Summary
Vi presenterar en metod för att studera tumörcellers respridning från lungmetastaser som involverar ett kirurgiskt protokoll för selektiv fotokonvertering av lungmetastaser, följt av identifiering av återspridda tumörceller i tertiära organ.
Abstract
Metastaser - den systemiska spridningen av cancer - är den främsta orsaken till cancerrelaterade dödsfall. Även om metastaser vanligtvis betraktas som en enkelriktad process där celler från den primära tumören sprider sig och frö till metastaser, kan tumörceller i befintliga metastaser också spridasig och ge upphov till nya lesioner på tertiära platser i en process som kallas "metastas-från-metastaser" eller "metastas-till-metastassådd". Sådd från metastasering till metastaser kan öka den metastaserande bördan och minska patientens livskvalitet och överlevnad. Att förstå processerna bakom detta fenomen är därför avgörande för att förfina behandlingsstrategier för patienter med metastaserande cancer.
Lite är känt om metastas-till-metastas-sådd, delvis på grund av logistiska och tekniska begränsningar. Studier av sådd från metastaser till metastaser förlitar sig främst på sekvenseringsmetoder, vilket kanske inte är praktiskt för forskare som studerar den exakta tidpunkten för sådd från metastaser till metastaser eller vad som främjar eller förhindrar dem. Detta belyser bristen på metoder som underlättar studiet av metastas-till-metastas-sådd. För att ta itu med detta har vi utvecklat - och beskriver här - ett murint kirurgiskt protokoll för selektiv fotokonvertering av lungmetastaser, vilket möjliggör specifik märkning och spårning av tumörceller som återsprids från lungan till tertiära platser. Såvitt vi vet är detta den enda metoden för att studera tumörcellers respridning och metastas-till-metastas-sådd från lungorna som inte kräver genomisk analys.
Introduction
Metastaser är den främsta orsaken till cancerrelaterade dödsfall1. Metastaserande cancer uppstår när celler från primärtumören sprids i hela kroppen och förökar sig till kliniskt detekterbara tumörer i avlägsna organ 2,3.
Även om metastasering vanligtvis betraktas som en enkelriktad process där tumörceller sprider sig från den primära tumören och koloniserar avlägsna organ4, tyder ökande kliniska och experimentella bevis på att en mer komplex, flerriktad process är i spel. Det har visats att cirkulerande tumörceller kan återplantera den primära tumören (om den fortfarande är på plats)5,6,7,8,9, och tumörceller från befintliga metastaserande härdar kan färdas till tertiära platser och ge upphov till nya lesioner 10,11,12,13. Faktum är att bevis från nyligen genomiska analyser tyder på att vissa metastaserande lesioner inte härrör från den primära tumören, utan från andra metastaser – ett fenomen som kallas "metastasering från metastaser" eller "metastasering till metastassådd"14,15,16. Sådd från metastasering till metastaser kan vidmakthålla sjukdomsprocessen även efter avlägsnande av den primära tumören, vilket ökar den metastaserande bördan och minskar patientens livskvalitet och överlevnad. Därför är det viktigt att förstå processerna bakom metastas-till-metastas-sådd för att förfina behandlingsstrategier för patienter med metastaserad sjukdom.
Trots de potentiellt allvarliga kliniska implikationerna är lite känt om metastas-till-metastas-sådd, delvis på grund av logistiska och tekniska begränsningar. Studier på människor begränsas av en brist på kliniska prover. Klinisk resektion och biopsi av metastaserande lesioner är ovanligt, liksom biopsi av till synes friska organ, där enstaka utspridda tumörceller kan lura. Detta innebär att studier på människor vanligtvis endast är möjliga med hjälp av obduktionsprover från individer vars primära tumörer antingen fortfarande finns på plats eller tidigare har avlägsnats men fortfarande är tillgängliga för forskare. När sådana prover finns tillgängliga måste härstamningsanalyser av cancerprogression utföras med hjälp av sekvenseringsmetoder14. Bulksekvensering av matchade primära tumörer och metastaser har dock inte den känslighet som krävs för omfattande härstamningsspårning. Till exempel kan bulksekvensering av en lesion avslöja en subklon som inte kan upptäckas i någon av dess matchade lesioner. I det här fallet skulle man inte kunna fastställa ursprunget till denna subklon. Den kan ha funnits i den primära tumören eller en annan metastas med en frekvens under detektionsgränsen, eller så kan den ha uppstått efter den initiala koloniseringen av den metastaserande lesionen som den hittades i. Encellssekvensering ger ökad känslighet, men den höga kostnaden begränsar den storskaliga tillämpningen av denna teknik. Den retrospektiva karaktären hos dessa studier innebär också att de ger begränsad insikt i övergående metastaserande händelser och sjukdomslandskapet vid olika tidpunkter.
I djurmodeller möjliggör de senaste tekniska framstegen nu prospektiv fylogenetisk kartläggning med hög rumslig och tidsmässig upplösning 17,18,19,20. Dessa tekniker använder CRISPR/Cas9-genomredigering för att konstruera celler med en streckkod under utveckling - ärftliga mutationer som ackumuleras över tid. Vid sekvensering kan härstamningen för varje cell spåras baserat på mutationsprofilen för dess streckkod 17,18,19,20. Faktum är att sådan teknik redan används för att kartlägga metastas-till-metastas-sådd. I en nyligen publicerad artikel visade Zhang et al. att bröst- och prostatacancerceller i skelettmetastaser återsprids från benet för att bilda sekundära metastaser i fleraorgan.
