방법 논문

인간 피하 지방 조직에서 지방 내피 세포/지방 세포 누화 연구

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DOI:

10.3791/66608

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2024년 4월 5일

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1Leeds Institute of Cardiovascular and Metabolic Medicine, University of Leeds

이 논문에서

요약

여기에서는 인간 피하 지방 조직(hSATMVECs)에서 미세혈관 내피 세포를 분리, 배양 및 표현형으로 분석하기 위한 프로토콜에 대해 설명합니다. 또한 hSATMVEC-지방 세포 누화의 실험 모델을 설명합니다.

초록

미세혈관 내피 세포(MVEC)는 혈관 긴장도 조절, 혈전증 조절, 혈관 신생 등 많은 중요한 역할을 합니다. 내피 세포(endothelial cell, EC) 유전자형과 표현형의 유의미한 이질성(heterogeneity)은 혈관층과 숙주 질환 상태에 따라 다릅니다. 조직 특이적 혈관 침대 및 개별 환자 그룹에서 MVEC를 분리할 수 있는 기능은 다양한 질병 상태에서 MVEC 기능을 직접 비교할 수 있는 기회를 제공합니다. 여기에서는 심장 이식형 전자 장치(CIED) 삽입 시 측정한 피하 지방 조직(SAT)을 사용하여 기능성 인간 피하 지방 조직 MVEC(hSATMVEC)의 순수 집단을 분리하는 방법과 hSATMVEC-지방 세포 누화의 실험 모델을 설명합니다.

hSATMVEC은 anti-CD31 항체 코팅된 마그네틱 비드로 배양하고 자성 컬럼을 통과하여 SAT의 효소 분해 후 분리했습니다. hSATMVEC을 젤라틴 코팅된 플레이트에서 성장시키고 통과시켰습니다. 실험은 2-4 단락의 세포를 사용했습니다. 세포는 적어도 5번 통과까지 EC 형태학의 고전적인 특징을 유지했습니다. 유세포 분석 결과 CD31+/CD144+/CD45-로 정의된 분리 hSATMVEC의 순도가 99.5%인 것으로 나타났습니다. 대조군에서 분리한 hSATMVEC은 약 57시간의 개체군 배증 시간을 가졌으며 세포 증식 이미징 키트를 사용하여 활성 증식을 확인했습니다. 인슐린 자극에 대한 반응과 혈관신생 튜브 형성 전위에 대한 반응을 사용하여 분리된 hSATMVEC 기능을 평가했습니다. 그런 다음 세포 누화를 연구하기 위해 hSATMVEC-피하 지방세포 공동 배양 모델을 구축하고 hSATMVEC가 지방세포 기능에 미치는 다운스트림 효과를 입증했습니다.

hSATMVEC은 CIED 삽입 시 측정한 SAT에서 분리할 수 있으며, hSATMVEC-지방세포 누화를 실험적으로 표현형으로 연구하고 연구하기에 충분한 순도를 가지고 있습니다.

서론

내피 세포(EC)는 혈관 벽의 내부 표면을 단층으로 둘러싸고 있는 편평 세포입니다. 혈관 긴장도 조절, 혈전증 조절, 염증 반응 조절, 혈관 신생 기여 등 많은 중요한 역할을 한다1. 심장 대사 생리학에서 내피 세포의 중요성을 감안할 때, 내피 세포는 병태 생리학에 대한 이해를 높이고 심장 대사 질환에 대한 새로운 약리학적 치료법을 조사하기 위해 실험적으로 자주 사용됩니다.

그러나 혈관층의 기원에 따라 내피세포 형태, 기능, 유전자 발현, 항원 조성 등에는 엄청난 이질성이 존재한다2. 큰 동맥의 내피 세포가 죽상동맥경화증 연구에 가장 적합하지만, 미세혈관 내피세포(MVEC)로 알려진 작은 혈관의 내피 세포가 혈관신생 연구에 더 적합합니다2. 내피 이질성에 대한 분자적 기초를 이해하면 혈관 침대 특이적 치료법에 대한 귀중한 통찰력을 얻을 수 있습니다. 미세혈관 내피 기능은 또한 당뇨병, 심혈관 질환 및 전신 감염을 포함한 수많은 질병에서 크게 다릅니다 3,4. 따라서, 정의된 환자군으로부터 내피세포를 분리할 수 있는 능력은 그들의 내피세포 기능과 세포의 누화를 직접 비교할 수 있게 한다5.

이 논문에서는 심장 이식형 전자 장치(CIED) 삽입 시 채취한 피하 지방 조직(hSATMVEC)에서 인간 MVEC를 분리하는 새로운 방법을 설명합니다. 피하 지방 조직(SAT)의 효소 분해 후 분리한 hSATMVEC을 성장시키고 젤라틴 코팅 플레이트에서 통과시켰습니다. 그런 다음 hSATMVEC에 성공적으로 적용된 다양한 표현형 분석을 설명하여 표현형을 검증하고 일상적인 내피 세포 분석에서의 사용을 입증합니다. 마지막으로, hSATMVECs-adipocyte cross-talk의 실험 모델에서 hSATMVECs의 적용에 대해 설명합니다.

프로토콜

기술된 기술에 사용된 인체 조직의 샘플은 Leeds Teaching Hospitals NHS Trust(Leeds, United Kingdom)에서 일상적인 임상 실습에 따라 가이드라인에 표시된 CIED 삽입을 받는 환자로부터 채취되었습니다. 연구 프로토콜은 다른 모든 문서와 함께 참가자 등록 전에 지역 윤리 위원회(11/YH/0291)의 승인을 받았습니다. 이 연구는 헬싱키 선언의 원칙에 따라 수행되었습니다.

