Summary
目前用于分析极化单细胞细胞内动力学的方法通常是手动的，缺乏标准化。本文介绍了一种新颖的图像分析管道，用于在用户友好的在线界面中自动提取单偏振细胞的中线，并量化时间流逝的时空行为。
Abstract
细胞极性是一种宏观现象，由空间集中的分子和结构的集合建立，最终导致亚细胞水平上出现专门的结构域。它与发育不对称的形态结构有关，这些结构是细胞分裂、生长和迁移等关键生物学功能的基础。此外，细胞极性的破坏与组织相关疾病有关，如癌症和胃发育不良。
目前评估单个偏振细胞中荧光报告基因时空动力学的方法通常涉及沿着细胞长轴追踪中线的手动步骤，这既耗时又容易产生强烈的偏差。此外，尽管比率分析可以使用两个荧光通道校正报告分子的不均匀分布，但背景减法技术通常是任意的，缺乏统计学支持。
本文介绍了一种新的计算管道，使用细胞极性模型（花粉管/根毛生长和胞质离子动力学）来自动化和量化单个细胞的时空行为。开发了一种三步算法来处理比率图像并提取细胞内动力学和生长的定量表示。第一步将细胞从背景中分割出来，通过像素强度空间中的阈值技术生成二进制掩码。第二步通过骨架化操作追踪穿过细胞中线的路径。最后，第三步将处理后的数据作为比率延时提供，并生成比率测距仪（即随时间变化的一维空间剖面图）。使用来自生长花粉管的遗传编码荧光报告基因获取的比率图像的数据用于对该方法进行基准测试。该管道可以更快、更少、更准确地表示沿极化细胞中线的时空动力学，从而推进可用于研究细胞极性的定量工具包。AMEBaS Python 源代码可在以下网址获得： https://github.com/badain/amebas.git
Introduction
细胞极性是一个基本的生物学过程，在这个过程中，一系列空间集中的分子和结构的协同作用最终导致了专门的形态亚细胞结构域的建立1。细胞分裂、生长和迁移依赖于这种极性位点，而其丢失与上皮组织相关疾病中的癌症有关2。
顶端生长的细胞是极性的一个戏剧性例子，其中尖端的极性位点通常重新定向到细胞外线索3。这些包括发育中的神经突、真菌菌丝、根毛和花粉管，其中多个细胞过程显示出从细胞尖端到小腿的明显差异。特别是在花粉管中，肌动蛋白聚合、囊泡运输和离子浓度明显极化，显示出以尖端为中心的梯度4。花粉管是开花植物的雄配子体，负责将精子细胞输送到胚珠，以单个细胞已知的最快生长速度之一仅在细胞的顶端生长。钙5 （Ca2+） 和质子 6 （H+） 等离子的尖端聚焦梯度在维持花粉管生长中起着重要作用，这对于实现其主要生物学功能至关重要，最终导致双重受精 5,6。因此，分析顶端生长细胞中线时空动力学的定量方法对于研究极化生长的细胞和分子机制至关重要7,8,9。研究人员经常使用kymographs，即表示细胞中线（例如，列）随时间（例如，行）的像素强度的矩阵，这允许可视化细胞在对角线上的生长和迁移（图1）。尽管它们很有用，但 kymograph 经常通过手动跟踪中线来提取，容易出现偏差和人为错误，同时也相当费力。这需要一种自动化的中线提取方法，这是本文介绍的名为AMEBaS的管道的第一个特征：偏振单细胞的比率荧光延时的utomatic Midline Extraction和Background S牵引。
