Summary
Este protocolo detalla la preparación de CLON-G para extender la vida útil de los neutrófilos a más de 5 días y proporciona un procedimiento confiable para evaluar la muerte de neutrófilos con citometría de flujo y microscopía de fluorescencia confocal.
Abstract
El promedio de vida de un neutrófilo es inferior a 24 h, lo que limita la investigación básica sobre neutrófilos y la aplicación de estudios de neutrófilos. Nuestra investigación previa indicó que múltiples vías podrían mediar la muerte espontánea de los neutrófilos. Se desarrolló un cóctel dirigiéndose simultáneamente a estas vías, caspasas-permeabilización de membrana lisosomal-oxidante-necroptosis inhibición más factor estimulante de colonias de granulocitos (CLON-G), que prolongó la vida útil de los neutrófilos a más de 5 días sin comprometer significativamente la función de los neutrófilos. Al mismo tiempo, también se desarrolló un protocolo confiable y estable para evaluar y evaluar la muerte por neutrófilos. En este trabajo, mostramos que CLON-G puede prolongar la vida útil de los neutrófilos in vitro a más de 5 días, y exhibimos el alargamiento de la vida útil de los neutrófilos con FACS y microscopía de fluorescencia confocal. Este informe presenta procedimientos para la preparación de CLON-G y muestra un ensayo de muerte espontánea in vitro de neutrófilos, que puede utilizarse para el estudio de neutrófilos y para interrogar posteriormente la muerte de neutrófilos, proporcionando así un recurso confiable para la comunidad de neutrófilos.
Introduction
Se sabe que los neutrófilos comprenden un arsenal de abundantes gránulos citoplasmáticos, nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADPH) oxidasa, enzimas antimicrobianas y varios orgánulos que defienden contra los microbios invasores; Además, son altamente móviles y son las primeras células reclutadas en el sitio de inflamación, lo que significa que los neutrófilos son la primera línea de defensa del sistema inmune innato 1,2. Por lo tanto, la terapia de transfusión de granulocitos se ha convertido en un tratamiento clínico prometedor para las infecciones relacionadas con neutropenia para aumentar transitoriamente la inmunidad de los neutrófilos 3,4,5. Descubrimientos recientes han demostrado claramente que los neutrófilos también funcionan como efectores multifacéticos en muchos escenarios fisiopatológicos6. El promedio de vida de un neutrófilo es inferior a 24 h y, por lo tanto, la investigación básica sobre neutrófilos y la aplicación de estudios de neutrófilos son tremendamente difíciles debido a las limitaciones relacionadas con la manipulación genética estable y el almacenamiento a largo plazo 7,8,9,10,11 . Hay algunas líneas celulares que pueden mostrar parcialmente algunas funciones de neutrófilos, como HL-60, PLB-985, NB4, Kasumi-1 y células madre pluripotentes inducidas12. Estas líneas celulares pueden lograr una edición y criopreservación de genes efectivas; Sin embargo, todavía difieren enormemente de los neutrófilos primarios y, por lo tanto, no pueden recapitular fielmente las funciones de los neutrófilos13. Por lo tanto, la mayor parte de la investigación en este campo todavía se basa en neutrófilos primarios recién aislados. El campo todavía se basa en la generación de ratones knock-out condicionales costosos y lentos para investigar funciones genéticas específicas en neutrófilos, pero actualmente no existen modelos humanos.
