Summary
このプロトコルは循環アデノシンの一リン酸塩(cAMP)の生物センサー、 その場 (cADDis)のcAMPの相違の探知器のアデノウイルス配達を使用して細胞内シグナリングでき事およびインシュリンおよびグルカゴンの分泌およびmicroperifusionシステムの同時獲得そしてco登録のための方法を記述する。
Abstract
ランゲルハンス膵島は、膵臓全体に点在する特殊な内分泌細胞と支持細胞の小さな3Dコレクションであり、血糖値を下げるベータ細胞によるインスリンの分泌と、血糖値を上昇させるアルファ細胞によるグルカゴンの分泌を介して、グルコースホメオスタシスの制御に中心的な役割を果たしています。cAMPによって媒介されるものを含む細胞内シグナル伝達経路は、アルファ細胞およびベータ細胞ホルモンの分泌調節に重要です。3D膵島構造は、協調的な膵島機能に不可欠ですが、初代ヒト膵島細胞における細胞内シグナル伝達経路の機構研究には実験上の課題があります。これらの課題と制限を克服するために、このプロトコルでは、形態、組成、および機能において天然の膵島に類似している糖尿病のないドナーから生成された一次ヒト偽膵島を使用して、統合された生細胞イメージングおよびマイクロ流体プラットフォームについて説明します。これらの偽膵島は、初代ヒト膵島細胞の分散および再凝集プロセスを通じてサイズ制御されます。分散状態では、膵島細胞の遺伝子発現を操作し得る。例えば、遺伝子コードされたcAMPバイオセンサ、cADDisなどのバイオセンサを導入することができる。いったん形成されると、遺伝子にコードされたバイオセンサーを発現する偽膵島は、共焦点顕微鏡および微小周融合プラットフォームと組み合わせることで、蛍光バイオセンサーの動態とアルファ細胞およびベータ細胞ホルモン分泌プロファイルの同期評価を可能にし、細胞のプロセスと機能に関するより多くの洞察を提供します。
Introduction
ランゲルハンス島は、膵臓全体に散らばる小さな器官であり、その機能はグルコースの恒常性の維持に不可欠です。インスリンは、グルコースの代謝、ATP/ADP比の増加、ATP感受性カリウムチャネルの閉鎖、原形質膜の脱分極、および細胞外カルシウムの流入に続いてベータ細胞から分泌されます1。アルファ細胞からのグルカゴン分泌はあまり理解されていませんが、細胞内およびパラクリン経路がグルカゴン顆粒エキソサイトーシスに寄与すると仮定されています2,3,4。1型糖尿病と2型糖尿病はどちらも膵島細胞機能障害と関連しています5,6,7。したがって、膵島ホルモン分泌を媒介する細胞内シグナル伝達経路の解明は、膵島における生理的・病態学的メカニズムの理解に不可欠です。
小島の球状構造は、実験に一定の障害をもたらします。これらの課題には、膵島サイズのばらつきや、膵島コア内のウイルス形質導入を減少させる膵島の3D特性が含まれる8,9。これらの課題を克服するために、初代ヒト膵島を単一細胞に分散させ、目的の標的をコードするコンストラクトでアデノウイルス形質導入し、再凝集して偽島と呼ばれるサイズ制御された膵島様構造を形成する偽膵島系が開発されました7。並行して培養された同じドナー由来の天然膵島と比較すると、これらの偽膵島は形態、内分泌細胞組成、およびホルモン分泌において類似している7。この方法は、偽膵島全体に構築物を発現させることを可能にし、初代ヒト膵島の均一な遺伝子操作に対する以前の障壁を克服することを意味する7,8,9。
このプロトコルでは、pseudoisletシステムはmicrofluidic装置と第一次人間の膵島のセルのbiosensorsを表現し、動的perifusion10,11,12の間にpseudoisletホルモンの分泌の一時的な決断を得るために統合される。偽膵島はマイクロチップ内に配置され、蠕動ポンプ12を介して異なる分泌促進物質の安定した流れに曝露される。マイクロチップは透明なガラス底を持ち、共焦点顕微鏡に取り付けられ、バイオセンサーの蛍光強度の変化を介して細胞内シグナル伝達の動態を記録します。バイオセンサーイメージングは、インスリンおよびグルカゴン分泌のその後の分析のために、微小周融合廃液の収集と同期されます7。大半融合と比較して、この微小半周融合アプローチは、大周輸チャンバー7と比較してマイクロ流体デバイスの体積が小さいため、使用する偽膵島が少なくて済む。
このシステムの有用性を活用するために、環状アデノシン一リン酸(cAMP)差分検出器 in situ (cADDis)バイオセンサーをヒト偽島で発現させ、cAMPの動態とホルモン分泌を評価しました。cADDisバイオセンサーは、cAMP 2(EPAC2)によって活性化された交換タンパク質のヒンジ領域に配置され、その調節領域と触媒領域をつなぐ円形に順列された緑色蛍光タンパク質(cpGFP)で構成されています。cAMPがEPAC2の調節領域に結合すると、ヒンジ領域の立体構造変化が誘発され、cpGFPからの蛍光が増加します13。cAMPなどの細胞内メッセンジャーは、Gタンパク質共役受容体の上流活性化後にインスリンおよびグルカゴン分泌を誘発する14。生細胞イメージングと微小ペリフュージョンを組み合わせることで、細胞内のcAMP動態と膵島ホルモン分泌を結びつけることができます。具体的には、このプロトコルでは、cADDis表現のpseudoisletsはさまざまな刺激にアルファおよびベータセルのcAMPの応答を監視するために生成される: 低いブドウ糖(2 mMブドウ糖;G 2)、高グルコースとイソブチルメチルキサンチン(IBMX;20 mMグルコース + 100 μM IBMX;G 20 + IBMX)、および低グルコースとエピネフリン(Epi;2 mMグルコース + 1 μM Epi;G 2 + エピ)。この処理ワークフローにより 、1) IBMXを介したホスホジエステラーゼ阻害により、細胞内のcAMPレベルの分解を防ぐこと、および2)βアドレナリン受容体の活性化によって媒介されるアルファ細胞グルカゴン分泌の既知のcAMP依存性刺激剤であるエピネフリンを介して、細胞内のcAMP動態を直接評価できます。生細胞イメージング実験用のマイクロペリフュージョン装置のセットアップ、マイクロチップへの偽膵島の装填、同期生細胞イメージングおよびマイクロペリフュージョン、およびマイクロプレートベースのホルモンアッセイによるバイオセンサーの痕跡およびホルモン分泌の分析のステップを以下に詳述する。
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Protocol
