Summary
Het huidige protocol beschrijft de zuiveringsstappen en daaropvolgende studies van vier verschillende schimmel-β-glucanen als potentiële immunomodulerende moleculen die de anti-tumorale eigenschappen van microglia tegen glioblastoomcellen verbeteren.
Abstract
Een van de grootste uitdagingen bij het ontwikkelen van effectieve therapieën tegen glioblastoom is het overwinnen van de sterke immuunsuppressie in de micro-omgeving van de tumor. Immunotherapie is naar voren gekomen als een effectieve strategie om de reactie van het immuunsysteem tegen tumorcellen te keren. Glioom-geassocieerde macrofagen en microglia (GAMs) zijn belangrijke aanjagers van dergelijke ontstekingsremmende scenario's. Daarom kan het verbeteren van de antikankerrespons bij GAM's een potentiële co-adjuvante therapie zijn om glioblastoompatiënten te behandelen. In die geest staan schimmel- β-glucaanmoleculen al lang bekend als krachtige immuunmodulatoren. Hun vermogen om de aangeboren immuunactiviteit te stimuleren en de behandelingsrespons te verbeteren is beschreven. Die modulerende kenmerken worden deels toegeschreven aan hun vermogen om te binden aan patroonherkenningsreceptoren, die, interessant genoeg, sterk tot expressie komen in GAMs. Dit werk is dus gericht op de isolatie, zuivering en het daaropvolgende gebruik van schimmel β-glucanen om de tumordodende respons van microglia tegen glioblastoomcellen te verbeteren. De muisglioblastoom (GL261) en microglia (BV-2) cellijnen worden gebruikt om de immunomodulerende eigenschappen te testen van vier verschillende schimmel β-glucanen geëxtraheerd uit paddenstoelen die veel worden gebruikt in de huidige biofarmaceutische industrie: Pleurotus ostreatus, Pleurotus djamor, Hericium erinaceus en Ganoderma lucidum. Om deze verbindingen te testen, werden co-stimulatietests uitgevoerd om het effect van een vooraf geactiveerd microglia-geconditioneerd medium op de proliferatie en apoptose-activering in glioblastoomcellen te meten.
Introduction
Ondanks de komst van nieuwe prestaties op het gebied van neuro-oncologie, blijft de levensverwachting van glioblastoompatiënten mager. Gouden standaard therapieën tegen hersentumoren zijn gebaseerd op de samensmelting van chirurgie, radiotherapie en chemotherapie. In het afgelopen decennium is immunotherapie echter naar voren gekomen als een krachtige strategie om verschillende soorten kanker te behandelen1. Zo is de mogelijkheid om de immuunrespons van het lichaam tegen tumorcellen te benutten onlangs de vierde pijler van de oncologie geworden.
Het is al lang bekend dat een van de grootste uitdagingen in het veld is om de sterke immunosuppressie in de micro-omgeving van de tumorte overwinnen 2. Met name in het geval van glioblastoom, een van de meest voorkomende en agressieve vormen van hersenkanker, kan het ontrafelen van belangrijke routes die dergelijke pro-tumorale scenario's orkestreren en het vinden van nieuwe verbindingen die de deprimerende reactie van het immuunsysteem kunnen tegengaan, de weg vrijmaken voor toekomstige therapieën tegen deze ongeneeslijke ziekte.
De hersenen bezitten hun eigen cellen van het immuunsysteem en het meest relevante celtype zijn microglia. Het is bewezen dat deze cellen een vrij complex gedrag vertonen bij verschillende centrale ziekten3. In het geval van primaire hersentumoren (bijv. Glioblastoom), worden deze cellen verschoven naar een ontstekingsremmend fenotype dat tumorcellen ondersteunt om het hersenparenchym te koloniseren3. Talrijke publicaties hebben de belangrijke rol van deze cellen tijdens tumorprogressie versterkt. Een van de belangrijkste redenen hiervoor is dat glioom-geassocieerde microglia en geïnfiltreerde macrofagen (GAMs) goed zijn voor een derde van de totale tumormassa, wat de ondubbelzinnige invloed van hun activeringstoestanden tijdens de progressie van de hersentumorsuggereert 4,5.
In die geest zijn schimmel β-glucanen beschreven als krachtige moleculen die effectieve immuunresponsen veroorzaken, waaronder fagocytose en pro-inflammatoire factoren productie, wat leidt tot de eliminatie van schadelijke stoffen 6,7,8,9,10. Schimmel β-glucanen zijn over het algemeen bestudeerd met behulp van extracten van verschillende paddenstoeldelen. De toekenning van specifieke effecten vereist echter de zuivering ervan om dubbelzinnigheden te voorkomen en om het werkingsmechanisme van dergelijke moleculen als immunomodulerende middelen te kunnen begrijpen8.
In dit werk worden oplosbare β-glucanen gezuiverd uit het vruchtlichaam van vier verschillende paddenstoelen, regelmatig gebruikt als eetbare (Pleurotus ostreatus en Pleurotus djamor) en als medicinale (Ganoderma lucidum en Hericium erinaceus) paddenstoelen. Met name deze vier paddenstoelen worden veel gebruikt in de voedings- en farmaceutische industrie en werden geproduceerd binnen een milieuvriendelijke circulaire economie in een commerciële onderneming (zie Materiaaltabel).