Habiendo puesto nuestro esfuerzo en explorar los procesos heterogéneos involucrados en la muerte de neutrófilos y las múltiples vías que regulan estos procesos14,15, recientemente se ha descrito un nuevo tratamiento denominado CLON-G (caspasas-permeabilización de membrana lisosomal-inhibición de la necroptosis oxidante más factor estimulante de colonias de granulocitos) 16. CLON-G consiste en Q-VD-oph (quinolyl-valyl-O-methylaspartil-[-2,6-difluorophenoxy]-methyl ketone), Hsp70 (proteína de choque térmico 70), DFO (deferoxamina), NAC (N-acetilcisteína), Nec-1s (necrostatina-1s) y G-CSF (factor estimulante de colonias de granulocitos). La muerte espontánea de neutrófilos está mediada por múltiples vías, incluyendo apoptosis, necroptosis y piroptosis. Q-VD-oph inhibe la apoptosis de los neutrófilos como un inhibidor de pan-caspasa al dirigirse a la caspasa 1, caspasa 3, caspasa 8 y caspasa9 17. La necroptosis de neutrófilos depende de una vía de señalización que involucra la proteína quinasa-1 que interactúa con el receptor (RIPK1) y la proteína similar al dominio de la quinasa de linaje mixto (MLKL)18. Como inhibidor de RIPK1, los Nec-1 inhiben la necroptosis de los neutrófilos. Hsp70 y DFO pueden inhibir la permeabilización de la membrana lisosomal (LMP), lo que podría inducir la apoptosis de neutrófilos19 y la piroptosis20. Las especies reactivas de oxígeno (ROS) desempeñan un papel vital en la muerte de neutrófilos al mediar LMP19 y apoptosis21 e inhibir las señales de supervivencia22. Como antioxidante que puede reducir la acumulación de ROS, NAC retrasa la muerte de neutrófilos. Como factor de crecimiento, el G-CSF activa las señales de supervivencia de los neutrófilos e inhibe la apoptosis inducida por calpaína23,24. Al dirigirse simultáneamente a múltiples vías de muerte espontánea de neutrófilos, la vida útil de los neutrófilos puede extenderse efectivamente a más de 5 días sin comprometer su función. El tratamiento con CLON-G amplía las posibilidades de preservación, transporte y manipulación de genes de neutrófilos, lo que puede acelerar la investigación en la comunidad de neutrófilos. Mientras tanto, con base en el conocimiento de la muerte de neutrófilos, los protocolos actualmente aprobados para los ensayos de muerte celular pueden causar daños inesperados a los neutrófilos14, por lo que estos protocolos se han refinado para ser más apropiados para los estudios de neutrófilos. Este informe proporciona protocolos detallados para el cultivo de neutrófilos con CLON-G y un ensayo de muerte celular in vitro de neutrófilos de ratón utilizando citometría de flujo e imágenes de fluorescencia. CLON-G es eficaz tanto en neutrófilos de ratón como humanos; Sin embargo, aquí se demuestran las muestras de ratón para simplificar este protocolo. La concentración de NAC es de 1 mM para neutrófilos de ratón y de 10 μM para neutrófilos humanos. Hsp70 es específico de la especie y, por lo tanto, debe utilizarse de acuerdo con la fuente del neutrófilo. Para este protocolo, no importa si los neutrófilos se aíslan de la sangre periférica o de la médula ósea y cómo se aíslan.
Para el presente estudio, se aislaron neutrófilos de médula ósea de ratón para lograr suficientes neutrófilos para los experimentos, ya que se pueden obtener aproximadamente 1 x 10 7-1.5 x 107 neutrófilos de la médula ósea, mientras que solo se pueden aislar 1 x 10 6 neutrófilos de la sangre periférica de un solo ratón C57BL /6 de 8-12 semanas de edad (de cualquier sexo). La centrifugación por gradiente se llevó a cabo para evitar posibles daños y activación por la estimulación mecánica de la clasificación FACS o la clasificación MACS.
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Protocol
El Boston Children's Hospital y el Comité Estatal de Cuidado y Uso de Animales del Laboratorio Clave de Hematología Experimental (SKLEH) aprobaron y supervisaron todos los procedimientos. La Figura 1 muestra un diagrama de flujo del cultivo de neutrófilos con CLON-G y el ensayo de muerte in vitro .
1. Extensión de la vida útil de los neutrófilos con CLON-G
NOTA: Todas las operaciones y materiales mencionados deben ser estériles. Asegúrese de que todas las soluciones estén bien mezcladas y distribuidas de manera uniforme.
- Preservación de los componentes CLON-G
- Disolver 50 mg de Q-VD-oph (ver Tabla de materiales) a una concentración final de 100 mM añadiendo 973,7 μL de dimetilsulfóxido (DMSO), y pipetear el líquido hasta que la mezcla se vuelva clara. Alícuota 50 μL por tubo y conservar a −20 °C.
PRECAUCIÓN: El DMSO es un líquido químico dañino. Use una bata de laboratorio, gafas protectoras y una máscara para evitar el contacto con la piel, el contacto visual y la inhalación. - Descongele Hsp70 (ver Tabla de materiales) a 4 °C y reduzca el contenido del vial. Alícuota 1 μL de Hsp70 por tubo sobre hielo y conservar a −80 °C.