ヒト膵島(N = 4製剤)は、Integrated Islet Distribution Program、Human Pancreas Analysis Program、Prodo Laboratories, Inc.、およびImagine Pharmaとのパートナーシップを通じて入手しました。ヴァンダービルト大学の治験審査委員会は、匿名化されたヒト膵臓標本をヒト被験者の研究とは見なしません。この活動は、臓器提供者やその家族、臓器調達団体の協力なくしては成り立ちません。ドナーの人口統計情報については、 表1 を参照してください。糖尿病のない膵臓ドナーからのヒト膵島は、15時間未満の寒冷虚血時間で単離されました。
1. 偽膵島形成(詳細はWalker et al.7)
- 膵島培養培地の外側の表面でピペットチップを汚染しないように細心の注意を払いながら、P200ピペットと卓上顕微鏡を使用して初代ヒト膵島を採取し、手摘みします(CMRL 1066中の10%FBS、100 μg/mLストレプトマイシン、100 U/mLペニシリン、2 mM L-グルタミン)。
- 初代膵島を15 mLチューブに移し、コンタミネーションを防ぐために組織培養フードの下で以下の偽膵島形成ステップをすべて実行します。0.025%トリプシン中のP1000ピペットを使用して、室温で7分間一次膵島をゆっくりと解離します。膵島がバラバラになり始めると、溶液は不透明になります。
- これらの研究では、直径約200μmの200〜300個の手摘みされた一次膵島を500μLの0.025%トリプシンに分散させると、偽島嶵の96ウェルプレートが1〜2枚得られます。正確な数は、平均的な膵島の大きさと生存率によって異なる場合があります。>500 個の初代膵島については、0.025% トリプシンの容量を 1:1 の比率でスケールアップします(例:600 個の手摘みした膵島に対して 0.025% トリプシン 600 μL)。
- 使用したトリプシンの量と同量のヴァンダービルト疑似島培地(VPM)を添加して、分散液をクエンチします。その後、1 mL の VPM で 2 回洗浄します。洗浄の場合は、分散した細胞を485 x g で4°C、4〜3分間、卓上遠心分離機で遠心分離します。細胞を規定量のVPM(通常1 mL)で再懸濁し、計数します。
注:疑似膵島生成およびVPM組成は、先行刊行物7に詳述されている。簡単に説明すると、VPMには、同量の濃縮CMRL培地(20%FBS、100μg/mLストレプトマイシン、100U/mLペニシリン、1mMピルビン酸ナトリウム、2mMグルタマックス、CMRL 1066中の2mMHEPES)およびiEC-培地(VEGF培地コンプリートキットからFBS+内皮細胞培地サプリメント1本を差し引いたもの)が含まれています。擬似島生成の概略図を 図1Aに示します。 - 10 μL のトリパンブルーと 10 μL の細胞懸濁液を混合して、自動セルカウンターを使用して細胞数と生存率を測定します。細胞懸濁液をよく混合して、正確な細胞数を確保します。
- 必要な数の偽膵島に必要な細胞懸濁液、ウイルス、およびVPMの量を計算します。すべての計算は、ステップ1.4で得られた生細胞数に基づいて行います。
- これらの研究では、MOI 500(N = 1)または1,000(N = 2)で分散したヒト膵島細胞をAd-CMV-cADDisで総容量500 μLで形質導入します。形質導入した偽膵島(2,000細胞/偽膵島)の1プレートで、ドナー1人あたり3回の技術的複製(32の偽膵島/実験)が得られます。アデノウイルスは、この研究で商業的に入手された。
- 計算した量の細胞懸濁液、ウイルス、VPMを1.5 mLのチューブに混ぜ合わせます。ピペッティングで上下させて内容物を静かに混合します。
- 形質導入中は、チューブをオープンキャップでインキュベートし、37°C、5% CO 2/95%空気の組織培養インキュベーターで滅菌シャーレで2時間覆います。
- 各チューブに500 μLのVPMを加え、4°Cで3分間、500 x g で遠心分離して細胞を洗浄します。 さらに2回の洗浄を完了し、合計3回の洗浄を行います。上清を吸引し、細胞を 1 mL の VPM に再懸濁します。
- 総細胞播種量(200 μL/偽島)を計算します。VPM(計算された細胞播種量から2 mLを引いたもの)を適切なサイズのコニカルチューブに加えます。ステップ1.7の形質導入細胞懸濁液をコニカルチューブに加えます。円錐形のチューブを少し閉じたままにしますが、セルの空気交換を可能にするためにしっかりと閉じないでください。
- 1.5 mLのチューブ(ステップ1.7から)を1 mLのVPMで洗い流し、内容物をコニカルチューブに移し、その時点でコニカルチューブに総細胞播種量が含まれているはずです。
- 電動血清ピペットでピペッティングしてコニカルチューブの内容物をよく混合し、内容物を滅菌試薬リザーバーに移します。リザーバーが細胞播種量全体を保持していない場合は、連続転写を行い、各ステップで懸濁液が十分に混合されていることを確認します。
- マルチチャンネルP200ピペットを使用して、試薬リザーバー内の細胞懸濁液を3〜4回上下にピペットで固定して均質性を確保し、次に200 μLの細胞懸濁液をマイクロウェルプレートの各ウェルにピペットで移します。
- 偽島を組織培養インキュベーターで37°C、5% CO2/95%空気で培地を変化させずに6日間インキュベートします。6日目までに、偽島は完全に形成され、実験の準備が整うはずです(図1B-D)。
2.生細胞イメージングおよびマイクロペリフュージョンの準備(実験の1日前)
注:微小拡散培地の調製に関する情報は、protocols.io リソース(https://www.protocols.io/view/analysis-of-islet-function-in-dynamic-cell-perifus-bt9knr4w.html)から入手できます。
- 偽膵島をマルチチャンネルピペットを使用して、96ウェルプレートから滅菌ペトリ皿に移し替えて収穫します。次に、偽膵島を手摘みし、新鮮なVPMを含む別の滅菌ペトリ皿に移します。偽膵島を組織培養インキュベーターで37°C、5%CO2/95%空気で一晩インキュベートします。
- 超純度水1Lに、BSA(ラジオイムノアッセイグレード)1g、ピルビン酸ナトリウム0.11g、L-グルタミン0.58g、重炭酸ナトリウム3.2g、HEPES1.11g、DMEMボトル1本を加えて、DMEM1Lを調製します。DMEMで1 Mグルコースストック溶液を調製します。両方の溶液を4°Cで一晩保持します。
- 実験前日に微小周輸システムの流れを確認する。図2A-Bに示すように、空のマイクロチップが入ったチップホルダーにすべてのチューブを接続します。超純度水を廃液として利用し、フラクションコレクターで100μL/minの流量を確認します。
3. DMEMへの分泌促進剤の追加(実験当日)
