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Developmental Biology

चिकन भ्रूण में इनट्रेसलोमिक प्रत्यारोपण के माध्यम से किडनी ऑर्गेनोइड्स का कुशल वैस्कुलराइजेशन

Published: February 17, 2023 doi: 10.3791/65090
Automatic Translation
1,2, 1,2, 3, 1,2,4, 1,2,4
1Department of Internal Medicine - Nephrology, Leiden University Medical Center, 2Einthoven Laboratory of Vascular and Regenerative Medicine, Leiden University Medical Center, 3IBPS, CNRS UMR7622, Developmental Biology Laboratory, Sorbonne Université, 4The Novo Nordisk Foundation Center for Stem Cell Medicine (reNEW), Leiden University Medical Center

Summary

यहां, हम चिकन भ्रूण के सेलोमिक गुहा में किडनी ऑर्गेनोइड्स के प्रत्यारोपण के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल प्रस्तुत करते हैं। यह विधि 8 दिनों के भीतर ऑर्गेनोइड्स के वैस्कुलराइजेशन और बढ़ी हुई परिपक्वता को प्रेरित करती है और इन प्रक्रियाओं का कुशल तरीके से अध्ययन करने के लिए उपयोग की जा सकती है।

Abstract

मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम कोशिकाओं से प्राप्त किडनी ऑर्गेनोइड्स में नेफ्रॉन जैसी संरचनाएं होती हैं जो एक निश्चित डिग्री तक वयस्क गुर्दे से मिलती-जुलती होती हैं। दुर्भाग्य से, उनकी नैदानिक प्रयोज्यता एक कार्यात्मक वाहिका की कमी और परिणामस्वरूप विट्रो में सीमित परिपक्वता से बाधित होती है। चिकन भ्रूण के सेलोमिक गुहा में गुर्दे के ऑर्गेनोइड्स का प्रत्यारोपण ग्लोमेरुलर केशिकाओं के गठन सहित संक्रमित रक्त वाहिकाओं द्वारा वैस्कुलराइजेशन को प्रेरित करता है, और उनकी परिपक्वता को बढ़ाता है। यह तकनीक बहुत कुशल है, जिससे बड़ी संख्या में ऑर्गेनोइड्स के प्रत्यारोपण और विश्लेषण की अनुमति मिलती है। यह पेपर चिकन भ्रूण में किडनी ऑर्गेनोइड्स के इंट्रासेलोमिक प्रत्यारोपण के लिए एक विस्तृत प्रोटोकॉल का वर्णन करता है, इसके बाद फ्लोरोसेंटली लेबल लेक्टिन का इंजेक्शन होता है ताकि संक्रमित वाहिका को दाग दिया जा सके, और इमेजिंग विश्लेषण के लिए प्रत्यारोपित ऑर्गेनोइड्स का संग्रह। इस विधि का उपयोग इन प्रक्रियाओं को बढ़ाने और रोग मॉडलिंग में सुधार के लिए सुराग खोजने के लिए ऑर्गनॉइड वैस्कुलराइजेशन और परिपक्वता को प्रेरित करने और अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है।

Introduction

मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल (एचआईपीएससी) -व्युत्पन्न किडनी ऑर्गेनोइड्स को विकासात्मक अध्ययन 1,2,3,4, विषाक्तता स्क्रीनिंग 5,6, और रोग मॉडलिंग5,7,8,9,10,11,12,13 के लिए क्षमता दिखाया गया है।. हालांकि, इन और अंतिम नैदानिक प्रत्यारोपण उद्देश्यों के लिए उनकी प्रयोज्यता संवहनी नेटवर्क की कमी से सीमित है। भ्रूण के गुर्दे के विकास के दौरान, पोडोसाइट्स, मेसांगियल कोशिकाएं और संवहनी एंडोथेलियल कोशिकाएं (ईसी) ग्लोमेरुलस की जटिल संरचना बनाने के लिए बातचीत करती हैं। इस बातचीत के बिना, ग्लोमेरुलर निस्पंदन बाधा, जिसमें पोडोसाइट्स, ग्लोमेरुलर बेसमेंट झिल्ली (जीबीएम), और ईसी शामिल हैं, ठीक से विकसित नहीं हो सकते हैं। हालांकि इन विट्रो में किडनी ऑर्गेनोइड्स में कुछ ईसीएस होते हैं, ये एक उचित संवहनी नेटवर्क बनाने में विफल रहते हैं और समयके साथ कम हो जाते हैं। इसलिए यह आश्चर्य की बात नहीं है कि ऑर्गेनोइड अपरिपक्व रहते हैं। चूहों में प्रत्यारोपण गुर्दे के ऑर्गेनोइड्स 18,19,20,21 के वैस्कुलराइजेशन और परिपक्वता को प्रेरित करता है। दुर्भाग्य से, यह एक श्रम-गहन प्रक्रिया है जो बड़ी संख्या में ऑर्गेनोइड ्स के विश्लेषण के लिए अनुपयुक्त है।

चिकन भ्रूण का उपयोग एक सदी से अधिक समय से वैस्कुलराइजेशन और विकास का अध्ययन करने के लिए किया गयाहै। वे आसानी से सुलभ हैं, कम रखरखाव की आवश्यकता होती है, पूरी तरह कार्यात्मक प्रतिरक्षा प्रणाली की कमी होती है, और अंडे के खोल 23,24,25,26 को खोलने के बाद सामान्य रूप से विकसित हो सकते हैं। उनके कोरियोलांटोइक झिल्ली (सीएएम) पर ऑर्गेनोइड्स के प्रत्यारोपण को वैस्कुलराइजेशन27 का कारण दिखाया गया है। हालांकि, सीएएम पर प्रत्यारोपण की अवधि, साथ ही ग्राफ्ट की परिपक्वता का स्तर, सीएएम गठन द्वारा सीमित है, जिसे पूरा होने में भ्रूण के दिन 7 तक का समय लगता है। इसलिए, चिकन भ्रूण28 में इंट्रासेलोमिक प्रत्यारोपण के माध्यम से कुशलतापूर्वक संवहनी और परिपक्व किडनी ऑर्गेनोइड्स के लिए एक विधि हाल ही में विकसित की गई थी। चिकन भ्रूण की सेलोमिक गुहा 1930 के दशक से भ्रूण के ऊतकों29,30 के भेदभाव के लिए एक अनुकूल वातावरण के रूप में जानी जाती है। यह भ्रूण के विकास में जल्दी पहुँचा जा सकता है और सभी दिशाओं में ग्राफ्ट के अपेक्षाकृत असीमित विस्तार की अनुमति देता है।