NOTA: Hsp70 es una proteína; El almacenamiento ultrafrío es necesario para mantenerlo estable. Evite el ciclo de congelación-descongelación. - Disolver 1 mg de DFO (ver Tabla de Materiales) con 7,61 ml RPMI 1640 para obtener un stock de 200 μM. Alícuota 500 μL por tubo, y conservar a −20 °C.
- Disuelva 0,1 g de NAC (consulte la Tabla de materiales) con 2,5 ml de RPMI 1640 en un tubo de centrífuga de 15 ml y ajuste el pH a 7-7,4 con NaOH. Agregue RPMI 1640 a un volumen final de 3.06 ml para hacer un stock NAC de 200 mM. Filtrarlo con una unidad de filtrado de 0,2 μm. Alícuota 500 μL por tubo y conservar a −20 °C.
NOTA: Disolver NAC en esta alta concentración no es fácil, y el vórtice puede ayudar a disolverlo. El rojo fenol en RPMI 1640 es una indicación perfecta del pH; cuando el NAC acaba de disolverse, el color es amarillento; Ajústalo hasta que se vuelva rosado. Las soluciones madre NAC son estables hasta 1 mes a -20 °C. - Disuelva 10 mg de Nec-1s (ver Tabla de materiales) a 20 mM con 1.8 ml de DMSO, y pipete la mezcla hasta que se aclare. Alícuota 50 μL por tubo y conservar a −20 °C. Proteger de la luz.
- Disuelva 250 μg de G-CSF (ver Tabla de materiales) a 200 μg/ml con 1,25 ml de RPMI 1640. Alícuota 50 μL por tubo y conservar a 4 °C.
- Disolver 50 mg de Q-VD-oph (ver Tabla de materiales) a una concentración final de 100 mM añadiendo 973,7 μL de dimetilsulfóxido (DMSO), y pipetear el líquido hasta que la mezcla se vuelva clara. Alícuota 50 μL por tubo y conservar a −20 °C.
- Preparación de 2x medio de cultivo CLON-G
- Prepara el medio básico. Agregue 39.5 ml de RPMI 1640, 10 ml de suero bovino fetal (FBS) y 0.5 ml de estreptococo (antibióticos) a un tubo de 50 ml para hacer RPMI 1640 con 20% FBS y 1% PS como medio básico.
NOTA: Esta alta concentración de FBS se utiliza para proporcionar el cultivo prolongado de neutrófilos, que puede ser mayor de 5 días. Si el tiempo de cultivo es de 1-2 días, 10% -15% FBS es suficiente. - Descongele todas las soluciones madre de los componentes CLON-G en hielo.
- Diluir 1 μL de Hsp70 a 20 μM añadiendo 606 μL del medio básico. Diluir 1 μL de 200 μg/mL G-CSF a 20 μg/ml añadiendo 9 μL del medio básico.
- Añadir 976 μL de medio básico a un tubo de centrífuga de 15 ml. Agregue 1 μL de Q-VD-oph (100 mM), 10 μL de DFO (200 μM), 1 μL de Hsp70 (20 μM), 10 μL de NAC (200 mM), 1 μL de Nec-1s (20 mM) y 1 μL de G-CSF (20 μg / mL) para hacer 1 ml de medio 2x CLON-G.
NOTA: El medio 2x CLON-G debe utilizarse inmediatamente después de prepararlo. Se puede almacenar el 2x CLON-G temporalmente a 4 °C. Los restos de 20 μM Hsp70 deben desecharse.
- Prepara el medio básico. Agregue 39.5 ml de RPMI 1640, 10 ml de suero bovino fetal (FBS) y 0.5 ml de estreptococo (antibióticos) a un tubo de 50 ml para hacer RPMI 1640 con 20% FBS y 1% PS como medio básico.
- Cultivo de neutrófilos
- Aislar neutrófilos de ratón por centrifugación de gradiente después de un informe anterior25. Resuspender los neutrófilos de ratón aislados en el medio básico (1 millón de células/100 μL).
