Summary
Klinik öncesi testler için yaygın hasta mutasyonları tarafından yönlendirilen immün yetmez, otokton bir tümör modelinin kullanılması, immünoterapötik testler için kritik öneme sahiptir. Bu protokol, yaygın hasta mutasyonlarını temsil eden plazmit DNA'nın elektroporasyona dayalı dağıtımını kullanarak beyin tümörü fare modelleri oluşturmak için bir yöntemi açıklar, böylece doğru, tekrarlanabilir ve tutarlı bir fare modeli sağlar.
Abstract
Tümör modelleri, yeni ve daha etkili tedavilerin araştırılması açısından beyin tümörlerinin klinik öncesi testleri için kritik öneme sahiptir. İmmünoterapiye büyük ilgi duyulduğundan, beyindeki tümör ve bağışıklık hücresi popülasyonlarını ve tedaviye yanıtlarını incelemek için tutarlı, klinik olarak uygun, immün yetmezliği olan bir fare modeline sahip olmak daha da kritiktir. Klinik öncesi modellerin çoğu, yerleşik tümör hücre hatlarının ortotopik transplantasyonunu kullanırken, burada sunulan modelleme sistemi, bölünen nöral öncü hücrelere (NPC'ler ) eklenen DNA yapılarından kademeli ancak etkili bir gelişimde hastaya özgü tümör mutasyonlarının "kişiselleştirilmiş" bir temsiline izin verir. DNA yapıları, sürücü mutasyonlarının tek kopyalı, somatik mutajenezine izin veren çift rekombinaz aracılı kaset değişimi (MADR) yöntemiyle mozaik analizine sahiptir. Doğum ile 3 günlük arasındaki yeni doğan fare yavruları kullanılarak, NPC'ler lateral ventrikülleri kaplayan bu bölünen hücrelerden yararlanılarak hedeflenir. DNA plazmitlerinin (örneğin, MADR türevi, transpozonlar, CRISPR'ye yönelik sgRNA) ventriküllere mikroenjeksiyonunu, başın rostral bölgesini çevreleyen kürekler kullanılarak elektroporasyon takip eder. Elektriksel stimülasyon üzerine DNA, genoma entegre olma potansiyeli ile bölünen hücrelere alınır. Bu yöntemin kullanımı, en yaygın malign beyin tümörü olan glioblastoma dahil olmak üzere hem pediatrik hem de yetişkin beyin tümörlerinin geliştirilmesinde başarıyla gösterilmiştir. Bu makale, genç fare yavrularının uyuşturulması, plazmit karışımının mikroenjeksiyonu ve ardından elektroporasyon dahil olmak üzere bu tekniği kullanarak bir beyin tümörü modeli geliştirmenin farklı adımlarını tartışmakta ve göstermektedir. Bu otokton, bağışıklığı yeterli fare modeli ile araştırmacılar, etkili kanser tedavisini iyileştirme ve inceleme çabalarında klinik öncesi modelleme yaklaşımlarını genişletme yeteneğine sahip olacaklar.
Introduction
Murin beyin tümörü modelleri, beyin tümörü oluşum ve tedavi mekanizmalarını anlamak için çok önemlidir. Mevcut modeller tipik olarak, uygun immünoterapi çalışmalarını engelleyen immün yetmezliği olan fareler kullanılarak, sınırlı sayıda sürücü mutasyonuna veya hastadan türetilen ksenogreft modellerine dayalı olarak, yaygın olarak kullanılan tümör hücre hatlarının hızla üretilen deri altı veya ortotopik transplantasyonlarını içerir 1,2,3,4. Ek olarak, bu klinik öncesi sonuçlar yanlış pozitiflere yol açabilir, çünkü bu tür modeller tedaviye yanıt olarak dramatik, çoğu zaman iyileştirici etkiler gösterebilir, ancak bu klinik 2,5,6,7'ye dönüşmez. Hasta mutasyon imzalarını daha fazla yansıtan, genetiği değiştirilmiş klinik öncesi fare modellerini hızlı bir şekilde üretme yeteneğine sahip olmak, klinik öncesi sonuçların geçerliliğini artırmak için zorunludur.
Hem fonksiyon kaybı (LOF) hem de fonksiyon kazancı (GOF) mutasyonlarını indüklemek için DNA plazmitlerinin elektroporasyon (EP) tabanlı iletimi, bu tür modellerin üretilmesine izin verir. Çift rekombinaz aracılı kaset değişimi veya MADR8 ile mozaik analizi adı verilen GOF sürücü mutasyonlarının daha kesin bir temsili için bir yöntem geliştirdik. Bu yöntem, ilgilenilen bir genin (veya genlerin) somatik hücrelerde kontrollü, lokusa özgü bir şekilde ekspresyonuna izin verir8. Kümelenmiş düzenli aralıklı kısa palindromik tekrarlar (CRISPR) gibi diğer moleküler araçlarla kombinasyon halinde, fare beyin tümörü modelleri geliştirmek için farklı hasta mutasyonları birleştirilebilir. Bu yöntem, gliomlar ve ependimomlar8 dahil olmak üzere farklı pediatrik beyin tümörlerinin yanı sıra glioblastoma (GBM) gibi yetişkin beyin tümörü modelleri için kullanılmıştır.