Även om dessa nya metoder har stor potential att generera detaljerade, högupplösta fylogenetiska kartor över cancerprogression, är de mycket opraktiska för dem som studerar den exakta tidpunkten för metastas-till-metastas-såddhändelser och vad som främjar eller förhindrar dem. Att fylla dessa kunskapsluckor är avgörande för att förfina vår förståelse och behandling av metastaserande cancer, men det finns en märkbar brist på teknik för att underlätta sådana studier. För att möta detta behov har vi nyligen utvecklat - och presenterar här - en ny teknik som gör det möjligt för oss att specifikt markera tumörceller via fotokonvertering i en metastaserad plats (lungan) och därefter återidentifiera dem i tertiära organ. Med hjälp av denna teknik har vi nyligen visat att bröstcancerceller redisseminerar från lungmetastaser och frötertiära organ13. Denna teknik kan också användas för att bestämma tidpunkten för respridningshändelser inom ett snävt fönster och kvantifiera återdisseminerade tumörceller, vilket underlättar studier av organotropism hos återdisseminerade celler och vad som främjar/förhindrar återspridning.
Medan fotokonversion och lokalt inducerbara cre/lox-system som permanent ersätter ett fluorescerande protein med ett annat tidigare har använts för att markera och spåra tumörceller 11,22,23, har så vitt vi vet ingen metod för spatiotemporal märkning av tumörceller optimerats för att rikta in sig på lungan - en av de vanligaste platserna för metastaser bland män och kvinnor som diagnostiserats med någon av de 14 vanligaste cancerformerna 24. Alla typer av cancerceller och alla protokoll för generering av lungmetastaser kan användas med vår procedur, vilket gör den allmänt användbar för metastasforskare. Alla cancerceller som används för att bilda lungmetastaser bör uttrycka ett fotokonvertibelt eller fotoomkopplingsbart protein, och forskare kan välja vilket protein som ska användas baserat på deras specifika behov och resurser. I den här studien använde vi 6DT1 bröstcancerceller som stabilt uttryckte det fotokonvertibla grön-till-röda fluorescerande proteinet Dendra2 (6DT1-Dendra2-celler)25 taggade till histonen H2B. Vi injicerade 5,0 × 104 6DT1-Dendra2-celler i den fjärde bröstfettkudden hos honmöss av typen Rag2-/- . Primära tumörer var palperbara mellan 12 och 16 dagar efter injektionen och avlägsnades inte under hela experimentet. Spontana lungmetastaser utvecklades mellan 19 och 26 dagar efter tumörcellsinjektionen. Fotokonverteringsoperationer utfördes mellan 26 och 29 dagar efter tumörcellsinjektionen. Möss avlivades 72 timmar efter operationen på grund av lungmetastaser.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Alla procedurer som beskrivs i detta protokoll har utförts i enlighet med riktlinjer och föreskrifter för användning av ryggradsdjur, inklusive förhandsgodkännande av Albert Einstein College of Medicine Institutional Animal Care and Use Committee.
Före operationen ska lungmetastaser bildas hos möss med hjälp av cancerceller som uttrycker ett fotokonvertibelt/fotoomkopplingsbart protein. Flera protokoll för generering av lungmetastaser har publicerats 26,27,28.
1. Förberedelse för operation
- Förbered distinkta arbetsområden för musförberedelse (hårborttagning och intubation), kirurgi och återhämtning.
- Sterilisera alla kirurgiska instrument i en autoklav.
OBS: Eftersom en teknik med endast tips används för denna operation, kan en sterilisator med varma pärlor användas för att omsterilisera instrument för efterföljande procedurer. - Slå på den uppvärmda operationsplattformen och låt den nå och stabilisera sig vid 37-40 °C.
- Inducera anestesi med 5 % isofluran och sänk sedan isofluran till 3 %. Utför tåklämtester med jämna mellanrum under hela proceduren för att bedöma anestesiens tillräcklighet.
- Placera den sövda musen i ett höger lateralt tryckläge. Ta bort håret på det övre vänstra bröstet/sidan (se figur 1A) genom att applicera hårborttagningskräm på området. Fukta en bit gasbinda eller pappershandduk med vatten och torka bort håret och hårborttagningskrämen. Upprepa vid behov tills allt hår har tagits bort från operationsområdet.
OBS: Lämna inte hårborttagningskräm på musen längre än 20 s, eftersom det kan skada huden. - Knyt en dubbelknut ~3 mm ovanför basen av en 22 G kateter med 2-0 silkessutur. Lämna 2 tum långa svansar.
- Intubera musen med denna kateter enligt tidigare beskrivning 29,30. För att bekräfta lyckad intubation, fäst en uppblåsningslampa i änden av katetern och kläm försiktigt.
OBS: Möss som har intuberats framgångsrikt kommer att uppleva bilateral brösthöjning med bulb squeeze. - Fäst 2-0 silkessuturen ordentligt runt musens nos med en dubbelknut för att hålla intubationskatetern på plats.
2. Kirurgi för att exponera lungan
OBS: Utför alla steg i operationen (Figur 1), inklusive fotokonvertering, i en huva eller skåp med laminärt flöde för att undvika kontaminering av det kirurgiska området.
- Tvätta händerna med antiseptisk tvål och ta på dig nya sterila handskar.
OBS: Eftersom en teknik med endast tips används för denna operation kan icke-sterila handskar också användas. Desinficering av icke-sterila handskar med ett alkoholbaserat desinfektionsmedel rekommenderas. - Bered en dos på 0,1 mg/kg buprenorfin (0,03 mg/ml) och injicera subkutant mot smärtlindring.
OBS: Multimodal smärtlindring, inklusive lokala smärtblockerare och icke-steroida antiinflammatoriska läkemedel, bör användas tillsammans med buprenorfin om de inte förväntas störa biologin av intresse. - Applicera ögonsalva på båda musögonen för att förhindra skador på hornhinnan.
- Placera musen i rätt sidoläge på den uppvärmda kirurgiska plattformen.
