Etablering av en fysiologisk human vaskularisert mikrotumormodell for kreftforskning

Summary

Denne protokollen presenterer en fysiologisk relevant tumor-on-a-chip-modell for å utføre grunnleggende og translasjonell kreftforskning med høy gjennomstrømning, fremme legemiddelscreening, sykdomsmodellering og personlig medisintilnærminger med en beskrivelse av laste-, vedlikeholds- og evalueringsprosedyrer.

Abstract

Mangel på validerte kreftmodeller som rekapitulerer tumormikromiljøet til faste kreftformer in vitro er fortsatt en betydelig flaskehals for preklinisk kreftforskning og terapeutisk utvikling. For å overvinne dette problemet har vi utviklet den vaskulariserte mikrotumoren (VMT), eller tumorchip, et mikrofysiologisk system som realistisk modellerer det komplekse menneskelige tumormikromiljøet. VMT danner de novo innenfor en mikrofluidisk plattform ved samkultur av flere humane celletyper under dynamiske, fysiologiske strømningsforhold. Denne vevskonstruerte mikrotumorkonstruksjonen inkorporerer et levende perfusert vaskulært nettverk som støtter den voksende tumormassen, akkurat som nydannede kar gjør in vivo. Det er viktig at narkotika og immunceller må krysse endotellaget for å nå svulsten, modellere in vivo fysiologiske barrierer for terapeutisk levering og effekt. Siden VMT-plattformen er optisk gjennomsiktig, kan høyoppløselig avbildning av dynamiske prosesser som ekstravasasjon av immunceller og metastase oppnås med direkte visualisering av fluorescerende merkede celler i vevet. Videre beholder VMT in vivo tumorheterogenitet, genuttrykkssignaturer og legemiddelresponser. Nesten hvilken som helst tumortype kan tilpasses plattformen, og primære celler fra ferske kirurgiske vev vokser og reagerer på medikamentell behandling i VMT, og baner vei mot virkelig personlig medisin. Her er metodene for å etablere VMT og bruke den til onkologisk forskning skissert. Denne innovative tilnærmingen åpner nye muligheter for å studere svulster og legemiddelresponser, og gir forskere et kraftig verktøy for å fremme kreftforskning.

Introduction

Kreft er fortsatt et stort helseproblem over hele verden og er den nest største dødsårsaken i USA. Bare for året 2023 forventer National Center for Health Statistics mer enn 1,9 millioner nye krefttilfeller og over 600 000 kreftdødsfall i USA¹, noe som understreker det presserende behovet for effektive behandlingstilnærminger. Men for tiden får bare 5.1% av anti-kreftbehandlinger som går inn i kliniske studier, til slutt FDA-godkjenning. Manglende evne til å lykkes med å utvikle seg gjennom kliniske studier kan delvis tilskrives bruk av ikke-fysiologiske modellsystemer, for eksempel 2D og sfæroidkulturer, under preklinisk legemiddelutvikling². Disse klassiske kreftmodellene mangler essensielle komponenter i tumormikromiljøet, for eksempel en stromalnisje, tilknyttede immunceller og perfusert vaskulatur, som er viktige determinanter for terapeutisk resistens og sykdomsprogresjon. Dermed er et nytt modellsystem som bedre etterligner det humane in vivo-tumormikromiljøet nødvendig for å forbedre den kliniske oversettelsen av prekliniske funn.

Feltet for vevsteknikk utvikler seg raskt, og gir forbedrede metoder for å studere menneskelige sykdommer i laboratorieinnstillinger. En betydelig utvikling er fremveksten av mikrofysiologiske systemer (MPS), også kjent som organbrikker eller vevsbrikker, som er funksjonelle, miniatyriserte menneskelige organer som er i stand til å replikere sunne eller syke tilstander ^3,4,5. I denne sammenheng har tumorbrikker, som er tredimensjonale mikrofluidbaserte in vitro humane tumormodeller, blitt utviklet for onkologisk forskning 2,3,4,5,6,7,8,9,10,11,12,13 . Disse avanserte modellene innlemmer biokjemiske og biofysiske signaler i et dynamisk tumormikromiljø, slik at forskere kan studere tumoradferd og respons på behandlinger i en mer fysiologisk relevant sammenheng. Til tross for disse fremskrittene har imidlertid få grupper lykkes med å innlemme en levende, funksjonell vaskulatur, spesielt en som selvmønstre som respons på fysiologisk flyt 3,4,5,6. Inkluderingen av et funksjonelt vaskulært nettverk er avgjørende, da det muliggjør modellering av fysiske barrierer som påvirker legemiddel- eller cellelevering, cellehoming til forskjellige mikromiljøer og transendotelial migrasjon av tumor-, stromal- og immunceller. Ved å inkludere denne funksjonen kan tumorbrikken bedre representere kompleksiteten observert i in vivo-tumormikromiljøet.

For å imøtekomme dette udekkede behovet har vi utviklet en ny plattform for screening av legemidler som gjør det mulig for mikrofartøynettverk å dannes i en mikrofluidisk enhet 8,9,10,11,12,13,14,15,16. Denne baseorganbrikkeplattformen, kalt det vaskulariserte mikroorganet (VMO), kan tilpasses praktisk talt ethvert organsystem for å replikere original vevsfysiologi for sykdomsmodellering, legemiddelscreening og personlige medisinapplikasjoner. VMOer er etablert ved samdyrking av endotelkolonidannende celleavledede endotelceller (ECFC-EC), HUVEC eller iPSC-EC (heretter EC), og flere stromale celler i kammeret, inkludert normale humane lungefibroblaster (NHLF), som omdanner matrisen, og pericytter som vikler og stabiliserer karene. VMO kan også etableres som et kreftmodellsystem ved å dyrke tumorceller med tilhørende stroma for å skape en vaskularisert mikrotumor (VMT) 8,9,10,11,12,13 eller tumorchip, modell. Gjennom samkultur av flere celletyper i et dynamisk strømningsmiljø dannes perfuserte mikrovaskulære nettverk de novo i vevskamrene i enheten, hvor vaskulogenese er nøye regulert av interstitielle strømningshastigheter^14,15. Medium drives gjennom de mikrofluidiske kanalene til enheten av et hydrostatisk trykkhode som forsyner de omkringliggende cellene i vevskammeret med næringsstoffer utelukkende gjennom mikrokarene, med en permeabilitetskoeffisient på 1,2 x ^10-7 cm / s, lik det som ses for kapillærer in vivo⁸.

Inkorporering av selvorganiserende mikrofartøy i VMT-modellen representerer et betydelig gjennombrudd fordi det: 1) etterligner strukturen og funksjonen til vaskulariserte tumormasser in vivo; 2) kan modellere viktige trinn i metastase, inkludert tumor-endotel- og stromale celleinteraksjoner; 3) etablerer fysiologisk selektive barrierer for levering av næringsstoffer og legemidler, forbedrer farmasøytisk screening; og 4) tillater direkte vurdering av legemidler med anti-angiogene og antimetastatiske evner. Ved å replikere in vivo-levering av næringsstoffer, legemidler og immunceller i et komplekst 3D-mikromiljø, er VMO / VMT-plattformen en fysiologisk relevant modell som kan brukes til å utføre legemiddelscreening og studere kreft, vaskulær eller organspesifikk biologi. Det er viktig at VMT støtter veksten av ulike typer svulster, inkludert tykktarmskreft, melanom, brystkreft, glioblastom, lungekreft, peritoneal karsinomatose, eggstokkreft og kreft i bukspyttkjertelen 8,9,10,11,12,13. I tillegg til å være billig, lett etablert og arrangert for eksperimenter med høy gjennomstrømning, er den mikrofluidiske plattformen fullt optisk kompatibel for sanntids bildeanalyse av tumor-stromale interaksjoner og respons på stimuli eller terapi. Hver celletype i systemet er merket med en annen fluorescerende markør for å tillate direkte visualisering og sporing av celleadferd gjennom hele forsøket, og skaper et vindu inn i det dynamiske tumormikromiljøet. Vi har tidligere vist at VMT mer trofast modellerer in vivo tumorvekst, arkitektur, heterogenitet, genuttrykkssignaturer og medikamentresponser enn standard kulturmodaliteter¹⁰. Det er viktig at VMT støtter veksten og studien av pasientavledede celler, inkludert kreftceller, som bedre modellerer patologien til foreldretumorene enn standard sfæroidkulturer og videre fremmer personlig medisininnsats¹¹. Dette manuskriptet skisserer metodene for å etablere VMT, og viser nytten for å studere kreft hos mennesker.