EP tümör modelleme yöntemi bir nakil kadar yaygın olmasa da, aşağıdakiler şimdiye kadar bu modelleme sisteminin kolaylığını ve yüksek tekrarlanabilirliğini göstermektedir. mTmG fareleri, MADR-plazmid DNA 8,9'un eklenmesi için kullanılır. Bu sistem, donör DNA plazmidinin (yani, ilgilenilen GOF geni) daha sonra eklenmesi için Rosa26 lokusunda bulunan loxP ve Flp rekombinaz hedef (FRT) bölgelerinin rekombinasyonuna izin verir8,9. Aşağıdaki protokol, gayretli bir uygulamadan sonra bu yöntemin basitliğini ve fare beyin tümörü modellerini otokton, tutarlı bir şekilde geliştirme yeteneğini göstermektedir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Bu protokoldeki tüm prosedürler Cedars Sinai Tıp Merkezi Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi (IACUC) tarafından onaylanmıştır. Homozigot mTmG fareleri, aşağıdaki protokolde kullanılmak üzere karışık cinsiyetli, heterozigot mTmG farelerinin yavrularını elde etmek için C57BL / 6J farelerle yetiştirildi. Hayvanlar ticari bir kaynaktan elde edilmiştir (bkz. Fare yavruları doğum sonrası 0. ve 3. günler arasında elektroporasyona tabi tutuldu (P0-P3).
1. Cerrahi kurulum
- Ameliyat masasına kimyasal dezenfektan (örneğin Vimoba) püskürtün ve silin, ardından %70 etanol ekleyin ve tekrar silin.
- Aşağıdaki aletleri/malzemeleri ameliyat masasına yerleştirin: çekilmiş cam kılcal pipetler (pipetlerin nasıl çekileceği ile ilgili referans10'a bakın), küçük makaslar, küçük biyolojik tehlike kesici alet atık kabı, mikrolitrelik pipetleyici ve pipet uçları, 2x kesilmiş kare parafin film parçaları, elektrot jeli, elektrotlar, mikroenjektör tutucu ve DNA plazmit karışımı (bkz.
- Aşağıdaki ataşmanları, belirtildiğinde ameliyat masasındaki veya zemindeki ekipmanın üzerine yerleştirin: mikroenjektör kontrol paneli, makineye takılı tutucu ve fiş, mikroenjektör tutucuyu yana tutmak için stand (lehimleme yardımcısı), mikroenjektör ayak pedalı (yerde), makineye bağlı elektrotlar ve elektrot ayak pedalı (zeminde) (bkz.
NOT: Elektrot ayak pedalı, kullanım sırasını hatırlatmak için mikroenjektör ayak pedalının sağına yerleştirilmiştir. - Mikroenjektör ve elektrot kontrol panellerini açın.
- Mikroenjektör üzerindeki ayarların deney için doğru olup olmadığını kontrol edin: plazmit karışımının nasıl alındığına bağlı olarak basınç 220-450 hPa arasında olmalıdır.
- Elektrot panelindeki ayarların deney için doğru olup olmadığını kontrol edin.
NOT: Mevcut deney (ve beyin tümörü modellerimizin çoğu) için, 120 V'luk (50 ms; 950 ms ile ayrılmış) beş darbe kullanılmıştır.
2. Ameliyat öncesi hazırlık
- Plazmid karışımını mikroenjektörde hazırlayın.
- Çekilmiş bir cam kılcal pipeti alın ve mikroenjektör tutucusuna yerleştirin. Yerinde tutmak için ucun vidalandığından emin olun.
- Mikroenjektör tutucuyu bir elinizle, küçük makası diğer elinizle tutun; Pipetin ucunu küçük bir keskin biyolojik tehlike kabının üzerine koyun. Makas kapalıyken, uzatılmış cam kılcal pipete hafifçe bastırın. Bükümün görüldüğü yerde, açıklıktan yaklaşık 2 mm uzakta kesin. Kesim başarılı görünüyorsa, dikkatlice yana yerleştirin.
- Piyasada bulunan plazmid karışım tüpünü ameliyat masasına düz bir şekilde yerleştirin ve açın. Plazmid karışımını hazırlarken sabit tutmak için pipet ucu kutusunu veya başka bir öğeyi tüpün tabanının arkasına yerleştirin. Mikroenjektör hattına bağlı cam pipeti masanın üzerine düz bir şekilde yerleştirin ve ucun tüpün dibine yakın karışımda iyice olduğundan emin olarak plazmit karışımının tüpüne yavaşça yerleştirin.