1. 환자 집단

  1. 대흉근 위에 있는 SAT에서 CIED 이식 중 새로운 피하 지방 조직(SAT)을 얻습니다.
  2. 멸균 조건에서 SAT 샘플을 분리하고 수집 후 조직 샘플을 엄격한 무균 조건의 층류 후드에서 처리하여 박테리아 오염을 방지합니다.

2. 내피세포 분리 및 배양

참고: hSATMVEC 절연을 위한 회로도는 그림 1에 나와 있습니다.

  1. hSATMVEC 분리의 경우 SAT에서 CIED 이식 중에 얻은 최소 250mg의 신선한 피하 지방 조직(SAT)을 대흉근 위에 사용합니다( 그림 1 참조).
    참고: 더 많은 양의 새로운 SAT를 사용하면 격리 중 hSATMVEC의 수율이 증가하고 성공적인 격리 및 hSATMVEC 배양 가능성이 가장 높습니다.
  2. 실험실로 옮기기 전에 SAT를 1.5mL 미세 원심분리기 튜브의 얼음처럼 차가운 MACS(자기 활성화 세포 분류) 조직 보관 용액에 즉시 넣습니다.
    알림: 성공적인 격리 가능성을 높이려면 가능한 한 빨리 hSATMVEC 격리를 수행해야 합니다. 그러나 SAT는 필요한 경우 격리하기 전에 얼음 위에 최대 24시간 동안 보관할 수 있습니다.
  3. 다음과 같이 1mg/mL 콜라겐분해효소/디스파제 작업 용액을 준비합니다.
    1. 먼저 500mg의 멸균수에 500mg의 콜라겐분해효소/디스파제 동결건조 분말을 재구성하여 100mg/mL 농도의 콜라겐분해효소/디스파제 원액을 형성합니다.
    2. 각 hSATMVEC 분리에 대해 100μL의 콜라겐분해효소/디스파제 원액을 10mL의 Cold Hanks′ Balanced Salt 용액에 희석하여 1mg/mL의 작업 용액으로 만듭니다.
  4. 층류 캐비닛에서 두 개의 메스를 사용하여 페트리 접시 뚜껑에 있는 500μL의 1mg/mL 콜라겐분해효소/디스파제 용액에 조직을 ~1mm3 개로 다지고 삼중 처리하여 깨끗한 50mL 원심분리기 튜브로 옮깁니다.
  5. 페트리 접시 뚜껑을 4.5mL의 신선한 1mg/mL 콜라겐분해효소/디스파제 용액으로 세척하고 50mL 원심분리 튜브에 추가합니다. 37 °C에서 20 rpm의 튜브 로테이터에서 30 분 동안 분해시킵니다. 10mL의 완전한 EC 성장 배지 MV를 추가하여 분해 과정을 중지합니다.
  6. 분해된 혼합물을 삼각 추출하고 70μm 세포 체를 통과시킵니다. 0.5% 인산염 완충 식염수 - 소 혈청 알부민(PBS-BSA) 완충액 10mL로 체를 헹굽니다. 샘플을 300 x g 에서 실온에서 10분 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다. 0.5% PBS-BSA 5mL를 더 넣어 이 단계를 반복합니다.
  7. 그런 다음 죽은 세포 제거 키트를 사용하여 죽은 세포를 제거합니다. 이렇게 하려면 1.5mL 미세 원심분리기 튜브에서 실온(RT)에서 15분 동안 200μL의 죽은 세포 제거 비드(사용 전 소용돌이)에 세포 펠릿을 배양합니다.
  8. 30μm 필터가 있는 LS 컬럼을 분리기 자석에 부착하고 그 아래에 15mL 원심분리기 튜브를 놓습니다. 샘플/비드 현탁액을 추가하기 전에 1mL의 데드 셀 제거 결합 완충액으로 자기 컬럼을 한 번 세척하고 중력 하에서 수동적으로 통과하도록 합니다.
  9. 다음으로, 0.5mL의 결합 완충액을 추가하여 컬럼을 세척하고 컬럼을 수동적으로 통과하도록 합니다. 이 세탁을 4회 반복합니다.
  10. 용리액을 살아있는 세포 분획으로 수집하고, 세포를 RT에서 300 x g으로 10분 동안 회전시킨 다음, 생성된 펠릿을 400μL의 0.5% PBS-BSA에서 세척하고 재현탁시킵니다.
  11. 20 μL의 anti-CD31 코팅 마그네틱 비드를 부유 세포에 추가하고 4 °C에서 20 분 동안 배양합니다. 배양 후 샘플을 300 x g 에서 RT에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다. 세포 펠릿을 0.5% PBS-BSA 500μL에 재현탁시킵니다.
  12. 30μm 필터가 있는 MS 컬럼을 분리기 자석에 부착하고 그 아래에 15mL 원심분리기 튜브를 놓습니다. 500μL의 0.5% PBS-BSA로 컬럼을 프라이밍합니다. 이 단계를 두 번 반복합니다.
  13. cell-microbead 현탁액을 추가하고 중력 하에서 통과하도록 합니다. 500μL의 0.5% PBS-BSA로 컬럼을 3회 세척합니다. 컬럼 아래의 원심분리기 튜브의 플로우 스루에는 CD31- 분획이 포함되어 있습니다.
  14. CD31+ 분획(즉, hSATMVEC을 함유한 분획)을 수집하려면 분리기 자석에서 MS 컬럼을 제거하고 새 15mL 원심분리 튜브에 넣습니다. 0.5% PBS-BSA 1mL를 첨가하고 컬럼 플런저를 부드럽게 적용하여 캡처된 hSATMVEC를 방출합니다.
  15. 샘플을 300 x g 에서 RT에서 5분 동안 원심분리하고 상층액을 버립니다. 세포 펠릿을 1mL의 완전한 EC 성장 배지 MV에 재현탁시키고 1mL 세포 용액을 2% 젤라틴 코팅된 24웰 플레이트(통로 0)의 하나 또는 두 개의 웰(펠릿 크기에 따라 다름) 사이에 나눕니다.
    알림: 격리 후 처음 몇 일 동안 부착 세포가 거의 없더라도 걱정하지 마십시오.
  16. 3일마다 미디어를 교체하십시오. 37 ° C에서 5 % CO2로 세포 배양. 분리된 세포가 ~80% 밀도(2-4주)에 도달하면 6웰 플레이트(통로 1)의 단일 웰로 통과시킵니다.
    참고: 후속 통로는 하나의 합류 공여체 웰에서 수혜자 웰로 세포를 재플레이트할 수 있습니다. 실험은 세포가 유세포 분석을 사용하여 >99%의 순도를 입증한 후 통로 2-4 세대의 세포에서 수행되었습니다(섹션 3 참조). 세포는 적어도 5번 통로까지 전형적인 내피 형태를 유지하였다.