NOTA: Evite activar los neutrófilos manipulándolos suavemente. Evite la formación de espuma durante todo el proceso. - Agregue 500 μL de medio 2x CLON-G, 400 μL del medio básico y 100 μL de la suspensión celular a placas de cultivo no tisulares de 24 pocillos (consulte la Tabla de materiales) y pipetear suavemente de tres a cuatro veces.
NOTA: Las altas concentraciones de los componentes en el medio 2x CLON-G podrían dañar los neutrófilos; Evite sumarlos sin el medio básico. La placa de cultivo no cultivada en tejidos es necesaria para evitar la adhesión de neutrófilos. - Colocar la placa de cultivo en una incubadora a 37 °C y al 5 % deCO2 sin problemas.
NOTA: No es necesario cambiar el medio celular dentro de los 7 días. Las concentraciones finales de la composición CLON-G son 50 μM Q-VD-Oph, 1 μM DFO, 10 pM Hsp70, 1 mM NAC, 10 μM Nec-1 s y 10 ng/mL G-CSF. - Tinción de los neutrófilos cultivados con tinción compuesta de Wright Giemsa (ver Tabla de materiales) y analícelos con un microscopio óptico (Figura 2A-D). Alternativamente, teñir con anticuerpos APC-CD11b y PE-Cy7-Ly6G, y analizar con citometría de flujo (Figura 2E-I) como se describió anteriormente26.
- Aislar neutrófilos de ratón por centrifugación de gradiente después de un informe anterior25. Resuspender los neutrófilos de ratón aislados en el medio básico (1 millón de células/100 μL).
2. Ensayo de muerte espontánea in vitro de neutrófilos
- Análisis de citometría de flujo
- Cultivo aislado de neutrófilos a una densidad de 1 millón de células/ml en el medio básico a 37 °C y 5% deCO2. La placa de cultivo de 24 pocillos no se cultiva en tejidos. Agregue 1 ml de medio celular por pocillo.
- Disolver 1 g de CaCl 2 con 45 mL de solución salina para obtener 200 mM de CaCl2. Filtrarlo con una unidad de filtrado de 0,2 μm. Conservar a 4 °C.
- Prepare la mezcla de tinción. Agregue 7 μL de solución salina por muestra a un tubo de 1,5 ml y agregue 0,4 mg/ml de FITC-Annexin-V, 0,5 mg/ml de yoduro de propidio (PI) y 200 mM de solución de CaCl2 a 1 μL cada uno por muestra. Mezclar bien. Use la solución inmediatamente después de la preparación.
- Pipetear suavemente el medio celular de cinco a siete veces para mezclar bien, seguido de transferir 100 μL a un tubo de citometría de flujo en los puntos de tiempo deseados.
NOTA: Evite la formación de espuma durante todo el proceso. - Vortex contando cuentas (ver Tabla de materiales) para mezclarlas bien. Pipetear 10 μL de las perlas de conteo bien mezcladas al mismo tubo de citometría de flujo que en el paso 2.1.4.
- Añadir 10 μL de la mezcla de tinción preparada (paso 2.1.3) al tubo de citometría de flujo. Incubar a temperatura ambiente durante 5 minutos lejos de la luz.
- Agregue 100 μL de solución salina al tubo y mezcle bien para asegurar la distribución uniforme de las perlas y células de conteo.
- Realizar análisis de citometría de flujo del medio celular. Recopile las celdas a una tasa baja con ~ 400 eventos / s. Vincular las celdas APC-PE-Cy7- a FSC-A y SSC-A, y compuerta las celdas intactas con posiciones FSC-A y SSC-A medianas a FITC-Annexin-V y PE-PI; la población de Annexin-V−PI− se clasifica como células sanas.
NOTA: Las siguientes ecuaciones determinan el número total de células sanas por muestra y la viabilidad de los neutrófilos:
Número total de células sanas por muestra27 = (1.000/número de perlas de conteo) × número de población de Annexin-V−PI− × 10
Viabilidad de neutrófilos = número total de células sanas en el momento indicado/número total de células sanas en el momento cero
- Ensayo de imagen fluorescente
- Cultivo aislado de neutrófilos a una densidad de 1 millón de células/ml en el medio básico a 37 °C y 5% deCO2 en una placa confocal con 2 mL de medio celular por placa.