- 0.07 mg/mL アスコルビン酸を DMEM に添加し、グルコース含有バッファーに 1 M グルコースストックを使用して、DMEM + アスコルビン酸バッファーで分泌促進物質を調製します。
注:アスコルビン酸塩は、エピネフリンの酸化を防ぐことにより、エピネフリンを安定させるために使用されます。エピネフリンを使用しない場合は、アスコルビン酸をDMEMから省略できます。 - 分泌促進物質を0.22 μmのポアフィルターで2回ろ過し、そのたびに新しいフィルターを使用します。溶液を37°Cに温め、グルコメーター で グルコースを測定し、所望の濃度を確認します。
4. マイクロペリフュージョン装置のセットアップ
- 共焦点レーザー走査型顕微鏡の環境チャンバーを37°Cに温め、すべてのドアが閉じられ、チャンバーが安定した温度に保たれるようにします。マイクロチップが入ったチップホルダーをチャンバーに入れてウォームアップします。赤外線ガンでチップ温度を確認します。
注:この場合、恒温槽は38.5°Cに設定されており、チップは37°Cに達することができます。 - すべてのチューブをチップホルダに接続します(図2A-Bを参照)。ベースライン分泌促進剤で5分間フラッシュラインします。この研究では、ラインを 2 mM グルコース(G 2)でフラッシュしました。デバブラーのバブルトラップメンブレンは、8〜10回の実験ごとに交換してください。
5. マイクロチップへの偽膵島の装填
- マイクロチップを装填する前に、その後の膵島当量(IEQ)の定量化のために実験で使用される疑似膵島の明視野および暗視野画像(倍率10倍)を撮影します。
注:IEQは、ホルモン分泌を実験全体の膵島数の変動に正規化するために使用されます。このステップは、実験の前日に行うこともできます。 - マイクロチップの下半分と上半分から余分な液体を吸引します。マイクロチップの上半分には、各ウェルの適切なシールを確保するガスケットが含まれており、マイクロチップの下半分には、ガラスカバーガラスが取り付けられたウェルが含まれています。5 μLのDMEMでマイクロチップに1つを事前に濡らします。井戸の外縁の周りをピペットで動かして、隙間を濡らしてください。
- あらかじめ湿らせたピペットを使用して、23 μLの容量で30〜32個の偽島を回収し、マイクロチップの底部にあるウェルの中央に偽島をゆっくりと分注します。ピペットの先端に偽膵島が付着していないか確認します。
- ゲルローディングチップを使用して、偽島をウェルの中央に静かに動かします。これにより、最大数の疑似膵島が視野にキャプチャされます。
- ステレオスコープ上のマイクロチップ内の偽膵島の画像を撮影します。このカウントは、このプロセス中の疑似膵島損失に対して計算されたIEQを調整するために使用されます。
- 手順5.3のすべての疑似アイズレットがマイクロチップにロードされていない場合は、それに応じてIEQを調整します。たとえば、現在 30 個の疑似膵島が可視化されているが、ステップ 5.1 で可視化されたのは 32 個の場合、ステップ 5.1 の画像の IEQ を計算し、30/32 を掛けます。
- マイクロチップの底部をマイクロチップホルダーに入れます。マイクロチップの上部を、緑色のガスケット側を下にして慎重に置きます。
- マイクロチップを所定の位置に保持しながら、マイクロチップホルダーを静かに閉じて、マイクロチップをクランプします。このプロセス中にマイクロチップに過度の圧力をかけると、ウェルに含まれる液体が置換され、偽島の損失につながる可能性があるため、マイクロチップに過度の圧力をかけないようにしてください。井戸に気泡を入れないでください。
6. 同期生細胞イメージングとマイクロペリフュージョン
- 分泌促進剤、ポンプ、マイクロチップをホルダーに入れ、共焦点顕微鏡に取り付けられた恒温槽に移します。排出チューブをチャンバーからフラクションコレクターに導きます。
- バッファーを 15 mL のコニカルチューブに入れ、キャップに穴を開けます。これらの穴は、収集チューブがチューブから漂うのを防ぎます。
- チューブをデバブラーにねじ込むときは、ナットとフェルールを分離してから、デバブラーにねじ込みます。これにより、ラインのねじれが防止されます。
- フラクションコレクターを2分ごとに回転するように設定します。適切な数のチューブをフラクションコレクターにロードし、洗浄と実験フラクションを考慮します。これらの実験では、15本の洗浄チューブ(合計30分間の洗浄)と28本のフラクション回収用チューブを使用しました。
- ポンプを始動して、ベースライン培地(ベースラインのグルコース濃度を含む)を 100 μL/分で送液します(100 μL/分の流速で 2 分間の回収を行うと、各フラクションチューブあたり 200 μL の廃液が得られます)。この流量は、疑似膵島へのストレスを制限し、ライブイメージング中の重大な疑似膵島の動きを防ぐために選択されました。
- 流体が装置内を流れている間は、次の点に注意してください。
- フラクションコレクターの注ぎ口の端にある液滴に注意し、システム内の流れを示します。
- システムからの排出の減少に注意してください。コレクションチューブに<200μLがある場合は、システムに詰まりまたは漏れがある可能性があることを示しています。排水量の減少の考えられる原因、解決策、および防止のヒントのリストについては、 表2 を参照してください。
- 流体が装置内を流れている間は、次の点に注意してください。
- 排出チューブから安定した媒体の流れができたら、フラクションコレクターヘッドを回転させてチューブに分注し、フラクションコレクターを始動します。最初の 15 フラクション(30 分)を洗浄として回収し、偽膵島を平衡化させます。これらの最初の 15 フラクションを使用して、システム内の継続的かつ正確な培地フローを確保します。後でこれらの分数を破棄します。
- 30分間の洗浄中に、次のパラメータに従って生細胞イメージング用に顕微鏡をセットアップします:対物レンズ:Uプラン蛍石20倍、1倍ズーム。蛍光チャンネル:EGFP(発光= 510 nm、レーザー波長= 488、検出波長= 500-600 nm);時系列:実験全体(つまり、56分)で2秒ごとに取得された画像。サンプリング速度:2μs/ピクセル。
- 視野内の偽島嶼の底部を特定し、焦点面をこの位置より15μm上に調整します。これは、イメージング実験全体で使用されるフレームです。
- 30分間の洗浄が完了したら、フラクションの回収と画像取得を開始します。
