Summary
La utilización de un modelo tumoral autóctono inmunocompetente impulsado por mutaciones comunes de los pacientes para las pruebas preclínicas es fundamental para las pruebas inmunoterapéuticas. Este protocolo describe un método para generar modelos de ratón con tumores cerebrales utilizando la administración de ADN plasmídico basado en electroporación que representa mutaciones comunes de los pacientes, proporcionando así un modelo de ratón preciso, reproducible y consistente.
Abstract
Los modelos tumorales son fundamentales para las pruebas preclínicas de los tumores cerebrales en términos de explorar tratamientos nuevos y más eficaces. Con un interés significativo en la inmunoterapia, es aún más importante contar con un modelo de ratón consistente, clínicamente pertinente e inmunocompetente para examinar las poblaciones de tumores y células inmunitarias en el cerebro y su respuesta al tratamiento. Si bien la mayoría de los modelos preclínicos utilizan el trasplante ortotópico de líneas celulares tumorales establecidas, el sistema de modelado presentado aquí permite una representación "personalizada" de las mutaciones tumorales específicas del paciente en un desarrollo gradual pero efectivo a partir de construcciones de ADN insertadas en células precursoras neurales (NPC) en división in vivo. Las construcciones de ADN presentan el análisis en mosaico con el método de intercambio de casetes mediado por recombinasa dual (MADR), lo que permite la mutagénesis somática de una sola copia de las mutaciones conductoras. Utilizando crías de ratón recién nacidas entre el nacimiento y los 3 días de edad, los NPC son atacados aprovechando estas células en división que recubren los ventrículos laterales. La microinyección de plásmidos de ADN (p. ej., derivados de MADR, transposones, sgRNA dirigido por CRISPR) en los ventrículos es seguida de electroporación utilizando paletas que rodean la región rostral de la cabeza. Tras la estimulación eléctrica, el ADN es absorbido por las células en división, con el potencial de integrarse en el genoma. El uso de este método se ha demostrado con éxito en el desarrollo de tumores cerebrales pediátricos y adultos, incluido el tumor cerebral maligno más común, el glioblastoma. Este artículo discute y demuestra los diferentes pasos del desarrollo de un modelo de tumor cerebral utilizando esta técnica, incluyendo el procedimiento de anestesia de crías de ratón jóvenes, hasta la microinyección de la mezcla de plásmidos, seguida de electroporación. Con este modelo de ratón autóctono e inmunocompetente, los investigadores tendrán la capacidad de ampliar los enfoques de modelado preclínico, en un esfuerzo por mejorar y examinar el tratamiento eficaz del cáncer.
Introduction
Los modelos de tumores cerebrales murinos son cruciales para comprender los mecanismos de formación y tratamiento de tumores cerebrales. Los modelos actuales suelen incluir trasplantes subcutáneos u ortotópicos producidos rápidamente de líneas celulares tumorales de uso común, basados en un número limitado de mutaciones conductoras o modelos de xenoinjertos derivados de pacientes, utilizando ratones inmunodeficientes que dificultan los estudios de inmunoterapia adecuados 1,2,3,4. Además, estos resultados preclínicos pueden conducir a falsos positivos, en el sentido de que dichos modelos pueden exhibir efectos dramáticos, a menudo curativos, en respuesta a la terapia, pero esto no se traduce en la clínica 2,5,6,7. Tener la capacidad de producir rápidamente modelos de ratón preclínicos modificados genéticamente que reflejen mejor las firmas de mutación de los pacientes es imperativo para mejorar la validez de los resultados preclínicos.
La administración de plásmidos de ADN basada en la electroporación (EP) para inducir mutaciones tanto de pérdida de función (LOF) como de ganancia de función (GOF) permite la generación de dichos modelos. Desarrollamos un método para una representación aún más precisa de las mutaciones conductoras de GOF llamado análisis en mosaico con intercambio de casetes mediado por doble recombinasa, o MADR8. Este método permite la expresión de un gen (o genes) de interés de forma controlada y específica del locus en células somáticas8. En combinación con otras herramientas moleculares, como las repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPR), se pueden combinar diferentes mutaciones de pacientes para desarrollar modelos de tumores cerebrales de ratón. Este método se ha utilizado para diferentes tumores cerebrales pediátricos, incluidos gliomas y ependimomas8, así como modelos de tumores cerebrales en adultos, como el glioblastoma (GBM).