NOTA: Un microscopio de fluorescencia confocal tiene la mejor calidad de imagen, pero cualquier microscopio de fluorescencia que tenga 488/561/DIC es suficiente para apoyar este experimento. - Saque el plato suavemente en el punto de tiempo indicado. Agregue 10 μL de 0,4 mg/ml de FITC-Annexin-V, 0,5 mg/ml PI y 200 mM CaCl2 a la placa de manera uniforme. Manchar a temperatura ambiente durante 5 min.
NOTA: Evite agitar durante todo el proceso. Agregue los agentes de tinción de manera uniforme y suave. - Capture imágenes de fluorescencia a 488 (anexina-V)/561 (PI)/canales DIC utilizando un microscopio de fluorescencia confocal con una lente objetivo 20x (consulte la Tabla de materiales). Establezca el tiempo de exposición del canal 488 como 500 ms, el canal 561 como 200 ms y el canal DIC como 100 ms. Seleccione 5-10 áreas aleatorias para cada placa. Los tipos de células se definen en nuestro informe14 publicado anteriormente.
- Cultivo aislado de neutrófilos a una densidad de 1 millón de células/ml en el medio básico a 37 °C y 5% deCO2 en una placa confocal con 2 mL de medio celular por placa.
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Representative Results
La morfología teñida con Wright-Giemsa (Figura 2A-D) y los fenotipos FACS (Figura 2E-J) de los neutrófilos tratados con CLON-G no se vieron afectados. La viabilidad de los neutrófilos tratados con CLON-G a las 24 h fue de aproximadamente 90% + según el análisis de citometría de flujo (Figura 3) y los ensayos de imagen fluorescente (Figura 4). Una menor viabilidad podría resultar de un almacenamiento inadecuado, concentraciones inadecuadas de los componentes CLON-G o mala calidad de los neutrófilos aislados iniciales. El análisis de citometría de flujo de los neutrófilos no tratados que fueron cultivados con el medio básico durante 24 h mostró que estos neutrófilos tenían una población Annexin-V-positiva (Figura 3B). La pérdida de esta población podría deberse al ácido etilendiamina tetraacético (EDTA) en el medio celular. Las imágenes de fluorescencia de los neutrófilos cultivados con el medio básico durante 24 h deben contener células infladas (flecha blanca en la Figura 4A). La pérdida de células hinchadas puede ser el resultado de la sacudida o pipeteo de la placa confocal.
Figura 1: Diagrama de flujo del cultivo de neutrófilos con CLON-G y el ensayo de muerte in vitro. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 2: Morfología y fenotipos marcadores de superficie celular de los neutrófilos de ratón tratados con CLON-G. Las células se tiñeron (A-D) con tinción del compuesto Wright-Giemsa después del cultivo y se evaluaron por microscopía utilizando una lente objetivo 40x o (E-I) se tiñeron con anticuerpos APC-CD11b y PE-Cy7-Ly6G y se analizaron con citometría de flujo. (J) Se analizaron estadísticamente las proporciones de las células CD11b+ y Ly6G+ en los puntos temporales indicados. La barra de escala es de 10 μm. Los datos se presentan como medias ± SD de tres experimentos. ns = ninguna diferencia estadísticamente significativa en comparación con el grupo correspondiente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 3: Análisis de citometría de flujo de neutrófilos de médula ósea de ratón tratados con CLON-G . (A) estrategia de compuerta, (B) resultados representativos, y (C) la viabilidad de los neutrófilos después del cultivo durante 24 h. Los datos se presentan como medias ± SD de tres experimentos. **P < 0,001 en comparación con el grupo correspondiente. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Figura 4: Resultados representativos de la muerte por neutrófilos basados en el ensayo de imagen de fluorescencia. Muerte de neutrófilos después del cultivo con (A) medio básico durante 24 h o CLON-G durante (B) 24 h, (C) 3 días o (D) 5 días. Después del cultivo, las células se tiñeron con FITC-Annexin-V (verde) y PI (rojo) y se evaluaron mediante microscopía de fluorescencia confocal. La barra de escala es de 40 μm. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
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Discussion
Los neutrófilos desempeñan un papel vital en la inmunidad innata y adaptativa, y su homeostasis está estrictamente regulada. Los neutrófilos son los leucocitos más abundantes en la sangre periférica humana, y tienen un recambio robusto y rápido. Un adulto sano puede liberar 1 x 109 neutrófilos/kg diarios de la médula ósea28. La muerte de los neutrófilos se ha convertido así en uno de los enigmas desconcertantes de este campo, y se ha dedicado mucho esfuerzo a comprenderlos mejor. Caspasa 29,30,31,32, LMP 33, ROS21,22,33, necrosis 34,35,36,37 y necropotosis 18,38 han demostrado estar involucradas en estos procesos heterogéneos. GM-CSF 24 y G-CSF23 pueden prolongar la vida útil de los neutrófilos a aproximadamente24h con funciones suprimidas. CLON-G se dirige a todos los mecanismos conocidos de muerte espontánea de neutrófilos. Hasta donde sabemos, CLON-G actualmente proporciona el alargamiento más largo de la vida útil de los neutrófilos in vitro sin comprometer la función.