メモ: この手順の前に、問題を特定して修正するためにあらゆる努力を払ってください。データ収集が始まると、実験の一時停止や分泌促進物質への過度の曝露は、結果に悪影響を与える可能性があります。 - 最初のベースライン採取の期間中、偽膵島をベースライン培地で周接流し続け、廃液を1.5 mLチューブに集めます。実験に適した時期に、チューブをベースラインバッファーから新しい刺激バッファーチューブに手作業で切り替えます。
- 標準的な微小周絡血流配列を 表3に示す。
- ~10 個のフラクションを採取した後、すべてのフラクションを実験終了まで 4 °C の冷蔵庫に入れ、ホルモン、特にグルカゴンの分解を防ぎます。
- 各チューブの排水量を確認することにより、実験全体を通してシステムの流れを引き続き監視します。
- 実験が完了したら、ベースライン培地に切り替え、ポンプを5分間運転し続けて、ベースライン培地(この場合は2 mMグルコース)で刺激を洗い流します。
- ポンプを停止し、デバブラーとフラクションコレクターでマイクロチップホルダーチューブを外して、マイクロチップホルダーを環境チャンバーから取り外します。マイクロチップを取り外した後、すべてのドアを閉めて温度を維持します。
- ペリフューセートを-80°Cで保存し、その後のホルモン分析に役立ててください。
7.偽島酸エタノール抽出
- マイクロチップホルダーを慎重に開き、マイクロチップの上部を持ち上げて外します。ピペットと卓上顕微鏡を使用して、ウェルから偽島を採取し、1.5 mLチューブに移します。必要に応じて、卓上顕微鏡を使用してすべての偽膵島を確実に収集します。
- ウェルから取り出す前に、マイクロチップ内の偽膵島の最終画像を撮影し、ステップ5.5と同様に、膵島抽出物IEQを調整します。
- 500 μL の PBS で 2 回洗浄します。各洗浄の合間に偽膵島を94 x g で1分間スピンダウンし、上清を吸引します。
- 最後の洗浄液を除去した後、200 μLの酸性エタノール(5.5 mLの95%エタノール + 50 μLの12 N HCl)を加えます。4°Cで一晩保管してください。
- 翌日、抽出物を 15,989 x g、4°C で 10 分間スピンダウンします。 45 μL を 3 本の新しいチューブに分注します。ホルモン含量分析のために-80°Cで保存してください。ホルモン分泌をIEQに正常化する代替として、ホルモン分泌を抽出物から測定した偽島ホルモン含量に正規化することもできる。
8. 追加実験とクリーンアップ
- 後続の疑似膵島グループで手順5〜7を繰り返して、追加のテクニカルレプリケートを取得します。
- すべての微小拡散実験が終了したら、マイクロチップとチューブに10%漂白剤を5分間通し、次に超精製水を30分間流してチューブを消毒します。
9. データ分析
注:生細胞イメージングは、レーザー走査型共焦点顕微鏡を使用して行いました。画像は、顕微鏡関連のイメージングソフトウェアパッケージを使用して分析されました。以下は一般的なガイドラインですが、顕微鏡メーカーや画像取得ソフトウェアによって異なる場合があります。
- データ正規化のための合計アイレット等価物 (IEQ) の決定
- ソフトウェアプログラムを開き、ウィンドウの右上にある[ 取得 ]タブをクリックします。マクロ・マネージャー (マクロ・マネージャー (マクロ・マネージャー) の「バッチ ・バーンイン 」機能を選択して、すべての暗視野イメージ>>バッチ書き込みを行います。
- 一度に複数のイメージを書き込むには、マクロマネージャ内の実行ボタンをクリックする前に、バッチモードの切り替えボタンをクリックします。画面の指示に従って、書き込んだ画像のソース画像の場所と保存先の場所を選択します。画像ファイルの種類として、[タグ付きイマジンファイル形式 (*.tif)] を選択します。
- IEQ測定では、手順5.1で撮影した10倍暗視野画像の焼き付きバージョンを開きます。上部の [Count and Measure ] タブをクリックし、左側の [ Manual HSV Threshold ] ボタンを選択します。
- ドロッパー機能を使用して、各疑似島が赤で強調表示されるまで、疑似島の境界を越えずに正の領域(赤)を追加/削除します。[ Count and Measure] をクリックします。
- 自動分割機能または手動分割機能を使用して、結合された疑似島を分割します。
- 疑似島を手動で分割するには、手動分割機能を選択し、左クリックして疑似島を区切る線を引き、右クリックして線を完成させます。自動分割するには、自動分割機能を選択し、グループ化された疑似島をクリックします。その後、正しい自動分割を確認します。
- バッチ書きの画像では、縮尺記号と拡大テキストが正の値としてマークされる場合があります。これらのオブジェクトを削除すると、正確なカウントが得られるように、マウスを使用してテキストと縮尺記号をハイライト表示し、キーボードの Delete キーを押します。
- フィルターのオンとオフを切り替えて、すべての疑似膵島がカウントされていることを確認します。このファイルは、相互参照のためにプログラムの外部で開くこともできます。終了したら、[ Excelにエクスポート]をクリックします。
- スプレッドシートを開き、次のように変更します。
- 下部のカウント、平均、および並べ替え情報を削除します。平均直径に基づいてオブジェクトを並べ替えます。平均直径の後に列を挿入し、その列に「Pseudoislet count」という名前を付けます。
- 膵島数は、以下の各指標内に収まる平均直径の疑似膵島の数によって決定されます。インデックスあたりの疑似島数にそれぞれのIEQ変換係数を掛け、これらの値を合計して合計IEQを決定します。各実験の前に取得した画像に対してIEQ計算を実行します。次のインデックスと IEQ 変換係数を使用します。
1-49 μm:×0.167
50-100 μm:0.667×
101-150 μm: × 1.685
151-200 μm:× 3.500
201-300 μm:× 6.315
301-350 μm:× 10.352 - IEQ カウントを決定するためのスプレッドシートの例については、 補足ファイル 1 を参照してください。
- ソフトウェアプログラムを開き、ウィンドウの右上にある[ 取得 ]タブをクリックします。マクロ・マネージャー (マクロ・マネージャー (マクロ・マネージャー) の「バッチ ・バーンイン 」機能を選択して、すべての暗視野イメージ>>バッチ書き込みを行います。
- ソフトウェアによる生細胞イメージングの定量
- cellSensで目的のファイル(.oir)を開きます。
- 関心領域 (ROI) を次のように指定します。
- 描画ツールを使用して、ROI(つまり、各擬似島)を指定します。フリーハンド描画オプションを使用する場合は、右クリックして図形を閉じます。