在实验程序方面，单细胞中感兴趣的离子/分子/物种的定量成像可以通过基因编码的荧光探针10实现。在不断扩大的选择中，比率探针是最准确的探针之一，因为它们在与目标分子结合/未结合时会发出不同的荧光波长11。这允许通过使用两个通道的比率来校正探针细胞内浓度的空间异质性，并减去它们的通道特定背景。然而，估计每个通道和时间点的背景阈值可能是一项复杂的任务，因为它经常在空间上因阴影等效应而变化，其中图像的角落相对于中心有光度变化，并且由于荧光团的褪色（光漂白）而在时间上变化12。尽管有多种可能的方法，但本文建议使用使用 Isodata 算法13 获得的分割阈值自动确定背景强度，然后通过多项式回归作为标准在帧之间进行平滑处理。然而，该方法忽略了与12中去除的靶细胞无关的荧光异质性产生的空间成分。自动阈值可以通过多种方法执行，但 Isodata 算法在经验上产生了最佳结果。因此，自动背景值减法和比率计算是 AMEBaS 的第二个主要功能（图 1），它一起接收一堆双通道荧光显微镜图像作为输入，估计细胞的中线和通道特定背景，并在背景减去、平滑和异常值去除后输出两个通道及其比率的 kymograph（主输出 #1）， 以及一堆比例图像（主输出 #2）。
使用在显微镜下获得的生长拟南芥花粉管的荧光延时测试AMEBaS，使用在花粉特异性LAT52启动子下表达的Ca2+ （CaMeleon）8 或pH（pHluorin）6 比率传感器。每 4 秒拍摄一次来自每个通道的图像，耦合到倒置显微镜、前照式相机（2560 像素× 2160 像素，像素大小 6.45 μm）、荧光照明器和水浸物镜 63x，1.2NA。用于CaMeleon的滤光片设置为：激发波长426-450 nm（CFP）和505-515 nm（YFP），发射波长458-487 nm（CFP）和520-550 nm（YFP），而pHluorin的激发波长为318-390 nm（DAPI）和428-475 nm（FITC），发射波长为435-448 nm（DAPI）和523-536 nm（FITC）。添加了一个完整的数据集，用于在 Zenodo （DOI： 10.5281/zenodo.7975350）14 进行测试。
此外，使用根毛数据测试了管道，其中使用光片显微镜 （SPIM） 进行成像，如前所述 15,16 在 UBQ10 启动子的控制下，拟南芥根毛表达遗传编码的 Ca2+ 报告基因 NES-YC3.617。自制的LabView软件控制了光片显微镜的相机采集、样品平移和快门，可以观察两个cpVenus和CFP通道，还可以实时显示它们的比率。延时摄影的每个比率图像都代表了从间隔 3 μm 的 15 个样品切片中获得的 cpVenus 和 CFP 荧光通道图像之间的最大强度投影 （MIP）。MIPs的延时cpVenus/CFP比值被保存下来，并直接用于AMEBaS分析。
尽管该管道可以处理多种类型的生长和迁移细胞，但它专门设计用于分析仅在尖端生长的生长细胞，例如花粉管、根毛和真菌菌丝，其中框架之间存在非生长细胞质区域的对应关系。当不存在此类对应关系时，用户应在步骤 1.3.1.1 中选择 “complete_skeletonization ”选项（有关详细信息，请参阅“讨论”部分）。
图 1：管道工作流概述。 AMEBaS 流程通过三个主要步骤分析和处理微观时间流逝：单细胞分割、中线追踪和 Kymograph 生成。 请点击这里查看此图的较大版本.