Protocol

1. Design og fabrikasjon

1. Enhetsdesign
   1. For fabrikasjon av mikrofluidisk enhet, lag en SU-8-form ved å bruke et 200 μm lag av SU-8 spin-belagt på en Si-wafer (RCA-1 renset og 2% hydrogenfluorid (HF) behandlet), etterfulgt av et enkelt maskefotolitografitrinn som beskrevet tidligere ^8,9.
   2. Støp en 4 mm tykk kopi av polydimetylsiloksan (PDMS) fra SU-8-formen for å generere en holdbar polyuretanform for nedstrøms fabrikasjonstrinn. Ulike designiterasjoner kan brukes 8,9,10,11,12,13,14,15.
   3. I den nåværende iterasjonen designer du den mikrofluidiske enheten som skal spesialtilpasses i et standard 96-brønns plateformat og bestående av et 2 mm tykt PDMS-funksjonslag med 12 mikrofluidiske enhetsenheter omsluttet av et tynt (1/16 tommer) gjennomsiktig polymermembranlag på bunnen (figur 1A).
   4. Sørg for at individuelle vevsenheter består av et vevskammer flankert av gellasteinnløp (L1) og utløp (L2), en trykkregulator (PR)¹⁶ og frakoblede mikrofluidiske kanaler koblet til 2 medieinntak og utløp på hver side (M1-M2, M3-M4; Figur 1B).
   5. Plasser hvert innløp og utløp i en enkelt brønn som fungerer som et middels reservoar for å etablere hydrostatisk trykk (10 mm H₂O) over den mikrofluidiske kanalen. For å tillate vaskulære nettverksanastomoser med de ytre kanalene, koble mikrofluidiske kanaler til vevskammeret via 50 μm brede kommunikasjonsporer (6 øverst, 6 nederst).
      MERK: Mikrofluidiske motstander skaper en 5 mm H₂O interstitiell trykkgradient over vevkammeret som blir intraluminal når det vaskulære nettverket er fullt dannet ^8,10. De påfølgende prosedyrene begynner med en fullt montert høy gjennomstrømningsplate.

Figur 1. Mikrofluidisk plattformdesign. (A) Skjemaet over plattformenheten viser PDMS-funksjonslaget med 12 enhetsenheter bundet til en bunnløs 96-brønnsplate og forseglet med en tynn gjennomsiktig polymermembran. Hver enhetsenhet har en kolonne med brønner på platen. Den ene enhetsenheten som er skissert i rødt, vises med detaljer i (B). (B) Skjematisk av en enhetsenhet viser et enkelt vevskammer plassert i en brønn på 96-brønnsplaten og to lasteporter med innløp og utløp (L1-L2) hull stanset for å tillate cellematriseblanding å bli introdusert. Middels innløp og utløp (M1-M2, M3-M4) er hullstanset og plassert i brønner som fungerer som mediereservoarer. Ulike volumer av medier etablerer en hydrostatisk trykkgradient over vevskammeret via frakoblede mikrofluidiske kanaler. Trykkregulatoren (PR) -enheten fungerer som en gelsprengningsventil for å øke enkel belastning. Merk at enheten er 200 μm dyp, og vevkammeret er 2 mm x 6 mm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

2. Forberedelser før lasting

1. Cellekultur
   1. Vedlikehold celler i henhold til produsentens anbefalinger i en fuktet 37 ° C og 5% CO₂ -inkubator.
   2. Plate T75-flasker av transdusert EC, NHLF eller annen fibroblast / stromalcelle og ønskede kreftceller 3-4 dager før lasting med en tetthet informert av produsent- og brukerprotokoller. For denne protokollen, plate 1 x 10⁶ celler per kolbe for hver celletype. Kultur EC i Endothelial Growth Media 2 (EGM2) komplette medier, NHLF i Dulbecco's Modified Eagle Medium (DMEM) med 10% FBS, og kreftceller i passende medier avhengig av celletype.
   3. Vedlikehold celler ved å mate med de respektive mediene hver 2-3 dag og bekreft transduksjons- eller merkingseffektiviteten ved å visualisere celler under et fluorescerende mikroskop. På dagen for lasting, sørg for at EC er 80% -100% sammenflytende, mens NHLF er subfluent på 70% -80%.
2. Fremstilling av fibrinogen
   1. Forbered fibrinogenoppløsningen til ønsket konsentrasjon (vanligvis støtter 5-8 mg / ml robust vaskulær nettverksdannelse), og regner med prosentvis koagulering av fibrinogen. Beregn mengden fibrinogen som trengs med følgende ligning:
      Fibrinogen (mg) = (volum (ml)) x (konsentrasjon (mg/ml))/ (koagulering %)
   2. Løs opp fibrinogenet i et passende volum endotelial basalmedium 2 (EBM2), oppvarmet til 37 °C, ved forsiktig å knipse på tuben (ikke virvel). Inkuber fibrinogen i et vannbad på 37 °C slik at det kan gå helt i oppløsning. Det er viktig at du ikke bruker et komplett medium.
   3. Sterilfilter fibrinogenløsning med 0,22 μm filter og alikot til ønsket volum, typisk 400 μL per mikrosentrifugerør.
      MERK: Andre matriksproteiner (f.eks. Kollagen, fibronektin eller laminin) kan pigges inn i fibrinogenblandingen.

3. Lasting av prøver

MERK: Lasting er tidsfølsom og bør fullføres fra start (celleløft) til slutt (tillegg av media til enheter) innen ca. 1,5-1,75 timer for å sikre optimale resultater. Hvert trinn er notert med en foreslått tidtaker for å holde brukeren på sporet.