3. 유세포 분석

  1. 유세포 분석을 수행하기 전에 hSATMVEC가 합류하고 형태학적으로 대표적으로 나타나는지 육안으로 확인합니다. 6-웰 플레이트의 단일 웰에서 세포를 사용하여 통로 2에서 hSATMVEC의 유세포 분석을 수행합니다.
  2. 500μL의 PBS를 잘 추가하고 매번 흡인하여 PBS로 세포를 두 번 세척합니다. 그런 다음 300μL/웰의 따뜻한 트립신/EDTA(0.25%) 용액을 추가합니다. 37 ° C에서 5 % CO2 로 2 분 동안 배양합니다.
  3. 분리가 완료되면 700 μL의 완전한 EC 성장 매체 MV로 trypsin/EDTA 용액을 중화하고 1.5 mL 미세 원심분리 튜브로 옮깁니다.
  4. 셀 현탁액을 400 x g 에서 RT에서 8분 동안 원심분리합니다. 펠릿을 방해하지 않고 상층액을 버립니다. 다음으로, 세포 펠릿을 1mL MACS 완충액에 재현탁시키고 비염색 대조군과 염색된 시료(웰당 500μL)로 표시된 두 개의 1.5mL 미세 원심분리기 튜브로 나눕니다.
  5. 각 마이크로 원심분리기 튜브에 500μL의 MACS 완충액을 추가로 추가한 후 RT에서 400 x g 에서 8분 동안 다시 원심분리합니다.
  6. 상층액을 버리고 세포 펠릿을 비염색 대조군의 경우 100μL의 MACS 완충액에 재현탁시키고 염색된 샘플의 경우 100μL 염색 칵테일(보충 표 1)에 재현탁시킵니다. CD45-FITC(범-백혈구 마커)와 CD144-PE 및 CD31-PerCP(내피 세포에서 발현)로 세포를 염색합니다.
  7. 부유 세포를 5초 동안 잠시 소용돌이친 다음 4°C에서 10분 동안 배양합니다. 다음으로, 각 튜브에 MACS 완충액 1mL를 첨가하고 RT에서 400 x g 에서 8분 동안 다시 원심분리한 다음 상층액을 버립니다.
  8. 마지막으로, 세포 펠릿을 500μL의 MACS 완충액에 재현탁시키고 새로운 1.5mL 미세 원심분리기 튜브로 옮깁니다. 라벨이 부착된 튜브를 분석 준비가 된 덮개가 있는 아이스 박스에 넣습니다.
    참고: 포함된 모든 유세포 분석은 Beckman Coulter Cytoflex 4-레이저 유세포 분석기 시스템에서 수행되었습니다(488nm 여기 레이저만 사용).
  9. 다음과 같이 각 플루오로초메에 대한 최대 방출 파장 및 필터를 설정합니다: CD45-FITC - 최대 방출 520nm, 필터 525/50; CD144-PE - 방출 최대 578 nm, 필터 585/40; CD31-PerCP - 방출 최대 675nm, 필터 655-730.
  10. 그림 2에서 볼 수 있듯이 샘플당 10,000개 셀에 대한 데이터를 singlet gate(P2)에 기록합니다. P1이 주요 세포 클러스터를 둘러싸고 있고 이러한 세포의 대부분이 P2 단일 게이트에 속하는지 확인합니다. 염색되지 않은 대조군에 singlet의 %로 최소 CD45-CD144+CD31+ 세포가 있는지 확인합니다.
  11. 염색된 샘플에서 CD45-CD144+CD31+ 세포 단일항의 백분율을 기록합니다.