यह पेपर दिन 4 चिकन भ्रूण के सेलोमिक गुहा में एचआईपीएस-व्युत्पन्न किडनी ऑर्गेनोइड्स के प्रत्यारोपण के लिए एक प्रोटोकॉल की रूपरेखा तैयार करता है। यह विधि 8 दिनों के भीतर ऑर्गेनोइड्स के वैस्कुलराइजेशन और बढ़ी हुई परिपक्वता को प्रेरित करती है। भ्रूण का त्याग करने से पहले फ्लोरोसेंटली लेबल लेंस कलिनेरिस एग्लूटीनिन (एलसीए) का इंजेक्शन कॉन्फोकल माइक्रोस्कोपी के माध्यम से ऑर्गेनोइड्स के भीतर संक्रमित रक्त वाहिकाओं के विज़ुअलाइज़ेशन को सक्षम बनाता है।

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Protocol

डच कानून के अनुसार, इस शोध के लिए पशु कल्याण समिति द्वारा अनुमोदन की आवश्यकता नहीं थी।

1. प्रत्यारोपण के लिए एचआईपीएस-व्युत्पन्न किडनी ऑर्गेनोइड्स तैयार करना

  1. ताकासाटो एट अल.4,18,31 द्वारा विकसित प्रोटोकॉल का उपयोग करके एचआईपीएससी को किडनी ऑर्गेनोइड्स से अलग करें। पॉलिएस्टर सेल कल्चर पर इस प्रोटोकॉल का पालन करने वाले ऑर्गेनोइड्स को 0.4 μm छिद्रों (सेल कल्चर इंसर्ट) के साथ भेदभाव के दिन 7 + 12 तक सम्मिलित किया जाता है। प्रत्येक सेल कल्चर इंसर्ट में तीन ऑर्गेनोइड ्स होंगे।
  2. सेल कल्चर इंसर्ट से ऑर्गेनोइड्स को हटा दें।
    1. कोशिका संस्कृति की झिल्ली के बीच में एक छेद बनाएं जिसमें विच्छेदन बल की एक जोड़ी शामिल हो। विच्छेदन कैंची का उपयोग करके, कोशिका संस्कृति डालने के बीच में छेद से किनारे तक झिल्ली में तीन कट बनाएं, ऑर्गेनोइड्स के बीच काट दें। इसके परिणामस्वरूप झिल्ली के तीन टुकड़े होंगे, जिनमें से प्रत्येक में एक ऑर्गेनोइड जुड़ा हुआ है, जो अभी भी उनके बाहरी किनारे पर सेल कल्चर इंसर्ट से जुड़े हैं।
    2. झिल्ली के टुकड़ों में से एक को उसके बाहरी किनारे के करीब एक जोड़ी बल के साथ पकड़ें और इसे सेल कल्चर डालने से ढीला फाड़ दें। पेट्री डिश में संलग्न ऑर्गेनॉइड के साथ झिल्ली का टुकड़ा रखें। निर्जलीकरण से बचने के लिए ऑर्गेनॉइड में कैल्शियम और मैग्नीशियम (डीपीबीएस-/-) के बिना डलबेकको के फॉस्फेट-बफर्ड सेलाइन (डीपीबीएस) की कुछ बूंदें जोड़ें। अन्य दो ऑर्गेनोइड के लिए दोहराएं।
  3. ऑर्गेनोइड्स को उनकी झिल्ली को बल के साथ पकड़ कर और उन्हें डबल-एज स्टेनलेस स्टील रेजर ब्लेड के साथ आधे में काटकर विभाजित करें (विकास के इस चरण में सेलोम को समायोजित करने के लिए एक पूरा ऑर्गेनॉइड बहुत बड़ा है)। धीरे से दो ऑर्गेनॉइड हिस्सों को ड्यूरा विच्छेदक के साथ झिल्ली से बाहर धकेलें। झिल्ली को त्याग दें और प्रत्यारोपण तक डीपीबीएस में ऑर्गेनोइड्स छोड़ दें।
    नोट: प्रत्यारोपण से पहले ऑर्गेनोइड्स को तनाव से बचने के लिए प्रत्यारोपण के लिए एक समय में अधिकतम तीन ऑर्गेनोइड तैयार करें। आदर्श रूप से, एक व्यक्ति ऑर्गेनोइड तैयार करता है जबकि दूसरा प्रत्यारोपण करता है।

