Summary
يفصل هذا البروتوكول إعداد CLON-G لإطالة عمر العدلات إلى أكثر من 5 أيام ويوفر إجراء موثوقا به لتقييم موت العدلات باستخدام قياس التدفق الخلوي والفحص المجهري الفلوري متحد البؤر.
Abstract
متوسط عمر العدلات أقل من 24 ساعة ، مما يحد من الأبحاث الأساسية حول العدلات وتطبيق دراسات العدلات. أشار بحثنا السابق إلى أن المسارات المتعددة يمكن أن تتوسط في الموت التلقائي للعدلات. تم تطوير كوكتيل من خلال استهداف هذه المسارات في وقت واحد ، وتثبيط نفاذية غشاء الكاسباس - الليزوزومي - المؤكسد - التنخر بالإضافة إلى عامل تحفيز مستعمرة المحببات (CLON-G) ، والذي يطيل عمر العدلات إلى أكثر من 5 أيام دون المساس بشكل كبير بوظيفة العدلات. في الوقت نفسه ، تم تطوير بروتوكول موثوق ومستقر لتقييم وتقييم موت العدلات. في هذا العمل ، نظهر أن CLON-G يمكن أن يطيل عمر العدلات في المختبر إلى أكثر من 5 أيام ، ونعرض إطالة عمر العدلات باستخدام FACS والفحص المجهري الفلوري متحد البؤر. يقدم هذا التقرير إجراءات لإعداد CLON-G ويعرض مقايسة الموت التلقائي في المختبر للعدلات ، والتي يمكن استخدامها لدراسة العدلات ولاستجواب موت العدلات لاحقا ، وبالتالي توفير مورد موثوق لمجتمع العدلات.
Introduction
من المعروف أن العدلات تتكون من ترسانة من حبيبات السيتوبلازم الوفيرة ، نيكوتيناميد الأدينين ثنائي النوكليوتيد فوسفات (NADPH) أوكسيديز ، الإنزيمات المضادة للميكروبات ، والعضيات المختلفة التي تدافع ضد الميكروبات الغازية. بالإضافة إلى ذلك ، فهي شديدة الحركة وهي الخلايا الأولى التي يتم تجنيدها إلى موقع الالتهاب ، مما يعني أن العدلات هي خط الدفاع الأول لجهاز المناعة الفطري 1,2. وبالتالي أصبح العلاج بنقل الخلايا المحببة علاجا سريريا واعدا للعدوى المرتبطة بقلة العدلات لتعزيز مناعة العدلات بشكل عابر3،4،5. أظهرت الاكتشافات الحديثة بوضوح أن العدلات تعمل أيضا كمستجيبات متعددة الأوجه في العديد من السيناريوهات الفسيولوجيةالمرضية 6. متوسط عمر العدلات أقل من 24 ساعة ، وبالتالي ، فإن الأبحاث الأساسية حول العدلات وتطبيق دراسات العدلات صعبة للغاية بسبب القيود المتعلقة بالتلاعب الجيني المستقر والتخزين طويل الأجل7،8،9،10،11. هناك بعض خطوط الخلايا التي يمكن أن تعرض جزئيا بعض وظائف العدلات ، مثل HL-60 و PLB-985 و NB4 و Kasumi-1 والخلايا الجذعية المستحثةمتعددة القدرات 12. يمكن أن تحقق خطوط الخلايا هذه تحريرا فعالا للجينات وحفظها بالتبريد. ومع ذلك ، فإنها لا تزال تختلف اختلافا كبيرا عن العدلات الأولية ، وبالتالي ، لا يمكنها تلخيص وظائف العدلات بأمانة13. وبالتالي ، فإن معظم الأبحاث في هذا المجال لا تزال تعتمد على العدلات الأولية المعزولة حديثا. لا يزال المجال يعتمد على توليد فئران مشروطة مكلفة وتستغرق وقتا طويلا للتحقيق في وظائف جينية محددة في العدلات ، ولكن لا توجد نماذج بشرية حاليا.