- Anslut ventilatorn till intubationskatetern. Var noga med att hålla katetern stadigt, eftersom även små rörelser kan störa kateterns placering och leda till dålig ventilation.
- Observera stabila, ventilatorstyrda, bilaterala brösthöjningar och -fall.
- Fäst lemmarna på operationsplattformen med märktejp. Stabilisera operationsområdet genom att placera ytterligare en bit tejp längs musens rygg och fästa rygghuden och pälsen på operationsplattformen (Figur 1A).
- Öppna de steriliserade kirurgiska instrumenten.
- Applicera klorhexidinlösning på musens hud för att sterilisera operationsområdet.
- Identifiera området ~7 mm till vänster om bröstbenet och ~7 mm ovanför subcostalkanten. Lyft huden över detta område med en pincett och gör ett ~10 mm cirkulärt snitt med en vass mikrodissekerande sax, var noga med att bara klippa huden.
- Ta bort mjukvävnaden över bröstkorgen (Figur 1B). Bränn alla större kärl i båda ändar med en brännpenna.
OBS: Förutom att ta bort all mjukvävnad som ligger under det 10 mm cirkulära snittet i huden, underlättar avlägsnandet av ytterligare icke-muskulös mjukvävnad från omkretsen framtida steg i proceduren. - Använd en pincett med en hand för att höja det 6:e eller 7:e revbenet. Med den andra handen använder du ett enda blad på den trubbiga mikrodissekerande saxen - vinklad parallellt med bröstväggen, rundad kant nedåt - och genomborrar försiktigt den 6:e eller 7:e interkostalmuskeln för att komma in i brösthålan (Figur 1C). Vrid försiktigt saxen efter behov och klipp för att göra ett ~10 mm snitt i det interkostala utrymmet, var noga med att undvika att vidröra lungvävnaden och klippa revbenen.
- Släpp försiktigt ut tryckluft mot det interkostala snittet för att öka utrymmet mellan lungan och bröstväggen. Töm ut luften först vid handleden eller handen för att hitta lämplig flödesstyrka och rensa munstycket från skräp, sedan i korta skurar vid snittet för att förhindra lungskador.
- Använd en pincett med en hand för att höja det 6:e eller 7:e revbenet. Håll upprullningsdonet stängt med den andra handen och för in det i det interkostala snittet. Rikta upprullningsdonets blad så att de är parallella med bröstväggen, var noga med att undvika att vidröra själva lungan (Figur 1D).
- När upprullningsdonet är på plats, släpp långsamt handtaget, så att upprullningsdonet kan öppnas och exponera lungan (Figur 1E). Figur 2A visar representativa bilder av exponerade lungmetastaser före fotokonvertering, inklusive hur de ser ut för blotta ögat, och i FITC (gröna, icke-fotokonverterade) och TRITC (röda, fotokonverterade) fluorescerande kanaler vid användning av vidvinkelbelysning.
3. Fotokonversion av lungmetastaser
OBS: Detaljer och variationer på följande steg finns i diskussionen.
- Applicera försiktigt 2-3 droppar steril PBS uppvärmd till 37 °C på den exponerade lungvävnaden för att förhindra uttorkning.
- Lägg en bit steril aluminiumfolie med en liten utskärning över musen. Placera utskärningen direkt över den exponerade lungvävnaden och dimensionera den så att den endast exponerar den öppna delen av bröstkorgen och några millimeter av omgivande mjukvävnad och hud för att säkerställa fotokonvertering av endast den exponerade lungan.
- Placera en låda med en utskärning över musen och aluminiumfolie. Se till att urtaget är direkt över den exponerade lungan.
- Placera fotokonverteringen lamp direkt över utskärningen på lådan (Figur 1F).
- Slå på fotokonverteringen lamp och tillåt 6 minuters kontinuerlig belysning av exponerad lungvävnad.
OBS: Övervaka musens vitala tecken med hjälp av de fysiologiska övervakningsprogrammen på ventilatorn. - Efter fotokonvertering, stäng av lamp och ta bort lamp, låda och aluminiumfoliemask från musen.
4. Procedur för att stänga bröstväggen
- Upprepa steg 2.13 för att separera lungan från bröstväggen.
- Ta försiktigt tag i upprullningshandtaget och kläm för att stänga knivarna.
- Manövrera den stängda upprullningsdonet ut ur det interkostala utrymmet, var noga med att undvika att vidröra lungvävnaden.
- Använd 5-0 silkessuturen och stäng det interkostala snittet med ett enkelt kontinuerligt suturmönster som innehåller revbenet på båda sidor av snittet (Figur 1G). Dra åt suturen för att säkerställa att sårkanterna är positionella och återupprättar bröstväggens integritet (Figur 1H). Var noga med att inte dra åt suturen för hårt eftersom det kan slita sönder de interkostala musklerna.
- Fäst suturen genom att knyta ihop de två ändarna av suturen 4x. Klipp sutursvansarna så nära knuten som möjligt.
- Stäng huden med kirurgiska häftklamrar.
- Ta bort överflödig luft från brösthålan med en 1 ml insulinspruta med en 28 G nål fastsatt. Lokalisera xiphoidprocessen taktilt och för in nålen precis nedanför, avancera mot vänster axel för att komma in i brösthålan genom diafragman. Dra tillbaka sprutan till ~1 ml; Ta bort nålen från musen och töm ut luften ur sprutan. Upprepa denna process 3-4 gånger.
OBS: Var noga med att inte punktera några inre organ. Dessutom är det viktigt att använda en 1 ml spruta och upprepa proceduren 3-4 gånger i stället för att använda en spruta med större volym och försöka ta bort all luft på en gång. Användning av en spruta med större volym kan resultera i ett för stort vakuum i brösthålan och leda till utspänd lungvävnad och skador. - Stäng av isofluranen.