Om de basis te leggen voor het toekomstige gebruik van schimmel-β-glucanen in hersenkankertherapieën, zijn goed gedefinieerde zuiveringsstrategieën en preklinische studies die zich verdiepen in hun vermeende interactie met cellen van het immuunsysteem essentieel om hun potentiële rol als antitumormediatoren te evalueren. Dit werk beschrijft de talrijke stappen van isolatie en zuivering die nodig zijn om de oplosbare β-glucanen in de vruchtlichamen van de geselecteerde paddenstoel terug te halen. Eenmaal met succes gezuiverd, worden microgliacellen geactiveerd om hun inflammatoire fenotype te verbeteren. Muis glioblastoom cellen (GL261) worden gecoat met een ander microglia-geconditioneerd medium, eerder behandeld met deze extracten, en vervolgens wordt het effect ervan op het gedrag van tumorcellen geëvalueerd. Interessant is dat pilotstudies van ons laboratorium (gegevens niet getoond) hebben blootgelegd hoe pro-inflammatoire microglia de migratie van tumorcellen en invasie-eigenschappen kunnen vertragen, niet alleen in glioblastoomcellen, maar ook in andere kankercellijnen. Dit multidisciplinaire werk kan een nuttig hulpmiddel zijn voor oncologische onderzoekers om veelbelovende verbindingen te testen die de immuunrespons in veel verschillende soorten tumoren kunnen stimuleren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
De vier verschillende paddenstoelvarianten die in dit protocol worden beschreven, zijn verkregen uit een commerciële bron (zie tabel met materialen).
1. Isolatie van schimmel β-glucanen
- Extractie en isolatie van oplosbare paddenstoelpolysachariden
OPMERKING: Oplosbare paddenstoelpolysachariden (SMP's) werden verkregen volgens de procedure die schematisch is weergegeven in figuur 1.- Spoel verse P. ostreatus, P. djamor, H. erinaceus en G. lucidum vruchtlichamen (ongeveer 2.000 g/paddenstoel) vijf keer voorzichtig af in gedestilleerd water.
- Droog de vruchtlichamen bij 50 ± 2 °C in een conventionele luchtdroogoven tot een constant gewicht is bereikt (~24 uur).
- Vermaal de gedroogde paddenstoelen in een bladmolen en haal ongeveer 200 g poeder uit elke paddenstoel.
- Suspensie 100 g champignonpoeder (MP) (P. ostreatus, P. djamor, H. erinaceus en G. lucidum) in 1.000 ml H2Od. Vervolgens de autoclaaf bij 121 °C gedurende 15 minuten en ten slotte gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Centrifugeer de resulterende suspensie gedurende 10 minuten bij 6.000 x g bij 4 °C.
- Droog het neerslag dat onoplosbare paddenstoelpolysachariden (GMP's) bevat bij 50 ± 2 °C gedurende 24 uur in een aan de lucht drogende oven.
- Gooi het neerslag weg en houd het bovennatuurlijke middel. Concentreer het supernatant 10 keer in een roterende verdamper.
- Neerslag het concentraat dat SMP's bevat neer met ethanol (80% eindconcentratie) bij 4 °C gedurende een nacht.
- Centrifugeer de ethanolsuspensie gedurende 15 minuten bij 4 °C bij 6.000 x g , houd de pellet vast (neerslag) en gooi het supernatant weg met een pipet.
- Was het neerslag drie keer met 80% ethanol voordat het wordt opgelost in H2Od (10% w / v). Stel de pH in op 6,5/7 en de temperatuur op 37 °C en behandel met respectievelijk 2 U en 4 U α-amylase en glucoamylase om α-glucanen op te lossen volgens de instructies van de fabrikant (zie materiaaltabel).
- Stel na de behandeling met α-amylase/glucoamylase de pH en temperatuur in op respectievelijk 8,0 en 50 °C en behandel met alcalase (2,5 E/g eiwit) (zie Tabel met materialen) om de eiwitten op te lossen.
OPMERKING: Deze sequentiële enzymatische behandeling verwijdert de meeste α-glucanen en eiwitten die samen met β-glucanen neerslaan in de ethanolprecipitatie. - Na hydrolyse centrifugeert u het hydrolysaat bij 6.000 x g gedurende 15 minuten bij 4 °C en het schone supernatantconcentraat vijf keer in een roterende verdamper. Opnieuw neerslaan met 80% ethanol.
- Solubiliseer het resulterende neerslag in H2Od en dialyseer gedurende 24 uur in gedestilleerd water met behulp van cellulosebuismembranen (12.000 Da-afsnijmembranen; zie tabel met materialen) om moleculen met een laag molecuulgewicht te verwijderen. Recupereer het in water oplosbare deel en vriesdroog het om oplosbare β-glucanen (SβGs) te produceren.
- Suiker- en eiwitmeting
- Meet het totale suikergehalte van elke fractie met de fenol-zwavelzuurmethode, met glucose als standaard8.
OPMERKING: Kwantificering van het β-glucaangehalte kan ook worden gedaan met behulp van de β-glucaantestkit (paddenstoel en gist; zie materiaaltabel), gebaseerd op enzymatische hydrolyse en de activiteit van oxidoreductasen: namelijk exo-1,3-β-glucanase, glucoseoxidase, β-glucosidase en peroxidase, met de daaropvolgende vorming van de chinoneimine. Volg de instructies van de fabrikant, met kleine wijzigingen. - Gebruik 18 MH 2 SO4 in plaats van 12 MH2SO4.
- Evalueer het gehalte aan de totale glucanen en α-glucanen afzonderlijk.
- Meet de resulterende β-glucaanwaarden als het verschil tussen de totale glucaan- en α-glucaanwaarden (drievoudige waarden) volgens het Kjeldahl-protocol. In bepaalde gevallen kan het eiwitgehalte worden bepaald met behulp van de Lowry-methode, waarbij albumine wordt gebruikt om de kalibratiecurve11,12 uit te zetten.
- Meet het totale suikergehalte van elke fractie met de fenol-zwavelzuurmethode, met glucose als standaard8.
- Ultraviolette absorptiespectroscopie analyse
- Verkrijg de SβG ultraviolette (UV) spectra met behulp van een UV-zichtbare spectrofotometer (zie Tabel van Materialen) door de monsters te scannen in het 200-400 nm gebied (Figuur 2).