2. प्रत्यारोपण के लिए चिकन भ्रूण तैयार करना

  1. निषेचित सफेद लेगहॉर्न अंडे सेना। प्रत्यारोपण का सही समय सुनिश्चित करने के लिए किडनी ऑर्गनॉइड भेदभाव दिवस 7 + 8 पर अंडे की इनक्यूबेशन शुरू करें।
    1. निषेचित सफेद लेगहॉर्न अंडे (गैलस डोमेस्टिकस) को क्षैतिज रूप से एक धारक पर रखें (चित्रा 1 ए; दिन 0), एक पेंसिल के साथ ऊपर की ओर की तरफ के पक्ष के मध्य को चिह्नित करना।
      नोट: या तो कस्टम-निर्मित प्लास्टिक धारकों या अंडे के डिब्बों को अंडे को सेने के लिए धारकों के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है।
    2. धारक को 38 ± 1 डिग्री सेल्सियस पर एक ह्यूमिडिफायर इनक्यूबेटर में अंडे के साथ रखें (चित्रा 1 ए; दिन 0)।
    3. इनक्यूबेटर में पानी के बेसिन को भरते हुए, 3 दिनों के लिए अंडे सेकें।
  2. इनक्यूबेशन के तीसरे दिन अंडे के छिलके में एक खिड़की बनाएं।
    1. इनक्यूबेशन के तीसरे दिन, अंडे (छोटे छोर) की नुकीली नोक पर पारदर्शी टेप का एक छोटा टुकड़ा (~ 1 सेमी x 0.5 सेमी) रखें। पारदर्शी टेप के बीच में अंडे के छिलके में एक छोटा सा छेद बनाएं, इसे विच्छेदन कैंची की एक जोड़ी के तेज सिरे से टैप करके।
    2. 5 एमएल सिरिंज पर 19 ग्राम की सुई को 45 डिग्री कोण पर छेद में डालें, जर्दी थैली को नुकसान से बचाएं, और अंडे के अंदर भ्रूण को कम करने के लिए अंडे से 2-3 एमएल एल्बमन को एस्पिरेट करें। पारदर्शी टेप के दूसरे टुकड़े (~ 1 सेमी x 0.5 सेमी) के साथ छेद को सील करें।
    3. अंडे के पेंसिल-चिह्नित, ऊपर की ओर की ओर पारदर्शी टेप का एक बड़ा टुकड़ा (~ 5 सेमी x 5 सेमी) रखें। पारदर्शी टेप के बीच में अंडे के छिलके में एक छेद बनाएं, इसे विच्छेदन कैंची की एक जोड़ी के तेज सिरे से टैप करके (चित्रा 1 ए; चित्र 1 ए) दिन 3)।
    4. इस छेद से शुरू करके, घुमावदार विच्छेदन कैंची का उपयोग करके अंडे के छिलके में एक छोटी गोलाकार खिड़की काट लें। भ्रूण का पता लगाने के लिए इस खिड़की के माध्यम से देखें, फिर भ्रूण तक पहुंच को अनुकूलित करने के लिए खिड़की को बड़ा करें (चित्रा 1 ए; दिन 3)।
    5. अंडे के किसी भी बड़े टुकड़े को हटा दें जो भ्रूण के शीर्ष पर गिर सकता है। प्लास्टिक ट्रांसफर पिपेट के साथ भ्रूण पर कैल्शियम और मैग्नीशियम (डीपीबीएस + / +) के साथ डीपीबीएस की कुछ बूंदों को रखकर छोटे टुकड़ों को हटा दें, फिर पिपेट में अंडे के छिलके के साथ डीपीबीएस + / + को हटा दें।
    6. प्लास्टिक ट्रांसफर पिपेट का उपयोग करके अंडे में 0.5% पेनिसिलिन / स्ट्रेप्टोमाइसिन के साथ पूरक डीपीबीएस + / + की तीन बूंदें जोड़ें।
    7. अंडे को इनक्यूबेशन के चौथे दिन तक इनक्यूबेटर में वापस रखने से पहले पारदर्शी टेप के एक बड़े टुकड़े (~ 5 सेमी x 5 सेमी) के साथ खिड़की को सावधानीपूर्वक सील करें, जब भ्रूण हैमबर्गर-हैमिल्टन चरण 23-24 (एचएच 23-24)32 में है।
      नोट: निर्जलीकरण और भ्रूण की मृत्यु से बचने के लिए खिड़की को सील करना बहुत महत्वपूर्ण है।
    8. टेप के माध्यम से उन्हें देखकर व्यवहार्यता के लिए रोजाना भ्रूण की जांच करें (निर्जलीकरण से बचने के लिए टेप को न हटाएं)। इनक्यूबेशन के इन पहले दिनों के दौरान, भ्रूण की मृत्यु पर अंडे की जर्दी का रंग उज्ज्वल से मैट पीले रंग में बदल जाता है। मृत भ्रूण को त्याग दें।
    9. इनक्यूबेटर में पानी के बेसिन को भरा रखें।

3. इनक्यूबेशन के चौथे दिन इनट्रेसलोमिक प्रत्यारोपण

  1. सेलोमिक गुहा तक पहुंच प्राप्त करना
    1. घुमावदार विच्छेदन कैंची के साथ खिड़की से टेप काट लें।
    2. अंडे को एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत रबर धारक या अंडे के कार्टन पर रखें।
    3. चिकन भ्रूण अब एचएच 23-24 में है और इसके बाईं ओर पड़ा हुआ है, इसके दाईं ओर दर्शक के सामने है (चित्रा 1 ए; चित्र 1 ए) दिन 4)। भ्रूण के दाहिने पंख और पैर की कली का पता लगाएं, क्योंकि इन दो अंग कलियों के बीच सेलोम तक पहुंचा जा सकता है। दाएं पंख और पैर की कली के बीच के क्षेत्र में, विटेलिन झिल्ली, कोरियन और एमनियन में लगातार एक उद्घाटन बनाएं, उन्हें विच्छेदन बल के दो जोड़े के साथ पकड़कर और धीरे से उन्हें विपरीत दिशाओं में खींचकर।
      नोट: विटेलिन झिल्ली पहली झिल्ली है जो अंडे को खोलने के बाद सामने आती है, और कुछ मामलों में, दिन 3 पर खिड़की बनाने के बाद पहले से ही क्षतिग्रस्त हो जाती है। यदि भ्रूण को घुमाया जाता है, तो उसके दाईं ओर लेटा हुआ होता है और उसकी बाईं ओर दर्शक का सामना होता है (चित्र 1 ए; दिन 4), प्रत्यारोपण को सक्षम करने के लिए इसे बदलना आवश्यक है। ऐसा करने के लिए, विटेलिन और कोरियन झिल्ली में एक बड़ा उद्घाटन करें, फिर बल का उपयोग करके भ्रूण को सावधानीपूर्वक घुमाएं।
    4. जांचें कि क्या सेलोमिक गुहा तक निर्बाध पहुंच है: धीरे-धीरे विंग और अंग की कली के बीच शरीर की दीवार के किनारे को विच्छेदन बल की एक जोड़ी के साथ पकड़ें और इसे दर्शक की ओर थोड़ा खींचें। सेलोमिक गुहा स्पष्ट रूप से दिखाई देनी चाहिए। सावधानी से एक कुंद लेकिन पतला उपकरण (उदाहरण के लिए, एक माइक्रोस्केलपेल धारक में एक कुंद टंगस्टन तार) को सेलोमिक गुहा में डालें।
      नोट: यदि सीलोमिक गुहा में कुंद उपकरण का सम्मिलन संभव नहीं है, तो इसका मतलब है कि एक या अधिक झिल्ली ठीक से नहीं खोली गई है।
  2. प्रतिरोपण
    1. ड्यूरा विच्छेदक का उपयोग करके एलेन्टोइस के शीर्ष पर अंडे के अंदर आधा ऑर्गेनॉइड रखें।
    2. विच्छेदन बल का उपयोग करके, शरीर की दीवार के किनारे को ध्यान से पकड़ें और इसे दर्शक की ओर थोड़ा खींचें ताकि सेलोम का उद्घाटन दिखाई दे सके।
      नोट: शरीर की दीवार में रक्त वाहिकाओं को नुकसान पहुंचाने से बचें।
    3. धीरे से ऑर्गेनॉइड को शरीर की दीवार में उद्घाटन के माध्यम से एक माइक्रोस्केलपेल धारक में एक कुंद टंगस्टन तार के साथ सेलोम में ले जाएं। ऑर्गेनॉइड को सेलोम के अंदर रखने के लिए थोड़ा कपाल की ओर धकेलें। यह अब विंग बड के ठीक पीछे दिखाई देता है (चित्रा 1 ए; दिन 4)।
    4. प्लास्टिक ट्रांसफर पिपेट का उपयोग करके अंडे में डीपीबीएस + / + की तीन बूंदें जोड़ें।
    5. अंडे को इनक्यूबेशन के 12 वें दिन (प्रत्यारोपण के 8 दिन बाद) तक इनक्यूबेटर में वापस रखने से पहले पारदर्शी टेप के एक बड़े टुकड़े (~ 5 सेमी x 5 सेमी) के साथ खिड़की को सावधानीपूर्वक सील करें।
    6. टेप के माध्यम से उन्हें देखकर व्यवहार्यता के लिए भ्रूण की दैनिक जांच करते रहें (निर्जलीकरण से बचने के लिए टेप को न हटाएं)। मृत भ्रूण को त्याग दें।
      नोट: जैसे-जैसे भ्रूण और उनके कोरियोएलेंटोइक झिल्ली बढ़ते हैं, वे टेप के माध्यम से अधिक स्पष्ट रूप से दिखाई देते हैं। भ्रूण द्वारा गति की कमी और ढह या विरल रक्त वाहिकाएं भ्रूण की मृत्यु का संकेत हैं।
    7. इनक्यूबेटर में रोजाना पानी के बेसिन की जांच करें और उसे भरकर रखें।