1. Klargjøring av materialer (lastedag)
   1. Plasser følgende i et vannbad på 37 °C i 10-15 minutter: Hanks balanserte saltløsning (HBSS) eller fosfatbufret saltvann (PBS) for vasking av celler, celledissosiasjonsreagens, media (f.eks. EGM2, DMEM)
   2. Oppbevar følgende reagenser i kjøleskap på 4 °C til de skal brukes: trombin, laminin (tint over natten ved 4 °C).
   3. Tine fibrinogen aliquot ved romtemperatur. Forbered 1,5 μL alikoter trombin i 500 μL mikrosentrifugerør, med ett rør per enhetsenhet. Sørg for at trombinalikvoten er i bunnen av hvert rør for å lette lastingen.
   4. Plasser UV-steriliserte plater med høy gjennomstrømning i en tørketrommel i minst 30 minutter før lasting for å fjerne luft fanget i mikrofluidikken.
2. Cell forberedelse (Timer start = begynne på 0 min)
   1. Sjekk celler under mikroskopet ved 4x forstørrelse for å bekrefte konfluens og transduksjonseffektivitet.
   2. Vask hver T75-kolbe med celler 2x med 5 ml HBSS og aspirer helt. Tilsett 1 ml dissosiasjonsreagens til hver kolbe og inkuber ved 37 °C, 5% CO₂ i 1-2 minutter.
   3. Bank forsiktig på platen med håndflaten og kontroller at alle cellene er løftet.
   4. Vask cellene av kolben med 9 ml egnet medium og samle dem opp i en 15 ml konisk. Fjern umiddelbart en liten aliquot for celletelling.
   5. Sentrifuger cellene ved 300 x g i 3-5 minutter ved 4 °C. Mens sentrifugerer celler, teller du cellene. En konfluent T75-kolbe av EC eller NHLF skal gi minst 2 x 10⁶ celler.
   6. Etter sentrifugering, aspirer mediet og resuspender pelleten i passende medier i en konsentrasjon på 1 x 10⁶ celler/ml. Hold celler på is.
3. Fremstilling av celle- og fibrinogenblanding (Timer = begynn ved 20 minutter)
   1. Bestem hvor mange enheter som skal lastes, legg til 1-2 for å ta hensyn til pipetteringstap, og multipliser med volumet av celle-/fibrinogenblanding som trengs per enhet. Dette vil avhenge av enhetskonfigurasjonen, men for enhetsdesignet som presenteres i denne artikkelen, kreves 6 μL per enhet.
   2. Konsentrasjonen av hver celletype bør bestemmes eksperimentelt. Til å begynne med, last EC i en konsentrasjon på ca. 7 x 10⁶ celler/ml og NHLF i en konsentrasjon på 3,5 x 10⁶ celler/ml. Konsentrasjonen av kreftceller kan variere betydelig basert på veksthastigheten, men ligger vanligvis innenfor området 0,5-2 x 10⁶ celler / ml. Bruk denne ligningen til å beregne antall celler som trengs:
      Antall celler som trengs = (volum fibrin (μL))/1000 μL x (konsentrasjon av celler)
   3. Resuspendere cellene i en konsentrasjon på 1 x 10⁶ celler / ml og bruk følgende ligning for å bestemme volumet av celler som trengs:
      Volum av celler som trengs (μL) = (antall celler nødvendig)/1000
   4. Bland respektive volumer av EC, NHLF og kreftceller (kun for VMT) i et konisk rør og sentrifuge ved 300 x g i 3-5 minutter ved 4 °C.
   5. Etter spinning, aspirer mediet forsiktig og pipe bort eventuelle gjenværende medier i nærheten av pelleten. Resuspender pelleten forsiktig, men grundig i det beregnede volumet av fibrinogen, og vær ekstra forsiktig så du ikke introduserer luftbobler. Hold på is.
   6. Ta steriliserte plater og trombinalikoter inn i vevskulturhetten.
4. Laster inn enheter (Timer = begynner på 30-35 min)
   1. Bruk en P20-pipette, pipet 6 μL volum fra cellen/fibrinblandingen. Pass på å pipe blandingen opp og ned minst 5x for å sikre jevn cellesuspensjon. Hold blandingen på is for å bremse koaguleringen.
   2. Bland cellen/fibrinet forsiktig inn i en tube trombin ved å sette pipetspissen direkte inn i trombinalikvinen i bunnen av røret. Pipet umiddelbart opp og ned minst 2x, pass på at det ikke kommer inn luftbobler. Fibrin vil begynne å koagulere en gang blandet med trombin, så raskt, men bevisst fullføre trinn 3.4.3. og 3.4.4. før fibringelene i pipettespissen (~3 s).
   3. Løft platen med høy gjennomstrømning skrått og sett pipetspissen raskt inn i en av enhetens lasteporter (L1 eller L2). Se figur 2A for skjematisk.
   4. Skyv pipetstempelet ned til første stopp med en jevn, flytende bevegelse for å injisere celle-/fibrinblandingen inn i vevskammeret. Se etter at gelen krysser helt gjennom kammeret.
      MERK: Bruk av for mye trykk under dette trinnet kan føre til sprengning av gelen inn i de mikrofluidiske kanalene på toppen og / eller bunnen av vevskamrene.
   5. Legg platen forsiktig flatt ned igjen i avtrekkshetten uten å fjerne pipettespissen, løsne pipettestempelet eller forstyrre pipetten. Bruk hånden til å vri og fjerne pipettespissen fra P20 og la den ligge i lasteporthullet. Ikke bruk ejektorknappen til å fjerne spissen, da dette vil føre til for mye trykk.
   6. Fortsett med trinn 3.4.1-3.4.5 for de gjenværende enhetene.
   7. Når lastingen er fullført, la platen sitte uforstyrret i 2 minutter i vevskulturhetten.
   8. Fjern pipettespisser ved å vri forsiktig og trekke dem fra lasteportene. Sett lokket på platen igjen.
   9. Inkuber hele platen i 15-20 minutter i en 37 ° C inkubator for å la gelen polymerisere helt.
   10. Etter inkubering, kontroller hver enhetsenhet under mikroskopet. Kontroller at cellene er jevnt fordelt over hele kammeret uten luftbobler, og at det er et godt synlig gelgrensesnitt mellom vevskammeret og de mikrofluidiske kanalene, som i figur 2B-C.
5. Kanalbelegg med laminin (Timer = begynner ved 45-50 min)
   1. Etter at gelene er helt faste, introduser laminin i mikrofluidiske kanaler for å fremme vaskulær anastomose.
   2. Bruk en P20 til å introdusere 4 μL laminin i hver mikrofluidiske kanal (topp og bunn) på enheten. Sett pipetspissen inn i M1 eller M3 og fjern laminininet sakte mens du ser på at lamininet dekker hele toppkanalen, og gjenta deretter for M2 eller M4 for å belegge hele bunnkanalen.
   3. Bestem retningen ved å pipetere laminin fra motsatt side av trykkregulatoren for å tillate tilstrekkelig trykk til å presse den gjennom. Men hvis laminin ikke beveger seg lett fra den ene siden, fjern spissen fra den ene siden og skyv laminininet fra den andre siden. Det kan være nødvendig å gå til andre stopp på pipetten (dvs. presse stempelet helt ned) for å generere tilstrekkelig trykk til å presse laminininet gjennom hele kanalen.
   4. Fjern spissen forsiktig fra medieinntaket/utløpet. Ikke bruk utløserknappen på P20.
   5. Gjenta trinn 3.5.1-3.5.4 for hver enhet og inkuber platen ved 37 °C, 5% CO₂ i 10 minutter.
6. Medietillegg (tidtaker = begynn på ca. 1 t 10 min)
   1. Tilsett 275 μL EGM2 komplette medier i de frakoblede mediereservoarene til brønner i rad A og B eller G og H. Dette vil være høysiden, og orienteringen bør bestemmes ved å gjøre brønnene på siden motsatt trykkregulatoren høyt volum for å starte. Media vil bli presset fra den høye siden av tyngdekraften.
   2. Bruk en P200-pipette til å innføre 75 μL medier i de mellomstore innløpene/utløpene til brønnene som inneholder 275 μL EGM2. Sett spissen inn i medieinnløpshullet og sakte utvis mediet, og se at mediet beveger seg gjennom kanalen og bobler opp på den andre siden.
   3. Fjern pipetspissen og skyv det gjenværende mediet fra spissen inn i mediebeholderen slik at totalvolumet på høysiden er 350 μL.
   4. Gjenta trinn 3.6.1–3.6.3 for hver enhetsenhet, topp- og bunnkanal.
   5. Tilsett 50 μL medier for å dekke den lave siden helt, brønnene i rad A og B eller G og H, avhengig av retningen beskrevet ovenfor. Sørg for at det er et jevnt lag med medier som dekker bunnen av brønnen. Se figur 2D for et skjema som viser mediemengder i reservoarene.
7. Fjerning av luftbobler (etter innlasting)
   MERK: Fjerning av bobler er et kritisk trinn for å sikre riktig flyt i hver enhet. Ved dag 2 vil endotelceller og fibroblaster begynne å strekke seg ut som respons på strømning (figur 2E).
   1. Når alle medier er tilsatt, inkuber platene i 1-2 timer i en 37 °C, 5% CO₂ -inkubator før du sjekker for luftbobler i kanalene eller ved mediuminnløpene / utløpene.
   2. Visualiser bobler i mediekanalene på mikroskopet og fjern ved å gjeninnføre 75 μL medier i kanalene for å skyve boblene ut.
   3. Visualiser bobler i middels innløp / utløp ved øye. Bruk en P200-pipette til å fjerne luftbobler fanget ved middels innløp og utløp ved å skyve stempelet ned, føre spissen inn i hullet og trekke boblen ut ved å løfte stempelet for å påføre undertrykk og suge opp boblen.