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Protocol
1. 交互式笔记本协议
Jupyter 笔记本可以在 https://colab.research.google.com/github/badain/amebas/blob/main/AMEBAS_Colab.ipynb 上使用 Google Colab 直接在 Web 上使用，以下说明基于该说明。或者，Jupyter 笔记本可在 https://github.com/badain/amebas 获得，可以在其中下载并配置为在 Jupyter 中本地运行（Anaconda 可以提供简单的跨平台安装过程）。完整的测试数据可以在Zenodo（https://doi.org/10.5281/zenodo.7975350）找到，其中包含表达pH或Ca2+ 报告基因的拟南芥花粉管的单通道和双通道数据14。管道已分为多个部分，在设置用户特定选项后，可以通过单击播放按钮来执行每个步骤。本研究所需的文件可在 AMEBaS- 主 zip 文件夹（补充编码文件 1）中找到。
- 打开 Jupyter 笔记本并读取延时摄影文件。
- 导航到上面提到的 Google Colab 中交互式笔记本的主页，或从 GitHub 下载并打开 AMEBaS_Local.ipynb 笔记本。
- 为输入和输出数据准备目录设置：
- 如果使用本地版本，请将荧光延时摄影作为 TIFF 文件或 DV 文件放在名为 data 的文件夹中，该文件夹必须位于程序的根文件夹中。必须创建一个名为 out 的文件夹才能接收生成的数据。然后运行安装程序代码块。
- 如果在 Google Colab 上使用笔记本，请运行 设置 代码块以自动生成 数据 和 输出 文件夹。
- 运行 文件输入 代码块，通过单击 播放 按钮读取延时摄影数据。如果使用 Google Colab 版本的笔记本，请单击 “选择文件”按钮将延时文件直接上传到 数据 文件夹。
注意： 通道数将根据图像的尺寸自动检测。 - 通过将“verbose”参数设置为 True 或 False，选择是否生成每个步骤的其他输出。
- 从背景中检测主细胞和片段（图2）。
- 运行 单细胞分割 代码块，通过单击 播放 按钮自动将感兴趣的细胞与背景分离。
注意：中值滤波器和高斯滤波器将作为预处理步骤应用，以去除不需要的噪声，然后通过等值数据阈值将前景与背景分割出来，并隔离最大区域的区域以去除不需要的伪影。- 调整高斯在“sigma”变量中使用的 sigma 值，以微调分割掩码的平滑度。默认值为 2.0。
- 将变量 估计 值设置为 False 以直接存储从 Isodata 估计的阈值，或设置为 True 以使用局部多项式回归 （LOESS） 在相邻帧中平滑该阈值。通过更改 n_points 变量来微调其功能。默认值为 40。
- 运行 单细胞分割 代码块，通过单击 播放 按钮自动将感兴趣的细胞与背景分离。
- 沿着细胞延伸追踪中线（图3）。
- 通过单击播放按钮运行 Cell Midline Tracing 代码块，以使用 Lee 的方法18 自动骨架化单元格，并通过线性外推延长最后一个骨架的尖端。
- 通过调整 complete_skeletonization 参数，选择仅在最后一帧上跟踪中线或每帧跟踪一次中线。
注意：当所有帧都骨架化时，将跳过外推。 - 通过调整 interpolation_fraction 变量，设置在外推期间要插值的骨架中点的分数。默认值为 0.25。
- 通过更改变量 extrapolation_length 来选择中线外推的长度。默认值为 -1，它将骨架向上延伸到最近的边。
- 通过调整 complete_skeletonization 参数，选择仅在最后一帧上跟踪中线或每帧跟踪一次中线。
- 通过单击播放按钮运行 Cell Midline Tracing 代码块，以使用 Lee 的方法18 自动骨架化单元格，并通过线性外推延长最后一个骨架的尖端。
- 为每个通道生成kymographs（ 图4）。
- 通过单击播放按钮运行第一个数据可视化代码块，以自动生成两个通道的 kymographs。
- 通过调整变量 kymograph_kernel来选择用于平滑的高斯核的大小。
注意：它对应于像素强度平均的邻域大小（以像素为单位）。默认值为 3 像素 x 3 像素。 - 非扩展骨架会生成有盖的 Kymographs，这些 Kymograph 必须使用自定义颜色图才能正确显示其强度。选择将分配给背景颜色（黑色）的强度的分数百分比，调整 shift_fraction 变量。默认值为 0.7。
- 通过调整变量 kymograph_kernel来选择用于平滑的高斯核的大小。
- 通过单击播放按钮运行第一个数据可视化代码块，以自动生成两个通道的 kymographs。
- 计算通道之间的比率（图5）。
- 通过单击播放按钮运行第二个数据可视化代码块，以自动生成比率式 kymograph 和比率式延时摄影（图 6）。
注意：此步骤仅在使用双通道延时摄影时可用。从每个通道中减去步骤 1.2.1.2 中存储的背景强度阈值。- 调整 switch_ratio 变量以切换比率计算期间用作分子和分母的通道顺序。默认值为 False。
- 选择是否必须通过调整 smooth_ratio 变量来使用中值滤波器通道进一步平滑比率延时摄影。默认值为 False。
- 选择是否通过操纵 reject_outliers 变量来消除由分母通道的低信号产生的异常值。默认值为 True ，并将异常值定义为高于第三个四分位数（其中 75% 的值位于其中）的四分位数范围的 1.5 倍的值。
- 通过调整变量 background_ratio来选择是否必须导出比率输出中的背景。默认值为 False，将其替换为零。
- 通过单击播放按钮运行第二个数据可视化代码块，以自动生成比率式 kymograph 和比率式延时摄影（图 6）。
图 2：单细胞分割步骤。 滤波、阈值和区域标记等图像处理技术用于隔离感兴趣的信号（步骤1.2）。此特定数据具有以下值：最低强度：2556，中位数：3441，最高强度：32125。 请点击这里查看此图的较大版本.