- 矢印を使用してドラッグし、イメージ内のすべての ROI を囲むようにドラッグして、すべての ROI を強調表示します。すべての ROI が強調表示された状態で、右クリックして [時間の経過に伴う動的 ROI に変換] を選択します
- XYT ファイルを再生して、ROI が経時的に正確であることを確認します。特定の期間でROIが正確でない場合は、その期間のサイズ/位置を修正します。ソフトウェアは、これらの変更に合わせて、時間の経過とともにROIのサイズ/場所を徐々に調整します。イメージング実験全体を通してROIが正確になるまで、これらの手順を繰り返します。
- 次のように、各 ROI の強度測定を実行します。
- ツールバーで、 Measure Intensity Profileをクリックします。分析するROIを強調表示します。Shift + クリックを使用して、複数の ROI を選択します。
注:ソフトウェアでは一度に複数のファイルを開くことができますが、一度に1つのファイルからのみROIを解析してください。 - バックグラウンド ノイズを考慮するには、各強度値から減算する定数値を選択するか、1 つの ROI をバックグラウンドとして指定します。「 実行」をクリックします。
- 強度プロファイルツールバーで、Excelにエクスポートをクリックしてデータをエクスポートします。
- すべてのデータポイントを、7〜8分(つまり、最初のベースライン培地周輸の最後の数分)から測定された強度の平均に正規化します。各時点におけるこれらの正規化された値は、相対的なcADDis強度として定義されます。画像データの解析と正規化のスプレッドシートの例については、 補足ファイル 2 を参照してください。
- ツールバーで、 Measure Intensity Profileをクリックします。分析するROIを強調表示します。Shift + クリックを使用して、複数の ROI を選択します。
- 各画分と膵島抽出物のホルモン分泌を測定します。これらの実験では、インスリンとグルカゴンの濃度をELISAで測定しました。ステップ9.1で決定されたIEQ測定値または抽出物ホルモン含有量を使用して、各画分のホルモン分泌を偽島体積に正規化します。
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Representative Results
バイオセンサーを発現するヒト偽膵島は、cAMPバイオセンサーcADDisをコードするコンストラクトのアデノウイルス送達によって作製されました(図1A)。図1Bは、形質導入したヒト膵島細胞の経時的な再凝集を示しており、6日間の培養後に完全に形成された偽膵島が観察されています。細胞は48時間以内に可視的なcADDis蛍光を示し始め、培養期間の終わりまでに形質導入細胞で高いバイオセンサー発現が見られました。このプロトコルを用いて、偽膵島はアルファ細胞で60%、ベータ細胞で95%の平均形質導入効率を示しました(図1C-D)。
図2は、マイクロ流体と生細胞のイメージングプラットフォームを統合したものです。cADDisを発現する偽膵島を回収し、新鮮な培地で一晩インキュベートさせた後、偽膵島をマイクロチップ上の事前に湿らせたウェルの中央にロードしました。その後、マイクロチップをホルダーにクランプし、顕微鏡ステージに置きました。顕微鏡に取り付けられた37°Cに保たれた恒温槽内では、偽膵島をアルファ細胞およびベータ細胞の分泌促進物質を含む培地で濁流し、システムへの気泡の侵入を防ぐためにデバブラーを通してポンプで送りました。マイクロチップ内の偽膵島を100μL/minの流速でペリフュージョンし、フラクションコレクターを介して2分間隔で流出物を回収しました(図2A-B)。マイクロチップウェルのガラス底部は、後の分析に不可欠な複数の疑似島のcADDis蛍光強度を視野内に捉えることができます(図2C)。
図3は、糖尿病のない3人のヒトドナーから単離された天然の膵島から生成されたcADDis発現偽膵島を用いて、記載されたプロトコルを使用した代表的な結果を示しています。cADDisを発現する偽膵島を、2 mMグルコース(G 2)、20 mMグルコースとホスホジエステラーゼ阻害剤イソブチルメチルキサンチン(IBMX;G 20 + IBMX)、および2 mMグルコースとエピネフリン(G 2 + Epi)を併用します。このプロトコルはアルファおよびベータセル(図3A-B)内のcAMPを高める知られていた細胞内細道を引き出す。微小中核融合セットアップは、cADDis蛍光とホルモン分泌による細胞内cAMP動態の同期収集を容易にします(図3C-E)。実験の厳密さを確保するために、偽島に関する実験を同じドナーから2〜3回の繰り返しで行い、凝集値を図3C-E、D'、E'にプロットしました。G2への曝露では、相対的なcADDis強度は低く安定しており、インスリン分泌も安定していました(図3C-D)。偽膵島をG 20 + IBMXに曝露すると、相対的なcADDis強度の増加によって証明されるように、細胞内cAMP濃度の有意な増加が見られました(図3C)。この増加は、インスリンとグルカゴンの両方の分泌の顕著な増加が付随していることから明らかなように、ベータ細胞とアルファ細胞の両方によるものである可能性が最も高い(図3D-E)。偽膵島をG 2 + Epiに曝露すると、細胞内のcAMP濃度が上昇し(図3C)、これはグルカゴン分泌の増加と関連していました(図3E)。G2+Epiに対するcAMP応答がIBMX応答と比較して比較的小さいという観察は、アルファ細胞におけるcADDisアデノウイルスコンストラクトの伝達効率の低さ(ベータ細胞に対する)と、このシグナルのアルファ細胞特異性(図3E)の組み合わせにより生じた可能性がある。従って、第一次人間のベータおよびアルファ セルの知られていたcAMP仲介されたシグナリング細道に基づいて、このプロトコルは首尾よくcADDisのbiosensorおよびベータおよびアルファ セル ホルモンの分泌のプロフィールの相対的な蛍光強度を技術的および生物的反復を渡る検査するこの統合されたプラットホームの有用性を示す。