Figur 2. Skjematisk av lasting av enheten. (A) Ved hjelp av en P20-pipette føres celle-/fibrinblanding inn i vevskammeret til hver enhetsenhet via en av lasteportene. (B) Brightfield-mikrografi viser en mikrofluidisk enhet lastet EC, fibroblaster og kreftceller for å danne en VMT. Skalastang = 500 μm. (C) Fluorescensmikrografi av enheten i B som viser EC i rødt, tumor i cyan og fibroblaster i blått. (D) Skjemaet viser tilsetning av medium i reservoarene, med 350 μL på høysiden og 50 μL på den lave siden for å generere det hydrostatiske trykkhodet. (E) Dag 2 av VMT-kultur viser fibroblaster og EC som begynner å strekke seg ut for å danne det vaskulære nettverket. Skala bar = 200 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

4. Enhetsvedlikehold og eksperimentelle applikasjoner

1. Vedlikehold og medikamentell behandling
   MERK: For å opprettholde strømningen i systemet må hydrostatisk trykk gjenopprettes daglig ved å pipetere medievolumet fra den lave siden tilbake til høysiden eller omvendt, slik at det totale volumet på høysiden forblir på 350 μL. Strømningsretningen endres hver dag etter dag 2 av VMO eller VMT-etablering. Ytterligere vedlikeholds- og behandlingsdetaljer er gitt nedenfor.
   1. Bytt medier annenhver dag med EGM2 komplett til vaskulaturen er fullt etablert (dag 5-6). Aspirer gamle medier helt og bytt ut høytrykksbrønner (350 μL) og lavtrykksbrønner (50 μL).
      MERK: Eksperimentell bestemmelse av optimaliserte medieformuleringer kan utføres for andre celletyper, ofte med en 50:50-blanding eller tilsetning av spesifikke komponenter i EGM2.
   2. Når det vaskulære nettverket er dannet og vevet er fullt utviklet (dag 4-7), utfør en dextranperfusjonstest før du bruker enhetene til eksperimenter (trinn 4.2.1.). Bruk bare enheter som har tilstrekkelig perfusjon i vevkammeret.
   3. For eksperimenter med terapeutika, den dagen behandlingen begynner, ta bilder i alle fluorescerende kanaler for hver enhet. Dette vil fungere som en grunnlinje.
   4. Behandle enheter med ønsket terapeutisk ved å erstatte mediet med friskt medium som inneholder det fortynnede legemidlet ved ønsket konsentrasjon. Sørg for at legemidler fortynnes i egnede kjøretøy avhengig av produsentens anbefaling, men ikke overskrider 0,01 % DMSO i mediet.
   5. Utsett enheter til stoffet i ønsket tid (vanligvis 48 timer, men kan informeres av farmakokinetikk).
   6. Avbilde hver kanal i hvert apparat med ønsket tidsintervall for å overvåke behandlingsresponsen. Vedlikehold platene som angitt i trinn 4.1.1 så lenge eksperimentet varer.
   7. Når eksperimentet er fullført, blekeplater og plasser i en biohazard-beholder, fikser du med 4% PFA for immunfluorescerende farging (trinn 4.3.), eller høsting for levende celle- eller RNA-isolasjon (trinn 4.4.).
2. Perfusjonsanalyser
   1. Perfusjon av dextran
      MERK: Vaskulær permeabilitet/patency kan bestemmes ved å perfusjonere det vaskulære nettverket med fluorescerende merket dextran med varierende molekylvekt (40 kD, 70 kD eller 150 kD). FITC- eller rhodamin-dextran kan brukes avhengig av fluorescerende etikett av EC.
      1. Før perfusjon bestemmes riktig eksponering av FITC- eller rhodaminkanalen ved å tilsette noen få μL dextran i den fluidiske kanalen eller kammeret til en tom enhet. Still inn eksponeringstiden rett under metningsnivået ved bruk av mikroskopprogramvare for å vise et histogram av pikselintensiteter, noe som sikrer et dynamisk område preget av jevnt fordelte piksler uten nevneverdig konsentrasjon av høyintensitetsverdier.
      2. Ta mikrografer av alle enheter i kanaler av interesse, inkludert et bakgrunnsbilde av alle enheter i den fluorescerende dextrankanalen, for å kalibrere mot bakgrunnen. Bruk samme eksponering som angitt ovenfor, og juster vevskammeret i midten av bilderammen for å sikre konsistente bilder for kvantifisering.
      3. Forbered et hovedlager av FITC-dextran eller rhodamine-dextran i en konsentrasjon på 5 mg / ml i 1x DPBS. Denne skjeftet kan oppbevares ved 4 °C.
      4. For å forberede et arbeidslager, fortynn 5 mg / ml lager til en endelig konsentrasjon på 50 μg / ml i EGM2.
      5. Bytt ut mediet i reservoarene med den fortynnede dextranoppløsningen som halvt maksimalt volum (175 μL i en brønn som den høye siden på toppen eller bunnen av vevkammeret). Bytt ut mediet i de andre brønnene slik at den frakoblede høysiden får 175 μL fersk EGM2 uten dextran, og brønnene på den lave siden bare har 50 μL i hver.
         MERK: Dextran bør bare legges til den ene siden av de mikrofluidiske kanalene (topp eller bunn) for å tillate visualisering av fargestoff som beveger seg gjennom høytrykkssiden, inn i vaskulærsengen og ut lavtrykkssiden.
      6. Under mikroskopet, se etter fluorescerende dextran å strømme gjennom det vaskulære nettverket. Dette vil vanligvis skje innen ca. 2 minutter etter tilsetning av fargestoffet til mediereservoaret.
      7. Begynn å avbilde den fluorescerende dekstrankanalen (og andre kanaler, hvis ønskelig). Dette er T = 0 tidspunkt. Ta flere bilder på flere tidspunkter (vanligvis hvert 10. minutt) eller ett enkelt sluttpunktbilde.
   2. Perfusjon av celler
      MERK: Ulike celletyper kan perfuseres gjennom vaskulaturen avhengig av studiedesign, inkludert lymfocytter eller makrofager for kreftimmunologistudier, samt kreftceller for metastasestudier. Celler må være fluorescerende merket for å lette sporing over tid.
      1. Minst 2 timer før perfusjonsceller, utfør dextranperfusjon på alle enheter som beskrevet ovenfor. Dette trinnet er viktig for å bestemme vaskulær patency før du legger til celler.
      2. Bestem passende kameraeksponering for cellene som skal perfunderes. Ta en liten prøve av celler for å se under mikroskopet og angi eksponeringstiden for den fluorescerende markøren. Still inn eksponeringstiden rett under metningsnivået.
      3. Ta mikrografer av alle enheter i kanaler av interesse, inkludert et bakgrunnsbilde av alle enheter i den fluorescerende dextrankanalen, for å kalibrere mot bakgrunnen. Bruk samme eksponering som angitt i trinn 4.2.2.1.
      4. Bekreft at dextran har diffundert helt ut av vevskamrene før cellene høstes til perfusjon. Høst og telle cellene av interesse.
      5. Resuspendere celler med passende tetthet i EGM2. For eksempel blir T-celler vanligvis tilsatt ved ca. 1 x 10⁶ celler / ml for å etterligne konsentrasjonen i blod.
         MERK: EC er følsomme for mediesammensetning, men tåler opptil 50% blanding med de fleste andre medier. Test på forhånd.
      6. Tilsett 175 μL cellesuspensjon i en brønn på høysiden av hver enhet og tilsett 175 μL EGM2 komplett til den andre brønnen. På den lave siden tilsettes 50 μL EGM2 komplette medier til begge brønnene.
      7. Under mikroskopet, se etter fluorescerende celler å strømme gjennom det vaskulære nettverket. Dette vil vanligvis skje innen ca. 2 minutter etter tilsetning av cellene i mediereservoaret.