4. फ्लोरोसेंटली लेबल लेक्टिन का इंजेक्शन

  1. इंजेक्शन लगाने की तैयारी
    1. निम्नलिखित सेटिंग्स के साथ एक माइक्रोपिपेट पुलर में ग्लास माइक्रोकेशिकाओं को खींचकर ग्लास माइक्रोइंजेक्शन सुई बनाएं: हीट 533, पुल 60, वेग 150, टाइम 200। विच्छेदन माइक्रोस्कोप के माध्यम से देखते समय, एक उद्घाटन बनाने के लिए विच्छेदन बल का उपयोग करके माइक्रोइंजेक्शन सुइयों से युक्तियों को सावधानीपूर्वक तोड़ें।
      नोट: माइक्रोपिपेट पुलर के लिए आवश्यक सेटिंग्स मशीन के आधार पर भिन्न हो सकती हैं।
    2. इंजेक्शन प्रणाली को इकट्ठा करें। 38 सेमी सिलिकॉन टयूबिंग के दो टुकड़े लें और उनके बीच 0.2 μm फ़िल्टर रखकर उन्हें एक दूसरे से कनेक्ट करें। ट्यूब के अंत में एक माउथपीस डालें जो फ़िल्टर आउटलेट (सिलिकॉन ट्यूब 1) से जुड़ा हुआ है, और ट्यूब के अंत में एक कनेक्टर है जो फ़िल्टर इनलेट (सिलिकॉन ट्यूब 2) से जुड़ा हुआ है। अंत में, माइक्रोइंजेक्शन सुई को कनेक्टर में डालें (चित्रा 1 बी)।
    3. 0.5 एमएल ट्यूब में 2.5 मिलीग्राम एमएल -1 की एकाग्रता के लिए डीपीबीएस -/ - के साथ फ्लोरोसेंटली लेबल लेंस क्यूलिनेरिस एग्लूटीनिन (एलसीए) पतला करें और समुच्चय को ट्यूब के नीचे ले जाने के लिए माइक्रोसेंट्रीफ्यूज में ~ 30 सेकंड के लिए स्पिन करें।
    4. पैराफिल्म के एक टुकड़े पर एलसीए के 20 μL का पिपेट।
    5. पैराफिल्म से एलसीए के 20 μL को इकट्ठे इंजेक्शन सिस्टम के माइक्रोकेशिका सुई में डालें।
  2. इंजेक्शन
    1. घुमावदार विच्छेदन कैंची के साथ खिड़की से टेप काट लें। अंडे को एक रबर धारक में एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के नीचे रखें।
    2. वाहिका का मूल्यांकन करें और नसों का पता लगाएं, जिन्हें धमनियों से उनके थोड़े चमकीले लाल रंग से अलग किया जा सकता है (चित्रा 1 ए; दिन 12)। वाहिका तक पहुंच में सुधार करने के लिए, घुमावदार विच्छेदन कैंची से काटकर खिड़की को सावधानीपूर्वक बड़ा करें। पहुंच और आकार के आधार पर इंजेक्शन के लिए एक नस का चयन करें।
    3. माइक्रोकेशिका सुई की नोक को चयनित नस में 0 ° -20º कोण पर डालें। सुनिश्चित करें कि सुई धीरे से नोक को एक तरफ से दूसरी तरफ ले जाकर नस में है। एलसीए को इंजेक्ट करने के लिए इंजेक्शन सिस्टम में धीरे से और लगातार प्रहार करें (चित्रा 1 ए; दिन 12)।
      नोट: यदि नस में सुई सही स्थिति में है, तो इसे नस की सीमाओं के भीतर रहना चाहिए।
    4. एलसीए को प्रसारित करने देने के लिए अंडे को 10 मिनट के लिए इनक्यूबेटर में वापस रखें।
      नोट: इस समय के दौरान टेप के साथ अंडे को सील करना आवश्यक नहीं है।

5. इनक्यूबेशन के 12 वें दिन प्रत्यारोपित ऑर्गेनोइड एकत्र करना

  1. मुर्गी के भ्रूण की बलि देना
    1. अंडे को बेंच पर रबर होल्डर में रखें। घुमावदार विच्छेदन कैंची के साथ खिड़की से टेप काट लें। फिर, घुमावदार विच्छेदन कैंची के साथ भ्रूण के आसपास की झिल्ली के माध्यम से काटें।
      नोट: इस चरण के लिए एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप की आवश्यकता नहीं है।
    2. भ्रूण को छिद्रित चम्मच से अंडे से ऊपर निकालें और कैंची का उपयोग करके भ्रूण को तुरंत हटा दें। भ्रूण के शरीर को विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत एक पेट्री डिश में रखें।
  2. ऑर्गेनोइड का पता लगाना और एकत्र करना
    1. पेट्री डिश में भ्रूण को उसकी पीठ पर रखें और उसके अंगों को फैलाएं।
    2. बल का उपयोग करके अनुदैर्ध्य अक्ष के साथ भ्रूण की पेट की दीवार को सावधानीपूर्वक खोलें।
    3. भ्रूण के अंदर ऑर्गेनॉइड का पता लगाएं। ऑर्गनॉइड अक्सर दाहिने यकृत लोब से जुड़ा होता है, या तो पुच्छल सिरे पर या पसली पिंजरे के ठीक नीचे कपाल (चित्रा 1 ए; दिन 12)। इसलिए इन स्थानों को देखकर शुरू करने की सिफारिश की जाती है।
    4. एक बार ऑर्गनॉइड स्थित होने के बाद, इसे सूक्ष्म कैंची के साथ इसके चारों ओर काटकर भ्रूण से हटा दें। ऑर्गेनॉइड और चिकन ऊतक को रखें जो अनिवार्य रूप से इससे जुड़ा हुआ है, विच्छेदन माइक्रोस्कोप के तहत एक पेट्री डिश में। डबल-एज स्टेनलेस स्टील रेजर ब्लेड के साथ जितना संभव हो उतना चिकन ऊतक निकालें।
    5. वांछित विश्लेषण के आधार पर ऑर्गनॉइड को संसाधित करें।