- Fortsätt ventilera med 100 % syre tills musen visar tecken på att vakna.
- När musen visar tecken på uppvaknande, koppla bort intubationskatetern från ventilatorn, klipp suturen runt nosen och extubera musen.
- Lossa musen och överför den till en ren bur placerad ~2 fot under en värmelampa. Övervaka tills den är helt återställd. Om musen visar tecken på andningssvårigheter eller brist på rörlighet, bedöva den med 5 % isofluran i 5 minuter, säkerställ adekvat anestesi genom att observera förlust av reflexer vid nyp i tån och avliva via cervikal luxation.
- När musen vaknar helt från narkosen och börjar röra på sig, bereds ytterligare 0,1 mg/kg buprenorfin och injiceras subkutant för postoperativ smärtlindring.
- Efter operationen, se till att mössen hålls individuellt. Ge antibiotika i dricksvattnet (enrofloxacin, slutkoncentration 0,4 mg/ml).
- Under de 3 dagarna efter operationen, kontrollera musen två gånger per dag för tecken på besvär. För smärtlindring, administrera 0,1 mg/kg buprenorfin (0,03 mg/ml) subkutant var 4-6:e timme. Avliva musen om den visar tecken på infektion, orörlighet eller andningssvårigheter. Efter den tredje dagen kan möss kontrolleras en gång per dag.
5. Provbearbetning och detektion av fotokonverterade celler med hjälp av vävnadsrensning
- Mellan 3 och 5 dagar (eller önskad tid) efter fotokonverteringskirurgi, bedöva musen med 5 % isofluran, minska isofluran från 5 % till 2,5 % efter induktion, säkerställ adekvat anestesi genom att observera en förlust av reflexer vid tånypning och utför en terminal transkardiell perfusion med 10 ml rumstemperatur PBS, följt av 10 ml 4 % paraformaldehyd kyld till 4 °C som tidigare beskrivits31.
- Samla in de organ som är av intresse och rensa dem optiskt enligt beskrivningen31.
- Avbilda de rensade vävnaderna med ett ljusarksmikroskop som tidigare beskrivits31. Alternativt kan du placera de rensade vävnaderna i en glasbottenskål och bild i FITC- och TRITC-kanalerna för att visualisera gröna (icke-fotokonverterade) och röda (fotokonverterade) celler med hjälp av ett konfokalt, snurrande skiva eller multifotonmikroskop.
6. Provbearbetning och detektion av fotokonverterade celler med hjälp av vävnadsdisaggregering
- Bedöva musen med 5 % isofluran i 5 minuter, säkerställ adekvat anestesi genom att observera en förlust av reflexer vid nyp i tårna och avliva via cervikal luxation 3-5 dagar efter fotokonvertering.
- Samla in och smält de organ som är av intresse enligt tidigare beskrivet13.
- Platta de nedbrutna vävnaderna och placera dem i en inkubator för att fästa över natten som tidigare beskrivits13.
- Följande dag, avbilda de pläterade cellerna i FITC- och TRITC-kanalerna för att visualisera gröna (icke-fotokonverterade) och röda (fotokonverterade) celler som tidigare beskrivits13.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Stegen i operationen som beskrivs i detta protokoll illustreras i figur 1. Kort sagt, musen sövs och hår tas bort från vänster bröstkorg. Musen intuberas och ventileras, vilket gör att musen kan få syre medan brösthålan är öppen. Mjukvävnad avlägsnas för att exponera bröstkorgen, och ett snitt görs i den 6:e eller 7:e interkostala muskeln. En retraktor förs in i det interkostala brottet och frigörs för att sprida de intilliggande revbenen och exponera vänster lunga och eventuella fotokonvertibla metastaser därpå. Lungan och metastaserna utsätts sedan för blått ljus för att fotokonvertera de exponerade lesionerna. Efter fotokonvertering avlägsnas upprullningsdonet, revbenen sys ihop igen och den överliggande huden stängs. Slutligen avlägsnas överflödig luft från brösthålan för att lindra trycket på lungorna och göra det möjligt för musen att återuppta självständig, spontan andning.
Protokollet som beskrivs här kan anpassas till ett antal olika fotokonvertibla/fotoomkopplingsbara proteiner. Att se till att fotokonverterade celler når sin maximala fluorescensintensitet i den fotokonverterade kanalen kan underlätta deras identifiering i andra organ. De betingelser som krävs för att uppnå maximal fluorescensintensitet efter fotokonvertering bör bestämmas empiriskt, eftersom de kan variera med andra aspekter av experimentet, t.ex. det fotokonvertibla protein som används och intensiteten hos det ljus som används för att fotokonvertera. Figur 2B,C visar hur fluorescensintensiteten förändrades i både FITC (icke-fotokonverterad) och TRITC (fotokonverterad) kanal som en funktion av varaktigheten av exponeringen för blått ljus i ett ex vivo-prov. Vi fastställde att 6 minuters exponering för blått ljus gav den ljusaste signalen i den fotokonverterade kanalen och att ytterligare exponering ledde till fotoblekning. Vi mätte sedan fluorescensintensiteten i båda kanalerna före och efter 6 minuters exponering för blått ljus, in vivo, och fick liknande resultat (Figur 2D).
Därefter skördades hjärnan, levern och den icke-fotokonverterade högra lungan från möss som genomgick denna operation med (experimentgrupp) och utan (kontrollgrupp) fotokonverteringslampan tänd. Vävnaderna rensades optiskt som tidigare beskrivits31, placerades i en glasbottenskål och avbildades på ett specialbyggt multifotonmikroskop32 med en 25x 1,0 NA-objektivlins och en excitationsvåglängd på 880 nm. Fluorescens fångades för de gröna och röda kanalerna med hjälp av bandpassfiltren 525/35 nm respektive 580/60 nm. Fotokonverterade och icke-fotokonverterade celler kunde tydligt identifieras i alla tre vävnadstyper från möss som genomgick operationen med exponering för blått ljus (Figur 3). Som förväntat hittades endast icke-fotokonverterade tumörceller i vävnaderna hos möss som genomgick operationen utan exponering för blått ljus.