NOT: Doğal yerçekimi emişi nedeniyle, plazmit karışımı emişi, aktif olarak çekilmeden önce cam pipette başlayacaktır. - Plazmit karışımındaki cam pipetin ucuyla, çekilen miktarı artırmak için mikroenjektör panelini kullanın. 0'dan başlayarak, sağ düğmeyi çevirin ve -60'a doğru negatif yönde çevirin - bu, plazmit karışımını cam pipete getirecektir. Sadece ~ 1 inç plazmit karışımı getirin. Düğmeyi tekrar 0'a çevirin ve ardından pipet ucunu karışımdan çıkarın.
NOT: Negatif yöndeyken pipet ucunu karışımdan çıkarmayın, çünkü bu, karışımı mikro enjektöre ve muhtemelen boruya fırlatacaktır. - Karışımı bir parafin film şeridine enjekte ederek bir enjeksiyondaki karışım miktarını test edin. Karışımı parafin filmine enjekte etmek için ayak pedalını kullanın ve bir kez basın. Tam olarak 1 μL olup olmadığını görmek için karışımı parafin filmine almak için 1 μL'ye ayarlanmış pipetleyiciyi kullanın.
NOT: 1 μL'den biraz daha azsa, mikroenjektörün basıncı artırılabilir. Basınç 450 hPa'ya yaklaşıyorsa ve hala 1 μL'den azsa, cam pipet açıklığı çok küçüktür ve daha fazla kesilmesi gerekecektir. Kırpmadan önce plazmit karışımının tekrar tüpe yerleştirilmesi önerilir. Buna rağmen, makas üzerinde hala bir kalıntı karışım olacaktır, bu nedenle kalan karışımı çıkarmak için makası daha sonra DNase ile iyice temizlemek zorunludur. Enjeksiyon 1 μL'den fazlaysa, yeni bir çekilmiş cam pipetin kullanılması ve kesilmesi gerekecektir. Test miktarı tam olarak 1 μL olduğunda, cam pipet ucu doğru boyuttadır. - Prosedür için ek plazmit karışımı veya çekilen cam pipete yaklaşık 2-3 inç çekmek için 2.1.4 adımını tekrarlayın. Karışımın, ucunun görülemeyeceği, mikroenjektörün içine çok fazla girmediğinden emin olun.
NOT: Plazmid karışımını çizerken hava kabarcıklarından kaçınmak çok önemlidir. Kabarcıklar varsa, plazmit karışımını çekilen cam pipetten çıkararak ve yeniden başlayarak bu adımı yeniden yapmak gerekir. Mevcut hava kabarcıkları, yavrunun ventrikülüne enjekte edilirken aşağıdaki adımlara zarar verecektir. - Plazmid karışımı çekilmiş cam pipette hazırken, hazırlanan pipeti yanlışlıkla dokunmamak/çarpmamak için lehimleme yardımı standının yan tarafına ve yoldan uzağa yerleştirin.
- Hayvanları deney için hazırlayın.
- Anestezi uygulayan yavrular için bir buz kovası hazırlayın. Eritmek için buz kovasına su ekleyin ve anestezi tutucuyu (örn. pipet kutusu üstü) soğutmaya yardımcı olun.
- Soğuması için kutunun üstünü erimiş buzun üzerine yerleştirin.
- Yavruları kafesten dikkatlice çıkarın ve buzun üzerinde kalan soğutulmuş kutunun üstüne yerleştirin. Soğutma işlemine yardımcı olmak için alt kısma gevşek bir şekilde başka bir üst kısım yerleştirin.
- 2-3 dakika sonra yavruları kontrol edin. Yüzüstü pozisyonda kalarak yavruları birbirinden ayırın.
NOT: Yavrular kıvranacak, ancak soğuk anestezi devreye girdiğinde bu yavaşlayacaktır. Yavruların kolay görüntülenmesi için kutunun üst kısmı kapalı bırakılabilir. - Uygun anestezi olup olmadığını kontrol etmek için yavrunun kuyruğunu sıkıştırın ve bir reaksiyon arayın. Bir reaksiyon varsa, 2.2.4 adımını tekrarlayın. Gıcırtı yoksa veya çok az hareket yapılırsa, yavru prosedür için hazırdır.
NOT: Fareler, işlemden sonra iyileşme yeteneklerini etkileyeceğinden uzun süre buz üzerinde tutulmamalıdır. Bir seferde sadece anestezi altındayken hem enjekte edilebilen hem de elektropore edilebilen yavru sayısı buza konulmalıdır; Tecrübe ile daha büyük sayılar yapılabilir.