6. होल-माउंट इम्यूनोफ्लोरेसेंस धुंधला

  1. एक प्रत्यारोपित ऑर्गेनॉइड को 24-वेल प्लेट में रखें और 24 घंटे के लिए 4 डिग्री सेल्सियस पर 4% पैराफॉर्मलडिहाइड (पीएफए) के 500 μL में ठीक करें। DPBS-/- के साथ 3x धो लें।
  2. कमरे के तापमान पर 2 घंटे के लिए ब्लॉकिंग समाधान के 300 μL (DPBS में 0.3% ट्राइटन-X जिसमें 10% गधा सीरम होता है) में ऑर्गेनॉइड को परमेबिलाइज और ब्लॉक करें।
  3. प्राथमिक एंटीबॉडी मिश्रण तैयार करें: एक ऑर्गेनॉइड के लिए, प्राथमिक एंटीबॉडी एनपीएचएस 1 (भेड़-α-मानव, 1: 100 का कमजोर पड़ना), सीडी 31 (माउस-α-मानव, 1: 100 का कमजोर पड़ना), और एलटीएल (बायोटिन-संयुग्मित, 1: 300 का कमजोर पड़ना) को ब्लॉकिंग समाधान के 300 μL में पतला करें। ऑर्गेनॉइड में एंटीबॉडी मिश्रण जोड़ें और 4 डिग्री सेल्सियस पर 72 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें।
  4. DPBS में 0.3% TritonX के साथ 3x धोएं।
  5. द्वितीयक एंटीबॉडी मिश्रण तैयार करें: एक ऑर्गेनॉइड के लिए, द्वितीयक एंटीबॉडी गधे-α-भेड़ एलेक्सा फ्लुर 647 (1:500 का पतला पड़ना), गधा-α-माउस एलेक्सा फ्लुर 488 (1:500 का कमजोर पड़ना), और स्ट्रेप्टाविडिन एलेक्सा फ्लुर 405 (1:200 का कमजोर पड़ना) ब्लॉकिंग समाधान के 300 μL में। द्वितीयक एंटीबॉडी मिश्रण को ऑर्गेनॉइड में जोड़ें और कमरे के तापमान पर 2-4 घंटे के लिए इनक्यूबेट करें। प्रकाश के लिए द्वितीयक एंटीबॉडी के संपर्क से बचने के लिए एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर करें।
  6. DPBS-/- के साथ 3x धो लें।
  7. ऑर्गनॉइड को 35 मिमी ग्लास बॉटम डिश में माउंटिंग माध्यम के ~ 30 μL में एम्बेड करें और एल्यूमीनियम पन्नी के साथ कवर किए गए कमरे के तापमान पर रात भर सूखने दें। 4 डिग्री सेल्सियस पर स्टोर करें।
  8. एक कॉन्फोकल माइक्रोस्कोप का उपयोग करके छवि।

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Representative Results

किडनी ऑर्गेनोइड्स के लिए एचआईपीएससी के विभेदन के लिए विधि और समयरेखा, निषेचित चिकन अंडे के इनक्यूबेशन, किडनी ऑर्गेनोइड्स के प्रत्यारोपण, एलसीए के इंजेक्शन और ऑर्गेनोइड्स के संग्रह को चित्रा 1 ए में संक्षेप ति किया गया है। ऑर्गेनॉइड भेदभाव और चिकन अंडे के इनक्यूबेशन के समय का समन्वय करना महत्वपूर्ण है, इनक्यूबेशन से 15 दिन पहले भेदभाव शुरू होता है। इनक्यूबेशन के दिन 0, 3, 4 और 12 पर कार्यों को समयरेखा के नीचे तस्वीरों द्वारा चित्रित किया गया है। ऑर्गेनोइड्स को दिन 4 (एचएच 23-24) चिकन भ्रूण में भेदभाव के दिन 7 + 12 पर प्रत्यारोपित किया जाता है। एलसीए को प्रत्यारोपण के 8 दिन बाद भ्रूण की शिरापरक प्रणाली में इंजेक्ट किया जाता है ताकि भ्रूण का त्याग करने और ऑर्गेनॉइड को पुनः प्राप्त करने से पहले, संक्रमित वाहिका को दाग दिया जा सके। इकट्ठे इंजेक्शन सिस्टम को चित्रा 1 बी में दिखाया गया है।

चिकन भ्रूण इनक्यूबेशन के 12 वें दिन बलिदान किया जाता है (चित्रा 1 ए)। भ्रूण के सावधानीपूर्वक विच्छेदन पर, प्रत्यारोपित ऑर्गेनॉइड आमतौर पर यकृत से जुड़ा पाया जा सकता है। एक विच्छेदन माइक्रोस्कोप के माध्यम से देखने पर, यह संवहनी प्रतीत होता है (चित्रा 1 ए; दिन 12; चरण 5.2.3)। एलसीए के साथ इंजेक्ट किए गए और नेफ्रॉन संरचनाओं और मानव ईसी के लिए दाग लगाए गए प्रत्यारोपित ऑर्गेनोइड्स की कॉन्फोकल इमेजिंग संक्रमित रक्त वाहिकाओं (चित्रा 2 ए) द्वारा वैस्कुलराइजेशन की पुष्टि करती है, जो ग्लोमेरुलर संरचनाओं पर भी आक्रमण करती है (चित्रा 2 बी)। वाहिका चिमेरिक है: संक्रमित मानव ईसी (सीडी 31 +, एलसीए +), अनपरफ्यूज्ड मानव ईसी (सीडी 31 +, एलसीए -), और संक्रमित चिकन-व्युत्पन्न ईसी (सीडी 31-, एलसीए +) को अलग किया जा सकता है (चित्रा 2 ए, पैनल III, IV, V)।