- Bereid 1,0 mg/ml van elke SβG in H2Od, breng de oplossing over in een kwartscuvet en scan bij kamertemperatuur.
- Analyse van de molecuulgewichtsverdeling
- Schat de homogeniteit van SβGs en het molecuulgewicht van polymeren naar grootte-uitsluitingschromatografie (SEC) met behulp van een high-performance vloeistofchromatografie (HPLC) -systeem (zie materiaaltabel) uitgerust met een brekingsindexdetector en een ultra-hydrogel lineaire gelfiltratiekolom (300 mm x 7,8 mm; Figuur 3).
- Voer de test uit bij 40 °C met gedeïoniseerd water als eluent met een stroomsnelheid van 0,5 ml/min-1 en dextrans (110, 80 en 50 kDa) als standaarden (zie materiaaltabel). Verzamel een fractie van 5 ml.
- Fourier-transform infrarood (FTIR) analyse
- Noteer de infraroodspectra (figuur 4) op een FTIR-spectrometer in het bereik van 4000-500 cm-1. De monsters moeten vooraf worden gemengd met KBr om films te vormen (standaard FTIR-procedure; zie de instructies van de fabrikant en de materiaaltabel).
- Analyse van de moleculaire samenstelling
- Schat de moleculaire samenstellingen van SβG's door middel van high-performance dunnelaagchromatografie (HPTLC) en gaschromatografie gekoppeld aan massaspectrometrie (GC-MS), volgens standaardprocedures12.
2. In vitro onderzoek naar β-glucaan-geïnduceerde microgliastimulatie
- Celkweek van muisglioblastoom en microgliacellen in 8-well kamerglaasjes
OPMERKING: Dit protocol is specifiek voor GL261 (glioblastoom) en BV2 (microglia) cellijnen. Met kleine aanpassingen kunnen deze stappen echter mogelijk worden gebruikt om andere kanker- en immuuncellijnen te bestuderen.- Bereid Dulbecco's gemodificeerde Eagle's medium (DMEM) compleet medium gemodificeerd met L-glutamine, 4,5 g / L D-glucose en zonder pyruvaat. Voeg 10% foetaal runderserum (FBS) en 1% penicilline/streptomycine toe (zie tabel met materialen). Verwarm het materiaal voor in een waterbad op 37 °C gedurende 15 min.
- Ontdooi bevroren BV2- en GL261-aliquots gedurende 2 minuten in een waterbad (37 °C) en voer ze vlak voordat ze volledig ontdooien in een laminaire stroomkap en plaats de cellen in twee verschillende steriele T25-kolven (één voor elke cellijn).
- Incubeer de T25-kolven bij 37 °C, 5% CO2 totdat de cultuur samenvloeit.
OPMERKING: Afhankelijk van de vriesomstandigheden en de tijd onder cryopreservatie, kan de tijd tot samenvloeiing variëren. Deze cellijnen hebben meestal tussen de 3 en 5 dagen nodig om confluentie in een T75-kolf te bereiken. - Nadat de BV2-celcultuur confluent is geworden, brengt u deze over in 8-well kamerglaasjes 0,6 x 106 cellen / put. Houd de 8-puts kamerschuiven 24 uur in de incubator.
- Zodra de microgliacellen in de 8-putkamerglaasjes zijn geplaatst, herhaalt u hetzelfde protocol met de GL261-cellen.
- Activering van microglia met β-glucanen
- Bedek de BV2-cellen met vier verschillende β-glucanen (P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum en H. erinaceus) in een concentratie van 0,2 mg/ml gedurende 72 uur. Eén experimentele aandoening moet onbehandeld blijven (normaal medium) en fungeert als controlegroep.
- Vang het supernatant na 72 uur op met een pipet en laat het resterende volume door een spuitfilter van 0,20 μm lopen. Vries het supernatant vervolgens gedurende ten minste 24 uur in bij -80 °C.
- Behandeling van GL261 met vooraf geactiveerd microglia-geconditioneerd medium
- Zodra de GL261 voor 80% samenvloeit is in de 8-well kamerglaasjes, voegt u β-glucaan-behandeld microgliaal medium (stap 2.2.2) toe bij een uiteindelijke volumeconcentratie van 25% gedurende 72 uur (totaal volume: 250 μl/put).
- Verwijder het medium na 72 uur incubatie en gooi het weg.
- Was de cellen drie keer gedurende 5 minuten met fosfaatbufferzoutoplossing (PBS; pH 7,4, 0,1 M).
- Bevestig de cellen door 200 μL 4% paraformaldehyde (PFA) toe te voegen bij 4 °C gedurende 15 minuten.
OPMERKING: Afhankelijk van de verschillende antilichamen die kunnen worden gebruikt voor immunofluorescentie, kunnen fixatiemethoden verschillen van typische 4% PFA. Op alcohol gebaseerde fixatieven kunnen efficiënter zijn in het behoud van bepaalde epitopen.
- Immunofluorescentie onderzoek
- Was de monsters met PBS met triton X (PBST; 0,01%) gedurende 10 minuten drie keer.
- Verwijder de PBST en voeg runderserumalbumine (BSA) blokkerende buffer 10% in PBST (tabel 1) toe gedurende 30 minuten bij kamertemperatuur.
- Verwijder de blokkeringsbuffer en voeg 200 μL toe per putje PBS dat het primaire antilichamenmengsel bevat (1:500 rat Ki-67 monoklonaal antilichaam en 1:500 konijn gekloofd caspase-3 antilichaam; zie tabel met materialen). Incubeer een nacht bij 4 °C.
- Laat de monsters na 24 uur incubatie bij 4 °C gedurende 30 minuten op kamertemperatuur staan.
- Was de putjes drie keer gedurende 10 minuten met PBS op een shaker (lage snelheid).