بعد أن بذلنا جهودنا في استكشاف العمليات غير المتجانسة التي ينطوي عليها موت العدلات والمسارات المتعددة التي تنظم هذه العمليات 14,15 ، تم الإبلاغ مؤخرا عن علاج جديد يسمى CLON-G (نفاذية الغشاء الليزوزومي - المؤكسد - تثبيط التنخر بالإضافة إلى عامل تحفيز مستعمرة المحببات) 16. يتكون CLON-G من Q-VD-oph (كينوليل - فاليل-O-ميثيل أسبارتيل- [-2،6-ثنائي فلورو فينوكسي] - ميثيل كيتون) ، Hsp70 (بروتين الصدمة الحرارية 70) ، DFO (ديفيروكسامين) ، NAC (N-أسيتيل سيستئين) ، Nec-1s (نيكروستاتين -1s) ، و G-CSF (عامل تحفيز مستعمرة المحببات). يتم التوسط في الموت التلقائي للعدلات من خلال مسارات متعددة ، بما في ذلك موت الخلايا المبرمج ، والتنخر ، والبيروبتوس. Q-VD-oph يثبط موت الخلايا المبرمج للعدلات كمثبط لعموم الكاسباز عن طريق استهداف الكاسباز 1 ، الكاسباز 3 ، الكاسباز 8 ، والكاسباز 917. يعتمد نخر العدلات على مسار إشارات يتضمن بروتين كيناز -1 المتفاعل مع المستقبلات (RIPK1) وبروتين شبيه بمجال كيناز مختلط السلالة (MLKL)18. كمثبط ل RIPK1 ، تمنع Nec-1s نخر العدلات. يمكن أن يمنع Hsp70 و DFO نفاذية الغشاء الليزوزومي (LMP) ، والتي يمكن أن تحفز موت الخلايا المبرمجالعدلات 19 و pyroptosis20. تلعب أنواع الأكسجين التفاعلية (ROS) أدوارا حيوية في موت العدلات عن طريق التوسط في LMP19 وموت الخلايا المبرمج21 وتثبيط إشارات البقاء على قيد الحياة22. كمضاد للأكسدة يمكن أن يقلل من تراكم أنواع الأكسجين التفاعلية ، يؤخر NAC موت العدلات. كعامل نمو ، ينشط G-CSF إشارات بقاء العدلات ويمنع موت الخلايا المبرمج الناجم عن كالبين23,24. من خلال استهداف مسارات الموت العفوية المتعددة للعدلات في وقت واحد ، يمكن تمديد عمر العدلات بشكل فعال إلى أكثر من 5 أيام دون المساس بوظيفتها. يوسع علاج CLON-G إمكانيات الحفاظ على العدلات ونقلها والتلاعب بالجينات ، والتي يمكن أن تسرع البحث في مجتمع العدلات. وفي الوقت نفسه ، بناء على معرفة موت العدلات ، يمكن أن تسبب البروتوكولات المعتمدة حاليا لمقايسات موت الخلايا أضرارا غير متوقعة للعدلات14 ، لذلك تم تحسين هذه البروتوكولات لتكون أكثر ملاءمة لدراسات العدلات. يقدم هذا التقرير بروتوكولات مفصلة لزراعة العدلات باستخدام CLON-G ومقايسة موت الخلايا في المختبر لعدلات الفئران باستخدام قياس التدفق الخلوي والتصوير الفلوري. CLON-G فعال على كل من العدلات الفأر والإنسان. ومع ذلك ، يتم عرض عينات الماوس هنا لتبسيط هذا البروتوكول. تركيز NAC هو 1 mM للعدلات الفئران و 10 μM للعدلات البشرية. Hsp70 خاص بالأنواع ، وبالتالي ، يجب استخدامه وفقا لمصدر العدلات. بالنسبة لهذا البروتوكول ، لا يهم ما إذا كانت العدلات معزولة عن الدم المحيطي أو نخاع العظم وكيف يتم عزلها.
بالنسبة للدراسة الحالية ، تم عزل العدلات من نخاع عظم الفأر لتحقيق ما يكفي من العدلات للتجارب ، حيث يمكن الحصول على حوالي 1 × 10 7-1.5 × 107 عدلات من نخاع العظم ، بينما يمكن عزل 1 × 10 6 عدلات فقط من الدم المحيطي لفأر واحد عمره 8-12 أسبوعا C57BL /6 (من أي من الجنسين). تم إجراء الطرد المركزي المتدرج لتجنب الضرر المحتمل والتنشيط من التحفيز الميكانيكي لفرز FACS أو فرز MACS.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
وافقت لجنة رعاية واستخدام الحيوان في مستشفى بوسطن للأطفال والمختبر الرئيسي لأمراض الدم التجريبية (SKLEH) على جميع الإجراءات وراقبتها. يصور الشكل 1 مخططا انسيابيا لزراعة العدلات باستخدام CLON-G ومقايسة الموت في المختبر .
1. تمديد عمر العدلات مع CLON-G
ملاحظة: يجب أن تكون جميع العمليات والمواد المذكورة معقمة. تأكد من خلط جميع الحلول جيدا وتوزيعها بالتساوي.
- الحفاظ على مكونات CLON-G
- قم بإذابة 50 مجم من Q-VD-oph (انظر جدول المواد) إلى تركيز نهائي قدره 100 mM بإضافة 973.7 ميكرولتر من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) ، وماصة السائل حتى يصبح الخليط صافيا. القسمة 50 ميكرولتر لكل أنبوب ، والحفاظ عليها عند -20 درجة مئوية.
تنبيه: DMSO هو سائل كيميائي ضار. ارتد معطف مختبر ونظارات واقية وقناعا لتجنب ملامسة الجلد وملامسة العين والاستنشاق. - قم بإذابة Hsp70 (انظر جدول المواد) عند 4 درجات مئوية ، وقم بتدوير المحتويات في القارورة. القسمة 1 ميكرولتر من Hsp70 لكل أنبوب على الجليد ، والحفاظ عليها عند -80 درجة مئوية.
ملاحظة: Hsp70 هو بروتين. التخزين فائق البرودة ضروري للحفاظ على استقراره. تجنب دورة التجميد والذوبان. - قم بإذابة 1 مجم من DFO (انظر جدول المواد) مع 7.61 مل RPMI 1640 للحصول على مخزون 200 ميكرومتر.
- قم بإذابة 0.1 جم من NAC (انظر جدول المواد) مع 2.5 مل من RPMI 1640 في أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل ، واضبط الرقم الهيدروجيني على 7-7.4 باستخدام NaOH. أضف RPMI 1640 إلى الحجم النهائي البالغ 3.06 مل لإنشاء مخزون NAC 200 مللي متر. قم بترشيحه بوحدة ترشيح 0.2 ميكرومتر. القسمة 500 ميكرولتر لكل أنبوب ، والحفاظ عليها عند -20 درجة مئوية.