4. 내피 세포 배증 시간 및 세포 증식(그림 3)

  1. 단락 2와 3에서 혈구측정법을 사용하여 각 샘플에 대해 실행 가능한 hSATMVEC의 수를 계산합니다. 각 셀 수의 날짜와 시간을 기록합니다.
  2. 두 배로 시간 = (기간 x log(2))/(log(최종 농도)-log(초기 농도)) 방정식에 따라 이 지점 사이의 인구 배가 횟수를 계산합니다.
    참고: 온라인 계산기는 https://doubling-time.com/compute.php 에서 사용할 수 있습니다.
  3. 시판되는 세포 증식 이미징 키트를 사용하여 hSATMVEC의 증식을 평가합니다. 24웰 플레이트에서 웰당 20,000개 세포 밀도로 hSATMVEC를 파종하고 완전한 EC 성장 배지 MV에 하룻밤 동안 방치하여 회수합니다.
  4. 다음 날, 최종 농도 10μM의 완전한 EC 성장 배지 MV에 희석한 각 웰에 5-Ethynyl-2'-deoxyuridine(EdU)을 추가합니다. 37°C(5% CO2)에서 2시간 동안 배양합니다.
  5. EdU 함유 매체를 제거하고 PBS로 각각 두 번씩 잘 세척합니다. RT에서 15분 동안 4% 파라포름알데히드로 세포를 고정하고 PBS로 각 우물을 두 번 세척하고 트리스 완충 식염수(TBS) 완충액에 500μL의 0.5% Triton X-100을 추가합니다. 실온에서 20분 동안 배양하도록 둡니다.
    참고: 이것은 세포막을 투과시켜 Alexa fluor 488 표지된 아지드화물이 세포에 들어갈 수 있도록 합니다.
  6. 웰 수에 따라 제조업체의 지침에 따라 Alexa fluor 488 라벨이 부착된 아지드 칵테일을 준비합니다(6 참조). 100μL의 Alexa fluor 488 라벨링 아지드 칵테일을 추가하기 전에 PBS로 각각 두 번 잘 세척하고 빛으로부터 보호되는 RT에서 30분 동안 배양합니다.
    참고: Alexa fluor 488 라벨링 아지드 칵테일은 클릭 반응으로 EdU와 반응합니다.
  7. Alexa fluor 488 라벨이 붙은 아지드 칵테일을 제거하고 PBS로 두 번 씻습니다. 웰당 500μL의 요오드화 프로피듐을 추가하고 실온에서 20분 동안 배양합니다.
    참고: 이 단계는 핵(증식 및 비증식 모두)을 적색으로 대조염색합니다.
    프로피듐 요오드화물을 제거하고 PBS로 두 번 세척한 다음 이미징을 위해 각 웰을 500μL의 PBS에 그대로 둡니다.
  8. 488nm 아지드화물에 대해 495/519nm 여기/방출을 사용하여 10x 배율에서 4개의 고출력 필드에서 각 웰을 이미징합니다( 그림 3C 참조).
    참고: 그림의 이미지는 800ms 노출 시간으로 10x 배율로 라이브 셀 분석 시스템을 사용하여 캡처했습니다.
  9. 증식하는 세포의 수(녹색)를 세고 각 고출력 필드 내 총 세포의 백분율(%)로 표시합니다(웰당 평균 4개 영역).

5. 내피 세포관 형성

  1. Matrigel (기저막 매트릭스; BMM)을 얼음 위에서 밤새 해동합니다. 다음 날, 얼음 위에 플레이트를 놓고 필요에 따라 160웰 플레이트의 각 웰에 24μL의 BMM을 추가합니다. BMM으로 각 웰을 완전히 덮을 수 있도록 플레이트를 기울입니다. 세포를 준비하는 동안 37 % CO2 가 있는 5 °C의 인큐베이터에 플레이트를 놓습니다.
  2. 웰당 100,000개의 세포(배지 1mL)에서 hSATMVEC를 시드합니다. 웰 측면에 피펫팅하고 매트릭스가 분리되지 않도록 천천히 피펫팅하도록 주의하십시오. 37 ° C에서 5 % CO2 로 플레이트를 4 시간 동안 배양합니다.
    참고: 이 시점에서 플레이트를 이미지화할 준비가 되었습니다. 10x 배율로 라이브 셀 분석 시스템의 위상 이미징 결과와 아래 그림은 5개의 다른 웰 영역에서 사용되었습니다( 그림 3D 참조).
  3. 각 고출력 필드에서 전체 튜브의 수를 계산하고 각 샘플의 평균 값을 계산합니다.

6. hSATMVEC의 인슐린 자극

  1. 37°C에서 5% CO2로 6웰 플레이트에서 hSATMVEC를 배양합니다. 합류하면 완전한 내피 세포 성장 배지 MV를 제거하고 PBS로 두 번 세척합니다.
  2. 500 μL의 혈청 결핍 배지(보충제 없는 내피 세포 성장 배지 MV)를 각 웰에 추가하고 37°C에서 5% CO2 로 4시간 동안 배양합니다. 이 시간 동안 혈청 고갈 배지에서 준비된 인슐린 농도 증가(0-150μM)의 500μL 분취액을 준비합니다.
  3. 혈청을 4 시간 동안 굶주린 후 웰에서 배지를 제거하고 각 웰에 1mL의 인슐린 함유 배지 (농도 증가)를 첨가하고 37 ° C에서 5 % CO2 로 10 분 동안 배양합니다.
  4. 단백질을 얻기 위해 세포를 용해하기 위해 프로테아제 및 인산가수분해효소 억제제가 포함된 단백질 용해 완충액 100μL를 추가하기 전에 차가운 PBS로 두 번 세척합니다. BCA 분석을 사용하여 단백질을 정량화합니다.
    참고: 아래에 설명된 실험에서, 세포 용해물을 얼음 수조에서 30분 동안 배양하고 20,000 x g 에서 15분 동안 원심분리했습니다. 전기영동에 앞서, 단백질 샘플을 끓여서 95°C에서 5분 동안 단백질을 변성시켰다. 단백질을 NuPAGE 4-12% Bis-Tris Gel에서 분해하고 니트로셀룰로오스 막으로 옮겼습니다. 면역블롯 분석은 관련 인단백질 항체 및 총 단백질 항체(제조업체의 지침에 따라)를 사용하여 표준 프로토콜에 따라 수행되었습니다. 적절한 Ig/HRP 2차 항체를 사용하여 1차 항체를 검출했습니다(제조업체의 지침에 따라). 단백질의 수준은 각 샘플의 띠 강도를 기반으로 한 밀도 측정법을 사용하여 정량화되었습니다. ß-actin은 적절한 경우 로딩 제어로 사용되었습니다.