Figur 1: Översikt över det kirurgiska protokollet för lungfotokonverteringskirurgi. A) Hårborttagning av musen som placerats på operationsstadiet och tejpats på plats. B) En 10 mm rund öppning av hud och mjukvävnad över bröstkorgen. (C) Initialt brott av interkostalmuskeln med mikrodissekerande sax med trubbig kant. (D) Stängt upprullningsdon insatt i 10 mm interkostalt snitt. E) Öppet upprullningsdon som exponerar lungvävnad. (F) Fotokonverteringslampan är placerad direkt ovanför musens öppna bröstkorg. (G) Enkel kontinuerlig sutur som omfattar revbenet på båda sidor av det interkostala snittet. (H) Suturen är åtdragen och säkrad för att återställa bröstväggens integritet. (I) Avlägsnande av luft från brösthålan. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 2: Bestämning av de förhållanden som krävs för att uppnå maximal fluorescensintensitet i fotokonverterad kanal. (A) Representativa bilder av exponerade Dendra2-uttryckande lungmetastaser före exponering för blått ljus i rumsbelysning utan filter och vid låg förstoring (1) och hög förstoring (2), och hög förstoring i FITC- (3) och TRITC-kanalerna med vidvinkelbelysning (4). (B) Fluorescensbilder av en Dendra2-uttryckande lungmetastas före exponering för blått ljus och efter 2 min, 4 min, 6 min och 8 min exponering för blått ljus, ex vivo. (C) Normaliserad genomsnittlig fluorescensintensitet för en Dendra2-uttryckande lungmetastaser som en funktion av varaktigheten av exponeringen för blått ljus, ex vivo. (D) Normaliserad genomsnittlig fluorescensintensitet för en Dendra2-uttryckande lungmetastaser före och efter 6 minuters exponering för blått ljus, in vivo. Skalstreck = 2 mm (A), 400 μm (B). Klicka här för att se en större version av denna figur.
Figur 3: Representativa bilder av fotokonverterade (översta raden) och icke-fotokonverterade (nedre raden) tumörceller funna i den kontralaterala lungan, hjärnan och levern hos möss som genomgick fotokonversionskirurgi. Skalstreck = 10 μm. Klicka här för att se en större version av denna figur.
Kompletterande figur S1: Specialbyggd 400 nm LED Array-lampa.(A) Av och (B) på. CF = Kylfläkt, R = Reflektor, LED = Högeffekt 400 nm LED. Klicka här för att ladda ner den här filen.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
I denna artikel beskriver vi ett kirurgiskt protokoll för selektiv fotokonvertering av tumörceller i lungan. Denna teknik gör det möjligt för forskare att selektivt markera tumörceller i lungan och spåra deras öde genom att återidentifiera dem i hela kroppen vid en senare tidpunkt, vilket underlättar studien av metastaser från lungmetastaser. Med hjälp av detta protokoll var det möjligt att visualisera fotokonverterade celler i hjärnan, levern och icke-fotokonverterade högra lungan hos möss som hade genomgått operationen med fotokonvertering, vilket indikerar att dessa celler återdisseminerade från de fotokonverterade lungmetastaserna till dessa tertiära platser. Vi hittade inga röda blodkroppar i organen hos möss som inte genomgått fotokonversion, vilket tyder på att naturlig autofluorescens i celler inte är tillräckligt ljus för att förväxlas med fotokonverterade tumörceller.
Noggrann uppmärksamhet på vissa aspekter av experimentet kan öka framgångsfrekvensen för denna procedur. För det första, vid generering av lungmetastaser, måste protokollet för metastasgenerering och fotokonvertibelt/fotoomkopplingsbart protein övervägas. Det har rapporterats att vissa fluorescerande proteiner är immunogena 33,34,35,36. Cancerceller som uttrycker sådana proteiner kan därför inte spontant metastasera i immunkompetenta möss. Vi observerade att primära tumörer bildas i både syngena, immunkompetenta (FVB) möss och immunsupprimerade (Rag2-/-) möss vid ortotopisk injektion av 6DT1-Dendra2-celler. Metastaser utvecklades dock endast i Rag2-/- möss, vilket tyder på att Dendra2 kan vara något immunogent. Sätt att övervinna den potentiella immunogeniciteten hos fluorescerande proteiner för att generera lungmetastaser inkluderar att använda en immunsupprimerad mus, generera metastaser via svansveninjektion, använda ett annat fotokonvertibelt/fotoomkopplingsbart protein eller använda ett transgent djur där det fotokonvertibla/fotoomkopplingsbara proteinet är genetiskt kodat så att mössen tolereras för proteinet37. Styrkan och stabiliteten hos den fluorescerande signalen i den fotokonverterade kanalen måste också beaktas. För många fotokonvertibla/fotoswitchbara proteiner minskar signalen i den fotokonverterade kanalen med tiden när proteinet bryts ned och späds ut med celldelning. Vi och andra har tidigare visat att fotokonverterad H2B-länkad Dendra2 kan detekteras på ett tillförlitligt sätt under 7 dagar i celler som delar sig och 16 dagar i celler som inte delar sig38,39. Att koppla det fotokonvertibla proteinet till ett protein med låg omsättningshastighet kan förlänga halveringstiden för den fotokonverterade signalen. Metoder för felsökning av lungmetastasmodellen måste vara beroende av forskningssyfte och cancercelltyp som används.