図1:バイオセンサーを発現するヒト偽膵島の形成 。 (A)初代ヒト膵島解離、単一細胞状態でのバイオセンサーコンストラクトによる形質導入、および再凝集を示す模式図。再凝集後、偽膵島は回収され、同期生細胞イメージングとマイクロペリフュージョンを受けます。プロトコルの手順は、回路図全体に示されています。(B)6日間の再凝集期間中のcADDis発現偽膵島の形成を捉えた代表的な画像。上:コントラストのある明視野、下:cADDは蛍光です。スケールバーは100μmです。 (C)C-ペプチド(CPEP、青)およびグルカゴン(GCG、赤)標識により、それぞれアルファ細胞およびベータ細胞を可視化したcADDis発現偽島(緑)の代表的な画像。DAPI(白色)を核対比染色として使用しました。白い矢印は、形質導入されたアルファ細胞とベータ細胞を強調表示しています。黄色の矢印は、形質導入されていないアルファ細胞を指しています。スケールバーは100μmです。 (D)HALO細胞核アルゴリズムによるベータ細胞およびアルファ細胞におけるMOI1,000での形質導入効率の定量化(N = 2人のドナー、複数の偽島にわたってドナーごとに平均601個のベータ細胞と627個のアルファ細胞を分析)。誤差範囲は、平均の標準誤差を示します。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図2:生細胞イメージングとマイクロペリフュージョンの統合システム 。 (A)生細胞イメージングおよびマイクロペリフュージョンシステムのコンポーネントの概要。マイクロチップ内の偽膵島は、環境チャンバー内に封入された共焦点レーザー走査型顕微鏡のステージに配置されます。この構成により、一連の明確に定義された分泌促進物質に対する動的応答中のバイオセンサー蛍光の細胞内変化に関する時間分解能と、細胞内シグナル伝達イベントとのさらなる統合のためのホルモン分泌の同期測定のための偽島周辺画分の収集が可能になります。(B)恒温槽の外側にあるマイクロ流体プラットフォームの構成要素。流体の方向性は、(1)分泌促進剤含有チューブから(2)0.01インチチューブから(3)ペリスタルティックポンプチューブ(内径0.02インチ)から(4)チューブ0.01インチ、(5)デバブラーから(6)マイクロチップ入口(0.01インチチューブ)から(7)マイクロチップホルダー/マイクロチップから(8)マイクロチップアウトレット(0.01インチチューブ)までです。注:0.01インチのチューブは、円錐形のアダプター(白い矢印)でペリスタルティックポンプチューブに結合されています。チューブは、ナットとフェルール(緑色の矢印) を介して デバブラーに差し込まれます。赤い破線は、コンポーネント間の接続性を示しています。(C)共焦点顕微鏡ステージに取り付けられた恒温チャンバー内のマイクロチップとホルダーの拡大図。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
図3:ヒト偽島cAMPとホルモン分泌動態 。 (A)β細胞およびα細胞における分泌促進物質によるcADDis蛍光およびホルモン分泌の概略図。ベータ細胞では、エピネフリン(Epi)がGi共役α2-アドレナリン受容体に結合し、アデニリルシクラーゼ(AC)の阻害、cAMPの減少、およびインスリン分泌の減少につながります。アルファ細胞では、EpiはGs共役ベータ1-アドレナリン受容体を刺激し、ACの活性化と細胞内cAMPの増加をもたらします。どちらの細胞タイプでも、ホスホジエステラーゼ(PDE)阻害剤であるIBMXは、細胞内cAMPの分解を防ぎ、ホルモン分泌を促進します。遊離細胞内cAMPの結合は、cADDisタンパク質の立体構造変化を引き起こし、蛍光強度の増加を引き起こします。(B)G2(2mMグルコース)、G20+IBMX(20mMグルコース+IBMX)、およびG2+Epi(2mMグルコース+エピ)に応答した生細胞イメージング中のcADDis発現偽膵島の代表的な画像。偽膵島は白で囲まれ、分泌膵島タイプは左上隅に示されています。スケールバーは50μmです。 (C)3つの臓器提供者調製物由来のヒト膵島から作製されたcADDis発現偽島全体の経時的な相対cADDis蛍光。(D)示された分泌促進物質に応答したインスリンおよび(E)グルカゴン分泌の凝集。データは、膵島等価物(IEQ)で表される膵島ボリュームに正規化されます。偽膵島は、3人のヒト膵島ドナーから調製し、2〜3人の技術的複製/ドナーを用いて分析した。膵島細胞をcADDisアデノウイルスコンストラクトでMOI 500(N = 1)または1,000(N = 2)で形質導入しました。(D',E')偽膵島ホルモン含有量。誤差範囲は、平均の標準誤差を示します。 この図の拡大版をご覧になるには、ここをクリックしてください。
表1:寄付者の人口統計。 cADDisバイオセンサー発現および生細胞イメージングによる偽膵島の準備中に使用されるヒト膵島のドナー人口統計情報の要約。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表2:トラブルシューティングガイド。 問題の一般的な原因、解決策、および防止手法のリストなど、発生する可能性のある課題が強調表示されます。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
表3:マイクロペリフュージョンプロトコル。 実験に用いた微小周融合プロトコルの例を、代表的な結果で強調した。このプロトコルは、細胞内cAMPと膵島ホルモン分泌の共登録に特化しています。代替プロトコルは、目的の細胞内分子および/または選択したバイオセンサーの動態に応じて、より適切である可能性があります。 この表をダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル1:膵島当量(IEQ)の計算。 各実験で使用した疑似島のIEQの計算方法の一例。シート 1 のデータ (1.オブジェクト測定)には、ソフトウェアから直接エクスポートされたオブジェクトデータが含まれます(ステップ9.1を参照)。緑色で強調表示された列は、ステップ9.1.6.2の各インデックスに含まれる疑似アイズレットの数をカウントするために挿入されます。カウントがシート 2 (2.IEQ Calculation)を作成し、インデックスごとに適切な変換係数を使用してIEQに変換します。チップのロード中(チップ内疑似アイズレット#)および抽出物の除去前(実行後の疑似アイズレット#)の疑似アイズレットの損失は、これらのフェーズでキャプチャされた画像を使用して説明できます(それぞれステップ5.5およびステップ7.1.1を参照)。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
補足ファイル2:データ分析。 ステップ9.2で得られたデータから相対cADDis強度を計算する方法の例。列D-Fの生データは、ソフトウェアから直接エクスポートされます。各時点の生の値は、ベースライン培地の最後の1分間の平均強度に正規化されます(G 2;プロトコルでは7〜8分)。経時的なすべての疑似膵島の平均強度を計算して、 図2Cのグラフを生成します。 このファイルをダウンロードするには、ここをクリックしてください。
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Discussion