7. hSATMVEC-지방세포 공동 배양 설정(그림 4)

참고: 아래 결과에서, 단일 남성 백인 기증자의 통로 2에 있는 상업적으로 이용 가능한 인간 백색 피하 지방세포가 모든 지방세포 분석에 사용되었습니다. 지방세포는 초기에 공급업체에서 제공한 바이알(통로 0)에서 cryo-SFM 동결 매체(통로 1)를 포함하는 12개의 cryovials로 확장되었습니다.

  1. 각 24웰 공동 배양 플레이트에는 지방세포의 cryovial 1개가 필요합니다(passage 1). 각 바이알과 플레이트를 12-15mL의 따뜻한 PGM-2 배지(10% FBS, 30μg/mL L-글루타민 및 15ng/mL GA-1000 SingleQuots 포함)가 들어 있는 T75 플라스크에 빠르게 해동합니다. 90%가 합류할 때까지 3일마다 미디어를 교체합니다.
  2. 90%가 합류하면 PBS로 인간 백색 피하 지방세포를 세척한 다음 1mL의 트립신/EDTA 용액(0.25%)을 추가합니다. RT에서 2분 동안 그대로 두고 광학 현미경으로 박리를 확인합니다. 23mL의 PGM-2 배지를 추가하여 트립신/EDTA를 중화하고 24mL의 지방세포 부유 용액을 만듭니다.
  3. 1mL의 부유 인간 피하 백색 지방전 세포 용액을 24웰 공동 배양 동반 플레이트의 각 웰에 넣고 밀도가 높아질 때까지 성장합니다(보통 2-3일).
  4. 합류점으로 성장하는 동안 지방전 세포 분화 배지(PDM)를 준비합니다. PDM을 준비하려면 PGM 기본 배지에 인슐린, 덱사메타손, 인도메타신 및 이소부틸-메틸크산틴의 독점 혼합물을 추가하여 2x PDM 스톡을 만듭니다. 2x PDM을 PGM과 1:1 비율로 희석하여 1x PDM을 만듭니다.
  5. 합류가 완료되면 배지를 각 웰에 1x PDM 배지 1mL로 변경하여 인간 피하 백색 지방세포를 분화합니다(Day 0). 인간 피하 백색 지방세포를 37°C, 5% CO2 에서 10일(배지 변경 없이) 배양하도록 두어 완전히 분화시킵니다. 광위상 현미경을 사용하여 차별화를 모니터링합니다( 그림 4B 참조).
    참고: 분화된 지방세포는 통과할 수 없으며 10일째부터 12일째까지 분석에 사용할 수 있습니다. 지방세포 분화는 렙틴, 아디포넥틴 및 PPAR-γ의 mRNA 증폭으로 측정할 수 있습니다.
  6. 분화 6일차에 트랜스웰 인서트(0.4μM 멤브레인)에서 500μL 완전 EC 성장 배지 MV에서 인서트당 5 x 104 세포 밀도로 hSATMVEC를 시드합니다. 트랜스웰 인서트를 500 μL의 완전한 EC 성장 매체 MV ()가 있는 웰에 넣고 37 ° C에서 5 % CO 2 에서 합류하도록 성장합니다.
  7. 10일째에 지방세포가 완전히 분화되면 각 웰에서 PDM 배지의 절반을 제거하고 자체 배지(ECGM-MV)에 합류 hSATMVEC이 포함된 트랜스웰 삽입물을 각 웰로 이송합니다( 그림 4A 참조).
  8. 트랜스웰 삽입물을 제거하기 전에 세포를 24시간 동안 공동 배양 상태로 두고 지방 세포 기능을 평가하는 분석을 수행합니다.
    참고: 이 시점에서 필요한 경우 단백질 또는 RNA 분리를 위해 지방세포를 용해할 수도 있습니다.

8. 지방세포 2-(N-(7-니트로벤즈-2-옥사-1,3-디아졸-4-일)아미노)-2-데옥시글루코스(2-NBD)-포도당 흡수

  1. 공동 배양에서 24시간 후 hSATMVEC가 포함된 세포 삽입물을 제거합니다. 다음으로, 각 웰의 배지에 2-NBD-glucose를 첨가하여 최종 농도 20μM를 얻습니다. 빛으로부터 보호하고 37 ° C에서 5 % CO2로 30 분 동안 배양합니다.
  2. PBS에서 세포를 두 번 세척하고 RT에서 15분 동안 500μL의 4% 파라포름알데히드(PFA) 500μL를 사용하여 지방 세포를 고정합니다. PBS 100μL를 남기기 전에 PBS에서 세포를 세 번 세척합니다.
    참고: 이 시점에서 지방세포는 이미징할 준비가 되었습니다. 포함된 그림에서 위상 이미징 및 녹색광(여기 440-480nm/방출 504-544nm)은 4개의 고출력 필드에서 10배 배율로 라이브 셀 분석 시스템에서 얻어졌습니다( 그림 4C 참조).
  3. ImageJ(또는 기타 유사한 소프트웨어 패키지)에서 임계값을 사용하여 전체 영역의 녹색 비율을 정량화하여 포도당 흡수 수준을 정량화합니다.