3. DNA plazmit karışımının beyin ventrikülüne mikroenjeksiyonu
- Ventral pozisyonda masanın üzerine bir yavru yerleştirin.
- Kafatası dikişlerini deriden görselleştirmek için başın arkasını hafifçe geriye doğru çekin. Kafatasında lambda bulun. Ventrikül/enjeksiyon bölgesi lambda ve gözün ortasında olacaktır.
NOT: Lambda, sagital ve lambdoid sütürlerin kesiştiği yerdir. Fare kafatasındaki lambdanın tanımlanması için referans11'e bakın. - Cam pipet ucuyla cildi dik bir açıyla delin (pipet tavana doğru dümdüzdür). Kafatasına bastırırken hafif bir içbükey girinti ve ilk direnç gözlemleyin. Delindikten ve cam pipet ucu içbükey girintiden geçtikten sonra uygun enjeksiyon seviyesine ulaşılır.
- Cam pipet ucunu yerinde tutun ve 1 μL plazmit karışımı enjekte etmek için mikroenjektör ayak pedalına bir kez basın.
NOT: Enjeksiyonun başarılı olduğunu net bir şekilde görmenin iki yolu vardır. İlk olarak, başka bir laboratuvar üyesinin plazmit karışımının enjekte edilirken cam pipete inmesini izlemesini sağlayın. Ayrıca, plazmit karışımında hızlı yeşil veya başka bir boya kullanılıyorsa, boya enjekte edildikten sonra derinin altındaki ventrikülde gözle görülür şekilde yayılır ve bir cerrahi lambaya tutulduğunda kolayca görülebilir.
4. Elektroporasyon
- Masanın üzerine bir parça parafin filmi (bir kare) yerleştirin ve filmin üstündeki elektrot jelini sıkın. Her bir kürek üzerine bol miktarda fırçalayarak elektrot kanatçıklarını elektrot jeli ile kaplayın. Damlayan fazla jel bir kağıt havlu üzerinde kaydırılabilir.
NOT: İlk EP'den sonra, her bir kürekten gelen jelin diğer tarafa temas etmesine izin vermeyin. Bu, yükü aktarır ve yavrunun kafasına uygulanırken cızırtılı bir ses duyulabilir. Bu, bir elektrottan yavrunun kafasındaki jel, diğerinden gelen jel ile temas ederse de olur.
DİKKAT: Elektroporasyon sırasında parmakları küreklerden uzak tutmaya özen gösterilmelidir. - Yavrunun vücudunu bir elinizle (tipik olarak baskın olmayan el) tutun ve parmakları başın arkasında tutun.
NOT: Sağ elini kullanıyorsa, yavruyu sol elinizle, elektrotları sağ elinizle tutmak en kolay yoldur. Solaksanız, tam tersini yapın. - Pozitif elektrot başın dışında ventrikülün hedeflendiği yerde olacak şekilde uygun pozisyonda olduklarından emin olmak için elektrotları yavrunun kafasına yaklaştırın (örneğin, sol ventrikülü hedefliyorsanız, pozitifi yavrunun sol tarafına ve negatifi yavrunun sağ tarafına yerleştirin). Elektrotları yerleştirirken, başın yerine kaldırılmasına yardımcı olmak için bir parmağınızı (tipik olarak başparmağınızı) vücudun dorsal tarafında/boynun arkasında, başın arkasına hafifçe kaydırın.
- Kuyruğu sıkıştırarak anestezi derinliğini kontrol edin ve sadece yavru uygun anestezi düzlemindeyse elektroporasyona devam edin. Elektrot küreklerini fare kafasının rostral kısmındaki hafifçe sıkın ve gözlerin üzerine yerleştirin. Elektroporasyonu başlatmak için elektrot ayak pedalına bir kez basın. Bu protokol, 120 V'luk beş darbe kullanır (50 ms, 950 ms ile ayrılmış); Her nabız duyulabilir.
- Her darbede, elektrot kanatlarını saat yönünün tersine hafifçe döndürün, böylece pozitif kanat başın tepesine doğru hareket eder.
NOT: Uygun elektroporasyon ile, her nabızda fare yavrusunun vücudunun seğirdiğini hissedecek/görecektir.
- Her darbede, elektrot kanatlarını saat yönünün tersine hafifçe döndürün, böylece pozitif kanat başın tepesine doğru hareket eder.
- Son darbeden sonra kürekleri çıkarın ve yana yerleştirin. Yavruyu temiz bir kağıt havluya taşıyın ve başka bir laboratuvar üyesinin jeli yavrunun kafasından temizlemesini ve bir kağıt havlu "teknesi" üzerindeki bir ısı lambasının altına yerleştirmesini sağlayın.