微小周融合システム、バイオセンサー発現偽島、レーザー走査型共焦点顕微鏡の統合により、細胞内シグナル伝達イベントと動的ホルモン分泌プロファイルの同期評価が可能になります。動的微小周輸システムは、一連の明確に定義された刺激を偽膵島に送達することができ、市販のELISAによってインスリンおよびグルカゴン濃度を測定できる廃液の収集を可能にする。同時に、共焦点顕微鏡プラットフォームによるバイオセンサー発現偽島体の生細胞イメージングは、細胞内シグナル伝達イベントに関する情報を提供するリアルタイムのバイオセンサー蛍光活性をキャプチャします。バイオセンサーシグナルとホルモン分泌プロファイルを経時的に同時に測定することで、膵島ホルモン分泌に対する細胞内シグナル伝達イベントの影響を直接比較することができます。
提示されたプロトコルの成功には、複数の考慮事項が鍵となります。これらには、バイオセンサーを発現する疑似膵島を生成することや、疑似膵島を動かさずに各実験中に一定の流量を使用することが含まれます。流速が 100 μL/分で、フラクション回収が 2 分の場合、各フラクションのペリフューセート容量は 200 μL であり、10 μL/フラクションを超えて変動してはなりません。また、イメージングソフトは視野内のXY平面内の微小な疑似膵島の動きに調整できますが、微小分裂実験の過程で視野外に移動する疑似膵島は解析できません。したがって、実験中の早い段階で漏れや動きを検出して、問題の修正を試みることが重要です。潜在的な課題、その一般的な原因、解決策、およびそれらが発生するのを防ぐためのヒントの概要を 表2にまとめました。それにもかかわらず、このプロトコルには、チップをロードする前にテスト実験を行う(ステップ2.3)などの問題を予測する複数の機会が含まれており、画像取得および微小分裂分画収集(ステップ6.4-6.5)前の30分間の洗浄期間中に顕微鏡 を介して 偽島が有意な動きをモニターします。
1つの制限は、現在の共焦点顕微鏡プラットフォームの視野では、マイクロチップ内のすべての偽膵島を一度に捕捉できないことです。ミクロペリフューセート中のインスリンとグルカゴンを確実に検出するには、最低30個の偽膵島が必要ですが、20倍の倍率で画像化できるのはサブセットのみです。疑似膵島をウェルの中央にロードすると、視野に捕捉できる数が最大化されます。さらに、マイクロチップには3つのウェルが装備されていますが、共焦点顕微鏡との統合により、測定は一度に1つのウェルに制限されるため、技術的な複製は並列ではなく直列に行う必要があります。さらに、この現在のアプローチは、偽島蛍光全体をアルファおよびベータ細胞特異的な分泌出力と共登録します。しかし、これは、遺伝子コードされたバイオセンサーの細胞特異的標的化を用いて、アルファ細胞またはベータ細胞の細胞内イベントの変化を直接測定するように改変することができます。このプロトコルではインスリンとグルカゴンの分泌のみが評価されましたが、今後の研究では、デルタ細胞からのソマトスタチン分泌など、他の膵島ホルモンの分泌も測定できます。注目すべきことに、現時点では、ソマトスタチンは、IBMXなどの高度に刺激的な分泌促進物質に応答して、このプラットフォームでのみ検出可能である。最後に、単離された膵島と偽膵島は、 in vivoで膵島の神経血管構造を欠いており、これは膵島機能に直接影響を与えることが示されています。
結論として、記載されたプラットフォームは、バイオセンサーとホルモン分泌を使用して細胞内シグナル伝達イベントの評価を同期させる戦略を提供します。このシステムは、RNA干渉(siRNAまたはshRNA)またはCRISPRを介した遺伝子ターゲティング戦略によってもたらされる機能的摂動を調べるためにさらに適応させることができます。これらの方法は、GCaMP6f 7で以前に実証されたように、cADDisの外側で遺伝的にコードされたバイオセンサーを使用して、多数の細胞内または細胞外のイベントに対する目的の経路の生物学的影響を決定するために使用できます7。さらに、特定の細胞タイプの選択的形質導入および/または細胞特異的刺激への曝露により、ヒト膵島のコンテキスト内の特定の細胞タイプの細胞内シグナル伝達イベントの標的調査が可能になります。例えば、ヒト膵島のアルファ細胞を細胞表面マーカーを用いて精製し、その後、細胞内カルシウム動態を評価するために、一般的に使用される遺伝子コードされたカルシウムバイオセンサーGCaMPで形質導入することができます。次に、これらのウイルス形質導入細胞を他の形質導入されていない膵島細胞と再結合させて偽膵島を形成するか、または単独で再凝集させて、組成的に1型糖尿病の膵島に類似したアルファ細胞に富む偽膵島を生成することができます。このアプローチは、Ca2+などの細胞内分子を負荷されたCa2+感受性色素を用いて測定し、免疫染色または他の手段による生細胞イメージング後に細胞の同一性を決定する従来の手法とは異なる15。あるいは、測定は、膵島細胞機能に対するパラクリンシグナル伝達の影響が失われる単一細胞状態で行われる15。このように、疑似膵島システムおよび微小周融合プラットフォームと統合されたこの生細胞イメージングは、膵島生物学における以前の課題を克服すると同時に、不可欠な細胞プロセスの知識を広げます。
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Disclosures
著者は何も開示していません。
Acknowledgments
臓器提供者とその家族は、その貴重な寄付に感謝し、国際臓器調達機構、医学振興機構(IIAM)、および国立疾病研究交換(NDRI)は、ヒトの膵臓組織を研究に利用できるようにするためのパートナーシップを認められています。この研究は、Human Islet Research Network (RRID:SCR_014393)、Human Pancreas Analysis Program (RRID:SCR_016202)、DK106755、DK123716、DK123743、DK120456、DK104211、DK108120、DK112232、DK117147、DK112217、EY032442、DK20593 (Vanderbilt Diabetes Research and Training Center)、レオナ・M・アンド・ハリー・B・ヘルムズリー慈善信託、JDRF、米国退役軍人省(BX000666)、 国立衛生研究所(T32GM007347)、F30DK134041、F30DK118830、および国立科学財団大学院研究フェローシップ(1937963)のNIGMS。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Ad-CMV-cADDis | Welgen | Not applicable | |