图 3：中线跟踪概述 - 通过计算其骨架（白色）获得单个细胞的中线。尖端（洋红色）从骨架末端的最后一个点线性外推（步骤 1.3）。在这种组合物中，中线及其尖端都叠加在原始细胞上。请点击这里查看此图的较大版本.
图 4：Timelapse 的 kymographs- 在关闭“complete_skeletonization”的情况下生成的每个通道的 kymograph 的比较（步骤 1.4）。纵轴描述时间的进展，横轴绘制外推中线路径的平均强度，然后是单个单元格。对于此特定数据，颜色图表示通道 1 最低强度：2886、中位数：3167、最高强度：21021 的以下值。通道 2 最低强度：3030，中位数：3400，最高强度：29688。请点击这里查看此图的较大版本.
图 5：背景阈值平滑 - 背景分割阈值通过等值数据算法估计，然后通过局部多项式回归进行平滑处理（步骤 1.5）。请点击这里查看此图的较大版本.
图 6：比例结果 - （A） 比例延时摄影的最后一帧与分段的原始第一通道之间的比较。（B） 由比率式延时摄影生成的 Kymograph（步骤 1.5）。 请点击这里查看此图的较大版本.
2. 批处理模式协议
- 从 AMEBaS GitHub 存储库下载文件 pipeline.py 并将其放置在与数据相同的目录中。
- 在命令行中，在程序文件后面键入文件位置。
- 如果需要，将 --v 作为位置参数包括在内，以显示管道的内部步骤。
- 在准备细胞分割时，在高斯滤波器预处理步骤中使用的 sigma 值中包括 --s 以选择。默认值为 2。
- 包括 - -a 以跟踪延时摄影的每一帧的中线。默认情况下，管道仅使用最后一帧。
- 包括 --f 以选择要在插值中使用的骨架的分数 [0,1]。默认值为 0.25。
- 包括 -e 以选择外推骨架的长度（以像素为单位）。默认值为 -1，它将骨架向上延伸到最近的边。
- 包括 - -sf 以选择在非外推 kymograph 中将移到背景的颜色范围的分数。默认值为 0.7。
- 包括 - -k 以确定 kymograph Gaussian 滤波中使用的内核的大小。默认值为 3。
- 包括 - -eb 以通过特定帧背景阈值强度的 LOESS 多项式回归来估计全局背景阈值强度。
- 通过修改参数 - -n，自定义背景阈值的黄土平滑中使用的点数。默认值为 40。
- 在比率计算期间切换用作分子和分母的通道，包括 -r 或 --switch_ratio（如果延时摄影有两个通道）。默认情况下，第二个通道是分子，第一个通道是分母。
- 选择是否必须使用带有 - -sm 参数的中值滤波器传递进一步平滑比率延时摄影。默认值为 False。
- 包括 -o 以在比例延时生成期间拒绝具有异常强度的像素。
- 选择是否必须使用参数 --b 导出比率输出中的背景。默认值为 False，将其替换为零。
- 按 回车键 运行。输出将在与程序文件相同的目录中生成。