Si bien el método EP de modelado tumoral no es tan común como un trasplante, lo siguiente demuestra hasta ahora la facilidad y la alta reproducibilidad de este sistema de modelado. Los ratones mTmG se utilizan para la inserción del ADN plasmídico MADR 8,9. Este sistema permite la recombinación de los sitios diana loxP y Flp recombinasa (FRT) localizados en el locus Rosa26 para la posterior inserción del plásmido de ADN donante (es decir, el gen GOF de interés)8,9. El siguiente protocolo demuestra la sencillez de este método después de una práctica diligente y la capacidad de desarrollar modelos de tumores cerebrales de ratón de una manera autóctona y consistente.
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Protocol
Todos los procedimientos de este protocolo fueron aprobados por el Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales (IACUC, por sus siglas en inglés) del Centro Médico Cedars Sinai. Los ratones mTmG homocigotos se cruzaron con ratones C57BL/6J para obtener camadas de ratones mTmG heterocigotos de sexo mixto para su uso en el siguiente protocolo. Los animales se obtuvieron de una fuente comercial (ver Tabla de Materiales). Las crías de ratón fueron electroporadas entre los días postnatales 0 y 3 (P0-P3).
1. Configuración quirúrgica
- Rocíe la mesa quirúrgica con desinfectante químico (por ejemplo, Vimoba) y limpie, seguido de etanol al 70 %, y vuelva a limpiar.
- Coloque los siguientes instrumentos/materiales en la mesa quirúrgica: pipetas capilares de vidrio estirado (consulte la referencia10 sobre cómo extraer pipetas), tijeras pequeñas, contenedor pequeño de desechos de objetos punzantes de riesgo biológico, pipeta de microlitros y puntas de pipeta, 2 piezas cuadradas cortadas de película de parafina, gel de electrodos, electrodos, soporte para el microinyector y mezcla de plásmidos de ADN (consulte la Tabla de materiales y el archivo complementario 1).
- Coloque los siguientes accesorios en el equipo en la mesa quirúrgica o en el piso cuando esté indicado: panel de control del microinyector, soporte y enchufe conectados a la máquina, soporte para sostener el soporte del microinyector a un lado (ayuda para soldar), pedal del microinyector (en el piso), electrodos conectados a la máquina y pedal del electrodo (en el piso) (consulte la Tabla de materiales).
NOTA: El pedal del electrodo se colocó a la derecha del pedal del microinyector como recordatorio del orden de uso. - Encienda los paneles de control del microinyector y del electrodo.
- Compruebe que los ajustes del microinyector son correctos para el experimento: la presión debe estar entre 220 y 450 hPa, dependiendo de cómo se absorba la mezcla de plásmidos.
- Compruebe que los ajustes del panel de electrodos sean correctos para el experimento.
NOTA: Para el experimento actual (y para la mayoría de nuestros modelos de tumores cerebrales), se utilizan cinco pulsos de 120 V (50 ms; separados por 950 ms).
2. Preparación prequirúrgica
- Prepare la mezcla de plásmidos en el microinyector.
- Recupere una pipeta capilar de vidrio extraída e insértela en el soporte del microinyector. Asegúrese de que la punta esté atornillada para mantenerla en su lugar.
- Sostenga el soporte del microinyector en una mano y las tijeras pequeñas con la otra; Coloque la punta de la pipeta sobre un pequeño recipiente para objetos punzocortantes de riesgo biológico. Con las tijeras cerradas, presione ligeramente la pipeta capilar de vidrio alargada. Corte donde se ve la curva, aproximadamente a 2 mm de la abertura. Si el corte parece exitoso, colóquelo con cuidado a un lado.
- Coloque el tubo de mezcla de plásmidos disponible en el mercado plano sobre la mesa quirúrgica y ábralo. Coloque la caja de puntas de pipeta u otro elemento detrás de la parte inferior del tubo para mantenerlo estable mientras extrae la mezcla de plásmidos. Coloque la pipeta de vidrio que está unida a la línea del microinyector plana sobre la mesa e insértela suavemente en el tubo de la mezcla de plásmidos, asegurándose de que la punta esté bien en la mezcla cerca del fondo del tubo.