För det andra är det viktigt att tajma operationen rätt utifrån den sjukdomsmodell som är av intresse. De som arbetar med sjukdomsmodeller med snabbväxande lungmetastaser kan ha en begränsad tidsram för att utföra operationen innan mössen blir för överväldigade av tumörbördan för att återhämta sig från operationen och/eller överleva den önskade tiden efter operationen. En grundlig förståelse av sjukdomsmodellens tidslinje, såväl som användningen av icke-invasiva avbildningsstrategier såsom mikrodatortomografi, kan hjälpa till att tajma denna procedur.
För det tredje kan oavsiktlig skärning av större kärl under avlägsnande av mjukvävnad orsaka kraftig blödning, vilket leder till dålig synlighet av det kirurgiska området och/eller blodförgiftning, som tidigare beskrivits40. Att undvika större kärl och använda en kauteriseringspenna under operationen kan förhindra detta. För det fjärde, när du sätter i och tar bort upprullningsdonet, är det avgörande att hålla upprullningsbladen parallella med bröstväggen hela tiden. Att vinkla bladen mot lungan ökar risken för lungskador, och att vinkla bladen mot bröstväggen ökar risken för att bryta igenom bröstväggen på andra områden. Om det inte verkar möjligt att sätta in eller ta bort upprullningsdonet parallellt, kan den trubbiga mikrodissekerande saxen användas för att öka längden på det interkostala snittet något innan du försöker sätta in/ta bort upprullningsdonet igen. Slutligen bör man se till att bröstkorgen är helt återförsluten i slutet av operationen. När du syr ihop revbenen igen ska sömnaden påbörjas ~1 mm innan snittet börjar och avslutas ~1 mm efter. Detta hjälper till att undvika kvarvarande öppningar på snittets ändar. Var dessutom noga med att dra och knyta suturen tillräckligt hårt för att eliminera utrymmet mellan revbenen, men inte så hårt att suturerna sliter sönder de intilliggande interkostala musklerna och skapar ytterligare brott. Om brösthålan inte kan återförslutas bör musen avlivas på ett humant sätt under operationen, eftersom den kommer att ha stora svårigheter eller inte kunna andas på egen hand när den mekaniska ventilationen stoppas.
Ljuskällan och den exakta metodiken för fotokonvertering kan variera mellan olika laboratorier. Alla ljuskällor och metoder som är säkra, konsekventa och lämpliga för modellen får användas. Fotokonversion kan till exempel utföras genom att musen överförs till ett stereoskop eller annat mikroskop som kan lysa med den våglängd och intensitet som behövs för fotokonversion på den exponerade lungan. Vi använder en specialbyggd 400 nm lysdiodmatrislampa inställd på sin högsta intensitet för att fotokonvertera Dendra2-uttryckande lungmetastaser (tilläggsfigur S1). För att stödja lampan ovanför musen och se till att lampan placeras på samma avstånd ovanför varje mus, skär vi en öppning på 6,5 x 6,5 cm i botten av en kartong med öppen topp (18,4 cm (L) x 13,2 cm (B) x 7,3 cm (H)). Vi placerar lådan upp och ner över musen och vilar lampan på 8,5 x 8,5 cm över utskärningen på 6,5 x 6,5 cm (Figur 1F), så att lampan stöds och det blå ljuset kan nå den exponerade lungvävnaden.
Det är viktigt att notera att vissa aspekter av detta protokoll, inklusive kirurgi och användning av bedövningsmedel, kan förändra spridningskinetiken och kapaciteten hos tumörceller 41,42,43,44. Lämpliga kontroller måste därför användas för att säkerställa att resultaten inte förväxlas av förfarandet.
Den största begränsningen med denna teknik är att endast metastaser på den exponerade delen av lungan kommer att genomgå fotokonversion. Därför kommer inte alla tumörceller som återsprids från lungan att fotokonverteras och all kvantifiering av återdisseminerade celler kommer att vara relativ. Trots denna begränsning kan denna teknik fortfarande ge värdefull insikt i tumörcellers spridning, inklusive att avgöra om och när det händer, vad som främjar eller förhindrar det och organotropismen hos återdisseminerade celler. Såvitt vi vet är detta den första tekniken som möjliggör selektiv märkning och ödesspårning av tumörceller i lungan. Sammanfattningsvis beskriver detta protokoll en ny teknik som kan användas för att underlätta och förbättra studien av tumörcellsrespridning och metastas-till-metastassådd utan genomisk analys. Att rikta in sig på lungmetastaser gör proceduren användbar och relevant för metastasforskare som studerar de flesta större cancertyper.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Disclosures
Författarna har inga intressekonflikter att redovisa.
