Summary
Мы показываем, что за выражение эпидермального фактора роста рецепторов (EGFR) повышает подвижность нервных стволовых клеток (NSCs) с использованием новых агарозном гель на основе микрожидкостных устройств. Эта технология может быть легко адаптированы к другим млекопитающих ячейку, где ячейка источников не хватает, например, человека нервные стволовые клетки, и повернуться время имеет решающее значение.
Abstract
Хотя микрожидкостных технология выходит на новый уровень зрелости для макромолекулярных анализы, клеточных анализов все еще находятся на младенческой стадии 1. Во многом это связано с трудностью, с которой можно создавать ячейки-совместимым и устойчивым микроокружения с использованием обычных технологий микротехнологий и материалов. Мы решению этой проблемы путем введения новых материала микроструктур, агарозном геле, в качестве базового материала для микрожидкостных устройств. Агарозном геле очень податлива, и проницаемой для газа и питательные вещества, необходимые для выживания клеток, и таким образом является идеальным материалом для клеточных анализов. Ранее нами было показано, что гель агарозы устройств на базе добились успеха в изучении бактерий и нейтрофилов миграции клеток 2. В этом докладе, три параллельных микрожидкостных каналов по образцу в мембраны агарозном геле толщиной около 1 мм. Постоянные потоки со средствами массовой информации / буфер ведутся в двух боковых каналов с помощью перистальтического насоса. Клетки хранятся в центральном канале для наблюдения. Так как питательные вещества и химические вещества в боковых каналов постоянно диффундирующих из стороны в центральный канал, химической среде центрального канала легко управляется с помощью потока вдоль боковых каналов. С помощью этого устройства, мы показываем, что движение нервных стволовых клеток можно наблюдать оптически с легкостью в различных условиях химической и экспериментальные результаты показывают, что за выражение эпидермального фактора роста рецепторов (EGFR) повышает подвижность нервных стволовых клеток. Подвижность нервных стволовых клеток является важным биомаркеров для оценки агрессивности клетки, тем самым онкогенными в 3 раза. Расшифровка механизма, лежащего НСК моторики даст понимание как нарушение развития нервной системы и в рак мозга вторжения стволовых клеток.
Protocol
Процедура
Покрытие слайды с фибронектин
До сборки микрожидкостных устройств, стерилизовать стеклянные слайды с фибронектина. Пальто слайдов в biohood для поддержания стерильности. Совместите стерильной Spacer PDMS по краям слайд и отметьте сторона, которая сталкивается с постоянным маркером. Внесите 1 мл 5 мкг / мл раствора фибронектина (Sigma) внутри прокладки PDMS за полноту стекло. Оставьте в покое на слайдах час, затем полностью высохнуть использованием N 2 пистолета. Слайды можно хранить при температуре 4 ° С в течение последующих экспериментах.
Сборка устройства
Весь протокол сборке устройства осуществляется в biohood в стерильных условиях, с использованием следующих процедур:
- Чистый кремний мастер с микроканалов по образцу он, протирая его вниз с 70% этанола и сушка с N 2 пистолета. Место стерильной Spacer PDMS 1 мм высоту с помощью щипцов вокруг рельефа мастера.
- Подготовка агарозном геле, используемые в устройстве весом 0,3 г агарозы порошка (Fisher Scientific) и 10 мл CO 2-независимые средства массовой информации (Invitrogen) в 50 мл стакан. Перемешать смесь с лопаточкой и тепла в микроволновой печи в течение 20 секунд на высоте. Если нерастворенных гранулах присутствуют, нагревайте смесь в течение еще 10 секунд и водоворот горячую смесь, чтобы избавиться от последних оставшихся гранул. Повторите процесс с отоплением время 8 секунд, а затем 5 секунд.
- Быстро влить раствор агарозы на кремний мастер окружении распорку PDMS и сразу же покрытие смесь агарозы стерильным предметное стекло. Применять постоянно, мягкое давление на слайд в течение 2 минут, чтобы обеспечить, что будет агарозном геле же постоянной высотой 1 мм, как распорки PDMS.
- После агарозном гелях, шелушиться узорной агарозном геле с распоркой PDMS от мастера кремния и передачи фибронектина покрытием предметное стекло с микроканалов в агарозном геле перед горкой. Используйте калибра 16 наконечника шприца для пробивки отверстий в резервуар регионов микроканалов для входа и выхода доступов. Добавить 500 мкл СО 2-независимые средства массовой информации к узорной агарозном гель на слайд, чтобы предотвратить высыхание микроканалов.