NOTA: Debido a la succión natural por gravedad, la succión de la mezcla de plásmidos comenzará en la pipeta de vidrio antes de aspirar activamente. - Con la punta de la pipeta de vidrio en la mezcla de plásmidos, utilice el panel del microinyector para aumentar la cantidad que se aspira. A partir de 0, gire la perilla derecha y dial en la dirección negativa hacia -60, esto llevará la mezcla de plásmidos a la pipeta de vidrio. Solo traiga ~ 1 pulgada de mezcla de plásmidos. Vuelva a colocar la perilla en 0 y, a continuación, retire la punta de la pipeta de la mezcla.
NOTA: No retire la punta de la pipeta de la mezcla mientras esté en la dirección negativa, ya que esto disparará la mezcla hacia el microinyector y posiblemente hacia el tubo. - Pruebe la cantidad de mezcla en una inyección inyectando la mezcla en una tira de película de parafina. Use el pedal y presione una vez para inyectar la mezcla en la película de parafina. Utilice la pipeta ajustada a 1 μL para absorber la mezcla en la película de parafina para ver si es exactamente 1 μL.
NOTA: Si es ligeramente inferior a 1 μL, se puede aumentar la presión del microinyector. Si la presión se acerca a los 450 hPa y sigue siendo inferior a 1 μL, la abertura de la pipeta de vidrio es demasiado pequeña y será necesario recortarla más. Se sugiere volver a colocar la mezcla de plásmidos en el tubo antes de recortar. A pesar de esto, todavía habrá una mezcla residual en las tijeras, por lo que es imperativo limpiar a fondo las tijeras después con DNase para eliminar cualquier resto de mezcla. Si la inyección es superior a 1 μl, será necesario utilizar y recortar una pipeta de vidrio extraída nueva. Cuando la cantidad de prueba es exactamente de 1 μl, la punta de la pipeta de vidrio tiene el tamaño correcto. - Repita el paso 2.1.4 para extraer una mezcla de plásmidos adicional para el procedimiento, o aproximadamente 2-3 pulgadas en la pipeta de vidrio extraída. Asegúrese de que la mezcla no penetre demasiado en el microinyector donde no se pueda ver el final.
NOTA: Al dibujar la mezcla de plásmidos, es fundamental evitar las burbujas de aire. Si hay burbujas, es necesario volver a realizar este paso retirando la mezcla de plásmidos de la pipeta de vidrio extraída y comenzando de nuevo. Las burbujas de aire presentes serán perjudiciales para los siguientes pasos al inyectar en el ventrículo del cachorro. - Con la mezcla de plásmidos lista en la pipeta de vidrio extraída, coloque la pipeta preparada a un lado en el soporte de ayuda para soldar y fuera del camino para no tocarla o golpearla accidentalmente.
- Prepara a los animales para el experimento.
- Prepara una cubeta de hielo para anestesiar a los cachorros. Agregue agua a la cubeta de hielo para que se derrita y ayude a enfriar el soporte de anestesia (p. ej., la parte superior de la caja de pipetas).
- Coloque la parte superior de la caja sobre el hielo derretido para que se enfríe.
- Retire con cuidado a los cachorros de la jaula y colóquelos en la parte superior de la caja enfriada, que permanece en el hielo. Coloque otra parte superior sin apretar sobre la parte inferior para ayudar al proceso de enfriamiento.
- Después de 2-3 minutos, revisa a los cachorros. Separe a los cachorros entre sí mientras permanecen en posición prona.
NOTA: Los cachorros se retorcerán, pero esto disminuirá a medida que la anestesia fría haga efecto. La parte superior de la caja se puede dejar fuera para facilitar la visualización de los cachorros. - Para verificar si la anestesia es adecuada, pellizca la cola del cachorro y busca una reacción. Si hay una reacción, repita el paso 2.2.4. Si no se hace ningún chillido o poco movimiento, el cachorro está listo para el procedimiento.
NOTA: Los ratones no deben mantenerse en hielo durante períodos prolongados de tiempo, ya que esto afectará su capacidad para recuperarse después del procedimiento. Solo el número de cachorros que pueden ser inyectados y electroporados mientras aún están bajo anestesia debe ponerse en hielo a la vez; Con la experiencia se pueden hacer números mayores.
3. Microinyección de mezcla de plásmidos de ADN en el ventrículo cerebral
- Coloque un cachorro en la mesa en posición ventral.
- Tire ligeramente hacia atrás de la parte posterior de la cabeza para visualizar las suturas del cráneo a través de la piel. Encuentra lambda en el cráneo. El ventrículo/sitio de inyección estará a medio camino entre lambda y el ojo.