- Verwijder de PBS en vervang door 200 μL per putje PBS met daarin het mengsel van secundaire antilichamen (1:200 ezel anti-rat IgG (H + L) sterk gekruist geadsorbeerd secundair antilichaam, Alexa Fluor 488 en 1:200 ezel anti-konijn IgG (H + L) sterk kruisgeadsorbeerd secundair antilichaam, Alexa Fluor 647; zie Materiaaltabel) gedurende 45 minuten bij kamertemperatuur in het donker.
- Was de monsters met PBS gedurende 10 minuten op een multifunctionele shaker.
- Verwijder de PBS en voeg 200 μL per putje van 4′,6-diamidino-2-fenylindool (DAPI) verdund in PBS (1:5.000) gedurende 1 min.
- Verwijder DAPI (zie materiaaltabel) en was de cellen gedurende 5 minuten in PBS.
- Verwijder het putframe en voeg 50 μL PBS:glycerol (1:1) toe aan elke put en dek af met een coverslip.
- Sluit de dia's af met nagellak.
- Verkrijg beelden op 20x met behulp van een confocaal microscoopsysteem (zie tabel met materialen).
3. Kwantificering en analyse van tumorcelproliferatie en apoptose
OPMERKING: Om het potentiële effect van de verschillende β-glucanen op tumorcelproliferatie en apoptose te meten, werd een intern script gebruikt in ImageJ-software om het aantal positieve pixels van Ki67 (proliferatie) en cCasp3 (apoptose) te kwantificeren13.
- Open AfbeeldingJ. Klik op de knop Plug-ins . Klik op Coloc2, een plug-in die eerder in de plug-inmap is geïnstalleerd en selecteer ten slotte de afbeelding om11 te analyseren.
OPMERKING: Deze plug-in was beschikbaar na eerder contact met Dr. Vasiliki Economopoulos (veconom@uwo.ca). In plaats van het script hebben zowel ImageJ- als Fiji-software verschillende tools voor colokalisatieanalyse (zie materiaaltabel), met vergelijkbare eigenschappen. - Stel drempelwaarden in op basis van de controlevoorwaarden (onbehandeld, alleen DMEM). Klik op de knop OK .
OPMERKING: Om achtergrond- en intensiteitsverschillen te voorkomen, moeten alle afbeeldingen onder dezelfde omstandigheden worden gemaakt. Bij voorkeur moeten beeldvormingssessies op dezelfde dag worden uitgevoerd en microscoopparameters ongewijzigd over afbeeldingen worden uitgevoerd. - Zorg ervoor dat de resulterende afbeeldingen van de gecolokaliseerde pixels en een overzichtsvenster met het percentage of het onbewerkte aantal pixels boven de drempel verschijnen. Normaliseer de resultaten met betrekking tot de controle (onbehandelde) aandoeningen.
OPMERKING: Alle gegevens worden gegeven als gemiddelde ± SEM. Statistische analyse werd uitgevoerd met behulp van grafische en analysesoftware (zie Materiaaltabel). Er werd gebruik gemaakt van een eenrichtings-ANOVA met de meervoudige vergelijkingstest van Tukey. Fouten worden weergegeven als standaardfout van het gemiddelde (s.e.m.) (*p < 0,05, **p < 0,01).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Succesvolle zuivering van β-glucanen
De massa MP, SMP's en SβG's verkregen uit vruchtlichamen van P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum en H. erinaceus na het extractie- en zuiveringsproces is samengevat in tabel 1. De basissamenstelling (totale koolhydraten, β-glucanen en eiwitten) van MP, SMP's en SβG's verkregen uit de schimmels is weergegeven in tabel 2. Deze resultaten laten zien hoe het protocol het mogelijk maakte om een grote hoeveelheid eiwitgehalte in SMP's op te halen. De enzymatische behandeling met α-amylase/glucoamylase en protease verminderde echter de hoeveelheid eiwit en verhoogde de β-glucaanconcentratie.
UV-spectra van de verschillende SβG's vertoonden geen UV-absorptiepieken bij 260 en 280 nm (figuur 2A), wat aangeeft dat SβG's nucleïnezuren (260 nm) en eiwitten (280 nm) misten. Bovendien werd de homogeniteit van SβG's getest volgens UV-zichtbare absorptiespectro-elektrochemie (SEC). De chromatogrammen (figuur 3) toonden een goede homogeniteit, met een hoofdscherpe en enkele piek op respectievelijk 8,20, 10,5, 10,9 en 11,3 min voor H. erinaceus, G. lucidum, P. ostreatus en P. djamor. Deze gegevens suggereren dat de fractie consistent is met homopolymeren. Bovendien werd het gewichtsgemiddelde Mw berekend als ongeveer 120,8, 92,8, 80,7 en 75,9 kDa voor respectievelijk H. erinaceus, G. lucidum, P. ostreatus en P. djamor, volgens de kalibratiecurvevergelijking (y = -0,0655x + 2,6194; R2 = 0,9951).
De FTIR-spectra maten moleculaire trillingen die overeenkwamen met covalente polysaccharidebindingen (figuur 4). De spectra vertoonden een brede en intense hydroxylgroep op ongeveer 3.435 cm-1. Het vertoonde ook een zwakke C-H-stretching piek op ongeveer 2.922 cm-1, overeenkomend met polysacchariden14. Bovendien kon de absorptie bij ongeveer 1.641 cm-1 worden toegewezen aan amide I15, gerelateerd aan de rektrillingen van de C=O- en CN-groepen. Het signaal rond 1.154 cm-1 kan te wijten zijn aan C-O-C asymmetrische uitrekking van de glycosidische koppeling16. Ten slotte duidde de band rond 1.072 cm-1 op C-O-uitrekking van β-glucanen16. De zwakke absorptie in de buurt van 893 cm-1 kan te wijten zijn aan de asymmetrische brekingstrilling van β-pyranose, die de β-configuratie van suikereenheden17 laat zien. Over het algemeen bleken SβG's voornamelijk te bestaan uit koolhydraten geconjugeerd met een minimale hoeveelheid eiwit.