| 0.01” FEP tubing | IDEX | 1527L | |
| 1 M HEPES | Gibco | 15630-080 | Enriched-CMRL Media Component |
| 1.5 mL and conical tubes | Any | Any | |
| 10 μm PTFE filter | Cole-Parmer | SK-21940-41 | Change every 8-10 runs |
| 100 mM Sodium Pyruvate | Thermo Scientific | 11360070 | Enriched-CMRL Media Component |
| 190 proof Ethanol | Decon labs | 2816 | Acid Ethanol Component |
| 200 mM GlutaMAX-I Supplement | Gibco | 35050061 | Enriched-CMRL Media Component |
| Ascorbate | Sigma | A5960 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Bovine Serum Albumin | Sigma | A7888 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Bubble trap | Omnifit | 006BT | |
| CellCarrier ULA 96-well Microplates | Perkin Elmer | 6055330 | |
| cellSens analysis software | Olympus | v3.1 | Software used for data analysis |
| CMRL 1066 | MediaTech | 15-110-CV | Enriched-CMRL Media Component |
| Conical adapter (IDEX, P-794) | IDEX | P-794 | |
| D-(+)-Glucose | Sigma | G7528 | Glucose Buffer Component |
| DMEM | Sigma | D5030 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Environmental chamber | okolab | IX83 | |
| Epinepherine (Epi) | Sigma | E4250 | Stimulation Buffer Component |
| Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated | Sigma | 12306C | Enriched-CMRL Media Component |
| Glucagon ELISA | Mercodia | 10-1281-01 | |
| Glucagon Kit HTRF | Cisbio | 62CGLPEH | |
| HCl (12N) | Any | Any | Acid Ethanol Component |
| HEPES | Sigma | H7523 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| iCell Endothelial Cells Medium Supplement | Cell Dynamics | M1019 | iEC Media Component |
| Idex Derlin nut & ferrule 1/4-24 | Cole-Parmer | EW-00414-LW | |
| Insulin ELISA | Mercodia | 10-1113-01 | |
| Isobutylmethylonine (IBMX) | Sigma | I5879 | Stimulation Buffer Component |
| Laser scanning confocal microscope | Olympus | FV3000 | |
| L-Glutamine | Sigma | G8540 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Microchip (University of Miami, FP-3W) | University of Miami | FP-3W | |
| Microchip holder | Micronit Microfluidics | FC_PRO_CH4525 | |
| Model 2110 Fraction Collector | Biorad | 7318122 | |
| P10, P200, and P1000 pipets and tips | Any | Any | |
| Penicillin/Streptomycin | Gibco | 15140-122 | Enriched-CMRL Media Component |
| Peristaltic pump | Instech | P720 | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco | 14190-144 | Wash Islets |
| Sarstedt dishes | Sarstedt | depends on dish diameter | |
| Sodium Bicarbonate | Sigma | S6014 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Sodium Pyruvate | Sigma | P2256 | DMEM Perifusion Buffer Component |
| Stereoscope | Olympus | SZX12 | |
| Steriflip Filter (0.22 μm) | Millipore | SCGP00525 | Filter all buffers twice |
| VascuLife VEGF Medium Complete Kit | LifeLine Cell Technology | LL-0003 | iEC Media Component |
References
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