Se deben considerar varias advertencias para obtener los mejores resultados del cultivo de neutrófilos con CLON-G. A través de nuestro cribado farmacológico anterior16, se enfatizó que las concentraciones precisas de los componentes CLON-G son clave para el éxito y, por lo tanto, que se debe tratar de evitar cometer errores durante la preparación y preservarlos adecuadamente. En cuanto a la manipulación y purificación de neutrófilos, es fácil activar y matar a los neutrófilos; Por lo tanto, deben tratarse suavemente durante todo el proceso y cultivarse una vez aislados. Son sensibles a la concentración celular, la condición de la placa de cultivo, la temperatura y el pH; Hay que tener cuidado al cambiar este protocolo. Con respecto al ensayo de muerte in vitro , los resultados anteriores han demostrado que los neutrófilos muertos espontáneamente se hinchan a células hinchadas que son intolerables de la fuerza mecánica; El centrifugado, el pipeteo y el lavado reducirían el número de neutrófilos, y reemplazar el tampón de unión estándar con una solución de CaCl2 puede simplificar este proceso y garantizar la representación precisa de los neutrófilos14. Las discrepancias entre los duplicados técnicos en el mismo experimento podrían resultar de la formación de espuma durante la operación. Las diferencias entre experimentos independientes podrían deberse a variaciones en la pureza y frescura de los neutrófilos39.
CLON-G combina vías conocidas y sustancias químicas inhibitorias correspondientes para prevenir la muerte espontánea de neutrófilos. Sin embargo, la pregunta central de este campo sigue siendo con respecto a las complicadas vías que median la muerte de neutrófilos, ya que aún no se comprenden completamente. La muerte de los neutrófilos tratados con CLON-G es inevitable. Por lo tanto, CLON-G todavía tiene margen de mejora. En cuanto a los componentes de CLON-G, las mejores opciones son los fármacos aplicados clínicamente para ampliar la posibilidad de la aplicación clínica de neutrófilos tratados con CLON-G; sin embargo, Q-VD-oph y Rec-1 son solo para investigación, y los ensayos clínicos que se centran en ellos actualmente no están disponibles. Por lo tanto, los compuestos alternativos son necesarios para la aplicación clínica.
Al prolongar la vida útil de los neutrófilos a más de 5 días con sus funciones intactas, CLON-G puede desbloquear infinitas posibilidades para la investigación de neutrófilos. Con esta ventana extendida, la observación, la manipulación de genes, el almacenamiento a largo plazo, el transporte y la criopreservación se pueden desarrollar basados en CLON-G. Los costos de mano de obra, tiempo y dinero se reducirían sustancialmente, lo que reduciría las barreras de entrada para los nuevos investigadores. CLON-G también puede promover aplicaciones clínicas de neutrófilos como la terapia de transfusión de granulocitos. La infección neutropénica post-quimioterapia es una causa importante de muerte para los pacientes que sufren de cáncer y neoplasias hematopoyéticas 40,41,42,43,44. La terapia de transfusión de granulocitos, que tiene un gran potencial como terapia alternativa para ayudar a estos pacientes, está severamente limitada por la corta vida útil de los neutrófilos45. El flujo de proceso actual para la transfusión de granulocitos lleva más tiempo que la vida útil de un neutrófilo, lo que lleva a que los neutrófilos transfundidos pierdan su efectividad como célula inmune de primera línea. El tratamiento con CLON-G proporciona tiempo suficiente para la preparación de transfusiones de granulocitos, que tienen el potencial de salvar innumerables vidas de pacientes infectados con neutropénicos y ayudar a mitigar el uso excesivo de antibióticos. Al mismo tiempo, el protocolo actual para el ensayo de muerte de neutrófilos puede demostrar con precisión el estado de los neutrófilos y mejorar la replicabilidad de los resultados experimentales.
