएमसी2) के अभिसरण केंद्र और उत्कृष्टता लिविंग, अनुकूली और ऊर्जा-स्वायत्त सामग्री प्रणालियों के क्लस्टर (लिवमैट्स) लिविंग मल्टीफंक्शनल सामग्री सहयोगी अनुसंधान बीज अनुदान कार्यक्रम और पेन स्टेट से स्टार्टअप फंड के समर्थन को स्वीकार करते हैं। इस प्रकाशन में रिपोर्ट किए गए शोध को पुरस्कार संख्या आर 56ईबी032672 के तहत राष्ट्रीय स्वास्थ्य संस्थान (एनआईएच) के नेशनल इंस्टीट्यूट ऑफ बायोमेडिकल इमेजिंग एंड बायोइंजीनियरिंग (एनआईबीआईबी) द्वारा आंशिक रूप से समर्थित किया गया था।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1H,1H-perfluoro-1-octanol Alfa Aesar, MA, USA B20156-18 98% purity
Biopsy punch Integra Miltex, NY, USA 33-31A-P/25 1.5 mm Biopsy Punch with Plunger System
Blunt needle SANANTS 30-002-25 25 G
Bruker Avance NEO 400 MHz 400 MHz Bruker NEO, MA, USA NMR device
Centrifuge Eppendorf, Germany 5415 C
Centrifuge tube Celltreat, MA ,USA 229423
Coffee filters BUNN, IL, USA 20104.0006 BUNN 8-12 Cup Coffee Filters, 6 each, 100 ct
Desiccator Thermo Scientific 5311-0250 Nalgene Vacuum Desiccator, PC Cover and Body, 280 mm OD
Deuterium oxide Sigma, MA, USA 151882
Dialysis membrane (12-14 kDa) Spectrum Laboratories, NJ, USA 08-667E
Dulbecco's phosphate buffered saline (DPBS, 1x) Sigma, MA, USA 56064C-10L dry powder, without calcium, without magnesium, suitable for cell culture
Erlenmeyer flask Corning, NY, USA 4980 Corning PYREX 
Ethanol VWR, PA, USA 89125-188 Koptec 200 proof
External thread cryogenic vials (cryovials) Corning, NY, USA 430659
Freeze dryer Labconco, MO, USA 71042000 Equipped with vacuum pump (Catalog# 7587000)
Gelatin powder Sigma, MA, USA G1890-5100G Type A from porcine skin, gel strength ~300 g Bloom
Glass microscope slides VWR, PA, USA 82027-788
Hotplate FOUR E'S SCIENTIFIC MI0102003 5 inch Magnetic Hotplate Stirrer Max Temp 280 °C/536 °F 
Kimwipes Fischer scientific, MA, USA 06-666
KMPR 1000 negative photoresist series Kayaku Advanced Materials, MA, USA 121619 KMPR1025 and KMP1035 are included
LAPONITE XLG BYK USA Inc., CT, USA 2344265
Lithium phenyl-2,4,6-trimethylbenzoylphosphinate (LAP) Sigma, MA, USA 900889-1G >95%
Luer-Lok connector BD, NJ, USA BD 302995 
MA/BA Gen4-Serie Mask- und Bond-Aligner SÜSS MicroTeck, German Nanofabrication device
Methacylate anhydride Sigma, MA, USA 276685-100ML contains 2,000 ppm topanol A as inhibitor, 94%
Milli-Q water Millipore Corporation, MA, USA ZRQSVR5WW electrical resistivity ≈ 18 MΩ at 25 °C, Direct-Q 5 UV Remote Water Purification System
Novec 7500 engineering fluid 3M, MN, USA 3M ID 7100003723
Oven VWR, PA, USA VWR-1410 1410 Vacuum Oven
Parafilm Fischer scientific, MA, USA HS234526C
Pasteur pipette VWR, PA, USA 14673-010
Petri dish VWR, PA, USA 25384-092 polystyrene
Pico-Surf Sphere Fluidics, UK C022 (5% (w/w) in Novec 7500)
Pipette VWR, PA, USA 89079-970
Pipette tips VWR, PA, USA 87006-060
Plasma cleaner chamber Harrick Plasma, NY, USA PDC-001-HP 
Polydimethylsiloxane Dow Corning, MI, USA  2065623 SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit
Positive displacement pipette Microman E M100E, Gilson, OH, USA M100E
Silicon wafers UniversityWafer, MA, USA 452/1196 4-inch mechanical grade
Spatula VWR, PA, USA 231-0104 Disposable
SU-8  Kayaku Advanced Materials, MA, USA
Syringe pump Harvard Apparatus, MA, USA 70-2001 PHD 2000
Trichloro(1H,1H,2H,2H-perfluorooctyl)silane Millipore Sigma, MA, USA 448931-10G 97%
Tygon tubings Saint-globain, PA, USA AAD04103 
UV light  QUANS Voltage: 85 V-265 V AC / Power: 20 W
Vacuum filtration unit VWR, PA, USA 10040-460 0.20 µm
Vortex Fischer scientific, USA 14-955-151 Mini Vortex Mixer

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References

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Ataie, Z., Jaberi, A., Kheirabadi, S., Risbud, A., Sheikhi, A. Gelatin Methacryloyl Granular Hydrogel Scaffolds: High-throughput Microgel Fabrication, Lyophilization, Chemical Assembly, and 3D Bioprinting. J. Vis. Exp. (190), e64829, doi:10.3791/64829 (2022).

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