NOTA: Lambda es donde se cruzan las suturas sagital y lambdoides. Véase la referencia11 para la identificación de lambda en el cráneo del ratón. - Perfore la piel con la punta de la pipeta de vidrio en un ángulo perpendicular (la pipeta está recta hacia el techo). Obsérvese una ligera hendidura cóncava al presionar sobre el cráneo y una resistencia inicial. Una vez perforada y la punta de la pipeta de vidrio asoma a través de la hendidura cóncava, se alcanza el nivel de inyección adecuado.
- Mantenga la punta de la pipeta de vidrio en su lugar y presione el pedal del microinyector una vez para inyectar 1 μL de la mezcla de plásmidos.
NOTA: Hay dos maneras de ver claramente que la inyección fue exitosa. Primero, pida a otro miembro del laboratorio que observe cómo la mezcla de plásmidos desciende en la pipeta de vidrio a medida que se inyecta. Además, si se usa verde rápido u otro tinte en la mezcla de plásmidos, el tinte se extenderá visiblemente en el ventrículo debajo de la piel una vez inyectado y es fácilmente visible cuando se sostiene frente a una lámpara quirúrgica.
4. Electroporación
- Coloque un trozo de película de parafina (un cuadrado) sobre la mesa y exprima el gel del electrodo sobre la película. Cubra las paletas de electrodos con gel de electrodos cepillando una cantidad generosa en cada paleta. Cualquier exceso de gel que gotee se puede deslizar sobre una toalla de papel.
NOTA: Después del primer EP, no permita que el gel de cada paleta toque el otro lado. Esto transferirá la carga y, cuando se aplique a la cabeza del cachorro, se puede escuchar un sonido chisporroteante. Esto también sucederá si el gel en la cabeza del cachorro de un electrodo entra en contacto con el gel de otro.
PRECAUCIÓN: Se debe tener cuidado de mantener los dedos alejados de las paletas durante la electroporación. - Sostenga el cuerpo del cachorro con una mano (generalmente la mano no dominante), manteniendo los dedos bien detrás de la cabeza.
NOTA: Si es diestro, es más fácil sostener al cachorro con la mano izquierda y los electrodos con la derecha. Si eres zurdo, haz lo contrario. - Acerque los electrodos a la cabeza del cachorro para asegurarse de que estén en la posición adecuada, con el electrodo positivo en la parte exterior de la cabeza donde se dirige el ventrículo (p. ej., si se dirige al ventrículo izquierdo, coloque el positivo en el lado izquierdo del cachorro y el negativo en el lado derecho del cachorro). Mientras coloca los electrodos, deslice suavemente un dedo (generalmente el pulgar) en el lado dorsal del cuerpo/cuello posterior a la cabeza para ayudar a levantar la cabeza a su posición.
- Verifique la profundidad de la anestesia pellizcando la cola y proceda con la electroporación solo si el cachorro está en el plano apropiado de anestesia. Apriete ligeramente las paletas de electrodos en la parte rostral de la cabeza del ratón, colocándolas sobre los ojos. Presione el pedal del electrodo una vez para iniciar la electroporación. Este protocolo utiliza cinco pulsos de 120 V (50 ms, separados por 950 ms); Cada pulso será audible.
- Con cada pulso, gire las paletas de electrodos ligeramente en sentido contrario a las agujas del reloj para que la paleta positiva se mueva hacia la parte superior de la cabeza.
NOTA: Con la electroporación adecuada, uno sentirá/verá que el cuerpo del cachorro de ratón se contrae con cada pulso.
- Con cada pulso, gire las paletas de electrodos ligeramente en sentido contrario a las agujas del reloj para que la paleta positiva se mueva hacia la parte superior de la cabeza.
- Después del pulso final, retire las paletas y colóquelas a un lado. Mueva al cachorro a una toalla de papel limpia y pídale a otro miembro del laboratorio que limpie el gel de la cabeza del cachorro y colóquelo debajo de una lámpara de calor en un "bote" de toallas de papel.
NOTA: Asegúrese de que la lámpara de calor no esté demasiado cerca de los cachorros. Asegúrate de que otro miembro del laboratorio te ayude con este paso y vigila constantemente a los cachorros. A menudo ayuda sostener a los cachorros en la mano debajo de la lámpara de calor para aumentar el calor para el cachorro. Masajear suavemente el abdomen del cachorro también puede ayudar con la recuperación. - Regrese a los cachorros a la jaula de la casa una vez que sus cuerpos tengan un color rosado saludable y tengan una respuesta chirriante a un ligero pellizco de la cola.