결과

hSATMVEC 순도 및 표현형
대조군 환자(즉, 심장대사 질환 병력이 없는 환자)로부터 hSATMVEC를 분리한 결과, 유세포 분석에서 99.5%의 CD31+CD144+CD45-가 검출되었습니다(그림 2). 분리된 hSATMVEC은 EC에서 흔히 볼 수 있는 조약돌과 같은 형태를 가지고 있었습니다(그림 3A). hSATMVEC의 평균 개체군 배증 시간은 56.6시간 ± 8.1시간(평균 ± SEM, n = 10)(그림 3B)이었고, hSATMVEC의 활성 DNA 복제는 세포 증식 이미징 키트를 사용하여 확인되었습니다(그림 3C).

hSATMVEC은 작동하는 MVEC처럼 작동하여 Matrigel에서 튜브를 형성했습니다(그림 3D). 인슐린 신호전달 Akt-eNOS 경로에 관여하는 주요 단백질의 상대적 발현은 그림 3E에 나와 있습니다. eNO와 Akt 모두 인슐린 유도 인산화의 증가를 보여주었으며, 이는 ß-actin에 대한 인산화 단백질/총 단백질의 비율로 표시됩니다(그림 3E).

hSATMVEC-지방세포 공동 배양
hSATMVEC-지방세포 공동 배양의 예시 모델은 그림 4A에서 볼 수 있습니다. 인간의 피하 백색 지방세포가 더욱 분화됨에 따라 지질 액포(그림 4B)의 발달을 알 수 있으며, 이는 Oil Red O 염색(그림 4B)으로 정량화할 수 있습니다.

그림 4C에는 20μM 2-NBD 포도당으로 30분 배양한 후 분화된 지방세포의 위상차 및 형광 이미징(여기 440-480nm/방출 504-544nm)이 나와 있습니다. 포도당 흡수는 전체 세포 면적의 백분율로 녹색 영역을 측정하여 정량화할 수 있습니다.

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그림 1: hSATMVEC의 수확 및 처리를 보여주는 개략도 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 2: 배양된 hSATMVEC의 유세포 분석의 일반적인 결과. (A) 특정 세포 집단 밀도 주위에서 배양된 hSATMVEC의 게이팅(빨간색 상자)을 보여주는 측면 산란 영역(SSC-A) 및 전방 산란 영역(FSC-A)의 산점도. (B) 특정 세포 집단 밀도 주위에서 배양된 hSATMVEC의 게이팅(빨간색 상자)을 보여주는 전방 산란 폭(FSC-Width) 및 FSC-A의 산점도. (C) CD45-FITC에 대한 게이트 세포의 형광을 보여주는 히스토그램. (D) CD144-PE(x축) 및 CD31-PerCP(y축)의 형광 강도에 대한 산점도. (E) CD144-PE에 대한 게이트 세포의 형광을 보여주는 히스토그램. (F) CD31-PerCP에 대한 게이트 세포의 형광을 보여주는 히스토그램. 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 3: hSATMVEC 표현형. (A) 조약돌과 같은 모양을 보여주는 합류점 근처의 hSATMVEC의 광학 현미경 이미지. (B) hSATMVEC 배증 시간 - 세포 증식 정도를 보여주는 24시간 간격으로 촬영한 HATEC의 광학 현미경. (C) hSATMVEC 확산. 대조군의 프로피듐 요오드화물 및 EdU/Alexa-fluor 488을 사용한 hSATMVEC의 형광 현미경. (D) 대조군의 hSATMVEC 튜브 형성(4배 배율로 촬영한 이미지). (E) HATEC의 인슐린 자극 - 인슐린 농도가 증가할 때 B-액틴으로 표준화된 예시적인 웨스턴 블롯과 함께 인슐린 농도가 증가할 때 인산화된 Akt(세린 473)와 총 Akt(왼쪽 패널), 인산화된 eNOS(세린 1177)의 상대적인 발현을 보여줍니다. 데이터는 SEM± 평균으로 표시되며, 표본 크기는 각 패널 아래에 있습니다. 약어: 5-에티닐-2'-데옥시우리딘(EdU), 인간 피하 지방 조직 미세혈관 내피 세포(hSATMVEC), 평균의 표준 오차(SEM). 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

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그림 4: hSATMVEC-지방세포 공동 배양. (A) hSATMVEC-지방세포 공동 배양의 개략도. (B) 지방 세포의 분화. 왼쪽 패널은 0일째의 지방세포를 보여주고, 오른쪽 패널은 PDM을 추가한 후 10일째의 분화된 지방세포를 보여줍니다. 아래 그림은 Oil Red O. (C) 포도당 흡수 분석으로 염색된 지방세포 및 지방세포에 저장된 지질의 양을 보여줍니다. 왼쪽 패널은 20μM의 2-NBD 포도당으로 30분 동안 공동 배양 및 배양 후 지방세포의 위상 이미징을 보여줍니다. 오른쪽 패널은 포도당 흡수량(전체 면적의 % 녹색)을 정량화할 수 있는 녹색 이미징을 보여줍니다. 데이터는 SEM± 평균으로 표시됩니다. 약어: Day 10 (D10), human subcutaneous adipose tissue microvascular endothelial cells (hSATMVEC), preadipocyte differentiation media (PDM) 이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.

보충 표 1: 유세포 분석을 위한 염색 칵테일. 이 파일을 다운로드하려면 여기를 클릭하십시오.