      8. Når cellestrømmen er etablert, begynner du å avbilde den fluorescerende cellekanalen (og andre kanaler, hvis ønskelig). Dette er T = 0 tidspunkt. Ta flere bilder på flere tidspunkter eller et enkelt sluttpunktbilde, avhengig av studiedesignet. For eksempel vil avbildning hvert 10. minutt resultere i høyoppløselige tidskurs eller hver 6-12 h for å spore periodiske cellebevegelser.
3. Immunfluorescerende (IF) farging
   1. Aspirer medier fra brønner. Tilsett 200 μL 4% PFA til begge brønnene på høysiden av hver enhetsenhet og 50 μL til den lave siden. La PFA strømme gjennom kamrene i 15 minutter ved romtemperatur eller 30 minutter ved 4 °C.
   2. Under inkubasjonen, lag en 24-brønnplate med 500 μL 1x PBS per brønn. Beregn hvor mange brønner som trengs for å flekke hver enhet.
   3. Fjern PFA helt fra brønner. Snu platen opp ned og fjern forsiktig plastunderlaget på membranen.
      MERK: Hvis farging også kan utføres in situ uten å fjerne membranen og enheten. For å gjøre det, utfør fargetrinn ved å perfusere reagenser gjennom VMO / VMT og øke varigheten av hvert inkubasjonstrinn med omtrent 6 ganger.
   4. Riv forsiktig og forsiktig det nederste membranlaget av funksjonslaget på enheten for å eksponere vevskamrene ved å gripe begge hjørnene og trekke ned i en langsom og jevn bevegelse. Det meste av vevet skal forbli i vevkammeret. Se figur 3A.
   5. Bruk et barberblad eller skalpell for å påføre tilstrekkelig kraft til å skjære helt gjennom funksjonslaget og skjær et lite rektangel rundt hver enkelt enhetsenhet, som vist i figur 3B.
   6. Kil en slikkepott mellom fondilaget og brønnplaten. Påfør et lett trykk under støttelaget for forsiktig å fjerne hele fondelaget som inneholder vevkammeret fra brønnplaten.
   7. Plasser hvert rektangulære PDMS-lagstykke som inneholder vevet med forsiden ned i en enkelt brønn som inneholder PBS.
   8. Når alle enhetene er i brønner, vask med PBS ved å plassere platen på en mild vippe i 5 minutter, aspirere PBS fra brønnen og erstatte den med 500 μL fersk PBS. Gjenta i totalt 3 vasker.
   9. Aspirer PBS fra hver brønn og permeabiliser vev med 500 μL 0,5% Triton-X i PBS, 2x i 10 minutter hver på en mild rocker. Fjern permeabiliseringsoppløsning.
   10. Blokker i 500 μL 10% serum i 0,1% Triton-X per enhet i 1 time ved romtemperatur med forsiktig gynging.
   11. Fortynn primære antistoffer i 3% serum i 0,1% Triton-X til ønsket konsentrasjon og volum. Fjern blokkeringsløsningen og tilsett nok primær antistoffløsning for å dekke bunnen av hver brønn helt og tillate fri bevegelse av enhetens vev (~ 200 μL). Dekk platen med en gjennomsiktig film.
   12. Inkuber platen som gynger over natten ved 4 °C. Neste dag, ta tallerkenen som inneholder enhetens vev tilbake til romtemperatur (~ 15 min).
   13. Aspirer primær antistoffoppløsning fra hver brønn og vaskekamre med 500 μL PBS, 3x i 5 minutter hver på en mild vippe.
   14. Tilsett 200 μL sekundært antistoff i 3% serum i 0,1% Triton-X ved ønsket konsentrasjon. Inkuber platen med forsiktig gynging i 1 time ved romtemperatur i mørket.
   15. Aspirer sekundær antistoffoppløsning og vask med PBS, 3x i 5 min hver med forsiktig gynging. Legg til en løsning på 1x DAPI i 0.1% Triton-X i 10 minutter mens du gynger i mørket.
   16. Fjern rektangulære enhetsutskjæringer som inneholder farget vev fra platen ved hjelp av pinsett og legg vevssiden opp på et papirhåndkle.
   17. Pipett noen få μL (~10 μL) antifadeoppløsning direkte på hvert kammer og dekkslipp, og pass på at boblene ikke introduseres. La antifade herde på kamre over natten ved romtemperatur i mørket, og fortsett deretter med avbildning.
4. Vevs- og celleisolering for molekylære analyser
   MERK: Hver plate med høy gjennomstrømning vil inneholde omtrent 1-2 x 10⁵ celler, avhengig av innhøstingstidspunktet. Skaler antall eksperimentelle replikater for å ta hensyn til totale celler samt potensielt tap under høsting.
   1. Encelleanalyser
      1. Aspirer medier fra hver brønn og inverter platen med høy gjennomstrømning slik at enhetslaget vender oppover.
      2. Fjern plastunderlaget på membranen. Fjern PDMS-bunnmembranen veldig forsiktig og forsiktig av funksjonslaget på enheten for å eksponere vevskamrene ved å gripe i begge hjørnene og trekke ned i en langsom og jevn bevegelse.
      3. Membranen kan fjernes selv med riktig liming. Det meste av vevet skal forbli i vevkammeret etter fjerning av membranen; Men hvis noen del sitter fast på membranen, følg trinnene nedenfor på selve membranen.
      4. Vask hver enhet med 500 μL HBSS eller PBS. Til hver enhetsenhet, tilsett 100 μL dissosiasjonsreagens og la den sitte som en dråpe på toppen av enheten. Sett platen tilbake i 37 °C inkubatoren i 5 min.
      5. Etter fordøyelsen, bruk en P200-pipette til å pipe opp og ned over vevskamrene og samle vevene i dissosiasjonsreagenset. Beveg pipetspissen frem og tilbake over hver enhet for å sikre full fjerning av vevet og samle inn i en 15 ml konisk med 500 μL EGM2 for å nøytralisere dissosiasjonsreagenset.
      6. For fullstendig fjerning av gjenværende celler fra vevkammeret, tilsett 500 μL EGM2 til hver enhetsenhet og vask med en P200-pipette.
      7. Sentrifuger fordøyelsesløsningen som inneholder det løsrevne vevet ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C for å pelletsere enkeltceller og hele vev.
      8. Forsiktig aspirer mediet og tilsett 500 mikrol 1 mg/ml (200 U/ml) kollagenase type IV, 0,1 mg/ml hyaluronidase type V og 200 U/ml DNAse type IV i HBSS til vevet.
      9. Etter skånsom resuspensjon, la oppløsningen sitte i 2 minutter ved romtemperatur før du pipetterer forsiktig igjen for å dissosiere gelen.
      10. Bland fordøyelsen med 10 ml EGM2 og sentrifuge ved 300 x g i 5 minutter ved 4 °C. Resuspender celler i 1x DPBS med 1% BSA eller HSA og pass gjennom et forfuktet 70 μm filter ved å spinne ved 200 x g i 1 min.
      11. Telle cellene og juster volumet slik at den endelige konsentrasjonen er 1000 celler per μL. Cellulære suspensjoner kan deretter bli utsatt for FACS, flowcytometri eller enkeltcelle RNA-sekvensering.
   2. RNA-isolasjon fra hele vev
      1. Følg trinn 4.4.1.1 og 4.4.1.2 ovenfor.
      2. Legg til ca. 10 μL RNA-lysisbuffer på hvert eksponerte vevskammer, slik at bufferpooler direkte på toppen av vev. Ikke bruk mer enn 100 μL RNA-lysisbuffer totalt.
      3. Inkuber i 3 minutter ved romtemperatur. Bruk P20 til å pipe opp og ned på hver enhetsenhet, og bruk pipetspissen til å skrape eventuelt gjenværende materiale fra vevkammeret om nødvendig.
      4. Overfør så mye lysisbuffer som mulig til et 1,5 ml mikrosentrifugerør. Gjenta trinn 4.4.2.2.-4.4.2.3. for gjenværende enheter og bassengprøver i 1,5 ml røret.
      5. Følg produsentens instruksjoner for isolering av RNA, avhengig av settet eller reagensene.