Acknowledgments
Författarna vill tacka Wade Koba för hans hjälp med mikrodatortomografi (S10RR029545), Vera DesMarais och Hillary Guzik från Analytical Imaging Facility för deras utbildning och hjälp med mikroskopi, Einstein Montefiore Cancer Center, National Cancer Institute (P30CA013330, R01CA21248, R01CA255153), Gruss Lipper Biophotonics Center, Integrated Imaging Program for Cancer Research, ett Sir Henry Wellcome Postdoctoral Fellowship (221647/Z/20/Z) och ett METAvivor Career Development Award.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| 0-30 V, 0-3 A Power Supply | MPJA | 9616 PS | |
| 12 VDC, 1.2 A Unregulated Plug Supply | MPJA | 17563 PD | |
| 28 G 1 mL BD Insulin Syringe | BD | 329410 | |
| 400 nm light emitting diode array lamp | LedEngin Inc. | 897-LZPD0UA00 | Photoconversion lamp, custom-built (individual parts included below) |
| 5-0 braided silk suture with RB-1 cutting needle | Ethicon, Inc. | 774B | |
| 9 cm 2-0 silk tie | Ethicon, Inc. | LA55G | |
| Baytril 100 (enrofloxacin) | Bayer (Santa Cruz Biotechnology) | sc-362890Rx | Antibiotic used in drinking water |
| Buprenorphine | Hospira | 0409-2012-32 | Analgesic |
| Cables (Cable Assemblies) 2.5 JK-ST 72" ZIP CD | Mouser | 172-0250 | |
| Chlorhexidine solution | Durvet | 7-45801-10258-3 | Chlorhexidine Disinfectant Solution |
| Compressed air canister | Falcon | DPSJB-12 | |
| Extra Fine Micro Dissecting Scissors 4" Straight Sharp/Sharp 24 mm | Roboz Surgical | RS-5912 | Sharp Micro Dissecting Scissors |
| Fiber-optic illuminator | O.C. White Company | FL3000 | Used during mouse intubation |
| Gemini Cautery Kit | Harvard Apparatus | 726067 | Cautery pen |
| Germinator 500 | CellPoint Scientific | GER 5287-120V | Bead Sterilizer |
| Graefe forceps | Roboz | RS-5135 | |
| High power LEDs - single color ultraviolet 90 watts | Mouser | LZP-D0UA00 | |
| Infrared heat lamp | Braintree Scientific | HL-1 | |
| Isoflurane SOL 250 mL PVL | Covetrus | 29405 | Anesthetic |
| Isoflurane vaporizer | SurgiVet | VCT302 | |
| Jacobson needle holder with lock | Kalson Surgical | T1-140 | |
| Labeling tape | Fisher Scientific | S68702 | |
| LED Lighting Reflectors CREE MP-L SNGL LENS REFLECTOR & LOC PIN | Mouser | 928-C11395TM | |
| Long cotton tip applicators | Medline Industries | MDS202055 | |
| Masscool / Soccket 478 / Intel Pentium 4/Celeron up to 3.4GHz / Ball Bearing / Copper Core / CPU Cooling Fan | CompUSA | #S457-1023 | |
| Micro Dissecting Scissors 4" Straight Blunt/Blunt | Roboz Surgical | RS-5980 | Blunt Micro Dissecting Scissors |
| Murine ventilator | Kent Scientific | PS-02 | PhysioSuite |
| Nair Hair Removal Lotion | Amazon | B001RVMR7K | Depilatory cream |
| Personnet mini retractor | Roboz | RS-6504 | Retractor |
| Phosphate Buffered Saline 1x | Fisher Scientific | 14190144 | PBS |
| pLenti.CAG.H2B-Dendra2.W | Addgene | 51005 | Dendra2 lentivirus |
| Puralube | Henry Schein Animal Health | 008897 | Eye Lubricant |
| Rodent intubation stand | Braintree Scientific | RIS 100 | |
| Small animal lung inflation bulb | Harvard Apparatus | 72-9083 | |
| SurgiSuite Multi-Functional Surgical Platform for Mice, with Warming | Kent Scientific | SURGI-M02 | Heated surgical platform |
| Test Leads 48" TEST LEAD BANANA - Black | Mouser | 565-1440-48-0 | |
| Test Leads 48" TEST LEAD BANANA - Red | Mouser | 565-1440-48-2 | |
| Tracheal catheter | Exelint International | 26746 | 22 G catheter |
| Wound closing system veterinary kit | Clay Adams | IN015 | Veterinary surgical stapling kit |
References
- Dillekås, H., Rogers, M. S., Straume, O. Are 90% of deaths from cancer caused by metastases. Cancer Medicine. 8 (12), 5574-5576 (2019).
- Gupta, G. P., Massagué, J. Cancer metastasis: building a framework. Cell. 127 (4), 679-695 (2006).
- Nguyen, D. X., Bos, P. D., Massagué, J. Metastasis: from dissemination to organ-specific colonization. Nature Reviews. Cancer. 9 (4), 274-284 (2009).
- Paget, S. The distribution of secondary growths in cancer of the breast. Cancer Metastasis Reviews. 8 (2), 98-101 (1989).
- Liu, T., et al. Self-seeding circulating tumor cells promote the proliferation and metastasis of human osteosarcoma by upregulating interleukin-8. Cell Death & Disease. 10 (8), 575 (2019).
- Liu, H., et al. Tumor-derived exosomes promote tumor self-seeding in hepatocellular carcinoma by transferring miRNA-25-5p to enhance cell motility. Oncogene. 37 (36), 4964-4978 (2018).
- Kim, M. -Y., et al. Tumor self-seeding by circulating cancer cells. Cell. 139 (7), 1315-1326 (2009).
- Zhang, Y., et al. Tumor self-seeding by circulating tumor cells in nude mouse models of human osteosarcoma and a preliminary study of its mechanisms. Journal of Cancer Research and Clinical Oncology. 140 (2), 329-340 (2014).
- Dondossola, E., Crippa, L., Colombo, B., Ferrero, E., Corti, A. Chromogranin A regulates tumor self-seeding and dissemination. Cancer Research. 72 (2), 449-459 (2012).
- Brown, M., et al. Lymph node blood vessels provide exit routes for metastatic tumor cell dissemination in mice. Science. 359 (6382), 1408-1411 (2018).
- Pereira, E. R., et al. Lymph node metastases can invade local blood vessels, exit the node, and colonize distant organs in mice. Science. 359 (6382), 1403-1407 (2018).
- Coste, A., et al. Hematogenous dissemination of breast cancer cells from lymph nodes is mediated by tumor microenvironment of metastasis doorways. Frontiers in Oncology. 10, 571100 (2020).
- Borriello, L., Condeelis, J., Entenberg, D., Oktay, M. H. Breast cancer cell re-dissemination from lung metastases-a mechanism for enhancing metastatic burden. Journal of Clinical Medicine. 10 (11), 2340 (2021).