ملاحظة: إذابة NAC في هذا التركيز العالي ليس بالأمر السهل ، ويمكن أن تساعد الدوامة في حلها. الفينول الأحمر في RPMI 1640 هو مؤشر مثالي على درجة الحموضة. عندما يتم إذابة NAC للتو ، يكون اللون مصفرا ؛ اضبطه حتى يصبح لونه ورديا. حلول مخزون NAC مستقرة لمدة تصل إلى 1 شهر عند -20 درجة مئوية. - قم بإذابة 10 مجم من Nec-1s (انظر جدول المواد) إلى 20 mM مع 1.8 مل من DMSO ، وماصة الخليط حتى يصبح واضحا. القسمة 50 ميكرولتر لكل أنبوب ، والحفاظ عليها عند -20 درجة مئوية. يحفظ بعيدا عن الضوء.
- قم بإذابة 250 ميكروغرام من G-CSF (انظر جدول المواد) إلى 200 ميكروغرام / مل مع 1.25 مل من RPMI 1640. القسمة 50 ميكرولتر لكل أنبوب ، والحفاظ عليها عند 4 درجات مئوية.
- قم بإذابة 50 مجم من Q-VD-oph (انظر جدول المواد) إلى تركيز نهائي قدره 100 mM بإضافة 973.7 ميكرولتر من ثنائي ميثيل سلفوكسيد (DMSO) ، وماصة السائل حتى يصبح الخليط صافيا. القسمة 50 ميكرولتر لكل أنبوب ، والحفاظ عليها عند -20 درجة مئوية.
- تحضير 2x وسط استزراع CLON-G
- تحضير الوسط الأساسي. أضف 39.5 مل من RPMI 1640 ، و 10 مل من مصل الجنين البقري (FBS) ، و 0.5 مل من البكتيريا العقدية (المضادات الحيوية) إلى أنبوب سعة 50 مل لصنع RPMI 1640 مع 20٪ FBS و 1٪ PS كوسيط أساسي.
ملاحظة: يستخدم هذا التركيز العالي من FBS لتوفير الثقافة المطولة للعدلات ، والتي قد تكون أكبر من 5 أيام. إذا كان وقت الزراعة 1-2 أيام ، فإن 10٪ -15٪ FBS كافية. - قم بإذابة جميع حلول المخزون لمكونات CLON-G على الجليد.
- تمييع 1 ميكرولتر من Hsp70 إلى 20 ميكرومتر بإضافة 606 ميكرولتر من الوسط الأساسي. خفف 1 ميكرولتر من 200 ميكروغرام / مل G-CSF إلى 20 ميكروغرام / مل بإضافة 9 ميكرولتر من الوسط الأساسي.
- أضف 976 ميكرولتر من الوسط الأساسي إلى أنبوب طرد مركزي سعة 15 مل. أضف 1 ميكرولتر من Q-VD-oph (100 مللي مول) ، و 10 ميكرولتر من DFO (200 ميكرومتر) ، و 1 ميكرولتر من Hsp70 (20 ميكرومتر) ، و 10 ميكرولتر من NAC (200 مللي مول) ، و 1 ميكرولتر من Nec-1s (20 مللي مول) ، و 1 ميكرولتر من G-CSF (20 ميكروغرام / مل) لجعل 1 مل من 2x وسط CLON-G.
ملاحظة: يجب استخدام وسيط 2x CLON-G فور تحضيره. يمكن للمرء تخزين 2x CLON-G مؤقتا عند 4 درجات مئوية. يجب التخلص من بقايا 20 ميكرومتر Hsp70.
- تحضير الوسط الأساسي. أضف 39.5 مل من RPMI 1640 ، و 10 مل من مصل الجنين البقري (FBS) ، و 0.5 مل من البكتيريا العقدية (المضادات الحيوية) إلى أنبوب سعة 50 مل لصنع RPMI 1640 مع 20٪ FBS و 1٪ PS كوسيط أساسي.
- ثقافة العدلات
- عزل العدلات الفئران عن طريق الطرد المركزي المتدرج بعد تقرير سابق25. إعادة تعليق العدلات الفأر المعزولة في الوسط الأساسي (1 مليون خلية / 100 ميكرولتر).
ملاحظة: تجنب تنشيط العدلات عن طريق التعامل معها بلطف. تجنب الرغوة أثناء العملية برمتها. - أضف 500 ميكرولتر من 2x وسط CLON-G ، و 400 ميكرولتر من الوسط الأساسي ، و 100 ميكرولتر من تعليق الخلية إلى 24 لوحة استزراع غير أنسجة جيدة (انظر جدول المواد) ، وماصة بلطف ثلاث إلى أربع مرات.
ملاحظة: قد تؤدي التركيزات العالية للمكونات في وسط 2x CLON-G إلى إتلاف العدلات. تجنب إضافتها معا بدون الوسيط الأساسي. لوحة الثقافة غير المزروعة بالأنسجة ضرورية لتجنب التصاق العدلات. - ضع طبق الاستزراع في حاضنة 37 درجة مئوية و 5٪ CO2 بسلاسة.