Figur 3. Forbereder plattform for immunfarging. (A) Skjematisk fremstilling av ferdig montert enhetsplattform med membranlag på toppen. For å fjerne membranen, trekk forsiktig hvert hjørne av det ytre laget ned i en jevn, forsiktig bevegelse. (B) Når membranlaget er fjernet helt, bruk et blad, skalpell eller kniv til å kutte rektangler rundt vevkammeret til hver enhetsenhet, og pass på at du ikke kutter i selve vevet. En slikkepott kan deretter klemmes under hvert rektangel for å løsne den fra platen og plassere hver enhet i en enkelt brønn på en 24-brønns plate med PBS for farging. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Representative Results

Etter protokollene som er skissert her, ble VMOer og VMTer etablert ved hjelp av kommersielt kjøpt EC, NHLF og, for VMT, den trippel-negative brystkreftcellelinjen MDA-MB-231. Etablerte VMOer ble også perfusert med kreftceller for å etterligne metastase. I hver modell, på dag 5 av samkultur, monterer et vaskulært nettverk seg selv som respons på tyngdekraftdrevet strømning over vevskammeret, og tjener som en kanal for in vivo som levering av næringsstoffer, terapeutiske midler og kreft eller immunceller til stromalnisjen (figur 4). VMO ble først etablert ved å introdusere mCherry-merket EC i vevskammeret, som vist i figur 4A (dag 0 i kultur), med en jevn fordeling av celler. På dag 2 av VMO-kulturen begynner EC å strekke seg ut og lumenisere (figur 4B), og ved dag 4 har EC anastomosert med de ytre mikrofluidiske kanalene og danner et kontinuerlig vaskulært nettverk (figur 4C). Etter at vaskulaturen dannet anastomoser og kantet de ytre kanalene, ble VMO-vev perfusert med 70 kD FITC-dextran for å bekrefte vaskulær patency (figur 4D). FITC-dextran ble introdusert i mediereservoaret med høyest hydrostatisk trykk og fikk perfusere over vevskammeret via mikrokar fra høytrykkssiden til lavtrykkssiden, som indikert av pilene. I VMO gjennomsyret FITC-dextran det mikrovaskulære nettverket fullstendig innen 15 minutter med minimal vaskulær lekkasje, noe som bekreftet tett vaskulær barrierefunksjon (figur 4E). MDA-MB-231-celler ble deretter perfusjonert til VMO, hvor celler festet seg til endotelforingen (figur 4F) og ekstravaserte inn i det ekstravaskulære rommet innen 24 timer etter perfusjon, og dannet flere mikrometastaser i vevskammeret (figur 4G). Time-lapse mikroskopiske fluorescerende bilder ble tatt hver 50. ms med 4x og 10x luftmål på et invertert konfokalmikroskop for å observere kreftceller perfusing gjennom mikrovaskulaturen i sanntid (Supplementary Video 1, Supplementary Video 2).

I VMO kan man se T-celler ekstravasere ut i det ekstracellulære rommet i løpet av 45 minutter (figur 4H-I). Time-lapse fluorescerende mikrografer ble tatt på et konfokalmikroskop for å oppnå en z-stabel på 150 μm dybde hvert 15. minutt for å observere T-celleekstravasasjon i sanntid (tilleggsvideo 3). Som vist i figur 4J ble MDA-MB-231 VMT med fullt dannede, ikke-lekkende kar perfusert med T-celler (gul), hvorav mange raskt festet seg til vaskulærveggen (pilspisser; Figur 4K, tilleggsvideo 4, tilleggsvideo 5). Disse resultatene, i tillegg til tidligere studier 8,9,10,11,12,13,14,15, demonstrerer nytten av VMO og VMT-plattformene for henholdsvis immunologi og immun-onkologisk forskning.

Figur 4. Representative resultater for MDA-MB-231 VMT og VMO. (A) VMO på dag 0 umiddelbart etter lasting av celler i vevskammeret. EC er vist i rødt. Skala bar = 500 μm. (B) Ved dag 2 av VMO-kultur begynner EC å strekke seg som svar på strømning. (C) VMO dag 4 viser at det vaskulære nettverket er anastomosert med de ytre mikrofluidiske kanalene, og karene er nesten modne. (D) VMO-nettverk er fullt ut perfundert og patent på dag 5 av kulturen. Fartøy vist i rødt, 70 kD FITC-dextran grønt. Strømningsretningen er indikert med piler. Skala bar = 500 μm. (E) Zoomvisning av perfusert VMO. Skalastang = 100 μm. (F) MDA-MB-231 (cyan) perfuseres gjennom det samme VMO-nettverket som er vist i E, og på tidspunkt 0 har kreftceller festet seg til endotelkarets foring (pilspisser). Skalastang = 100 μm. (G) Ved 24 timer har MDA-MB-231-celler ekstravasert inn i det ekstracellulære rommet, og etablert flere mikrometastaser i den vaskulære nisjen. Skalastang = 100 μm. (H) Time-lapse konfokal fluorescerende mikroskopi avslører T-celleekstravasasjon gjennom et mikrokar i VMO (I) i løpet av 45 minutter. Pilspisser angir områder med ekstravasasjon. Skala bar = 50 μm. (J) Trippel-negativ brystkreftcellelinje MDA-MB-231 er etablert i VMT og perfusert på dag 5. Skala bar = 500 μm. Det vaskulære nettverket viser minimal lekkasje 15 min etter perfusjon (innfelt, skala bar = 100 μm). (K) MDA-MB-231 VMT (samme som i B) perfuseres med T-celler (gul), med flere områder av T-celleadherens til vaskulærveggen (pilspisser). Skala bar = 500 μm. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Supplerende video 1. Perfusjon av eggstokkreftceller i VMO. Time-lapse fluorescerende mikroskopi av COV362 celler (cyan) perfusert gjennom et vaskulært nettverk (rødt) og avbildet ved 4x objektiv hver 50 ms i 1 min. Klikk her for å laste ned denne videoen.