Het monosaccharideprofiel van SβGs werd verder bestudeerd door HPTLC en GC-MS. De aanwezigheid van een grote hoeveelheid D-glucose met kleinere hoeveelheden D-galactose en D-mannose en een spoor van D-xylose, D-rhamnose, D-fucose en L-arabinose werd bevestigd. Tabel 3 geeft een overzicht van de verkregen resultaten voor SβGs van H. erinaceus, G. lucidum, P. ostreatus en P. djamor.
Microglia-geconditioneerd medium, vooraf geactiveerd met β-glucaan, geïnduceerde apoptose in kankercellen
Nadat β-glucanen uit de geselecteerde paddenstoelen met succes waren geïsoleerd en volledig gekarakteriseerd, werden ze toegevoegd aan de microgliacelcultuur (BV2). 72 h na de toevoeging van microglia-geconditioneerd medium aan de GL261-cellen (figuur 5), werd de expressie van twee belangrijke markers voor proliferatie (Ki67) en apoptose (gekloofd caspase 3 [cCasp3]) gemeten door immunofluorescentie. Met behulp van een intern script in ImageJ-software werd het aantal positieve pixels voor elk fluorescerend kanaal gekwantificeerd en dus werd de manier geanalyseerd waarop het potentiële effect van β-glucaan-geïnduceerde microgliale activering het gedrag van tumorcellen kan beïnvloeden. Met behulp van controlemonsters als drempel voor de intensiteit van elke fluorofoor, gaf het script het aantal pixels aan en gaf zo de expressie voor elke marker aan na de verschillende experimentele omstandigheden (figuur 6).
Interessant is dat GL261 geen significant verschil ondervond met betrekking tot tumorproliferatie na blootstelling aan de verschillende microglia-geconditioneerde media (figuur 7). P. djamor (B) en H. erinaceus (C) vertoonden echter een sterke inductie (respectievelijk ongeveer zesvoudige en negenvoudige toename) van cCasp3.
Figuur 1: Isolatieprotocol. Schema van het protocol voor het isoleren en zuiveren van SβG-preparaat uit P. streatus, P. djamor, H. erinaceus en G. lucidum. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 2: UV-spectra van β-glucanen. UV-spectra in het 200-400 nm gebied van (A) P. ostreatus, (B) G. lucidum, (C) P. djamor en (D) H. erinaceus. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 3: Grootte uitsluitingschromatogrammen. Grootte-uitsluitingschromatogrammen van (A) P. ostreatus, (B) G. lucidum, (C) P. djamor en (D) H. erinaceus. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 4: FTIR spectra. Fourier-transform infrarood (FTIR) spectra van (A) P. ostreatus, (B) G. lucidum, (C) P. djamor en (D) H. erinaceus. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 5: Schematische weergave van de costimulatietesten. Co-stimulatietest waarbij muizenmicroglia (BV2) cellen gedurende 72 uur werden gecoat met β-glucanen. Na gecryopreserveerd en gefilterd te zijn, werd het supernatant verzameld en overgebracht naar GL261 celcultuur (25%) gedurende 72 uur. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 6: Proliferatie- en apoptosebeelden. Immunofluorescentiebeelden tonen een drievoudige colocalisatie van GL261 met DAPI (blauw), Ki67 (groen) en cCasp3 (rood). Het 'Prob Coloc'-script (onderste afbeeldingen) maakte het mogelijk om het aantal positieve pixels van elke marker te kwantificeren en er colocalisatie tussen te maken. Schaalbalk: 10 μm. Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
Figuur 7: Kwantificering van proliferatiesnelheden en apoptose. Genormaliseerde waarden met betrekking tot de controlecondities (DMEM) van Ki67 (links) en cCasp3 (rechts) expressie in GL261 cellen na de microglia-geconditioneerde medium expositie. a) Pleurotus ostreatus, (B) Pleurotus djamor, (C) Hericium erinaceus y, (D) Ganoderma lucidum. Fouten worden weergegeven als s.e.m. (*p < 0,05, **p < 0,01). Klik hier om een grotere versie van deze figuur te bekijken.
| MP (g) | SMP's (g) | SβGs (g) | |
| P. ostreatus | 201,3 ± 2,2 | 14,4 ± 0,9 (7,1%) | 5,3 ± 0,2 (2,6%) |
| Drs. P. Djamor | 200,8 ± 1,9 | 13,5 ± 0,6 (6,7%) | 4,9 ± 0,3 (2,4%) |
| G. lucidum | 201,8 ± 1,6 | 14,7 ± 1,2 (7,3%) | 5,5 ± 0,2 (2,7%) |
| H. erinaceus | 204,2 ± 1,2 | 15,4 ± 0,8 (7,5%) | 5,7 ± 0,2 (2,8%) |
Tabel 1: Tabel met glucaangehalte. Massabalans voor het verkrijgen van MP, SMP's en SβG's uit vruchtlichamen van P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum en H. erinaceus.