ملاحظة: ليس من الضروري استبدال وسيط الخلية في غضون 7 أيام. التركيزات النهائية لتكوين CLON-G هي 50 ميكرومتر Q-VD-Oph ، 1 ميكرومتر DFO ، 10 pM Hsp70 ، 1 mM NAC ، 10 μM Nec-1 s ، و 10 ng / mL G-CSF. - قم بتلطيخ العدلات المستزرعة باستخدام صبغة Wright Giemsa المركبة (انظر جدول المواد) ، وقم بتحليلها باستخدام المجهر الضوئي (الشكل 2A-D). بدلا من ذلك ، قم بتلطيخ بالأجسام المضادة APC-CD11b و PE-Cy7-Ly6G ، وقم بتحليلها باستخدام قياس التدفق الخلوي (الشكل 2E-I) كما هو موضح سابقا26.
- عزل العدلات الفئران عن طريق الطرد المركزي المتدرج بعد تقرير سابق25. إعادة تعليق العدلات الفأر المعزولة في الوسط الأساسي (1 مليون خلية / 100 ميكرولتر).
2. في المختبر مقايسة الموت التلقائي من العدلات
- تحليل التدفق الخلوي
- العدلات المعزولة المستزرعة بكثافة 1 مليون خلية / مل في الوسط الأساسي عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO2. لوحة الاستزراع المكونة من 24 بئرا غير مستزرعة بالأنسجة. أضف 1 مل من وسط الخلية لكل بئر.
- قم بإذابة 1 جم من CaCl 2 مع 45 مل من المحلول الملحي لعمل 200 mM CaCl2. قم بترشيحه بوحدة ترشيح 0.2 ميكرومتر. يحفظ عند 4 درجات مئوية.
- تحضير مزيج تلطيخ. أضف 7 ميكرولتر من المحلول الملحي لكل عينة إلى أنبوب 1.5 مل ، وأضف 0.4 مجم / مل FITC-Annexin-V ، و 0.5 مجم / مل يوديد البروبيديوم (PI) ، و 200 مللي متر محلول CaCl2 بمعدل 1 ميكرولتر لكل عينة. تخلط جيدا. استخدم الحل مباشرة بعد التحضير.
- ماصة وسط الخلية بلطف خمس إلى سبع مرات لخلط جيد ، تليها نقل 100 ميكرولتر إلى أنبوب قياس التدفق الخلوي في النقاط الزمنية المطلوبة.
ملاحظة: تجنب الرغوة أثناء العملية برمتها. - حبات عد الدوامة (انظر جدول المواد) لخلطها جيدا. ماصة 10 ميكرولتر من حبات العد المخلوطة جيدا لنفس أنبوب قياس التدفق الخلوي كما في الخطوة 2.1.4.
- أضف 10 ميكرولتر من مزيج التلوين المحضر (الخطوة 2.1.3) إلى أنبوب قياس التدفق الخلوي. احتضان في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق بعيدا عن الضوء.
- أضف 100 ميكرولتر من المحلول الملحي إلى الأنبوب ، واخلطه جيدا لضمان التوزيع المتساوي لخرز العد والخلايا.
- إجراء تحليل التدفق الخلوي لوسط الخلية. اجمع الخلايا بمعدل منخفض مع ~ 400 حدث / ثانية. بوابة خلايا APC-PE-Cy7- إلى FSC-A و SSC-A ، وبوابة الخلايا السليمة ذات المواضع المتوسطة FSC-A و SSC-A إلى FITC-Annexin-V و PE-PI ؛ يتم تصنيف مجموعة Annexin-V−PI− على أنها خلايا سليمة.
ملاحظة: تحدد المعادلات التالية العدد الإجمالي للخلايا السليمة لكل عينة وصلاحية العدلات:
إجمالي عدد الخلايا السليمة لكل عينة27 = (1000 / عدد حبات العد) × عدد سكان Annexin-V−PI− ×10
صلاحية العدلات = إجمالي عدد الخلايا السليمة في الوقت المحدد / إجمالي عدد الخلايا السليمة في الوقت صفر
- مقايسة صورة الفلورسنت
- العدلات المعزولة المستزرعة بكثافة 1 مليون خلية / مل في الوسط الأساسي عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 في صفيحة متحدة البؤر مع2 مل من وسط الخلية لكل لوحة.
ملاحظة: يتمتع المجهر الفلوري متحد البؤر بأفضل جودة للصورة ، ولكن أي مجهر مضان يحتوي على قنوات 488/561 / DIC يكفي لدعم هذه التجربة. - أخرج اللوحة برفق في النقطة الزمنية المحددة. أضف 10 ميكرولتر لكل من 0.4 مجم / مل FITC-Annexin-V و 0.5 مجم / مل PI و 200 مللي متر CaCl2 إلى اللوحة بالتساوي. وصمة عار في درجة حرارة الغرفة لمدة 5 دقائق.
ملاحظة: تجنب الاهتزاز أثناء العملية برمتها. أضف عوامل التلوين بالتساوي وبلطف. - التقط صورا مضان عند قنوات 488 (annexin-V) / 561 (PI) / DIC باستخدام مجهر مضان متحد البؤر مع عدسة موضوعية 20x (انظر جدول المواد). قم بتعيين وقت التعرض لقناة 488 على أنه 500 مللي ثانية وقناة 561 على 200 مللي ثانية وقناة DIC على أنها 100 مللي ثانية. حدد 5-10 مناطق عشوائية لكل لوحة. يتم تعريف أنواع الخلايا في تقريرناالمنشور سابقا 14.