Supplerende video 2. Perfusjon av trippel-negative brystkreftceller i VMO. Time-lapse fluorescerende mikroskopi av MDA-MB-231 celler (cyan) perfusert gjennom et vaskulært nettverk (rødt) og avbildet ved 10x objektiv hver 50 ms i 30 s. Klikk her for å laste ned denne videoen.

Supplerende video 3. T-celle perfusjon av VMO. Time-lapse konfokal fluorescerende mikroskopi fanget prosessen med T-celle ekstravasasjon gjennom et mikrofartøy i VMO over en 45 min varighet. Z-stack-bilder ble tatt hvert 15. minutt, med en trinnstørrelse på 2 μm og en dybde på 150 μm. Fartøyet er rødt, T-celler er gule. Klikk her for å laste ned denne videoen.

Supplerende video 4. T-celle perfusjon av VMT. Time-lapse fluorescerende mikroskopi av T-celler perfusert gjennom MDA-MB-231 VMT ved 4x objektiv. Bilder ble tatt hver 50 ms i 30 s. T-celler er vist i gult, MDA-MB-231 i cyan og kar/EC i rødt. Klikk her for å laste ned denne videoen.

Supplerende video 5. Zoom-visning av T-celle-VMT-perfusjon. Forstørret 10x visning av MDA-MB-231 VMT perfusert med T-celler (fra tilleggsvideo 4). Bilder ble tatt hver 50 ms i 30 s. T-celler er vist i gult, MDA-MB-231 i cyan og kar/EC i rødt. Klikk her for å laste ned denne videoen.

Discussion

Nesten hvert vev i kroppen mottar næringsstoffer og oksygen gjennom vaskulaturen, noe som gjør den til en kritisk komponent for realistisk sykdomsmodellering og legemiddelscreening in vitro. Videre er flere maligniteter og sykdomstilstander definert ved vaskulær endoteldysfunksjon og hyperpermeabilitet³. Spesielt i kreft er tumorassosiert vaskulatur ofte dårlig perfusert, forstyrret og lekk, og virker dermed som en barriere for terapeutisk og immuncellelevering til svulsten. Videre fungerer vaskulatur som en kanal gjennom hvilken kreftceller kan metastasere til frø fjernt vev og letter cellecellekommunikasjon som demper immunresponsen samtidig som den fremmer kreftcellevekst og spredning. Disse fenomenene fremhever den avgjørende rollen den vaskulære nisjen spiller i terapeutisk resistens og kreftprogresjon og behovet for nøyaktig modellering av tumormikromiljøet under preklinisk studie. Likevel klarer ikke standard in vitro-modellsystemer å inkludere passende stromale og vaskulære komponenter eller innlemme dynamiske strømningsforhold. For å løse disse manglene i dagens modellsystemer ble metoder for å etablere et godt karakterisert mikrofysiologisk system som støtter dannelsen av en levende, perfundert human mikrotumor (VMT) for fysiologisk onkologisk forskning presentert. Det er viktig at VMT modellerer nøkkelegenskaper ved avvikende tumorassosierte kar og tumor-stromale interaksjoner, noe som gjør den ideell for biomimetisk sykdomsmodellering og terapeutisk effekttesting¹⁰.

For enkel bruk krever plattformen ingen eksterne pumper eller ventiler, og på grunn av plateformatet på 96 brønner kan den tilpasses standard kulturutstyr og arbeidsflyt. Videre har forskjellige enhetsiterasjoner for å løse forskjellige biologiske spørsmål og etablerte vevs- og pasientspesifikke rom blitt validert 8,9,10,11,12,13,14,15,16,17 . Mens plattformen kan tilpasses praktisk talt enhver organ- eller vevsspesifikk bruk ved å integrere forskjellige celletyper, må cellene først testes for vekst og vaskulogen kapasitet i VMO / VMT ved varierende cellekonsentrasjoner for å bestemme optimal såtetthet og samkulturforhold. For å etablere vaskulaturen kan humane endotelkolonidannende endotelceller (ECFC-EC) kjøpes kommersielt eller ferskt isolert fra navlestrengsblod ved å velge CD31+-celler. Humane navlestrengendotelceller (HUVEC) kan også brukes til å etablere vaskulatur i VMO / VMT og kan enten kjøpes kommersielt eller nylig isolert fra navlestrengene. I tillegg har induserte pluripotente stamcelleavledede endotelceller (iPSC-EC) blitt vellykket testet i plattformen, noe som åpner muligheten for et helt autologt system¹⁸. Kommersielt avledede fibroblaster (standard, normale humane lungefibroblaster for deres vaskulogene potensial) fungerer godt i VMO / VMT, og noen primære avledede stromalcellepopulasjoner kan også innlemmes eller erstattes. Primær-avledede svulster kan innføres i VMT som enkeltceller, sfæroider, organoider, eller tumor biter. Matrisesammensetningen kan modifiseres i henhold til eksperimentelle behov, inkludert spiking med kollagen, laminin, fibronektin eller til og med decellulariserte vevsmatriser¹⁹.

Protokollen inneholder flere kritiske trinn der spesiell forsiktighet er avgjørende for å unngå vanlige problemer (figur 5). Under lasting må du sørge for homogen blanding av cellen/fibrinoppslemmingen ved forsiktig pipettering og jevn innføring i vevskammeret (figur 5A). Påfør riktig trykk for å drive gelen helt ut i kammeret for å forhindre delvis belastning (figur 5B). Visualisering av cellen / fibrinoppslemmingen som krysser hele vevkammeret er nødvendig for å sikre fullstendig kammerfylling og kan forenkles ved å plassere en hansket finger bak enheten. Unngå å trykke for hardt på mikropipettestempelet for å hindre at cellen/fibrinblandingen sprekker opp i de mikrofluidiske kanalene (figur 5C). Forsiktighet må utvises for ikke å introdusere luftbobler under pipettering for å forhindre interferens med vevsutvikling og nedstrøms applikasjoner (figur 5D). Riktig blandings- og lastehastighet er avgjørende for å unngå områder med inkonsekvent koagulering (figur 5E), mens fjerning av pipettespissen for tidlig også kan forstyrre gelen i kammeret (figur 5F). Øvelsesbelastninger anbefales for å gjøre brukerne kjent med det tidsbestemte elementet i prosedyren og lastetrinnet. Videre er riktig innføring av laminin i de mikrofluidiske kanalene avgjørende for EC-migrasjon, anastomose med ytre kanaler og dannelsen av et kontinuerlig, parfymerbart nettverk for næringstilførsel. Ufullstendig eller fraværende kanalforing vil føre til dårlige perfusjonsresultater og ubrukelig VMO / VMT.