NOTA: Antes de volver a colocarlos en la jaula, tome una pequeña cantidad del material de cama de la jaula doméstica y cepille ligeramente a los cachorros con él para obtener el olor de la jaula. Vuelva a colocar a los cachorros en la jaula debajo del material de cama y regrese a la sala de espera.
5. Pasos postquirúrgicos
- Vuelva a colocar la mezcla de plásmidos no utilizada de la pipeta de vidrio del microinyector al tubo. Si queda suficiente mezcla, se puede utilizar en procedimientos futuros. Conservar a -20 °C.
- Limpie el gel de las paletas de electrodos con toallas de papel.
- Devuelva todas las piezas del equipo a su lugar original.
NOTA: Si se utilizaron tijeras para cortar la punta de la pipeta de vidrio después de tomar la mezcla de plásmidos, deje las tijeras afuera para limpiar a fondo con la solución de DNasa. - Rocíe la mesa con un desinfectante químico, luego limpie, seguido de un rociado de etanol al 70%, luego limpie nuevamente.
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Representative Results
El protocolo descrito anteriormente se ha utilizado para desarrollar con éxito modelos de ratones con tumores cerebrales pediátricos y adultos, y el primero se ha publicado con gran detalle en Kim et al.8. Con la técnica adecuada y una planificación cuidadosa del diseño de plásmidos, el éxito para el desarrollo de tumores EP suele ser del 100%. La histología es la forma más rápida y sencilla de comprobar el éxito de la inserción de plásmidos de ADN cuando se utiliza una proteína indicadora. Este protocolo incluye pasos sobre cómo desarrollar un modelo de tumor cerebral GBM con una penetrancia del 100%, según lo confirmado por el análisis histológico. Un plásmido donante de MADR expresó tanto una proteína reportera (smTagBFP2-V5) como SpCas9 (Archivo Suplementario 1). También se incluyeron dos ARN de guía única (sgRNA) del gen supresor de tumores LOF que impulsan fuertemente, dirigidos a Nf1 y Trp53 (consulte la referencia12 para la estrategia de clonación de sgRNA; consulte el Archivo suplementario 1 para las secuencias de oligonucleótidos utilizadas en este protocolo). Finalmente, los plásmidos recombinasa Cre y Flp se agregaron a la mezcla de plásmidos para su recombinación en el locus Rosa26 (Figura 1A; ver Archivo Suplementario 1). Los ratones estaban moribundos a los 5 meses después de la EP, y se detectó un crecimiento tumoral completo a través de la proteína reportera y el análisis histológico (Figura 1B).
Figura 1: Tinción inmunofluorescente del crecimiento tumoral exitoso a los 5 meses post-EP . (A) Plásmido donante de MADR para spCas9 y la proteína reportera TagBFP2-V5. También se incluyó en la mezcla de plásmidos un plásmido recombinasa Cre-Flp, junto con sgRNAs dirigidos a Nf1 y Trp53. (B) Una sección coronal tomada a los 5 meses después de la EP de un tumor GBM impulsado por Nf1 y Trp53 LOF. Las células tumorales se marcan con la proteína reportera TagBFP-V5 unida a spCas9 (B3). También se detecta el marcaje disperso de EGFP (B2) junto con todas las células que no expresaron los plásmidos marcados con tdTomato (B1). Barra de escala = 1.000 μm. Abreviaturas: Ctx = corteza; CC = cuerpo calloso; VI = ventrículo lateral; Str = cuerpo estriado. Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.
Archivo complementario 1: Secuencias de plásmidos. Secuencias completas de todos los plásmidos y oligonucleótidos utilizados en este protocolo, incluidos pDonor-SM-TagBFP2-V5-P2A-spCas9-WPRE, pCag-FlpO-2A-Cre y los oligonucleótidos para sgRNA dirigidos a Trp53 y Nf1. Haga clic aquí para descargar este archivo.