- العدلات المعزولة المستزرعة بكثافة 1 مليون خلية / مل في الوسط الأساسي عند 37 درجة مئوية و 5٪ CO 2 في صفيحة متحدة البؤر مع2 مل من وسط الخلية لكل لوحة.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
لم يتأثر مورفولوجيا رايت جيمسا الملطخة (الشكل 2A-D) والأنماط الظاهرية FACS (الشكل 2E-J) للعدلات المعالجة CLON-G. كانت صلاحية العدلات المعالجة ب CLON-G عند 24 ساعة حوالي 90٪ + بناء على تحليل قياس التدفق الخلوي (الشكل 3) ومقايسات الصور الفلورية (الشكل 4). يمكن أن ينتج انخفاض الصلاحية عن التخزين غير السليم ، أو التركيزات غير الصحيحة لمكونات CLON-G ، أو الجودة الرديئة للعدلات المعزولة الأولية. أظهر تحليل قياس التدفق الخلوي للعدلات غير المعالجة التي تم استزراعها بالوسط الأساسي لمدة 24 ساعة أن هذه العدلات لديها مجموعة إيجابية من Annexin-V (الشكل 3B). يمكن أن يكون فقدان هذه المجموعة بسبب حمض رباعي أسيتيك ثنائي الأمين (EDTA) في وسط الخلية. يجب أن تحتوي الصور الفلورية للعدلات المستزرعة بالوسط الأساسي لمدة 24 ساعة على خلايا منتفخة (سهم أبيض في الشكل 4 أ). قد ينتج فقدان الخلايا المنتفخة عن اهتزاز أو سحب الصفيحة متحدة البؤر.
الشكل 1: مخطط تدفق زراعة العدلات باستخدام CLON-G ومقايسة الموت في المختبر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
الشكل 2: الأنماط الظاهرية لعلامات التشكل وسطح الخلية لعدلات الفأر المعالجة ب CLON-G. تم صبغ الخلايا (A-D) بصبغة مركب رايت جيمسا بعد زراعتها وتقييمها عن طريق الفحص المجهري باستخدام عدسة موضوعية 40x أو (E-I) ملطخة بالأجسام المضادة APC-CD11b و PE-Cy7-Ly6G وتحليلها باستخدام قياس التدفق الخلوي. (ي) تم تحليل نسب خلايا CD11b + و Ly6G + في النقاط الزمنية المشار إليها إحصائيا. شريط المقياس هو 10 ميكرومتر. يتم تقديم البيانات كوسيلة ± SD لثلاث تجارب. ns = لا يوجد فرق ذو دلالة إحصائية مقارنة بالمجموعة المقابلة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 3: تحليل قياس التدفق الخلوي لعدلات نخاع عظم الفأر المعالجة ب CLON-G . (أ) استراتيجية البوابات، (ب) النتائج التمثيلية، (ج) صلاحية العدلات بعد الاستزراع لمدة 24 ساعة. يتم تقديم البيانات كوسيلة ± SD لثلاث تجارب. ** P < 0.001 مقارنة بالمجموعة المقابلة. يرجى النقر هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الرقم.
الشكل 4: النتائج التمثيلية لموت العدلات بناء على مقايسة الصورة الفلورية. موت العدلات بعد الاستزراع باستخدام (A) الوسط الأساسي لمدة 24 ساعة أو CLON-G لمدة (B) 24 ساعة أو (C) 3 أيام أو (D) 5 أيام. بعد الاستزراع ، تم تلطيخ الخلايا ب FITC-Annexin-V (أخضر) و PI (أحمر) وتم تقييمها بواسطة الفحص المجهري الفلوري متحد البؤر. شريط المقياس هو 40 ميكرومتر. الرجاء الضغط هنا لعرض نسخة أكبر من هذا الشكل.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
تلعب العدلات أدوارا حيوية في المناعة الفطرية والتكيفية، وينظم توازنها بإحكام. العدلات هي الكريات البيض الأكثر وفرة في الدم المحيطي البشري ، ولها دوران قوي وسريع. يمكن للبالغين الأصحاء إطلاق 1 × 109 عدلات / كجم يوميا من نخاع العظم28. وبالتالي أصبح موت العدلات أحد الألغاز المحيرة في هذا المجال ، وقد تم تكريس الكثير من الجهد لفهمها بشكل أفضل. وقد ثبت أن Caspase29،30،31،32 ، و LMP 33 ، و ROS21،22،33 ، والنخر 34،35،36،37 ، و necropotosis18،38 متورطة في هذه العمليات غير المتجانسة. يمكن ل GM-CSF 24 و G-CSF23 إطالة عمر العدلات إلى حوالي24ساعة مع وظائف مكبوتة. يستهدف CLON-G جميع آليات الموت التلقائي المعروفة للعدلات. على حد علمنا ، يوفر CLON-G حاليا أطول استطالة لعمر العدلات في المختبر دون المساس بالوظيفة.