NOT: Isı lambasının yavrulara çok yakın olmadığından emin olun. Bu adımda başka bir laboratuvar üyesinin yardım ettiğinden emin olun ve yavrulara sürekli göz kulak olun. Yavruların ısısını artırmak için genellikle yavruları ısı lambasının altında elinde tutmaya yardımcı olur. Yavrunun karnına hafifçe masaj yapmak da iyileşmeye yardımcı olabilir. - Vücutları sağlıklı pembemsi bir renge sahip olduğunda ve hafif bir kuyruk tutamına gıcırtılı bir tepki verdikten sonra yavruları ev kafesine geri koyun.
NOT: Onları kafese geri koymadan önce, az miktarda ev kafesi yatak malzemesi alın ve kafes kokusu için yavruları hafifçe fırçalayın. Yavruları yatak malzemesinin altındaki kafese geri koyun ve bekleme odasına geri dönün.
5. Ameliyat sonrası adımlar
- Kullanılmayan plazmid karışımını mikroenjektör cam pipetinden tüpe geri koyun. Yeterli karışım kaldıysa, bu gelecekteki prosedürlerde kullanılabilir. -20 °C'de saklayın.
- Elektrot küreklerindeki jeli kağıt havluyla silin.
- Tüm ekipman parçalarını orijinal yerlerine geri koyun.
NOT: Plazmit karışımı alındıktan sonra cam pipet ucunu kesmek için makas kullanılmışsa, DNase çözeltisi ile iyice temizlemek için makası dışarıda bırakın. - Masaya kimyasal bir dezenfektan püskürtün, ardından silin, ardından %70 etanol püskürtün, ardından tekrar silin.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Yukarıda açıklanan protokol, hem pediatrik hem de yetişkin beyin tümörü fare modellerini başarılı bir şekilde geliştirmek için kullanılmıştır ve ilki Kim ve ark.8'de ayrıntılı olarak yayınlanmıştır. Uygun teknik ve plazmit tasarımının dikkatli bir şekilde planlanması ile tümörlerin EP gelişimindeki başarı tipik olarak %100'dür. Histoloji, bir raportör protein kullanıldığında başarılı DNA plazmit eklemesini kontrol etmenin en hızlı ve en kolay yoludur. Bu protokol, histolojik analizle onaylandığı gibi, %100 penetranslı bir GBM beyin tümörü modelinin nasıl geliştirileceğine ilişkin adımları içerir. Bir MADR donör plazmidi hem bir raportör proteini (smTagBFP2-V5) hem de SpCas9'u (Ek Dosya 1) eksprese etti. Nf1 ve Trp53'e yönelik iki güçlü sürücü LOF tümör baskılayıcı gen tek kılavuzlu RNA'lar (sgRNA'lar) da dahil edildi (sgRNA klonlama stratejisi için referans12'ye bakın; bu protokolde kullanılan oligonükleotid dizileri için Ek Dosya 1'e bakın). Son olarak, Cre ve Flp rekombinaz plazmitleri, Rosa26 lokusunda rekombinasyon için plazmit karışımına eklendi (Şekil 1A; bkz. Ek Dosya 1). Fareler, EP'den 5 ay sonra can çekişiyordu ve raportör protein ve histolojik analiz yoluyla tam tümör büyümesi tespit edildi (Şekil 1B).
Şekil 1: EP'den 5 ay sonra başarılı tümör büyümesinin immünofloresan boyanması . (A) spCas9 ve raportör protein TagBFP2-V5 için MADR donör plazmidi. Plazmid karışımına ayrıca Nf1 ve Trp53'e yönelik sgRNA'lar ile birlikte bir Cre-Flp rekombinaz plazmidi de dahil edildi. (B) Nf1 ve Trp53 LOF tarafından yönlendirilen bir GBM tümörünün EP'sinden 5 ay sonra alınan bir koronal bölüm. Tümör hücreleri, spCas9'a (B3) bağlı TagBFP-V5 raportör proteini ile etiketlenir. Seyrek EGFP etiketlemesi de tespit edilir (B2) tdTomato (B1) ile etiketlenmiş plazmitleri eksprese etmeyen tüm hücrelerle birlikte. Ölçek çubuğu = 1.000 μm. Kısaltmalar: Ctx = korteks; CC = korpus kallozum; LV = lateral ventrikül; Str = striatum. Bu rakamın daha büyük bir sürümünü görüntülemek için lütfen buraya tıklayın.