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Discussion
La administración de ADN plasmídico basada en la electroporación permite el uso in vivo de la biología molecular, similar a la utilizada en modelos de ratón modificados genéticamente, pero con la velocidad, localización y eficiencia de la transducción viral 8,13,14. Con esto último, sin embargo, vienen preocupaciones de seguridad, así como respuestas inmunitarias. Hemos demostrado en nuestro sistema de modelado utilizando la administración EP de ADN plasmídico que se produce una respuesta inmunitaria mínima debido a la inserción inicial de la pipeta capilar de vidrio en el ventrículo cerebral8. Por lo tanto, para mejorar los sistemas actuales de modelado tumoral para inmunoterapia, el protocolo presentado anteriormente permite un sistema de modelado preclínico más conveniente y robusto para los tumores cerebrales.
El primer paso crucial para el modelado exitoso de tumores cerebrales utilizando este método es el diseño de plásmidos. Si bien no se describe en este protocolo, ha sido ampliamente discutido en Kim et al.8 y Rincón Fernández Pacheco et al.10 para modelos de tumores cerebrales pediátricos, así como en otras fuentes para usos adicionales15,16. Si bien nuestro laboratorio ha electroporado con éxito hasta seis plásmidos, habrá un límite superior para la cantidad de ADN que se puede entregar. Este límite superior está limitado por la concentración de ADN plasmídico, el tamaño de los plásmidos, el voltaje y el volumen de ADN entregado, que a su vez está limitado por el tamaño del ventrículo cerebral en la edad de electroporación. Además, con múltiples plásmidos de ADN en la mezcla, es imperativo tener una mezcla de plásmidos bien suspendida antes de la inyección. Si la mezcla no se resuspende bien, será difícil de absorber en la pipeta capilar de vidrio estrecho. Además, con la mezcla de plásmidos adecuada, la adición de colorante verde rápido (10% v/v) permite una visualización clara de la mezcla de plásmidos absorbida en el ventrículo cerebral durante la administración (paso 3.4). Sin embargo, una advertencia importante a esto es que el tinte puede interferir con la tinción de anticuerpos en las longitudes de onda de color rojo lejano (por ejemplo, Cy5) del tejido procesado dentro de varias semanas después de EP8. Aunque el tinte verde rápido es muy útil cuando se aprende EP por primera vez, se puede eliminar para evitar la tinción de falsos positivos. Vale la pena tener en cuenta que, para el paso 3.4, la administración de la mezcla de plásmidos en el ventrículo no será visible, por lo que será crucial observar la pipeta de vidrio para que el volumen disminuya a medida que se inyecta.
Para la consistencia y el manejo adecuado de las inyecciones, hay varios factores a tener en cuenta: 1) el volumen de inyección. Aunque pueden ser necesarios varios intentos para cortar la pipeta capilar de vidrio con precisión (paso 2.1.2), es crucial que solo se inyecte 1 μL de mezcla de plásmidos para cada animal. Los aumentos o disminuciones en el volumen entre animales sin duda afectarán la latencia de la formación de tumores. 2) Una vez ajustado el volumen de inyección, no se deben cambiar los parámetros del microinyector, ya que esto afectará al volumen. 3) Una vez que la mezcla de plásmidos se introduce en la pipeta capilar de vidrio, la pipeta debe mantenerse fuera del camino para no pincharse accidentalmente a sí mismo o a otros. Para ello, es útil utilizar un soporte de micropipeta (auxiliar de soldadura; consulte la Tabla de materiales) que se enganche al soporte del microinyector. Sin embargo, si la mezcla de plásmidos no se inyecta poco después, es probable que obstruya la punta. Por lo tanto, es importante hacer una microinyección de prueba en un trozo de parafilm inmediatamente antes de inyectarlo en el ventrículo cerebral para asegurarse de que no haya ninguna obstrucción que bloquee el orificio. Por último, al igual que cualquier otra técnica quirúrgica, la ejecución del protocolo es diferente para cada individuo. Por lo tanto, es imperativo que el mismo técnico realice la microinyección y/o la EP para todos los grupos de ratones en un experimento.
Los modelos de tumores cerebrales desarrollados en nuestro laboratorio se han centrado en los gliomas. Desde una perspectiva neurobiológica, la realización de este método entre los días postnatales 0-3 se dirige al período de gliogénesis y al período de neurogénesis postembrionaria. El interés en tumores cerebrales alternativos puede requerir un ajuste en el momento y/o la posición de los electrodos. Existen varios protocolos disponibles para la PE intrauterina que serían pertinentes para los tumores de base neural15,17,18.