يجب مراعاة العديد من المحاذير للحصول على أفضل النتائج من زراعة العدلات باستخدام CLON-G. من خلال الفحص الدوائي السابق16 ، تم التأكيد على أن التركيزات الدقيقة لمكونات CLON-G هي مفتاح النجاح ، وبالتالي ، يجب على المرء أن يحاول تجنب ارتكاب أي أخطاء أثناء التحضير والحفاظ عليها بشكل صحيح. فيما يتعلق بمعالجة العدلات وتنقيتها ، من السهل تنشيط وقتل العدلات. لذلك ، يجب معالجتها بلطف أثناء العملية برمتها وزراعتها بمجرد عزلها. فهي حساسة لتركيز الخلية ، وحالة لوحة الثقافة ، ودرجة الحرارة ، ودرجة الحموضة. يجب على المرء أن يكون حذرا عند تغيير هذا البروتوكول. فيما يتعلق بمقايسة الموت في المختبر ، أظهرت النتائج السابقة أن العدلات الميتة تلقائيا تنتفخ إلى خلايا منتفخة لا تطاق من القوة الميكانيكية. سيؤدي الدوران لأسفل ، والسحب ، والغسيل إلى تقليل عدد العدلات ، واستبدال المخزن المؤقت القياسي للربط بمحلول CaCl2 يمكن أن يبسط هذه العملية ويضمن التصوير الدقيق للعدلات14. يمكن أن تنتج التناقضات بين التكرارات التقنية في نفس التجربة عن الرغوة أثناء العملية. قد تكون الاختلافات بين التجارب المستقلة بسبب الاختلافات في نقاء ونضارة العدلات39.
يجمع CLON-G بين المسارات المعروفة والمواد الكيميائية المثبطة المقابلة لمنع موت العدلات التلقائي. ومع ذلك ، يبقى السؤال الأساسي في هذا المجال فيما يتعلق بالمسارات المعقدة التي تتوسط في موت العدلات ، حيث لا تزال هذه المسارات غير مفهومة تماما. موت العدلات المعالجة ب CLON-G أمر لا مفر منه. وبالتالي ، لا يزال لدى CLON-G مجال للتحسين. أما بالنسبة لمكونات CLON-G ، فإن أفضل الخيارات هي الأدوية المطبقة سريريا لتوسيع إمكانية التطبيق السريري للعدلات المعالجة ب CLON-G ؛ ومع ذلك ، فإن Q-VD-oph و Rec-1s مخصصان للبحث فقط ، والتجارب السريرية التي تركز عليهما غير متوفرة حاليا. وبالتالي ، فإن المركبات البديلة ضرورية للتطبيق السريري.
من خلال إطالة عمر العدلات إلى أكثر من 5 أيام مع سلامة وظائفها ، يمكن ل CLON-G فتح إمكانيات لا حصر لها لأبحاث العدلات. من خلال هذه النافذة الممتدة ، يمكن تطوير المراقبة والتلاعب بالجينات والتخزين طويل الأجل والنقل والحفظ بالتبريد بناء على CLON-G. سيتم تخفيض تكاليف العمالة والوقت والمال بشكل كبير ، مما يقلل من حواجز الدخول للباحثين الجدد. يمكن ل CLON-G أيضا تعزيز التطبيقات السريرية للعدلات مثل علاج نقل الدم المحبب. تعد عدوى قلة العدلات بعد العلاج الكيميائي سببا رئيسيا للوفاة للمرضى الذين يعانون من السرطان والأورام الخبيثة المكونة للدم40،41،42،43،44. علاج نقل الدم المحبب ، الذي لديه إمكانات كبيرة كعلاج بديل لمساعدة هؤلاء المرضى ، محدود للغاية بسبب العمر القصير للعدلات45. يستغرق تدفق العملية الحالية لنقل الخلايا المحببة وقتا أطول من عمر العدلات ، مما يؤدي إلى فقدان العدلات المنقولة فعاليتها كخلية مناعية من الخط الأول. يوفر علاج CLON-G وقتا كافيا لإعداد عمليات نقل الخلايا المحببة ، والتي لديها القدرة على إنقاذ عدد لا يحصى من أرواح المرضى المصابين بقلة العدلات والمساعدة في التخفيف من الإفراط في استخدام المضادات الحيوية. في الوقت نفسه ، يمكن للبروتوكول الحالي لمقايسة موت العدلات أن يوضح بدقة حالة العدلات ويحسن تكرار النتائج التجريبية.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
يعلن المؤلفون أن البحث قد أجري في غياب أي تضارب في المصالح.