- Вымойте акриловые многообразием используемых в устройстве с 70% этанола и смыть водой DI. Совместите отверстия в многообразии с отверстиями кулаком в агарозном геле с микроканалов. Затем выровняйте многообразие с гелем, PDMS распорка, и фибронектина слайд с металлической рамы устройства. Место винты в устройство и подтянуть к точке сопротивления с помощью отвертки. Это делается для того, чтобы устройство не затягивать слишком туго, в той мере, деформирующего микроканалов в агарозы. Затяните винты по часовой стрелке, чтобы гель внутри устройства нет смены. Проверьте устройство на предмет утечек и завалов в микроканалов использованием 1 мл шприца. Шприц оснащен Tygon труб с гелем загрузки пипетки на конце трубки для введения CO 2-независимых СМИ в микроканалов. Микроканальных считается успешно формируется, когда средства массовой информации наблюдается только выход из выхода микроканальных, когда средства массовой информации вводят в соответствующий вход. Теперь устройство готово к использованию.
Подготовка и посев клеток в устройстве
Когда клетки достигают 70% слияния (плотность клеток около 100000 клеток / мл), они готовы быть посеяны в устройство.
Тема клетки к двум DPBS (Invitrogen) стирок. Добавить 200 мкл трипсина-EDTA (Invitrogen), чтобы отделить клетки. Передача клетки 15 мл центрифугу пробирку, содержащую 5 мл М2 средах, содержащих сыворотку для инактивации трипсина. Центрифугировали питательной среды с клетками в 1000 оборотов в минуту в течение 5 минут. Наддувом от супернатант и ресуспендируют осадок клеток 5 мл DPBS. Центрифуга DPBS клетки снова на тех же условиях. Наддувом от супернатант снова, и ресуспендируют осадок клеток в 500 мкл СО 2-независимых СМИ.
Семенной полученной суспензии клеток в центре микроканальных из устройства через гравитацию управляемых потоков. Добавить входе и выходе из центра микроканальных с 60 мкл клеточной суспензии и 20 мкл СО 2-независимой среды, соответственно. Соблюдайте центр микроканальных при микроскопии светлого искать клеточной адгезии. Клетки обычно придерживаются через 10 минут. После клетки придерживаться дне канала на должном плотности, pipeted оставшиеся клеточной суспензии на входе и средств массовой информации в розетку. Место 60 мкл СО 2-независимые средства массовой информации в обеих входе и выходе из центрального канала. Место PDMS охватывает более-йЦентр электронной входе и выходе, чтобы минимизировать испарения средств массовой информации из центрального канала.
Изображения клеток в устройстве
До сборки устройства, поток стерильного перистальтической трубки через метеостанции микроскопа (Olympus X81) и соединиться с перистальтического насоса (Watson-Marlow 205U/CA). Флеш PBS через шланг в размере 4 оборотов в минуту. После сборки аппарата, подготовить соответствующие концентрации эпидермального фактора роста (ЭФР) (Sigma) решения в СО 2-независимые средства массовой информации в 15 мл пробирок центрифуги. Vortex ЭФР решения в течение 5 секунд и соединиться с трубкой. Подключение трубки, отмеченные соответствующие концентрации ЭФР к устройству. Она занимает около часа EGF диффундировать через канал хребта и создать устойчивый градиент химического вещества.
ПО для обработки изображений, Slidebook, используется, чтобы взять набор изображений в каждые 10 минут в течение 5 часов в экспериментальных перспективе. Ху автоматизированных этапе программируются таким образом, что две подзоны (каждый площадью x400μm 400μm) того же центрального канала, и в общей сложности три канала центра отображаемого в данный момент времени. Клетки в разных каналах центр (обычно 3 за один проход) имеют различные концентрации EGF, как отмечено на трубы.
Материалы и оборудование
Клеточные линии: C17.2 клетки NSCs происходит от внешнего зародышевого слоя послеродовой мозжечка мыши 6, 7. С помощью этой клеточной линии, мы разработали два других мышиных стволовых клеток линий с использованием метода трансфекции ретровируса. Эти два стабильно трансфицированных клеточные линии (1) wtEGFR - что чрезмерная выражает человека дикого типа EGFR, и (2) ΔEGFR - то есть конститутивно EGFR мутанта. Для облегчения обнаружения ретровирусов нести позвоночника с геном интересов следуют внутренний сайт для связывания рибосом (IRES) и зеленый флуоресцентный белок (GFP).