| MP | SMP's | SβGs | ||
| CHt (%) | 67,3 ± 1,9 | 53,8 ± 2,3 | 90,1 ± 1,2 | |
| P. ostreatus | β-Glucaan (%) | 22,7 ± 1,4 | 31,3 ± 2,4 | 89,4 ± 2,3 |
| Eiwit (%) | 21.5±0.9 | 19,6 ± 0,8* | 0,4 ± 0,1* | |
| CHt (%) | 68,3 ± 2,1 | 61,4 ± 3,1 | 93,4 ± 1,1 | |
| Drs. P. Djamor | β-Glucaan (%) | 24,3 ± 2,8 | 30,8 ± 3,5 | 91,3 ± 3,4 |
| Eiwit (%) | 19,9 ± 1,0 | 22.3 ± 1.1* | 0,9 ± 0,2* | |
| G. lucidum | CHt (%) | 66,4 ± 1,8 | 56,8 ± 2,9 | 93,7 ± 0,9 |
| β-Glucaan (%) | 22,5 ± 1,9 | 24,9 ± 3,1 | 92,0 ± 2,6 | |
| Eiwit (%) | 18,9 ± 0,8 | 21,4 ± 0,6* | 1,5 ± 0,4* | |
| H. erinaceus | CHt (%) | 67,4 ± 1,2 | 58,9 ± 1,9 | 93,8 ± 1,4 |
| β-Glucaan (%) | 23,9 ± 1,6 | 35,9 ± 2,1 | 91,8 ± 2,8 | |
| Eiwit (%) | 17,6 ± 1,3 | 22,7 ± 1,8* | 1,3 ± 0,2* |
Tabel 2: Totaal koolhydraten. Drooggewicht (g) gehalte aan totale koolhydraten (CHt), β-glucaan en eiwit van MP, SMP's en SβGs. Eiwitgehalte (MP) gekwantificeerd volgens de Kjeldah-methode12. (*, eiwitten gekwantificeerd volgens de Lowry-methode9).
| D-Gluc (%) | D-Mann (%) | D-Gala (%) | D-Fuco (%) | D-Xylo (%) | D-Rham (%) | L-Arabisch (%) | |
| H. erinaceus | 91,6 ± 0,6 | 3,8 ± 0,1 | 2,1 ± 0,2 | 0,5 ± 0,2 | 0,8 ± 0,2 | 0,3 ± 0,1 | N.D. |
| G. lucidum | 94,3 ± 0,8 | 2,6 ± 0,2 | 1,9 ± 0,2 | 0,3 ± 0,1 | 0,9 ± 0,2 | n.d. | 0,4 ± 0,1 |
| P. ostreatus | 93,8 ± 0,5 | 4,4 ± 0,1 | 0,8 ± 0,1 | 0,4 ± 0,1 | n.d. | n.d. | n.d. |
| Drs. P. Djamor | 95,2 ± 0,7 | 1,7 ± 0,2 | 1,1 ± 0,1 | 0,3 ± 0,1 | n.d. | n.d. | n.d. |
Tabel 3: Karakterisering van monosachariden. Monosaccharideprofiel van SβGs van P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum en H. erinaceus (n.d., sommige monosachariden waren niet detecteerbaar).
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Dit werk beschrijft het gebruik van gevestigde technieken om met succes het gehalte aan SβG's uit vier verschillende schimmels te isoleren, te zuiveren en te karakteriseren. De resultaten toonden aan hoe na warmwaterextractie van SMP's, verkregen uit P. ostreatus, P. djamor, G. lucidum en H. erinaceus, gevolgd door hydrolytische behandeling met α-amylase, glucosidase en protease, het gehalte aan α-glucaan en eiwit werd verminderd, waardoor de hoeveelheid zuivere SβG's aanzienlijk werd verrijkt.
Desondanks zagen we dat de meeste schimmel-β-glucanen onoplosbaar waren in water tijdens het zuiveringsproces. Het belangrijkste belang van de studie was de SβG's, vanwege hun medische/farmaceutische eigenschappen10,18. Bovendien werden dankzij hydrolytische verwerking, ethanolprecipitatie en dialyse oplosbare koolhydraten met een laag moleculair gewicht, peptiden, oligopeptiden en aminozuren met succes uit SMP's verwijderd, wat een vergelijkbare efficiëntie liet zien als andere eerdere werken met een ander type paddenstoel, maar met vergelijkbare processen 19,20.
Om de zuiverheid van SβG's te testen, werden de UV-spectra van de verschillende SβG's onderzocht met UV-spectrofotometrie, waarbij de monsters in het 200-400 nm-gebied werden gescand. Er werden geen UV-absorptiepieken waargenomen bij 260 en 280 nm, wat aangeeft dat SβG's noch nucleïnezuren (260 nm) noch eiwitten (280 nm) bevatten, wat opnieuw aantoont dat β-glucanen voornamelijk de SβG's vormden. Hoewel UV-spectra in de regio van 200-400 nm de afwezigheid van een gedefinieerde / scherpe pick bij 280 nm vertoonden, kon nog steeds een kleine piek worden waargenomen. Dit kan worden verklaard door de aanwezigheid van een kleine hoeveelheid polysaccharide-gebonden eiwitten, in overeenstemming met de resultaten in tabel 2. Het is echter interessant om te overwegen dat een dergelijke verwaarloosbare hoeveelheid polysacchariden ook kan worden verklaard door de vertraagde toegang tot de resterende eiwitten, die kunnen worden afgeschermd door glucanen of door sterische effecten die de volledige afbraak van glucaangebonden eiwitten voorkomen. Belangrijk is dat de homogeniteit van SβG's verder werd getest door SEC, een krachtige analytische techniek die wordt gebruikt om opgeloste moleculen op grootte te zuiveren, wat de protocolresultaten bevestigde.
Daarnaast werden FTIR-spectra gebruikt om moleculaire trillingen te meten die overeenkomen met covalente polysaccharidebindingen. Zoals eerder beschreven, werden vergelijkbare spectra verkregen voor alle vier de schimmels. Het spectrakenmerk vertoonde de aanwezigheid van polysachariden14, amide I 15 en β-glucanen16. De zwakke absorptie nabij 893 cm-1 suggereerde de β-configuratie van suikereenheden17. Over het algemeen bleken SβG's voornamelijk te worden gevormd door koolhydraten geconjugeerd met minimale eiwitten. Met betrekking tot de interesse in het gebruik van SβG's als immunomodulerende moleculen, is het de moeite waard om te benadrukken dat polysaccharide-eiwitcomplexen vaak bekend staan om hun immunomodulerende voordelen21.