Ek Dosya 1: Plazmid dizileri. pDonor-SM-TagBFP2-V5-P2A-spCas9-WPRE, pCag-FlpO-2A-Cre ve Trp53 ve Nf1'i hedefleyen sgRNA için oligonükleotidler dahil olmak üzere bu protokolde kullanılan tüm plazmitlerin ve oligonükleotidlerin tam dizileri. Bu dosyayı indirmek için lütfen buraya tıklayın.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Plazmid DNA'nın elektroporasyona dayalı iletimi, genetiği değiştirilmiş fare modellerinde kullanılana benzer, ancak viral transdüksiyonun hızı, lokalizasyonu ve verimliliği ile moleküler biyolojinin in vivo kullanımına izin verir 8,13,14. Bununla birlikte, ikincisi ile birlikte, güvenlik endişeleri ve bağışıklık tepkileri gelir. Plazmid DNA'nın EP iletimini kullanan modelleme sistemimizde, cam kılcal pipetin beyin ventrikülüne ilk yerleştirilmesi nedeniyle minimal bağışıklık tepkisinin meydana geldiğinigösterdik 8. Bu nedenle, immünoterapi için mevcut tümör modelleme sistemlerini geliştirmek için, yukarıda sunulan protokol, beyin tümörleri için daha uygun ve sağlam bir klinik öncesi modelleme sistemine izin verir.
Bu yöntemi kullanarak başarılı beyin tümörü modellemesi için ilk önemli adım plazmit tasarımıdır. Bu protokolde açıklanmamış olsa da, pediatrik beyin tümörü modelleri için Kim ve ark.8 ve Rincon Fernandez Pacheco ve ark.10'da ve ayrıca ek kullanımlar için diğer kaynaklarda kapsamlı bir şekilde tartışılmıştır15,16. Laboratuvarımız altı adede kadar plazmide başarılı bir şekilde elektroporasyon yapmış olsa da, ne kadar DNA verilebileceğinin bir üst sınırı olacaktır. Bu üst sınır, plazmit DNA konsantrasyonu, plazmit boyutları, voltaj ve elektroporasyon çağında beyin ventrikülünün boyutu ile sınırlı olan DNA hacmi ile sınırlıdır. Ek olarak, karışımda birden fazla DNA plazmidi varken, enjeksiyondan önce iyi süspanse edilmiş bir plazmit karışımına sahip olmak zorunludur. Karışım iyi bir şekilde yeniden süspanse edilmezse, dar cam kılcal pipette alınması zor olacaktır. Ayrıca, uygun plazmit karışımı ile hızlı yeşil boya (%10 v/v) ilavesi, uygulama sırasında beyin ventrikülünde alınan plazmit karışımının net bir şekilde görüntülenmesini sağlar (adım 3.4). Bununla birlikte, bunun için önemli bir uyarı, boyanın EP8'den sonraki birkaç hafta içinde işlenen dokunun uzak kırmızı dalga boylarında (örneğin, Cy5) antikor boyamasına müdahale edebilmesidir. Hızlı yeşil boya, EP'yi ilk öğrenirken çok yardımcı olsa da, yanlış pozitif lekelenmeyi önlemek için ortadan kaldırılabilir. Adım 3.4 için, ventriküldeki plazmit karışımının verilmesinin görünmeyeceğini, bu nedenle enjekte edilirken hacmin azalması için cam pipeti izlemenin çok önemli olacağını akılda tutmakta fayda var.
Enjeksiyonların tutarlılığı ve uygun şekilde kullanılması için akılda tutulması gereken birkaç faktör vardır: 1) enjeksiyon hacmi. Cam kılcal pipeti doğru bir şekilde kesmek için birkaç deneme gerekebilir (adım 2.1.2), her hayvan için sadece 1 μL plazmit karışımının enjekte edilmesi çok önemlidir. Hayvanlar arasındaki hacimdeki artışlar veya azalmalar, tümör oluşumunun gecikmesini kesinlikle etkileyecektir. 2) Enjeksiyon hacmi ayarlandıktan sonra, hacmi etkileyeceğinden mikroenjektörün parametreleri değiştirilmemelidir. 3) Plazmid karışımı cam kılcal pipete getirildikten sonra, yanlışlıkla kendini veya başkalarını dürtmemek için pipet yoldan uzak tutulmalıdır. Mikroenjektör tutucusuna takılan bir mikropipet standı (lehimleme yardımcısı; Malzeme Tablosuna bakın) kullanmak bunun için yararlıdır. Bununla birlikte, plazmit karışımı kısa bir süre sonra enjekte edilmezse, muhtemelen ucu tıkayacaktır. Bu nedenle, deliği tıkayan tıkanıklık olmadığından emin olmak için beyin ventrikülüne enjekte etmeden hemen önce bir parça parafilm üzerinde bir test mikroenjeksiyonu yapmak önemlidir. Son olarak, diğer tüm cerrahi tekniklerde olduğu gibi, protokolün uygulanması her birey için farklıdır. Bu nedenle, bir deneyde tüm fare grupları için mikroenjeksiyon ve / veya EP yapan aynı teknisyene sahip olmak zorunludur.