Figure 1
चित्र 1: इनट्रेसलोमिक प्रत्यारोपण विधि। (ए) किडनी ऑर्गेनोइड्स, निषेचित चिकन अंडे के इनक्यूबेशन और किडनी ऑर्गेनोइड्स के इनट्रेसेलोमिक प्रत्यारोपण के लिए एचआईपीएससी के भेदभाव की समयरेखा। चिकन अंडे की इनक्यूबेशन शुरू होने से 15 दिन पहले (विभेदन दिवस 0 = इनक्यूबेशन दिन -15) एचआईपीएससी का विभेदन शुरू किया जाता है ताकि इनक्यूबेशन के दिन 7 + 12 पर चिकन भ्रूण में भेदभाव के दिन 7 + 12 पर किडनी ऑर्गेनोइड्स के प्रत्यारोपण को सक्षम किया जा सके। इनक्यूबेशन के दिन: दिन 0: निषेचित चिकन अंडे धारकों (चरण 2.1.1) पर क्षैतिज रूप से तैनात किए जाते हैं, जिन्हें 38 डिग्री सेल्सियस ± 1 डिग्री सेल्सियस (प्रोटोकॉल चरण 2.1.2) पर इनक्यूबेटर में रखा जाता है। दिन 3: प्रत्येक अंडे में एक खिड़की बनाई जाती है, जिसमें अंडे के ऊपर की ओर एक छोटा सा छेद होता है, जिसमें घुमावदार विच्छेदन कैंची (चरण 2.2.3) की एक जोड़ी के तेज सिरे होते हैं और इस छेद से शुरू होने वाली एक गोलाकार खिड़की को काटते हैं (चरण 2.2.4)। इनक्यूबेटर में अंडे को वापस रखने से पहले खिड़की को पारदर्शी टेप से सील किया जाता है। दिन 4: भेदभाव के दिन 7 + 12 पर किडनी ऑर्गेनोइड्स का इनट्रेसलोमिक प्रत्यारोपण किया जाता है। भ्रूण एचएच 23-24 में है और इसके बाईं ओर पड़ा हुआ है, इसके दाईं ओर दर्शक के सामने है (चरण 3.1.3)। पंख और पैर की कली के बीच, सेलोमिक गुहा तक पहुंच प्राप्त करने के लिए विटेलिन झिल्ली, कोरियन और एमनियन में एक उद्घाटन किया जाता है, और ऑर्गेनॉइड को इन छिद्रों के माध्यम से सेलोम में डाला जाता है। प्रत्यारोपण के बाद, ऑर्गेनॉइड विंग बड के ठीक पीछे स्थित एक सफेद संरचना के रूप में दिखाई देता है। खोले गए विटेलिन और एमनियन झिल्ली के किनारे दिखाई देते हैं (चरण 3.2.3 और 3.2.3-ज़ूम)। कुछ मामलों में, भ्रूण को घुमाया जाता है, बाईं ओर (3.1.3 नोट) के बजाय उनके दाईं ओर लेटा जाता है, और प्रत्यारोपण से पहले चारों ओर घुमाया जाना चाहिए। दिन 12: फ्लोरोसेंटली लेबल लेक्टिन को अंतःशिरा रूप से इंजेक्ट किया जाता है। नसों को उनके रंग से धमनियों से अलग किया जाता है; नसों में रक्त ऑक्सीजन युक्त होता है, जो सीएएम से आता है, इसलिए वे भ्रूण से आने वाली धमनियों की तुलना में थोड़ा चमकीला लाल होते हैं (चरण 4.2.2., 4.2.2-ज़ूम, और 4.2.3.)। भ्रूण का बलिदान किया जाता है और ऑर्गनॉइड को पुनः प्राप्त किया जाता है। ऑर्गनॉइड (सर्कल) चिकन यकृत से जुड़ा हुआ हो गया है और संवहनी प्रतीत होता है (चरण 5.2.3)। स्केल बार = 1 मिमी। शीर्ष पैनल में इनट्रेसेलोमिक प्रत्यारोपण छवि को दर्शाने वाली योजनाबद्ध छवि को कोनिंग एट अल .28 से अनुमति के साथ पुनर्मुद्रित किया गया था। (बी) इकट्ठे इंजेक्शन सिस्टम की छवि, जिसमें एक माउथपीस, 38 सेमी सिलिकॉन टयूबिंग के दो टुकड़े, एक 0.2 μm फिल्टर, एक कनेक्टर और एक ग्लास माइक्रोइंजेक्शन सुई शामिल है जो एक माइक्रोपिपेट पुलर में ग्लास माइक्रोकेशिकाओं को खींचकर उत्पन्न हुई थी। संक्षेप: ए = एलेंटोइस; एम = एमनियन; सी = सेलोम; सीसी = कट कोरियन झिल्ली; CHIR = CHIR99021; एफजीएफ 9 = फाइब्रोब्लास्ट विकास कारक 9; HIPSC = मानव प्रेरित प्लुरिपोटेंट स्टेम सेल; आईएम = मध्यवर्ती मेसोडर्म; एलबी = पैर की कली; ओ = ऑर्गेनॉइड; पीएस = आदिम लकीर; यू = नाभि अंगूठी; वी = विटेलिन झिल्ली; डब्ल्यूबी = विंग बड; Y = जर्दी डंठल। कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

Figure 2
चित्र 2: संवहनी प्रत्यारोपित किडनी ऑर्गेनोइड्स। (ए) एक अप्रत्यारोपित किडनी ऑर्गनॉइड और (II) एक प्रत्यारोपित किडनी ऑर्गेनॉइड की इम्यूनोफ्लोरोसेंट छवियां। दोनों स्थितियों में, ग्लोमेरुलर (एनपीएचएस 1 +, सियान) और ट्यूबलर (एलटीएल +, पीला) संरचनाएं दिखाई देती हैं। अप्रत्यारोपित ऑर्गेनोइड्स में, कुछ मानव ईसी (सीडी 31 +, हरा) मौजूद हैं। प्रत्यारोपित ऑर्गेनॉइड में, एक संक्रमित संवहनी नेटवर्क (सीडी 31+, हरा; इंजेक्शन रोडामाइन-लेबल एलसीए +, सफेद) पूरे ऑर्गेनॉइड में दिखाई देता है। पैनल III, IV, और V में, पैनल II में बॉक्स किए गए क्षेत्रों के आवर्धन दिखाए गए हैं, ताकि तीन प्रकार के ईसी को प्रदर्शित किया जा सके जिन्हें प्रत्यारोपित ऑर्गेनोइड्स में अलग किया जा सकता है। पैनल III में संक्रमित मानव ईसी (सीडी 31+, एलसीए +) शामिल हैं, जिन्हें तीर के साथ चिह्नित किया गया है। पैनल IV में अनफ्यूज्ड मानव ईसी (सीडी 31+, एलसीए-) शामिल हैं, जिन्हें तीर के साथ चिह्नित किया गया है। पैनल वी में परफ्यूज्ड चिकन-व्युत्पन्न ईसी (सीडी 31-, एलसीए +) होते हैं, जिन्हें तीर के साथ चिह्नित किया जाता है। स्केल बार = 200 μm. (B) अप्रत्यारोपित ऑर्गेनोइड्स (I) में, ECs (CD31+, हरा) ग्लोमेरुलर संरचनाओं (NPHS1+, सियान) को घेर लेते हैं, लेकिन उन पर आक्रमण नहीं करते हैं। प्रत्यारोपित ऑर्गेनोइड्स (II) में, ग्लोमेरुलर संरचनाएं (एनपीएचएस 1 +, नीली) संक्रमित केशिकाओं (एलसीए +, सफेद) द्वारा संवहनी होती हैं; सीडी 31 +, हरा)। स्केल बार = 50 μm. कृपया इस आंकड़े का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहाँ क्लिक करें.