Ten slotte werd het monosaccharideprofiel van SβGs bestudeerd door HPTLC en GC-MS. De aanwezigheid van een grote hoeveelheid D-glucose met kleinere hoeveelheden D-galactose en D-mannose en sporen van D-xylose, D-rhamnose en D-fucose impliceert strikt dat de overheersende component in SβGs β-glucaan is. Het is echter belangrijk om te verduidelijken dat ons zuiveringssysteem het resultaat is van het optimaliseren van verschillende klassieke procedures. We werken momenteel aan het verbeteren van verschillende stappen, voornamelijk gericht op chromatografietechnieken (grootte-uitsluiting en ionenwisselingschromatografie).
Met betrekking tot het hoofddoel van dit werk, dat was om de impact van β-glucanen op immuuncellen te testen, werden na de vier verschillende soorten β-glucanen met succes gezuiverd, hun potentiële effecten op de activering van microglia getest. Immunofluorescentie werd gebruikt tegen twee gouden standaard markers voor proliferatie en apoptose22,23.
Ondanks geen statistische verschillen in tumorproliferatiesnelheden, waren P. ostreatus (A) en H. erinaceus (C) in staat om de Ki67-expressie met maximaal 50% te verlagen. Het gebrek aan significantie is waarschijnlijk te wijten aan de hoge variantie in de studie met betrekking tot G. lucidum. Bovendien is de inductie van apoptose in kankercellen een nogal interessante therapeutische benadering, en P. djamor (B) en H. erinaceus (C) vertoonden een significante inductie van cCasp3-niveaus, wat de activering van het celdoodprogramma suggereert. Al deze resultaten zijn in overeenstemming met eerdere studies die het anti-tumorale effect van deze schimmels in andere soorten tumoren aantoonden24,25. De experimenten werden in tweevoud uitgevoerd, met behoud van dezelfde omstandigheden en geleid door dezelfde onderzoekers. Softwarematige analyse van de resultaten van de immunofluorescentiestudies ondersteunt een onbevooroordeelde aanpak en vergroot het potentiële bereik van deze studie.
Over het algemeen hebben deze studies een belangrijke uitdaging met betrekking tot het gebruik van β-glucanen, namelijk de zuiverheid van de verbindingen. Het is verplicht om de hoogste normen na te streven om te bevestigen dat de waargenomen effecten, na hun gebruik in immunologische studies, uitsluitend worden veroorzaakt door de koolhydraten, en niet als gevolg van eiwitten of andere structuren die eraan kunnen blijven hechten als de zuivering niet adequaat wordt uitgevoerd. Een extra stap die in toekomstige studies kan worden overwogen, is het gebruik van chromatografietechnieken (bijvoorbeeld ionenuitwisseling of uitsluiting van grootte).
De algemene conclusie na de studies plaatst H. erinaceus als de topkandidaat als een potentiële immunotherapeutische optie voor de behandeling van glioblastoom, vanwege het vermogen om tumorproliferatie te laten vallen (~ 50%) en een sterke activering van het celdoodprogramma in glioblastoomcellen te induceren.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Er zijn geen tegenstrijdige belangen aan te geven.
Acknowledgments
We willen dr. Vasiliki Economopoulos bedanken voor haar interne script om het fuluorescence-signaal in ImageJ te meten. We willen ook de CITIUS (Universiteit van Sevilla) en al hun personeel bedanken voor hun steun tijdens de demonstratie. Dit werk werd ondersteund door de Spaanse FEDER I + D + i-USE, US-1264152 van de Universiteit van Sevilla, en het Ministerio de Ciencia, Innovación y Universidades PID2021-126090OA-I00
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 8-well chamber slides | Thermo Fisher, USA | 171080 | |
| Air-drying oven | J.P. Selecta S.A., Spain | 2000210 | |
| Albumin | Sigma-Aldrich, St. Louis | A7030 | |
| Alcalase | Novozymes, Denmark | protease | |
| Alexa Fluor 488 | Thermofisher, USA | A32731 | |
| Alexa Fluor 647 | Thermofisher, USA | A32728 | |
| Blade mill | Retsch, Germany | SM100 | |
| Bovine Serum Albumin | MERK, Germany | A9418 | |
| Cellulose tubing membrane | Sigma-Aldrich, St. Louis | D9402 | |
| Centrifuge | MERK, Germany | Eppendorf, 5810R | |
| Colocalisation pluggins | ImageJ | (https://imagej.net/imaging/colocalization-analysis ) | |
| DAPI | MERK, Germany | 28718-90-3 | |
| Dextrans | Pharmacosmos, Holbalk, Denmark | Dextran 410, 80, 50 | |
| Dulbecco´s modified Eagle´s medium, Gluta MAXTM | Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | 10564011 | |
| Extenda (α- Amylase/Glucoamylase) | Novozymes, Denmark | ||
| Fetal bovine serum | Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | A4736301 | |
| FT-IR spectromete | Bruker-Vertex, Switzerland | VERTEX 70v | |
| Graphing and analysis software | GraphPad Prism (GraphPad Software, Inc.) | ||
| H2SO4 | |||
| HPLC system | Waters Corp, Milford, MA, USA | Waters 2695 HPLC | |
| Incubator | Eppedorf | Galaxy 170S | |
| Mass Spectometer | Q Exactive GC, Thermo Scientific | 725500 | |
| Paraformaldehyde | MERK, Germany | P6148 | |
| Penicillin/streptomycin | Sigma-Aldrich, St. Louis | P4458 | |
| pH meter | Crison, Barcelona, Spain | Basic 20 | |
| Phosphate-buffered saline | Gibco, Life Technologies, Carlsbad, CA, USA | 1010-015 | |
| Rabbit Cleaved Caspase-3 (Asp175) Antibody | Abcam, UK | ab243998 | |
| Rat Ki-67 Monoclonal | Thermofisher, USA | MA5-14520 | |
| Rotary evaporator | Büchi Ibérica S.L.U., Spain | El Rotavapor R-100 | |
| Ultra-hydrogel linear gel-filtration column (300 mm x 7.8 mm) | Waters Corp, Milford, MA, USA | WAT011545 | |
| UV-Visible spectrophotometer | Amersham Bioscience, UK | Ultrospec 2100 pro | |
| VectaMount | Vector Laboratories, C.A, USA | H-5000-60 | |
| Water bath | J.P. Selecta S.A., Spain | ||
| Zeiss LSM 7 DUO Confocal Microscope System. | Zeiss, Germany | ||
| β-glucan Assay Kit | Megazyme, Bray, Co. Wicklow, Ireland | K-BGLU | |
| β-glucans | Setas y Hongos del Sur, S.L. | Supplied the four variants of mushrooms |
References
- Aldape, K., et al. Challenges to curing primary brain tumours. Nature Reviews. Clinical Oncology. 16 (8), 509-520 (2019).