Клеточные культуры: мыши C17.2 NSCs и их вариантов были выращены в 6-луночный планшет в M2 СМИ (DMEM (Invitrogen) с 10% эмбриональной телячьей сыворотки (FBS) (Invitrogen), 5% лошадиной сыворотки (ГС) (Invitrogen ), и 1% пенициллина / стрептомицина (Invitrogen).) Клетки при температуре 37 ° С в 80% воздуха и 5% СО 2.
Микрожидкостных устройств: пластиковые многообразие, прокладку PDMS и рамкой из нержавеющей стали для хранения устройства на месте.
Изображений
Перевернутой флуоресцентного микроскопа (Olympus IX-81) используется, в связи с усилением CCD камера (Orca, Хамамацу). Микрожидкостных устройство устанавливается на автоматизированные стадии XYZ, и сцена окружена экологические камеру, которая поддерживает температуру 37 ° С. Существуют, как правило 3-4 устройств на одном чипе, который будет снят в той же точке времени, используя автоматизированные стадии XYZ.
Поток поддержания
Перистальтического насоса с 8 параллельных линий (Watson-Marlow 205U/CA) авто используется для поддержания потоков во всей раковине и источника каналов.
Рис. 1 Подвижность из трех штаммов НСК (родительские, wtEGFR и D EGFR) в различных концентрациях ЭФР Все траектории взяты из отслеживания фильм 5 часов (за исключением wtEGF 100ng/ml, 4hour), и происхождение всех треков перемещены в (0,0) для сравнения цели.
Рис. 2 Корреляция уровня экспрессии EGFR и подвижность (а) два изображения NSCs wtEGF на поверхности микрожидкостных канал с 100ng/ml ЭФР. Левого изображения флуоресцентного изображения, а права передаются яркое изображение области. Шкалы является 100 мкм, а Ширина канала составляет 400 мкм. Клетки разделяются на две популяции по яркости GFP выражены. Клетки в синих кругов диммер, таким образом, имеют меньший уровень экспрессии EGFR, и ячейки в красных кругах brigher, таким образом, имеют более высокий уровень EGFR выражения. (Б) Траектории клеток с низким и высоким уровнем экспрессии EGFR. Эти траектории взяты из четыре часовых фильма.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Рис. 1 показаны траектории трех штаммов НСК, родительских клеток, wtEGFR и ΔEGFR (контроль). Каждый набор траекторий, были получены от 5 часов фильма. Для родительских клеток, клеточной подвижности пик, когда концентрация ЭФР ~ 10ng/ml, ибо wtEGFR клеток, клеточной подвижности пик смещается 100ng/ml или выше; для ΔEGFR клеток, клеточной подвижности не зависит от концентрации ЭФР, как ожидалось.
WtEGF клеток с 100ng/ml были наиболее подвижных клеток, они переехали примерно в 1,5 раза быстрее, чем родительские клетки с 10ng/ml. Это означает, что (1) по выражению EGFR повышает подвижность клетки, (2) число ЭФР лиганд-рецепторных событиях дожидаясь имеет непосредственное влияние на клеточной подвижности. ΔEGFR клеточная линия конститутивно EGFR мутанта. Этот мутант появляется в ~ 60% человеческих глиобластомы. Это усеченная внеклеточный домен, который становится активным учредительных лиганд-независимой киназы. Интенсивность аутофосфорилирование мала (около 10%) по сравнению с лигандом активированный дикого типа EGFR (wtEGFR) 4. Это лежит в основе наблюдения, что ΔEGF клетки немного выше, чем подвижность родителей и wtEGFR (при отсутствии эпидермального фактора роста), но подвижность сохраняется постоянной в различных концентрациях ЭФР.
С wtEGFR клетки осуществляется той же копии GFP (зеленый флуоресцентный белок) и EGFR, флуоресцентные интенсивность wtEGFR клетки выявить уровни EGFR выражения. Это позволяет нам напрямую коррелируют выражение EGFR белка (зеленый флуоресцентный интенсивности) с клеточной подвижности. Рис. 2 показаны траектории двух популяции клеток, клеток в красном круге ярче, таким образом, имеет более высокий уровень EGFR выражения, а также клетки в синем круге обеда, таким образом, имеет более низкий уровень EGFR выражения. Результаты еще раз показывают, что чем выше уровень EGFR выражения, более подвижны эти клетки.