Figur 5. Vanlige feil med lasting. (A) Enhet for mikrofluidisk enhet som er riktig lastet uten defekter. (B) Celle/fibrinblanding ble ikke ført helt inn i kammeret, noe som resulterte i delvis belastning. (C) For mye trykk påføres under lasting, noe som resulterer i at gel sprenger inn i den mikrofluidiske kanalen, blokkerer strømningen. (D) Luftbobler føres inn i cellen/fibrinblandingen i kammeret under pipettering. (E) Feil blanding av cellen / fibrinblandingen eller langsom belastning som forårsaker inkonsekvenser i koagulering. (F) Hvis pipettespissen fjernes fra lasteporten før gelen er tilstrekkelig innstilt, vil det føre til forstyrrelse av celle-/fibrinblandingen i vevskammeret. Klikk her for å se en større versjon av denne figuren.

Robuste og standardiserte arbeidsflyter for analyse er avgjørende i VMO/VMT-studier, da de genererer betydelige mengder bildedata. Bildebehandling og analysemetoder for VMO/VMT er tidligere beskrevet 8,9,10,11,12,13. For tumorkvantitativ analyse måles den fluorescerende intensiteten i fargekanalen som representerer tumorcellene ved hjelp av åpen kildekode-programvare som ImageJ / Fiji (National Institute of Health) ²⁰ eller CellProfiler (Broad Institute) ²¹. Terskelen for tumormikrografiske bilder er satt til å velge det fluorescerende tumorområdet, og den gjennomsnittlige fluorescensintensiteten måles innenfor denne regionen. Tumorens totale fluorescerende intensitet beregnes som produktet av det fluorescerende området og dets gjennomsnittlige intensitet, normalisert til baselineverdier (forbehandling) for å oppnå foldendringen i tumorvekst per enhet over den eksperimentelle perioden. Når det gjelder kvantitativ analyse av fartøy, kan AngioTool (National Cancer Institute)²², ImageJ/Fiji makroskript eller MATLAB-programvare, for eksempel REAVER²³, brukes til å kvantifisere total fartøylengde, antall endepunkter, antall kryss, gjennomsnittlig fartøylengde, fartøydiameter, gjennomsnittlig lacunaritet og fartøyprosentområde. Maskinlæringsalgoritmer kan integreres i arbeidsflyter for automatisk analyse av vaskulære bilder for å identifisere forbindelser som effektivt forstyrrer vaskulaturen²⁴. Perfusjonsbilder analyseres ved å måle endringen i fluorescensintensitet i regioner i det ekstracellulære rommet og beregne permeabilitetskoeffisienten¹⁰. Elementsimuleringer av intraluminal strømning i et mikrovaskulært nettverk kan utføres ved hjelp av COMSOL Multiphysics²⁵. Implementering av standardiserte analysemetoder er avgjørende for å trekke ut meningsfull innsikt fra den enorme mengden data som genereres i VMT-studier.

Protokollen som er skissert her, vil tillate brukeren å utnytte VMO / VMT-plattformen for å studere mange aspekter av tumorbiologi, inkludert tumorvekst / progresjon, tumormetastase, intratumor T-celledynamikk og tumorrespons på kjemoterapi og antiangiogen behandling. For å muliggjøre fysiologisk relevante immunonkologistudier ble det demonstrert hvordan ferskt isolerte T-celler perfusjonerer gjennom mikrovaskulaturen, ekstravaserer over endotelcellebarrieren og migrerer inn i vevskonstruksjonen. Time-lapse-mikroskopisk konfokal avbildning ble presentert som et verktøy for å se romlig tilfeldige, temporalt raske hendelser, inkludert T-celleekstravasasjon, som ikke lett visualiseres med andre modellsystemer. I tillegg har vi tidligere testet flere typer antineoplastiske legemidler i VMT, inkludert kjemoterapeutika, småmolekylære / tyrosinkinasehemmere, monoklonale antistoffer (som anti-PD1 og bevacizumab), anti-angiogene forbindelser og vaskulære stabiliseringsmidler, og understreker hvordan plattformen kan brukes til å teste forskjellige klasser av legemidler rettet mot både svulsten og tilhørende stroma^8, 9,10,11,12,13. Avløpsvann kan hentes fra plattformen og analyseres for forskjellige cytokiner samt eksosomer. I fremtidige studier kan VMT-plattformen brukes til å vurdere følsomheten til tumorceller til T-cellemediert angrep på individuelt pasientnivå. Avslutningsvis er VMT en fleksibel og kraftig plattform og en som er ideell for å studere tumorbiologi, hvor remodellering av vaskulære og stromale komponenter er nøkkelen til tumorprogresjon.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Fabrication
(3-Mercaptopropyl)trimethoxysilane, 95%	Sigma-Aldrich	175617-100G
Greiner Bio-One μClear Bottom 96-well Polystyrene Microplates	Greiner Bio-One	655096
Methanol ≥99.8% ACS	VWR Chemicals BDH	BDH1135-1LP
MILTEX Sterile Disposable Biopsy Punch with Plunger, 1mm diameter,	Integra Miltex	33-31AA-P/25
PDMS membrane	PAX Industries	HT-6240
Plasma Cleaner PDC-001	Harrick Plasma	N/A
Smooth-Cast 385	Smooth-On	N/A
SP Bel-Art Lab Companion Clear Polycarbonate Cabinet Style Vacuum Desiccator	Bel-Art	F42400-4031
Standard Lids with Condensation Rings, 96-well plate	VWR	82050-827
SYLGARD 184 Silicone Elastomer Kit (PDMS)	Dow	4019862
Cell culture/Loading
BioTek Lionheart FX Automated Microscope	Agilent	CYT5MFAW
CELLvo Human Endothelial Progenitor Cells	StemBioSys	N/A
Collagen I, rat tail	Enzo Life Sciences
Collagenase from Clostridium histolyticum (type 4)	Sigma-Aldrich	C5138
Corning Hank’s Balanced Salt Solution, 1X without calcium and magnesium	Corning	21-021-CV
Corning DMEM with L-Glutamine, 4.5g/L Glucose and Sodium Pyruvate	Corning	10013CV
DAPI	Sigma-Aldrich	D9542
DPBS, no calcium, no magnesium	Gibco	14190144
EGM-2 Endothelial Cell Growth Medium-2 BulletKit	Lonza	CC-3162
Fibrinogen from bovine plasma	Neta Scientific	SIAL-341573
Fibronectin human plasma	Sigma-Aldrich	F0895
Fluorescein isothiocyanate–dextran (70kDa)	Sigma-Aldrich	FD70S-1G
Gelatin from porcine skin	Sigma-Aldrich	G1890
Hyaluronidase from sheep testes (type 4)	Sigma-Aldrich	H6254
Laminin Mouse Protein	Gibco	23017015
Leica TCS SP8	Leica	N/A
MDA-MB-231	ATCC	HTB-26
NHLF – Normal Human Lung Fibroblasts	Lonza	CC-2512
Nikon Eclipse Ti	Nikon	N/A
Paraformaldehyde 4% in 0.1M Phosphate BufferSaline, pH 7.4	Electron Microscopy Sciences	15735-90-1L
PBMCs - Peripheral blood mononuclear cells	Lonza	CC-2702
PBS, pH 7.4	Gibco	10010049
Premium Grade Fetal Bovine Serum (FBS), Heat Inactivated	Avantor Seradigm	97068-091
ProLong Gold Antifade Mountant	Invitrogen	P10144
Quick-RNA Microprep Kit	Zymo Research	R1051
Thrombin from bovine plasma	Sigma-Aldrich	T4648
Triton X-100 (Electrophoresis),	Fisher BioReagents	BP151-100
TrypLE Express Enzyme (1X), phenol red	Gibco	12605028
Trypsin-EDTA (0.05%), phenol red	Gibco	25300062
Vasculife	Lifeline Cell Technology	LL-0003