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Representative Results
AMEBaS 流程可自动从荧光显微镜图像堆栈中提取偏振单细胞的中线动态，从而减少耗时且不易出现人为错误。该方法通过在生长的单细胞中生成kymographs和比率图像堆栈（图1）来量化这些时间流逝。它可以调整为用于迁移单个细胞，但还需要进一步的实验。AMEBaS 在 Python 中作为交互式 Jupyter Notebook（在 交互式 Notebook 协议部分中描述）实现，无需编程经验即可更轻松地使用，并作为命令行工具（在 批处理模式协议部分中），其中可以使用相同的参数集分析多个堆栈。虽然可以使用一个或两个荧光通道，但具有两个发射通道的比率探针应该产生更可靠的结果，因为探针未结合状态的荧光发射可以减轻由蛋白质在细胞质中分布不均匀引起的空间异质性。
流水线首先生成最强通道上最大单元的二进制掩码，导出为名为 Filename_binary_mask.tiff 的 tif 文件（图 2）。每个通道的等值数据获得的阈值估计值可选择用黄土平滑并保存在表Filename_background_treshold.csv中（图5）。从二进制掩码中提取的单元格中线导出为名为 Filename_skeletonized.tiff 的 tif 文件（图 3）。每个通道的Kymographs从中线产生，命名为Filename_kymograph_c_*.csv，其中*对应于通道号（图4）。最后，将比率测距仪保存为Filename_kymograph_ratio.csv，而完整的比率测距堆栈命名为Filename_ratiometric.tiff（图 6）。当用户在第一个代码块中指定了“verbose == True”或“--v”时，可以选择将图2、图3、图4、图5和图6对应的图保存为PNG文件（步骤1.1）。
这些结果可以与其他图像分析管道耦合，以进一步研究细胞的时空动力学，例如CHUKNORRIS8，它以每个通道的kymographs为输入，并结合各种时间序列分析方法进行亚像素分辨率的增长率分析。
AMEBaS 在花粉管数据集上进行了测试，这些数据集具有细胞内 Ca2+ （CaMeleon;图 7A，B） 和 H+ （pHluorin;图7C，D）在光学荧光显微镜上获得的浓度，以及在光片显微镜上获得的表达CaMeleon NES-YC3.6的生长根毛的cpVenus / CFP比率的最大强度投影（图7E，F），如前所述15,16。尽管在生长方向、成像技术、荧光报告基因和细胞类型方面存在差异，但该管线仍成功运行。显示了这些数据集的分割、中线追踪和kymograph提取（图7），展示了将AMEBaS应用于各种实验设置的潜力。
图 7：尖端生长细胞的不同荧光图像数据集的代表性结果。（甲，乙）表达 Ca2+ 报告基因 CaMeleon 的花粉管;（C，D）表达pH指示剂pHluorin的花粉管;（英，女）表达 Ca2+ 报告基因 NES-YC3.6 的根毛。请点击这里查看此图的较大版本.