Acknowledgments
تم دعم هذا المشروع من قبل مختبر Haihe لصندوق ابتكار النظام البيئي للخلايا (22HHXBSS00036 ، 22HHXBSS00019) ، وصندوق الابتكار للعلوم الطبية التابع للأكاديمية الصينية للعلوم الطبية (CAMS) (2021-I2M-1-040،2022-I2M-JB-015) ، وصندوق البحوث الخاص للجامعات المركزية ، وكلية الطب في اتحاد بكين (3332022062) ، وبرنامج دعم العلوم والتكنولوجيا في مقاطعة سيتشوان (رقم 2021YJ0480).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm syringe filter | Pall Corporation | 4612 | Filtrate prepared CLON-G components. |
| 1.5 mL micro centrifuge tube | LABSELECT | MCT-001-150 | Lab consumable. |
| 15 mL Centrifuge Tubes | LABSELECT | CT-002-15 | Lab consumable. |
| 24 well cell culture plate | Falcon | 351147 | Neutrophil culture plate. |
| 50 mL Centrifuge Tubes | LABSELECT | CT-002-50 | Lab consumable. |
| BD LSRII | BD | Instrument for flow cytometry analysis of neutrophil death. | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma Aldrich | C4901 | Assitant of Annexin-V binding to phosphatidylserine. |
| Confocal microscope | Perkinelmer | UltraVIEW VOX | Instrument for fluorescent analysis of neutrophil death. |
| Confocal plate | NEST | 801001-20mm | Lab consumable for fluorescent image assay. |
| Counting beads | Thermo Fisher | C36950 | Quantification in flow cytometry analysis of neutrophil death. |
| DFO | Sigma Aldrich | D9533 | Component of CLON-G. LMP inhibitor. |
| Dimethyl sulfoxide ( DMSO) | Sigma Aldrich | D2650 | Solvent for Q-VD-oph and Nec-1s. |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10099141C | Component of neutrophil culture basic medium. Nutrition supply. |
| FITC-Annexin-V | BD | 51-65874X | Annexin-V can bind to phosphatidylserine of aged cells.This is at FITC channel. |
| Hsp70 | Abcam | ab113187 | Component of CLON-G. LMP inhibitor. |
| NAC | Sigma Aldrich | A9165 | Component of CLON-G. Antioxidant. |
| Nec-1s | EMD Millipore | 852391-15-2 | Component of CLON-G. Necroptosis inhibitor. |
| Penicillin-Streptomycin Solution (PS) | Gibco | 15070063 | Component of neutrophil culture basic medium. Antibiotics to protect cells from bacteria comtamination. |
| Propidium Iodide (PI) | BioLegend | 421301 | For neutrophil death assay. A small fluorescent molecule that binds to DNA but cannot passively traverse into cells that possess an intact plasma membrane. |
| Q-VD-oph | Selleck chem | S7311 | Component of CLON-G. Pan-caspase inhibitor. |
| Recombinant Human Granulocyte Colony-stimulating Factor for Injection (CHO cell)(G-CSF) | Chugai Pharma China | GRANOCYTE | Component of CLON-G. Promote neutrophil survival through Akt pathway. |
| Round-Bottom Polystyrene Tubes | Falcon | 100-0102 | Lab consumable for flow cytometry analysis. |
| RPMI1640 | Gibco | C11875500BT | Component of neutrophil culture basic medium. |
| Saline | LEAGENE | R00641 | Solution for flow cytometry analysis of neutrophil death. |
| Sodium hydroxide (NaOH) | FENG CHUAN | 13-011-00029 | pH adjustion for NAC. |
| Wright-Giemsa Stain Solution | Solarbio | G1020 | Neutrophil cytospin staining. |
References
- Segal, A. W.
- Rosales, C. Neutrophil: A cell with many roles in inflammation or several cell types. Frontiers in Physiology. 9, 113 (2018).
- Chung, S., Armstrong-Scott, O., Charlewood, R. Therapeutic granulocyte infusion for patients with severe neutropaenia and neutrophilic dysfunction: New Zealand experience. Vox Sanguinis. 117 (2), 220-226 (2021).
- Zhou, B., et al. Clinical outcome of granulocyte transfusion therapy for the treatment of refractory infection in neutropenic patients with hematological diseases. Annals of Hematology. 97 (11), 2061-2070 (2018).
- Covas, D. T., et al. Granulocyte transfusion combined with granulocyte colony stimulating factor in severe infection patients with severe aplastic anemia: A single center experience from China. PLoS One. 9 (2), e88148 (2014).
- Tecchio, C., Cassatella, M. A. Uncovering the multifaceted roles played by neutrophils in allogeneic hematopoietic stem cell transplantation. Cellular & Molecular Immunology. 18 (4), 905-918 (2021).
- Lahoz-Beneytez, J., et al. Human neutrophil kinetics: Modeling of stable isotope labeling data supports short blood neutrophil half-lives. Blood. 127 (26), 3431-3438 (2016).
- Pillay, J., et al. In vivo labeling with 2H2O reveals a human neutrophil lifespan of 5.4 days. Blood. 116 (4), 625-627 (2010).
- Kolaczkowska, E., Kubes, P. Neutrophil recruitment and function in health and inflammation. Nature Reviews Immunology. 13 (3), 159-175 (2013).
- Tofts, P. S., Chevassut, T., Cutajar, M., Dowell, N. G., Peters, A. M. Doubts concerning the recently reported human neutrophil lifespan of 5.4 days. Blood. 117 (22), 6050-6052 (2011).
- McDonald, J. U., et al. In vivo functional analysis and genetic modification of in vitro-derived mouse neutrophils. FASEB Journal. 25 (6), 1972-1982 (2011).
- Pedruzzi, E., Fay, M., Elbim, C., Gaudry, M., Gougerot-Pocidalo, M. -A. Differentiation of PLB-985 myeloid cells into mature neutrophils, shown by degranulation of terminally differentiated compartments in response to N-formyl peptide and priming of superoxide anion production by granulocyte-macrophage colony-stimulating factor. British Journal of Haematology. 117 (3), 719-726 (2002).
- Blanter, M., Gouwy, M., Struyf, S. Studying neutrophil function in vitro: Cell models and environmental factors. Journal of Inflammation Research. 14, 141-162 (2021).
- Teng, Y., Luo, H. R., Kambara, H.
- Luo, H. R., Loison, F. Constitutive neutrophil apoptosis: Mechanisms and regulation. American Journal of Hematology. 83 (4), 288-295 (2008).
- Fan, Y., et al. Targeting multiple cell death pathways extends the shelf life and preserves the function of human and mouse neutrophils for transfusion. Science Translational Medicine. 13 (604), (2021).
- Caserta, T. M. Q-VD-OPh, a broad spectrum caspase inhibitor with potent antiapoptotic properties. Apoptosis. 8, 345-352 (2003).
- Wang, X., Yousefi, S., Simon, H. U.