Este método tiene algunas limitaciones. La capacidad de clonar, mezclar y combinar plásmidos de ADN LOF y GOF utilizando CRISPR, transposones y, más recientemente, el sistema MADR permite modelar infinitas combinaciones de mutaciones de pacientes. Las técnicas de microinyección y EP son relativamente simples, aunque se necesitan algunos intentos de práctica para mejorar y volverse consistentes. Una limitación del modelo presentado es el tiempo que tarda el tumor GBM en desarrollarse completamente (5 meses). A pesar de esto, actualmente estamos trabajando en modelos adicionales utilizando mutaciones tumorales comunes en pacientes que conducen a un crecimiento tumoral agresivo que dura menos de 2 meses. Además de las limitaciones, el equipo en sí es una inversión inicial sustancial (alrededor de $ 20,000 a $ 30,000); Sin embargo, la capacidad de electropoar decenas, si no cientos, de ratones de una sola vez permite una potencia increíble para un experimento preclínico. Dicho esto, si hay problemas con la cría de ratones, esta puede convertirse en la mayor limitación, ya que es imperativo tener criadores sanos y camadas sanas.
Han pasado varias décadas desde que se produjeron avances en el tratamiento de tumores cerebrales, con la última gran mejora de la temozolomida quimioterapéutica que extendió la supervivencia en solo unos pocos meses19. La inmunoterapia ha revolucionado muchos tipos de cáncer diferentes, pero aún no ha tenido un impacto significativo en el estándar de atención en neurooncología. Curiosamente, los modelos de tumores cerebrales de ratón utilizados actualmente han demostrado un gran éxito con la inmunoterapia, pero continuamente no logran trasladarse a la clínica y mostrar éxito con los pacientes. Por lo tanto, es imperativo dar un paso atrás y reevaluar los modelos tumorales de ratón utilizados. Los modelos actuales dependen del uso de líneas celulares más antiguas con mutaciones limitadas que no se encuentran comúnmente en los pacientes mientras se inyectan miles de células en el cerebro. Con la técnica discutida en este protocolo, se recapitulan diferentes perfiles de mutación tumoral de pacientes en un modelo de ratón, lo que permite un desarrollo autóctono y gradual de tumores dentro de un marco de tiempo que permitiría realizar pruebas preclínicas en ratones inmunocompetentes.
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Disclosures
Los autores no tienen nada que revelar.
Acknowledgments
Agradecemos a Gi Bum Kim por la tinción inmunofluorescente y las imágenes. También agradecemos a Emily Hatanaka, Naomi Kobritz y Paul Linesch por sus útiles consejos sobre el protocolo.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1-2.5 µL 1-channel pipette | Eppendorf | 3123000012 | |
| 2 µL pipette tips | Fisher Scientific | 02-707-442 | |
| 20 µL pipette tips | Fisher Scientific | 02-707-432 | |
| 2-20 µL 1-channel pipette | Eppendorf | 3123000098 | |
| DNAZap PCR DNA Degradation Solutions | Fisher Scientific | AM9890 | |
| ECM 830 Square Porator Electroporator | BTX | 45-0662 | |
| Electrode Gel | Parker Labs | PLI152CSZ | |
| Fast Green Dye | Sigma-Aldrich | F7258-25G | |
| Helping Hands Soldering Aid | Pro'sKit | 900-015 | |
| Micro Dissecting Scissors, 4.5" Straight Sharp | Roboz | RS-5916 | |
| Mouse Strain: C57BL/6J | The Jackson Laboratory | JAX: 000664 | |
| Mouse Strain: Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J | The Jackson Laboratory | JAX: 007676 | |
| Parafilm | Grainger | 16Y894 | |
| Plasmid: pCag-FlpO-2A-Cre EV | Addgene | 129419 | |
| Platinum Tweezertrode, 7 mm Diameter | BTX | 45-0488 | |
| Sharps container, 1-quart | Uline | S-15307 | |
| Standard Glass Capillaries, 4 in, 1 mm OD, 0.58 mm ID | World Precision Instruments | 1B100F-4 | Capillary pipettes need to be pulled - see reference 10 for details. |
| Vertical Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-30 | Heat settings: Heat #1 at 880, Heat #2 at 680; pull at 800. See reference 10 for more details on pulling. |
| Vimoba Tablet Solution | Quip Laboratories | VIMTAB | |
| XenoWorks Digital Microinjector | Sutter Instruments | BRE | |
| XenoWorks Micropipette Holder | Sutter Instruments | BR-MH |
References
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