补充编码文件1：AMEBaS-main.zip。请点击这里下载此文件。
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Discussion
这里介绍的新方法是一种有效的工具，可以简化和自动化偏振细胞的荧光显微镜图像堆栈的分析。文献中描述的当前方法，例如 ImageJ Kymograph 插件，需要手动跟踪目标偏振细胞的中线，这项任务不仅耗时，而且容易出现人为错误。由于该管道中中线的定义由执行骨架化的数值方法18,19 支持，因此消除了主观评估，从而为该过程引入了定量标准。这对于拥有大量数据的研究人员特别有用，可以根据不同的需求定制管道，包括提取每一帧的中线。此外，背景值减法通常是任意的，为给定通道的所有帧手动选择单个背景值。在这里，等值数据分割用于客观地确定每一帧的背景阈值，并（可选）使用局部多项式回归对其进行平滑处理，以捕获由褪色（光漂白）引起的荧光的长期变化。虽然通过按像素面积选择较大的对象，在背景中可以忽略可能的伪影和次要元素，但可以使用其他方法（如 FRET-IBRA12）来消除阴影等效果。空间伪影（如阴影）会影响通过阈值分割的细胞的形状，这可能解释了在AMEBaS徽标上的比率视频中看到的梯度偏向管的一侧（参见GitHub页面或Colab笔记本）。
尽管如此，仍有少数情况下，所提出的管道可能会失败，不应被视为灵丹妙药的解决方案。在图像捕获过程中必须特别注意，因为较大的干扰会损害算法分割目标细胞的能力。应考虑对图像堆栈进行预处理以获得最佳结果，删除不需要的元素和整体错误帧。
选择参数的目的是分析单个顶端生长的细胞，考虑拟南芥花粉管的有限数据集，用荧光报告基因测定离子浓度。因此，其他数据可能需要合理地选择参数。预处理滤波器对数据进行平滑处理，目的是在分割后生成干净的二进制掩码（步骤 1.2），因此用于高斯滤波器和中值滤波器的 sigma 值可以增加噪点较大的数据，或者如果结果过于平滑，则可以降低。假设在最强通道中获得的二进制掩码的位置与最弱通道相同，如果两个通道中的单元位置不同，则可能是一个问题。如果是这种情况，则必须为每个通道使用不同的掩模，或者必须执行图像配准，如FRET-IBRA12中所做的那样。
默认情况下，骨架化仅在最后一帧（步骤 1.3）中完成，它假设尖端生长的细胞随着时间的推移保持其细胞质的位置（顶点除外）。通过扩展骨架，可以使用CHUKNORRIS8等方法生成Kymographs，即使在亚像素分辨率下也能分析增长率。这种扩展是通过线性外推来完成的，考虑到骨架生长尖端的前 25% 点（步骤 1.3），并且可以通过将 interpolation_fraction 从整个骨架的 0% 调整到 100% 点来调整。但是，如果细胞在帧之间的位置漂移或是迁移细胞，则生长速率分析将变得更加复杂。在这种情况下，可以通过选择参数 complete_skeletonization=TRUE 为每一帧生成独立的骨架，这将产生没有细胞外延伸的骨架。仍然可以分析增长率，但分辨率将受到使用等值数据阈值生成的二进制掩码的限制。此外，得到的kymograph假设连续的骨骼可以按其默认坐标对齐，如果不是真的，则不适合分析细胞内动力学。
在生成kymographs（步骤1.4）时，AMEBaS使用高斯核的平均值，而不是使用中线周围的传统像素边距。3x3 的默认值是可能的最小大小，如果数据太嘈杂和/或单元格很大，则可能会增加该值。但是，此步骤可能会导致过度平滑，在这种情况下，应通过设置 kymograph_kernel = 0 来完全关闭过滤器。最后，当用户期望褪色（光漂白）或使用原始估计值（步骤 1.5）时，可以平滑每个通道每帧估计的背景。使用LOESS多项式回归（步骤1.5）对背景值进行平滑处理可以通过将窗口 n_points 中使用的点数设置为最小值3和堆栈中的最大帧数（自动封顶）来调整。描述背景随时间变化的更简单的函数可以通过更大的窗口获得，从而产生更粗糙的拟合。
由于这种方法整合了通常由研究人员进行的多个手动步骤，因此 AMEBaS 管道是一种更高效、无偏和精确的方法工具，用于分析单极化细胞延时的时空行为。未来，该方法有可能扩展到支持迁移单细胞的分析。此外，有必要进一步分析以评估该方法在更广泛的细胞类型中的性能。
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Disclosures
本手稿的作者声明不存在相互竞争的经济利益或其他利益冲突。
Acknowledgments
作者感谢 FAPESP 资助 2015/22308-2、2019/23343-7、2019/26129-6、2020/06744-5、2021/05363-0、CNPq、NIH R01 资助GM131043和 NSF 资助MCB1714993、MCB1930165的财政支持。根毛数据是在 Andrea Bassi 教授和 Alex Costa 教授的监督下通过基础设施制作的。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Github | Github | https://github.com/badain/amebas | |
| Google Colab | https://colab.research.google.com/github/badain/amebas/blob/main/AMEBAS_Colab.ipynb |
References
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