- Loison, F., et al. Proteinase 3-dependent caspase-3 cleavage modulates neutrophil death and inflammation. Journal of Clinical Investigation. 124 (10), 4445-4458 (2014).
- Kambara, H., et al. Gasdermin D exerts anti-inflammatory effects by promoting neutrophil death. Cell Reports. 22 (11), 2924-2936 (2018).
- Zhu, D., et al. Deactivation of phosphatidylinositol 3,4,5-trisphosphate/Akt signaling mediates neutrophil spontaneous death. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 103 (40), 14836-14841 (2006).
- Xu, Y., Loison, F., Luo, H. R. Neutrophil spontaneous death is mediated by down-regulation of autocrine signaling through GPCR, PI3Kgamma, ROS, and actin. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (7), 2950-2955 (2010).
- van Raam, B. J., Drewniak, A., Groenewold, V., vanden Berg, T. K., Kuijpers, T. W. Granulocyte colony-stimulating factor delays neutrophil apoptosis by inhibition of calpains upstream of caspase-3. Blood. 112 (5), 2046-2054 (2008).
- Klein, J. B., et al. Granulocyte-macrophage colony-stimulating factor delays neutrophil constitutive apoptosis through phosphoinositide 3-kinase and extracellular signal-regulated kinase pathways. Journal of Immunology. 164 (8), 4286-4291 (2000).
- Fan, Y., et al. Targeting multiple cell death pathways extends the shelf life and preserves the function of human and mouse neutrophils for transfusion. Science Translational Medicine. 13 (604), (2021).
- Xie, X., et al. Single-cell transcriptome profiling reveals neutrophil heterogeneity in homeostasis and infection. Nature Immunology. 21 (9), 1119-1133 (2020).
- Cosimo, E., et al. Inhibition of NF-kappaB-mediated signaling by the cyclin-dependent kinase inhibitor CR8 overcomes prosurvival stimuli to induce apoptosis in chronic lymphocytic leukemia cells. Clinical Cancer Research. 19 (9), 2393-2405 (2013).
- Borregaard, N. Neutrophils, from marrow to microbes. Immunity. 33 (5), 657-670 (2010).
- Porter, A. G., Jänicke, R. U.
- Scheel-Toellner, D., et al. Clustering of death receptors in lipid rafts initiates neutrophil spontaneous apoptosis. Biochemical Society Transactions. 32, 679-681 (2004).
- Geering, B., Simon, H. U. Peculiarities of cell death mechanisms in neutrophils. Cell Death and Differentiation. 18 (9), 1457-1469 (2011).
- Gabelloni, M. L., Trevani, A. S., Sabatté, J., Geffner, J. Mechanisms regulating neutrophil survival and cell death. Seminars in Immunopathology. 35 (4), 423-437 (2013).
- Loison, F., et al. Proteinase 3-dependent caspase-3 cleavage modulates neutrophil death and inflammation. Journal of Clinical Investigation. 124 (10), 4445-4458 (2014).
- Cho, Y. S., et al. Phosphorylation-driven assembly of the RIP1-RIP3 complex regulates programmed necrosis and virus-induced inflammation. Cell. 137 (6), 1112-1123 (2009).
- He, S., et al. Receptor interacting protein kinase-3 determines cellular necrotic response to TNF-alpha. Cell. 137 (6), 1100-1111 (2009).
- Sun, L., et al. Mixed lineage kinase domain-like protein mediates necrosis signaling downstream of RIP3 kinase. Cell. 148 (1-2), 213-227 (2012).
- Zhang, D. -W., et al. RIP3, an energy metabolism regulator that switches TNF-induced cell death from apoptosis to necrosis. Science. 325 (5938), 332-336 (2009).
- Wang, X., He, Z., Liu, H., Yousefi, S., Simon, H. -U. Neutrophil necroptosis is triggered by ligation of adhesion molecules following GM-CSF priming. Journal of Immunology. 197 (10), 4090-4100 (2016).
- Hsu, A. Y., Peng, Z., Luo, H., Loison, F. Isolation of human neutrophils from whole blood and buffy coats. Journal of Visualized Experiments. (175), e62837 (2021).
- George, B., Bhattacharya, S. Infections in hematopoietic stem cell transplantation (HSCT) patients. Contemporary Bone Marrow Transplantation. Chandy, M., Radhakrishnan, V. S., Sukumaran, R. , Springer. Cham, Switzerland. (2020).
- Lucena, C. M., et al. Pulmonary complications in hematopoietic SCT: A prospective study. Bone Marrow Transplant. 49 (10), 1293-1299 (2014).
- Tomblyn, M., et al. Guidelines for preventing infectious complications among hematopoietic cell transplantation recipients: A global perspective. Biology of Blood and Marrow Transplantation. 15 (10), 1143-1238 (2009).
- Wingard, J. R., Hiemenz, J. W., Jantz, M. A. How I manage pulmonary nodular lesions and nodular infiltrates in patients with hematologic malignancies or undergoing hematopoietic cell transplantation. Blood. 120 (9), 1791-1800 (2012).
- Wingard, J. R., Hsu, J., Hiemenz, J. W. Hematopoietic stem cell transplantation: An overview of infection risks and epidemiology. Infectious Disease Clinics of North America. 24 (2), 257-272 (2010).
- Netelenbos, T., et al. The burden of invasive infections in neutropenic patients: incidence, outcomes, and use of granulocyte transfusions. Transfusion. 59 (1), 160-168 (2019).