토론

이 연구는 CIED의 일상적인 이식 중에 SAT에서 가져온 hSATMVEC을 분리하는 기술을 설명합니다. 당사는 분리된 hSATMVEC이 순도가 높고, EC 특이적 막관통 단백질 CD144 및 CD31을 발현하며, 백혈구 CD45의 유의한 발현을 나타내지 않음을 입증합니다. 우리는 계속해서 재현 가능하고 신뢰할 수 있는 방식으로 분리된 hSATMVEC이 증식하고 인슐린 신호 전달 및 혈관 신생에 관여하는 세포 내 기계를 연구하는 데 실험적으로 사용할 수 있음을 보여줍니다. 단독으로 배양할 수 있을 뿐만 아니라 hSATMVEC-지방세포 누화를 연구하기 위해 공동 배양에 사용할 수도 있습니다.

기초 및 중개 연구에 사용되는 내피 세포는 일반적으로 대동맥 및 인간 제대 정맥 또는 미세혈관과 같은 큰 혈관에서 공급됩니다. 이 소스들은 둘 다 각각의 제한 사항을 가지고 있습니다 7,8; 대동맥 조직의 경우 접근이 어려운 내피세포(endothelial cell)가 있거나 생리학적 특성과 환경적 노출이 다를 수 있는 신생아 조직에서 유래한다9. CIED 이식 시 채취한 조직에서 분리한 내피 세포를 사용하면 특정 실제 환자 그룹 내에서 세포 생리학을 조사하고 실험할 수 있습니다. CIED는 서맥성 부정맥, 심부전, 심실 빈맥의 1차 및 2차 예방을 포함한 다양한 적응증에 이식된다10. 이러한 환자들은 당뇨병, 비만, 관상동맥 질환 등 여러 질환을 동반하고 있는 경우가 많으며, 이는 전 세계적으로 심혈관 연구의 주요 초점이 되고 있다 11,12,13. 또한, 이 논문의 예시 데이터는 대조군 환자와 관련이 있지만, 우리는 진행성 심부전 및/또는 제2형 당뇨병 환자를 포함한 다양한 환자로부터 SATMVEC을 분리하고 연구하기 위해 이러한 기술을 적용했습니다.

드물지 않게 세포 분리 시도 후 hSATMVEC 수율이 낮다는 문제가 발생합니다. 이 위험은 더 큰 SAT 시작 볼륨을 사용하여 hSATMVEC를 격리함으로써 크게 줄일 수 있습니다. 또한 SAT에서 심장 대사 질환, 특히 당뇨병이 있는 사람들로부터 이를 더 자주 접하게 됩니다.

이 기술의 한 가지 한계는 분리된 hSATMVEC이 제한된 수의 통과만 통과할 수 있다는 것입니다. 5번 통과 후의 경험에 따르면, 환자 표현형에 관계없이 hSATMVEC 증식이 현저히 느려집니다. 또한, 이 기법을 사용하여 분리된 hSATMVEC은 인구 밀도가 너무 낮을 때 잘 증식하지 않습니다. 따라서 1:6보다 큰 비율로 hSATMVEC를 패시징하지 않는 것이 좋습니다. 1 페이지에서 언급 한대로. 우리는 최대 4년 동안 액체 질소에 보관된 hSATMVEC를 성공적으로 해동 및 재생시켰으며, 우리의 경험에 따르면 더 낮은 통로 번호에서 냉동 보존할 때 재생의 가능성이 더 큽니다(일반적으로 hSATMVEC는 통로 2에서 냉동 보존합니다).

CIED 삽입 시 채취한 조직은 자유롭게 사용할 수 있으며 환자에게 해를 끼치지 않고 채취할 수 있습니다. 따라서 이러한 환자군의 내피 세포에 쉽게 접근할 수 있고 상대적으로 비침습적인 공급원은 표적 연구를 수행하는 데 큰 도움이 됩니다. 이 논문의 대표 이미지는 '대조군' 환자(즉, CIED 이식에 대한 적응증이 있음에도 불구하고 심부전 또는 당뇨병 진단을 받지 않은 환자)에서 파생되었지만, 우리는 심부전, 당뇨병 및 이러한 병리학의 조합이 있는 환자로부터 SATMVEC을 성공적으로 분리, 배양 및 공동 배양했습니다. 또한, 이러한 기술은 골격근을 포함한 다른 미세혈관층에도 적용될 수 있으며, 현재 골격근 MVEC-근세포 누화 모델을 최적화하고 있습니다.

hSATMVEC은 CIED 삽입 시 채취한 인체 조직에서 분리할 수 있으며, 심장 대사 질환이 있거나 없는 사람들의 미세혈관 기능 장애 및 내피 세포-지방 세포 누화를 연구하기 위해 실험적으로 사용할 수 있는 충분한 순도를 가지고 있습니다.

공개 사항

SS는 아스트라제네카로부터 비재정적 지원, 연사 비용, 사례금 등을 받았다. RC는 Janssen Oncology로부터 연사 비용을 받았습니다. OIB는 노바티스(Novartis)로부터 강연료를 받았다.

감사의 글

우리는 생명공학 및 생명과학 연구 위원회(Biotechnology and Biological Sciences Research Council) 보조금(BBSRC BB/R000352/1)의 지원을 받은 유세포 분석 시설을 사용한 생명과학부 바이오이미징 학과(영국 리즈 대학교)에 매우 감사드립니다. SS는 영국 심장 재단 임상 연구 교육 펠로우십(FS/CRTF/20/24071)의 지원을 받았습니다. CL은 영국 심장 재단(British Heart Foundation) 박사 과정 학생(FS/19/59/34896)의 지원을 받았습니다. LDR은 Diabetes UK RD Lawrence Fellowship Award(0005382월 16일)의 지원을 받았습니다. RMC는 British Heart Foundation Intermediate Clinical Research Fellowship(FS/12/80/29821)의 지원을 받았습니다. MTK는 영국 심장 재단(British Heart Foundation)의 심혈관 및 당뇨병 연구 교수(CH/13/1/30086)이며 영국 심장 재단 프로그램 보조금(RG/F/22/110076)을 보유하고 있습니다.