Laboratuvarımızda geliştirilen beyin tümörü modelleri gliomlara odaklanmıştır. Nörobiyolojik açıdan bakıldığında, bu yöntemin doğum sonrası 0-3. günler arasında uygulanması, gliogenez dönemini ve embriyonik nörojenez sonrası dönemi hedefler. Alternatif beyin tümörlerine olan ilgi, elektrotların zaman noktasında ve / veya konumunda ayarlama gerektirebilir. Nöral bazlı tümörler için uygun olan in utero EP için çeşitli protokoller mevcuttur15,17,18.
Bu yöntemin birkaç sınırlaması vardır. CRISPR, transpozonlar ve daha yakın zamanda MADR sistemi kullanarak hem LOF hem de GOF DNA plazmitlerini klonlama ve karıştırma ve eşleştirme yeteneği, hasta mutasyonlarının sonsuz kombinasyonlarının modellenmesine izin verir. Mikroenjeksiyon ve EP teknikleri nispeten basittir, ancak geliştirmek ve tutarlı hale getirmek için birkaç uygulama denemesi gerekir. Sunulan modelin bir sınırlaması, GBM tümörünün tam olarak gelişmesi için geçen sürenin uzunluğudur (5 ay). Buna rağmen, şu anda 2 aydan daha kısa süren agresif tümör büyümesine yol açan yaygın hasta tümör mutasyonlarını kullanan ek modeller üzerinde çalışıyoruz. Sınırlamalara ek olarak, ekipmanın kendisi önemli bir başlangıç yatırımıdır (yaklaşık 20.000-30.000 $); Bununla birlikte, bir oturuşta yüzlerce olmasa da onlarca fareyi elektropolasyon yeteneği, klinik öncesi bir deney için inanılmaz bir güç sağlar. Bununla birlikte, fare yetiştiriciliği ile ilgili sorunlar varsa, sağlıklı yetiştiricilere ve sağlıklı yavrulara sahip olmak zorunlu olduğundan, bu en büyük sınırlama haline gelebilir.
Beyin tümörü tedavilerindeki ilerlemelerin meydana gelmesinden bu yana birkaç on yıl geçti ve kemoterapötik Temozolomid'in son en büyük iyileşmesi hayatta kalma süresini sadece birkaç ay uzattı19. İmmünoterapi birçok farklı kanserde devrim yaratmıştır, ancak henüz nöro-onkolojide bakım standardı üzerinde önemli bir etki yaratmamıştır. İlginç bir şekilde, şu anda kullanılan fare beyin tümörü modelleri immünoterapi ile büyük başarı göstermiştir, ancak sürekli olarak kliniğe dönüşmekte ve hastalarda başarı göstermekte başarısız olmaktadır. Bu nedenle, bir adım geri atmak ve kullanılan fare tümörü modellerini yeniden değerlendirmek zorunludur. Mevcut modeller, beyne binlerce hücre enjekte edilirken hastalarda yaygın olarak bulunmayan sınırlı mutasyonlara sahip eski hücre hatlarının kullanılmasına dayanmaktadır. Bu protokolde tartışılan teknikle, bir fare modelindeki farklı hasta tümör mutasyon profilleri özetlenir ve immünokompetan farelerde klinik öncesi testlere izin verecek bir zaman dilimi içinde tümörlerin otokton, kademeli gelişimine izin verilir.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Yazarların açıklayacak hiçbir şeyi yok.
Acknowledgments
İmmünofloresan boyama ve görüntüler için Gi Bum Kim'e teşekkür ederiz. Ayrıca protokolle ilgili yararlı tavsiyeleri için Emily Hatanaka, Naomi Kobritz ve Paul Linesch'e teşekkür ederiz.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0.1-2.5 µL 1-channel pipette | Eppendorf | 3123000012 | |
| 2 µL pipette tips | Fisher Scientific | 02-707-442 | |
| 20 µL pipette tips | Fisher Scientific | 02-707-432 | |
| 2-20 µL 1-channel pipette | Eppendorf | 3123000098 | |
| DNAZap PCR DNA Degradation Solutions | Fisher Scientific | AM9890 | |
| ECM 830 Square Porator Electroporator | BTX | 45-0662 | |
| Electrode Gel | Parker Labs | PLI152CSZ | |
| Fast Green Dye | Sigma-Aldrich | F7258-25G | |
| Helping Hands Soldering Aid | Pro'sKit | 900-015 | |
| Micro Dissecting Scissors, 4.5" Straight Sharp | Roboz | RS-5916 | |
| Mouse Strain: C57BL/6J | The Jackson Laboratory | JAX: 000664 | |
| Mouse Strain: Gt(ROSA)26Sortm4(ACTB-tdTomato,-EGFP)Luo/J | The Jackson Laboratory | JAX: 007676 | |
| Parafilm | Grainger | 16Y894 | |
| Plasmid: pCag-FlpO-2A-Cre EV | Addgene | 129419 | |
| Platinum Tweezertrode, 7 mm Diameter | BTX | 45-0488 | |
| Sharps container, 1-quart | Uline | S-15307 | |
| Standard Glass Capillaries, 4 in, 1 mm OD, 0.58 mm ID | World Precision Instruments | 1B100F-4 | Capillary pipettes need to be pulled - see reference 10 for details. |
| Vertical Micropipette Puller | Sutter Instruments | P-30 | Heat settings: Heat #1 at 880, Heat #2 at 680; pull at 800. See reference 10 for more details on pulling. |
| Vimoba Tablet Solution | Quip Laboratories | VIMTAB | |
| XenoWorks Digital Microinjector | Sutter Instruments | BRE | |
| XenoWorks Micropipette Holder | Sutter Instruments | BR-MH |
References
- Brabetz, S., et al. A biobank of patient-derived pediatric brain tumor models. Nature Medicine. 24 (11), 1752-1761 (2018).