Традиционно, моторику NSCs определена методом анализа Бойден камеру, где процент клеток мигрируют через мембрану оценивается 5. Это населения на основе анализа, где поведение клеток, не может оцениваться в индивидуальном порядке. Микрожидкостных устройство, показанное здесь представляет возможность изучить ячейки движения на одном уровне клетки, так и в хорошо контролируемых химических окружающей среды. Это позволяет, в первый раз, соотносить непосредственно выражение EGFR белка с фенотипом NSCs подвижность в живых клетках. Небольшой размер устройства особенно полезно для экспериментов, в которых клетки источников ограничены, например, стволовые клетки человека.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Эта работа проводится при поддержке штата Нью-Йорк Управление по науке, технологии и научных исследований (NYSTAR) (в форме Центр перспективных технологий гранта), а также за счет субсидий из Нанобиотехнологии центр (NBTC), Программы НТС Национальной научного фонда по Договору № ECS-9876771, и Американская ассоциация опухоли мозга и Нью-Йоркской академии медицины (ОАК).
Materials
| Name | Type | Company | Catalog Number | Comments |
| Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM) (1X) | Reagent | Invitrogen | 11971-025 | |
| CO2-independent media | Reagent | Invitrogen | 18045-088 | A non-HEPES proprietary medium suitable for supporting cell growth for a variety of epithelial, fibroblast, and lymphoid cell lines in atmospheric conditions, contains no L-glutamine |
| Trypsin-EDTA | Reagent | Invitrogen | 25200-072 | |
| PBS | Reagent | Invitrogen | 14190-144 | Phosphate-buffered saline, without calcium or magnesium |
| Pen/Strep | Reagent | Invitrogen | 15140-122 | Contains 10,000 units of penicillin (base) and 10,000 g of streptomycin (base)/ml utilizing penicillin G (sodium salt) and streptomycin sulfate in 0.85% saline |
| FBS | Reagent | Invitrogen | 10437-028 | Fetal Bovine Serum, Qualified |
| Horse Serum | Reagent | Invitrogen | 16050-130 | Horse Serum, EIA tested (negative) serum |
| Fibronectin | Reagent | Sigma-Aldrich | F0895 | Fibronectin from human plasma, also called cold insoluble globulin |
| EGF | Reagent | Sigma-Aldrich | E4127 | Epidermal Growth Factor from murine submaxillary gland, lyophilized |
| Agarose | Reagent | Fisher Scientific | BP1356-500 |
References
- Blow, N. Microfluidics: in search of a killer application. Nature Methods. 4, 665-670 (2007).
- Shing-Yi Cheng, S. H., Wassweman, M. ax, Archer, S. hivaun, Shuler, M. ichael L., Wu, M. ingming A hydrogel-based microfluidic device for the studies of directed cell migration. Lab-on-a-chip. 7, 763-769 (2007).
- Pedersen, M. W., Tkach, V., Pedersen, N., Berezin, V., Poulsen, H. S. Expression of a naturally occurring constitutively active variant of the epidermal growth factor receptor in mouse fibroblasts increases motility. Int J Cancer. 108, 643-653 (2004).
- Ayuso-Sacido, A., Graham, C., Greenfield, J. P., Boockvar, J. A. The duality of EGFR signaling and neural stem cell phenotype: Cell enhancer or cell transformer. Current Stem Cell Research and Therapy. 1, 231-238 (2006).
- Eisenbach, M., Constantinou, C., Aloni, H., Shinitzky, M. Repellents for Escherichia coli operate neither by changing membrane fluidity nor by being sensed by periplasmic receptors during chemotaxis. J Bacteriol. 172, 5218-5224 (1990).
- Snyder, E. Y., Deitcher, D. L., Walsh, C., Arnold-Aldea, S., Hartwieg, E. A., Cepko, C. L. Multipotent neural cell lines can engraft and participate in development of mouse cerebellum. Cell. 68, 33-51 (1992).
- Snyder, E. Y., Yoon, C., Flax, J. D., Macklis, J. D. Multipotent neural precursors can differentiate toward replacement of neurons undergoing targeted apoptotic degeneration in adult mouse neocortex. Proc Natl Acad Sci U S A. 94, 11663-11668 (1997).