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Discussion

इस पांडुलिपि में, चिकन भ्रूण में एचआईपीएससी-व्युत्पन्न किडनी ऑर्गेनोइड्स के इनट्रैसेलोमिक प्रत्यारोपण के लिए एक प्रोटोकॉल का प्रदर्शन किया गया है। प्रत्यारोपण पर, ऑर्गेनोइड्स को संक्रमित रक्त वाहिकाओं द्वारा संवहनी किया जाता है जिसमें मानव ऑर्गेनॉइड-व्युत्पन्न और चिकन-व्युत्पन्न ईसी का संयोजन होता है। ये पूरे ऑर्गेनोइड में फैले हुए हैं और ग्लोमेरुलर संरचनाओं पर आक्रमण करते हैं, जिससे ईसी और पोडोसाइट्स के बीच बातचीत हो सकती है। यह पहले दिखाया गया था कि इससे ऑर्गेनॉइड ग्लोमेरुलर और ट्यूबलर संरचनाओं की परिपक्वता बढ़ जाती है। प्रत्यारोपण बहुत कुशल है, प्रति भ्रूण ~ 5 मिनट लेता है, और भ्रूण को जिस एकमात्र रखरखाव की आवश्यकता होती है वह इनक्यूबेटर में पानी के बेसिन का नियमित रिफिल है। इसलिए यह विधि बड़ी संख्या में ऑर्गेनोइड्स के विश्लेषण के लिए बहुत उपयुक्त है।

गुर्दे के ऑर्गेनोइड्स के वैस्कुलराइजेशन और परिपक्वता को पहले चूहों18,20 में प्रत्यारोपण के माध्यम से प्रदर्शित किया गया है। इन श्रम-गहन माउस मॉडल में, ऑर्गेनोइड्स को 2 से 12 सप्ताह तक प्रत्यारोपित किया गया था। यहां दिखाए गए इंट्रासेलोमिक प्रत्यारोपण प्रयोगों में, प्रत्यारोपण की अवधि 8 दिनों तक सीमित थी। यह इनक्यूबेशन के 13 वें दिन से पहले भ्रूण के बलिदान की अनुमति देता है, जब उन्हें33,34 दर्द का अनुभव करना शुरू कर दिया जाता है। चूंकि चिकन भ्रूण 21 वें दिन निकलता है, इसलिए प्रत्यारोपण की अवधि 15 दिनों तक बढ़ाई जा सकती है, अंडे सेने से बचने के लिए 19 वें दिन भ्रूण का त्याग किया जा सकता है। हालांकि, इसके लिए एनेस्थेटिक्स के उपयोग की आवश्यकता होगी। इस मॉडल में अपेक्षाकृत कम प्रत्यारोपण अवधि के बावजूद, यह इन विट्रो ऑर्गेनोइड्स की तुलना में ऑर्गेनॉइड नेफ्रॉन के व्यापक वैस्कुलराइजेशन और महत्वपूर्ण परिपक्वता को प्रेरित करता है, जिसमें ऑर्गनॉइड पोडोसाइट्स और हमलावर ईसीएस28 के बीच जीबीएम का गठन शामिल है।

इंट्रासेलोमिक प्रत्यारोपण प्रयोगों का प्रदर्शन करते समय, यह विचार करना महत्वपूर्ण है कि सभी चिकन भ्रूण सामान्य रूप से विकसित नहीं होते हैं और जीवित रहते हैं। आमतौर पर, दिन 0 पर इनक्यूबेटर में रखे गए ~ 65% भ्रूण प्रयोग के अंतिम बिंदु तक पहुंचते हैं। यह प्रत्यारोपण के दौरान वाहिका क्षति (हमारे हाथों में 5% -10%) और खिड़कियां और प्रत्यारोपण प्रक्रियाओं से प्रेरित तनाव के कारण तीव्र रक्तस्राव के संयोजन के कारण होता है। जब भ्रूण एचएच 23-24 की तुलना में पहले या बाद के चरण में होते हैं, तो प्रत्यारोपण क्रमशः सीमित स्थान और अधिक व्यापक वाहिका के कारण जटिल हो जाता है। यदि भ्रूण अपेक्षित समय पर सही चरण में नहीं हैं, तो यह इनक्यूबेशन के तापमान के कारण हो सकता है, क्योंकि उच्च तापमान आम तौर पर तेजी से विकास की ओर जाता है।

इसके अलावा, इनक्यूबेशन से पहले लंबे समय तक कमरे के तापमान पर निषेचित अंडे रखना विकास में अधिक परिवर्तनशीलता को प्रेरित करता है। इससे बचने के लिए, इनक्यूबेटर का तापमान प्रयोगों के दौरान और बीच स्थिर रखा जाना चाहिए, और निषेचित अंडे के वितरण के बाद 3 दिनों के भीतर इनक्यूबेशन शुरू किया जाना चाहिए। प्रक्रियाओं के बीच भ्रूण की मृत्यु का अप्रत्याशित रूप से उच्च प्रतिशत निर्जलीकरण के कारण हो सकता है। इससे बचने के लिए, प्रत्येक अंडे को खोलने के बाद और प्रत्यारोपण के बाद उसमें डीपीबीएस + / + की दो या तीन बूंदें जोड़ना और टेप के साथ अंडे को बहुत सावधानी से सील करना आवश्यक है, जितना संभव हो टेप में क्रीज को चिकना करना। अंडे खोलने की संख्या को कम करने के लिए खिड़की और प्रत्यारोपण चरणों के संयोजन की सिफारिश नहीं की जाती है, क्योंकि दिन 4 पर खिड़की से भ्रूण की मृत्यु में काफी वृद्धि होती है। यह रक्त वाहिकाओं को नुकसान का परिणाम है जो अक्सर इस स्तर पर अंडे के छिलके से जुड़े होते हैं।