재료

이 논문에 사용된 재료 목록
이름회사카탈로그 번호댓글
170L CO2 인큐베이터GS Biotech170G-014
2-NBDG (2-(N-(7-Nitrobenz-2-oxa-1,3-diazol-4-yl)Amino)-2-Deoxyglucose)InvitrogenN13195
4% PARAFIX 완충 조직학적 고정액VWR ChemicalsPRC/R/38/1
Akt (tAkt) Rabbit  1:1000Cell Signalling Technology9272
BD Venflon Pro Safety 14 g x 45 mm, 오렌지, 50/pkMedisave393230
소 세럼 알부민 용액, 7.5%MerckA8412-100ML
CD144 ( VE-Cadherin) 항체, anti-human, PE, REAfinityMiltenyi Biotec130-118-495
CD31 항체, anti-human, PerCP-Vio 700, REAfinityMiltenyi Biotec130-110-811
CD31 MicroBead Kit, human, 1 kitMiltenyi Biotec130-091-935
CD45 항체, anti-human, FITC, REAfinityMiltenyi Biotec130-110-769
세포 추출 InvitrogenFNN0011
Centrifuge 5804 REppendorf5805000060
이미징용 Click-iT EdU 세포 증식 키트, Alexa Fluor 488 염료InvitrogenC10337세포 증식 이미징 키트
, 콜라겐분해효소/디스파제, 500 mgRoche/Merck11097113001
Corning Matrigel Growth Factor Reduced (GFR) Basement Membrane Matrix코닝 354230베이스먼트 멤브레인 매트릭스
코닝 100mm TC 처리 배양 접시코닝 
Costar 24-well Clear TC-treated Multiple Well Plates, 개별 포장, 멸균Corning 3526
Costar 6-well Clear TC-treated Multiple Well Plates, 개별 포장, 멸균Corning 3516
CytoFLEX S – 4 레이저 플로우 사이토미터Beckman
데드 셀 제거 키트Miltenyi Biotec130-090-101
Dulbecco′ s 인산염 완충 식염수MerckD8537-500ML
EASY스트레이너 50 mL 튜브용 셀 체, 70 &마이크로; m mesh, 파란색, 멸균, 50/pkGreiner Bio-One542070
내피 세포 성장 배지 MVPromoCellC-22020
Eppendorf Safe-Lock 마이크로 시험관MerckEP0030120094
에틸렌디아민테트라아세트산 용액MerckE8008-100ML
Falcon 24 Well TC-Treated Cell 폴리스티렌 투과성 지지 플레이트, 뚜껑 포함, 멸균, 1/팩, 50/케이스Appleton WoodsCF537
Falcon 투과성 지원 24 웰 플레이트용 0.4 µ m 투명 PET 멤브레인, 멸균, 1/팩, 48/케이스Appleton WoodsCF521
냉동 매체 Cryo-SFMPromoCellC-29912
젤라틴 용액, 물 중 2%MerckG1393-100ML
Gibco 항생제-항진균제(100x), 100mLFisher Scientific11570486
Gibco TrypLE Select Enzyme(1x), 페놀 레드 없음Fisher Scientific
행크스&프라임; 균형 잡힌 소금 용액MerckH6648-500ML
인간 피하 지방세포LonzaPT-5020
Incucyte ZOOMEssen BioScience생세포 분석 시스템
인슐린 용액 인간MerckI9278-5ML
LS 기둥, 25/pkMiltenyi Biotec130-042-401
MACS MultiStandMiltenyi Biotec130-042-303
MACS 조직 저장 솔루션Miltenyi Biotec130-100-008
MACSmix 튜브 로테이터Miltenyi Biotec130-090-753튜브 로테이터
MS 컬럼, 25/pkMiltenyi Biotec130-042-201
NuPAGE 4– 12% Bis-Tris GelInvitrogenNP0322BOX
OctoMACS 분리기Miltenyi Biotec130-042-109
PGM-2 Preadipocyte Growth Medium-2 BulletKitLonzaPT-8002
Phospho (Ser1177) eNOS Rabbit 1:1000세포 신호 기술9570
Phospho-Akt (Ser473) Rabbit  1:1000세포 신호 기술4060
사전 분리 필터 30 & 마이크로; m, 50/pkMiltenyi Biotec130-041-407
프로피듐 요오드화물(PI)/RNase 염색 용액세포 신호 기술4087
QuadroMACS 분리기Miltenyi Biotec130-090-976
메스 일회용 멸균 스타일 10VWRI501
나사 캡 튜브, 15ml, (LxØ): 120 x 17mm, PP, 인쇄Sarstetd포함62.554.502
스크류 캡 튜브, 50 ml, (LxØ): 114 x 28 mm, PP, 프린트Sarstedt62.547.254
스크류 캡 튜브, 50 ml, (LxØ): 114 x 28 mm, PP, 프린트 포함Sarstetd62.547.254
Total eNOS Mouse 1:1000BD Biosciences610297
Triton X-100, BioUltra, 분자생물학 Merck93443-500ML
β-Actin (C4) Mouse 1:5000Santa Cruz Biotechnology  사우스캐롤라이나-47778
43016712563029

참고문헌

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  4. Brown, O. I., Bridge, K., Kearney, M. T. Nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidases in glucose homeostasis and diabetes-related endothelial cell dysfunction. Cells. 10 (9), 2315(2021).
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