- Ullah, I., et al. Evolutionary history of metastatic breast cancer reveals minimal seeding from axillary lymph nodes. The Journal of Clinical Investigation. 128 (4), 1355-1370 (2018).
- Gundem, G., et al. The evolutionary history of lethal metastatic prostate cancer. Nature. 520 (7547), 353-357 (2015).
- Brown, D., et al. Phylogenetic analysis of metastatic progression in breast cancer using somatic mutations and copy number aberrations. Nature Communications. 8, 14944 (2017).
- Kalhor, R., Mali, P., Church, G. M. Rapidly evolving homing CRISPR barcodes. Nature Methods. 14 (2), 195-200 (2017).
- Kalhor, R., et al. Developmental barcoding of whole mouse via homing CRISPR. Science. 361 (6405), eaat9804 (2018).
- McKenna, A., et al. Whole-organism lineage tracing by combinatorial and cumulative genome editing. Science. 353 (6298), aaf7907 (2016).
- Junker, J. P., et al. Massively parallel clonal analysis using CRISPR/Cas9 induced genetic scars. bioRxiv. , 056499 (2017).
- Zhang, W., et al. The bone microenvironment invigorates metastatic seeds for further dissemination. Cell. 184 (9), 2471.e20-2486.e20 (2021).
- Kedrin, D., et al. Intravital imaging of metastatic behavior through a mammary imaging window. Nature Methods. 5 (12), 1019-1021 (2008).
- Grau, N., et al. Spatiotemporally controlled induction of gene expression in vivo allows tracking the fate of tumor cells that traffic through the lymphatics. International Journal of Cancer. 147 (4), 1190-1198 (2020).
- Riihimäki, M., Thomsen, H., Sundquist, K., Sundquist, J., Hemminki, K.
- Gurskaya, N. G., et al. Engineering of a monomeric green-to-red photoactivatable fluorescent protein induced by blue light. Nature Biotechnology. 24 (4), 461-465 (2006).
- Zhang, G. -L., Zhang, Y., Cao, K. -X., Wang, X. -M. Orthotopic injection of breast cancer cells into the mice mammary fat pad. Journal of Visualized Experiments. (143), (2019).
- Pavese, J., Ogden, I. M., Bergan, R. C. An orthotopic murine model of human prostate cancer metastasis. Journal of Visualized Experiments. (79), (2013).
- Thies, K. A., Steck, S., Knoblaugh, S. E., Sizemore, S. T. Pathological analysis of lung metastasis following lateral tail-vein injection of tumor cells. Journal of Visualized Experiments. (159), (2020).
- Das, S., MacDonald, K., Sucie Chang, h-y, Mitzner, W. A simple method of mouse lung intubation. Journal of Visualized Experiments. (73), e50318 (2013).
- DuPage, M., Dooley, A. L., Jacks, T. Conditional mouse lung cancer models using adenoviral or lentiviral delivery of Cre recombinase. Nature Protocols. 4 (7), 1064-1072 (2009).
- Hsu, C. -W., et al. EZ Clear for simple, rapid, and robust mouse whole organ clearing. eLife. 11, e77419 (2022).
- Entenberg, D., et al. Setup and use of a two-laser multiphoton microscope for multichannel intravital fluorescence imaging. Nature Protocols. 6 (10), 1500-1520 (2011).
- Gambotto, A., et al. Immunogenicity of enhanced green fluorescent protein (EGFP) in BALB/c mice: identification of an H2-Kd-restricted CTL epitope. Gene Therapy. 7 (23), 2036-2040 (2000).
- Han, W. G. H., Unger, W. W. J., Wauben, M. H. M. Identification of the immunodominant CTL epitope of EGFP in C57BL/6 mice. Gene Therapy. 15 (9), 700-701 (2008).
- Stripecke, R., et al. Immune response to green fluorescent protein: implications for gene therapy. Gene Therapy. 6 (7), 1305-1312 (1999).
- Rosenzweig, M., et al. Induction of cytotoxic T lymphocyte and antibody responses to enhanced green fluorescent protein following transplantation of transduced CD34(+) hematopoietic cells. Blood. 97 (7), 1951-1959 (2001).
- Grzelak, C. A., et al. Elimination of fluorescent protein immunogenicity permits modeling of metastasis in immune-competent settings. Cancer Cell. 40 (1), 1-2 (2022).
- Fluegen, G., et al. Phenotypic heterogeneity of disseminated tumour cells is preset by primary tumour hypoxic microenvironments. Nature Cell Biology. 19 (2), 120-132 (2017).
- Yan, C., et al. Visualizing engrafted human cancer and therapy responses in immunodeficient zebrafish. Cell. 177 (7), 1903.e14-1914.e14 (2019).
- Borriello, L., Traub, B., Coste, A., Oktay, M. H., Entenberg, D. A permanent window for investigating cancer metastasis to the lung. Journal of Visualized Experiments. (173), (2021).
- Tohme, S., Simmons, R. L., Tsung, A. Surgery for cancer: a trigger for metastases. Cancer Research. 77 (7), 1548-1552 (2017).
- Al-Sahaf, O., Wang, J. H., Browne, T. J., Cotter, T. G., Redmond, H. P. Surgical injury enhances the expression of genes that mediate breast cancer metastasis to the lung. Annals of Surgery. 252 (6), 1037-1043 (2010).
- Lu, N., Piao, M. -H., Feng, C. -S., Yuan, Y. Isoflurane promotes epithelial-to-mesenchymal transition and metastasis of bladder cancer cells through HIF-1α-β-catenin/Notch1 pathways. Life Sciences. 258, 118154 (2020).
- Jiao, B., et al. Relationship between volatile anesthetics and tumor progression: unveiling the mystery. Current Medical Science. 38 (6), 962-967 (2018).