अंत में, यह विधि वैस्कुलराइजेशन को प्रेरित करने और किडनी ऑर्गेनोइड्स में परिपक्वता बढ़ाने के लिए एक कुशल और शक्तिशाली उपकरण प्रदान करती है। इसका उपयोग बड़ी संख्या में ऑर्गेनोइड्स में इन प्रक्रियाओं का अध्ययन करने के लिए किया जा सकता है और गुर्दे की बीमारियों के मॉडलिंग की क्षमता है जिन्हें वर्तमान में विट्रो में प्राप्त होने की तुलना में परिपक्वता के उच्च स्तर की आवश्यकता होती है।

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Disclosures

लेखकों के पास खुलासा करने के लिए हितों का कोई टकराव नहीं है।

Acknowledgments

हम चिकन भ्रूण इंजेक्शन के साथ उनकी मदद के लिए जॉर्ज गैलारिस (एलयूएमसी, लीडेन, नीदरलैंड) को धन्यवाद देते हैं। हम सास्किया वैन डेर वाल-मास (एनाटॉमी और भ्रूण विज्ञान विभाग, एलयूएमसी, लीडेन, नीदरलैंड), कोनी वैन मुंस्टरेन (एनाटॉमी और भ्रूणविज्ञान विभाग, एलयूएमसी, लीडेन, नीदरलैंड), मैनन ज़ुरमंड (एलयूएमसी, लीडेन, नीदरलैंड), और एनेमेरी डी ग्राफ (एलयूएमसी, लीडेन, नीदरलैंड) के समर्थन को स्वीकार करते हैं। M. Koning is is of 'Nephrosearch Stichting tot steun van het wetenschappelijk onderzoek van de afdeling Nierziekten van het LUMC'. यह काम लीडेन यूनिवर्सिटी फंड "प्रोफेसर जाप डी ग्रेफ-लिंगलिंग वियाधनर्मा फंड" जीडब्ल्यूएफ 2019-02 द्वारा समर्थित था। यह काम पुनर्योजी चिकित्सा क्रॉसिंग बॉर्डर्स (RegMedXB) और हेल्थ हॉलैंड, टॉप सेक्टर लाइफ साइंसेज एंड हेल्थ के भागीदारों द्वारा समर्थित है। वैन डेन बर्ग और टीजे राबेलिंक को नोवो नॉर्डिस्क फाउंडेशन सेंटर फॉर स्टेम सेल मेडिसिन (आरईन्यू) द्वारा समर्थित किया जाता है, नोवो नॉर्डिस्क फाउंडेशन सेंटर फॉर स्टेम सेल मेडिसिन नोवो नॉर्डिस्क फाउंडेशन अनुदान (एनएनएफ 21सीसी0073729) द्वारा समर्थित है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
0.2 µm filter: Whatman Puradisc 30 syringe filter 0.2 µm Whatman 10462200
35 mm glass bottom dishes  MatTek Corporation P35G-1.5-14-C
Aspirator tube assemblies for calibrated microcapillary pipettes Sigma-Aldrich A5177-5EA Contains silicone tubes, mouth piece and connector
Confocal microscope: Leica White Light Laser Confocal Microscope  Leica TCS SP8
Dissecting forceps, simple type. Titanium, curved, with fine sharp tips Hammacher Karl HAMMHTC091-10
Dissecting forceps, simple type. Titanium, straight, with fine sharp tips Hammacher Karl HAMMHTC090-11
Dissecting microscope  Wild Heerbrugg 355110
Dissecting scissors, curved, OP-special, extra sharp/sharp Hammacher Karl HAMMHSB391-10
Donkey serum Sigma-Aldrich D9663
Donkey-α-mouse Alexa Fluor 488 ThermoFisher Scientific A-212-02 dilution 1:500
Donkey-α-sheep Alexa Fluor 647 ThermoFisher Scientific A-21448 dilution 1:500
Double edged stainless steel razor blades Electron Microsopy Sciences 72000
DPBS, calcium, magnesium (DPBS-/-) ThermoFisher Scientific 14040133
DPBS, no calcium, no magnesium (DPBS+/+) ThermoFisher Scientific 14190094
Egg cartons or custom made egg holders  NA NA
Fertilized white leghorn eggs (Gallus Gallus Domesticus)  Drost Loosdrecht B.V. NA
Incubator Elbanton BV ET-3 combi
Lotus Tetragonolobus lectin (LTL) Biotinylated Vector Laboratories B-1325 dilution 1:300
Micro scissors, straight, sharp/sharp, cutting length 10 mm Hammacher Karl HAMMHSB500-09
Microcapillaries: Thin wall glass capillaries 1.5 mm, filament World Precision Instruments TW150F-3
Micropipette puller Sutter Instrument Company Model P-97 We use the following settings: Heat 533, Pull 60, Velocity 150, Time 200
Microscalpel holder: Castroviejo blade and pins holder, 12 cm, round handle, conical 10 mm jaws. Euronexia L-120
Mounting medium: Prolong Gold Antifade Mountant  ThermoFisher Scientific P36930
Olivecrona dura dissector 18 cm  Reda 41146-18
Parafilm  Heathrow Scientific HS234526B
Penicillin-streptomycin 5,000 U/mL ThermoFisher Scientific 15070063
Perforated spoon  Euronexia S-20-P
Petri dish 60 x 15 mm  CELLSTAR 628160
Plastic transfer pipettes  ThermoFisher Scientific PP89SB
Purified mouse anti-human CD31 antibody BD Biosciences 555444 dilution 1:100
Rhodamine labeled Lens Culinaris Agglutinin (LCA) Vector Laboratories RL-1042 This product has recently been discontinued. Vectorlabs does still produce Dylight 649 labeled LCA (DL-1048-1) and fluorescein labeled LCA (FL-1041-5)
Sheep anti-human NPHS1 antibody R&D systems AF4269 dilution 1:100
Sterile hypodermic needles, 19 G BD microlance 301500
Streptavidin Alexa Fluor 405 ThermoFisher Scientific S32351 dilution 1:200
Syringe 5 mL BD Emerald 307731
Transparent tape  Tesa 4124 Available at most hardware stores
Triton X Sigma-Aldrich T9284
Tungsten wire, 0.25 mm dia  ThermoFisher Scientific 010404.H2

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References

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चिकन भ्रूण में इनट्रेसलोमिक प्रत्यारोपण के माध्यम से किडनी ऑर्गेनोइड्स का कुशल वैस्कुलराइजेशन
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Koning, M., Lievers, E., Jaffredo, T., van den Berg, C. W., Rabelink, T. J. Efficient Vascularization of Kidney Organoids through Intracelomic Transplantation in Chicken Embryos. J. Vis. Exp. (192), e65090, doi:10.3791/65090 (2023).

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