- Himes, B. T., et al. Immunosuppression in glioblastoma: current understanding and therapeutic implications. Frontiers in Oncology. 11, 770561 (2021).
- Ma, J., Chen, C. C., Li, M.
- Sevenich, L. Turning "cold" into "hot" tumors-opportunities and challenges for radio-immunotherapy against primary and metastatic brain cancers. Frontiers in Oncology. 9, 163 (2019).
- Niesel, K., et al. The immune suppressive microenvironment affects efficacy of radio-immunotherapy in brain metastasis. EMBO Molecular Medicine. 13 (5), e13412 (2021).
- McCann, F., Carmona, E., Puri, V., Pagano, R. E., Limper, A. H. Macrophage internalization of fungal beta-glucans is not necessary for initiation of related inflammatory responses. Infection and Immunity. 73 (10), 6340-6349 (2005).
- Vetvicka, V., Teplyakova, T. V., Shintyapina, A. B., Korolenko, T. A. Effects of medicinal fungi-derived β-glucan on tumor progression. Journal of Fungi. 7 (4), 250 (2021).
- Chan, G. C. F., Chan, W. K., Sze, D. M. Y. The effects of beta-glucan on human immune and cancer cells. Journal of Hematology & Oncology. 2, 25 (2009).
- Lowry, O. H., Rosebrough, N. J., Farr, A. L., Randall, R. J.
- Klaus, A., et al. Antioxidative activities and chemical characterization of polysaccharides extracted from the basidiomycete Schizophyllum commune. Food Science and Technology. 44 (10), 2005-2011 (2011).
- Soto, M. S., et al. STAT3-mediated astrocyte reactivity associated with brain metastasis contributes to neurovascular dysfunction. Cancer Research. 80 (24), 5642-5655 (2020).
- Chromý, V., Vinklárková, B., Šprongl, L., Bittová, M. The Kjeldahl method as a primary reference procedure for total protein in certified reference materials used in clinical chemistry. I. A review of Kjeldahl methods adopted by laboratory medicine. Critical Reviews in Analytical Chemistry. 45 (2), 106-111 (2015).
- Waterborg, J. H., Matthews, H. R. The Lowry method for protein quantitation. Methods in Molecular Biology. 32, 1-4 (1994).
- Zhang, L., et al. Characterization and antioxidant activities of polysaccharides from thirteen boletus mushrooms. International Journal of Biological Macromolecules. 113, 1-7 (2018).
- Barbosa, J. S., et al. Obtaining extracts rich in antioxidant polysaccharides from the edible mushroom Pleurotus ostreatus using binary system with hot water and supercritical CO2. Food Chemistry. 330, 127173 (2020).
- Ma, Y. H., et al. Assessment of polysaccharides from mycelia of genus Ganoderma by mid-infrared and near-infrared spectroscopy. Scientific Reports. 8 (1), 10 (2018).
- Nie, L., et al. Immune-enhancing effects of polysaccharides MLN-1 from by-product of Mai-luo-ning in vivo and in vitro. Food and Agricultural Immunology. 30 (1), 369-384 (2019).
- Cerletti, C., Esposito, S., Iacoviello, L. Edible mushrooms and beta-glucans: impact on human health. Nutrients. 13 (7), 2195 (2021).
- Klaus, A., et al. The edible mushroom Laetiporus sulphureus as potential source of natural antioxidants. International Journal of Food Sciences and Nutrition. 64 (5), 599-610 (2013).
- Kozarski, M., et al. Dietary polysaccharide extracts of Agaricus brasiliensis fruiting bodies: chemical characterization and bioactivities at different levels of purification. Food Research International. 64, 53-64 (2014).
- Ayimbila, F., Keawsompong, S. Functional composition and antioxidant property of crude polysaccharides from the fruiting bodies of Lentinus squarrosulus. 3 Biotech. 11 (1), 7 (2021).
- de Azambuja, E., et al. Ki-67 as prognostic marker in early breast cancer: a meta-analysis of published studies involving 12,155 patients. British Journal of Cancer. 96 (10), 1504-1513 (2007).
- Holubec, H., et al. Assessment of apoptosis by immunohistochemical markers compared to cellular morphology in ex vivo-stressed colonic mucosa. The Journal of Histochemistry and Cytochemistry. 53 (2), 229-235 (2005).
- Borges, G. M., et al. Extracellular polysaccharide production by a strain of Pleurotus djamor isolated in the south of Brazil and antitumor activity on Sarcoma 180. Brazilian Journal of Microbiology. 44 (4), 1059-1065 (2014).
- Sohretoglu, D., Huang, S. Ganoderma lucidum polysaccharides as an anti-cancer agent. Anti-Cancer Agents in Medicinal Chemistry. 18 (5), 667-674 (2018).