- Hadad, A. F., et al. Mouse models of glioblastoma for the evaluation of novel therapeutic strategies. Neuro-Oncology Advances. 3 (1), (2021).
- He, C., et al. Patient-derived models recapitulate heterogeneity of molecular signatures and drug response in pediatric high-grade glioma. Nature Communications. 12 (1), 4089 (2021).
- Szatmári, T., et al. Detailed characterization of the mouse glioma 261 tumor model for experimental glioblastoma therapy. Cancer Science. 97 (6), 546-553 (2006).
- Genoud, V., et al. Responsiveness to anti-PD-1 and anti-CTLA-4 immune checkpoint blockade in SB28 and GL261 mouse glioma models. Oncoimmunology. 7 (12), 1501137 (2018).
- Reardon, D. A., et al. Effect of Nivolumab vs Bevacizumab in patients with recurrent glioblastoma: the CheckMate 143 phase 3 randomized clinical trial. JAMA Oncology. 6 (7), 1003-1010 (2020).
- Wainwright, D. A., et al. Durable therapeutic efficacy utilizing combinatorial blockade against IDO, CTLA-4, and PD-L1 in mice with brain tumors. Clinical Cancer Research. 20 (20), 5290-5301 (2014).
- Kim, G. B., et al. Rapid generation of somatic mouse mosaics with locus-specific, stably integrated transgenic elements. Cell. 179 (1), 251-267 (2019).
- Muzumdar, M. D., Tasic, B., Miyamichi, K., Li, L., Luo, L. A global double-fluorescent Cre reporter mouse. Genesis. 45 (9), 593-605 (2007).
- Rincon Fernandez Pacheco, D., Sabet, S., Breunig, J. J. Preparation, assembly, and transduction of transgenic elements using mosaic analysis with dual recombinase (MADR). STAR protocols. 1 (3), 100199 (2020).
- White, H. E., Goswami, A., Tucker, A. S. The intertwined evolution and development of sutures and cranial morphology. Frontiers in Cell and Developmental Biology. 9, 653579 (2021).
- Ran, F. A., et al. Genome engineering using the CRISPR-Cas9 system. Nature Protocols. 8 (11), 2281-2308 (2013).
- Breunig, J. J., et al. Ets factors regulate neural stem cell depletion and gliogenesis in Ras pathway glioma. Cell Reports. 12 (2), 258-271 (2015).
- Hambardzumyan, D., Parada, L. F., Holland, E. C., Charest, A. Genetic modeling of gliomas in mice: new tools to tackle old problems. Glia. 59 (8), 1155-1168 (2011).
- Feng, W., et al. CRISPR-mediated loss of function analysis in cerebellar granule cells using in utero electroporation-based gene transfer. Journal of Visualized Experiments. (136), e57311 (2018).
- Zhang, L., et al. Gene knock-in by CRISPR/Cas9 and cell sorting in macrophage and T cell lines. Journal of Visualized Experiments. (177), e62328 (2021).
- Artegiani, B., Lange, C., Calegari, F. Expansion of embryonic and adult neural stem cells in utero electroporation or viral stereotaxic injection. Journal of Visualized Experiments. (68), e4093 (2012).
- Rice, H., Suth, S., Cavanaugh, W., Bai, J., Young-Pearse, T. L. In utero electroporation followed by primary neuronal culture for studying gene function in subset of cortical neurons. Journal of Visualized Experiments. (44), e2103 (2010).
- Zanders, E. D., Svensson, F., Bailey, D. S. Therapy for glioblastoma: is it working. Drug Discovery Today. 24 (5), 1193-1201 (2019).