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Disclosures
Los autores declaran que la investigación se llevó a cabo en ausencia de conflictos de intereses.
Acknowledgments
Este proyecto fue apoyado por el Fondo de Innovación del Laboratorio de Ecosistemas Celulares de Haihe (22HHXBSS00036, 22HHXBSS00019), el Fondo de Innovación para Ciencias Médicas de la Academia China de Ciencias Médicas (CAMS) (2021-I2M-1-040,2022-I2M-JB-015), el Fondo Especial de Investigación para Universidades Centrales, el Colegio Médico de la Unión de Pekín (3332022062) y el Programa de Apoyo a la Ciencia y la Tecnología de la Provincia de Sichuan (NO. 2021YJ0480).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.2 µm syringe filter | Pall Corporation | 4612 | Filtrate prepared CLON-G components. |
| 1.5 mL micro centrifuge tube | LABSELECT | MCT-001-150 | Lab consumable. |
| 15 mL Centrifuge Tubes | LABSELECT | CT-002-15 | Lab consumable. |
| 24 well cell culture plate | Falcon | 351147 | Neutrophil culture plate. |
| 50 mL Centrifuge Tubes | LABSELECT | CT-002-50 | Lab consumable. |
| BD LSRII | BD | Instrument for flow cytometry analysis of neutrophil death. | |
| Calcium chloride (CaCl2) | Sigma Aldrich | C4901 | Assitant of Annexin-V binding to phosphatidylserine. |
| Confocal microscope | Perkinelmer | UltraVIEW VOX | Instrument for fluorescent analysis of neutrophil death. |
| Confocal plate | NEST | 801001-20mm | Lab consumable for fluorescent image assay. |
| Counting beads | Thermo Fisher | C36950 | Quantification in flow cytometry analysis of neutrophil death. |
| DFO | Sigma Aldrich | D9533 | Component of CLON-G. LMP inhibitor. |
| Dimethyl sulfoxide ( DMSO) | Sigma Aldrich | D2650 | Solvent for Q-VD-oph and Nec-1s. |
| Fetal Bovine Serum | Gibco | 10099141C | Component of neutrophil culture basic medium. Nutrition supply. |
| FITC-Annexin-V | BD | 51-65874X | Annexin-V can bind to phosphatidylserine of aged cells.This is at FITC channel. |
| Hsp70 | Abcam | ab113187 | Component of CLON-G. LMP inhibitor. |
| NAC | Sigma Aldrich | A9165 | Component of CLON-G. Antioxidant. |
| Nec-1s | EMD Millipore | 852391-15-2 | Component of CLON-G. Necroptosis inhibitor. |
| Penicillin-Streptomycin Solution (PS) | Gibco | 15070063 | Component of neutrophil culture basic medium. Antibiotics to protect cells from bacteria comtamination. |
| Propidium Iodide (PI) | BioLegend | 421301 | For neutrophil death assay. A small fluorescent molecule that binds to DNA but cannot passively traverse into cells that possess an intact plasma membrane. |
| Q-VD-oph | Selleck chem | S7311 | Component of CLON-G. Pan-caspase inhibitor. |
| Recombinant Human Granulocyte Colony-stimulating Factor for Injection (CHO cell)(G-CSF) | Chugai Pharma China | GRANOCYTE | Component of CLON-G. Promote neutrophil survival through Akt pathway. |
| Round-Bottom Polystyrene Tubes | Falcon | 100-0102 | Lab consumable for flow cytometry analysis. |
| RPMI1640 | Gibco | C11875500BT | Component of neutrophil culture basic medium. |
| Saline | LEAGENE | R00641 | Solution for flow cytometry analysis of neutrophil death. |
| Sodium hydroxide (NaOH) | FENG CHUAN | 13-011-00029 | pH adjustion for NAC. |
| Wright-Giemsa Stain Solution | Solarbio | G1020 | Neutrophil cytospin staining. |
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